Artykuł metodologiczny

Zastosowanie fioletu krystalicznego w celu poprawy wizualnego odczytu opartego na efekcie cytopatycznym do miareczkowania wirusów przy użyciu testów TCID50

DOI:

10.3791/63063

⸱

12 lutego 2022

 , 
1College of Veterinary Medicine, Department of Population Health and Pathobiology, North Carolina State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pokazuje dokładne i obiektywne podejście do wizualizacji miareczkowania wirusa za pomocą fioletu krystalicznego, porównując go z mikroskopią optyczną i barwieniem immunocytochemicznym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miareczkowanie wirusa jest kluczowym testem w badaniach wirusologicznych. Wykrywanie efektu cytopatycznego (CPE) za pomocą testów TCID50 i testów jednostek tworzących blaszki (PFU) to dwie główne metody obliczania miana wirusa i często opierają się na wykrywaniu mikroskopowym lub barwieniu komórek w celu wizualizacji. W przypadku testu TCID50 obiektywna wizualizacja jest zwykle oparta na immunocytochemicznym (ICC) barwieniu wewnątrzkomórkowego wirusa w celu obliczenia mian w połączeniu z wizualnym wykrywaniem CPE za pomocą mikroskopii. Jednak barwienie ICC jest kosztowne i czasochłonne. W tym badaniu porównaliśmy wizualną obserwację CPE za pomocą mikroskopii, barwienia ICC i barwienia fioletem krystalicznym w celu określenia mian dwóch wirusów tworzących CPE, wirusa grypy A (IAV) pochodzącego od świń i wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń (PRRSV). Wykazaliśmy, że zarówno barwienie fioletem krystalicznym, jak i ICC są dokładniejsze niż wizualne wykrywanie CPE, prezentując prawie identyczne poziomy precyzji zarówno w przypadku IAV, jak i PRRSV. Z tego powodu przedstawiamy tutaj barwienie fioletem krystalicznym jako szybszy i tańszy sposób określania miareczkowania wirusa w teście TCID50 dla wirusów tworzących CPE miareczkowanych w liniach komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miareczkowanie wirusa za pomocą testu TCID50 jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach nad chorobami zakaźnymi1. Chociaż z biegiem czasu zaproponowano różne wersje matematyki stojącej za tą metodą1,2,3,4, obecnie stosowane metody wykrywania infekcji opierają się na wizualnym potwierdzeniu poprzez obecność efektu cytopatycznego (CPE) za pomocą mikroskopii5. Aby bardziej obiektywnie potwierdzić wizualizację CPE w testach TCID50, barwienie wewnątrzkomórkowe immunocytochemiczne (ICC) ukierunkowane na białka wirusa jest jedną z najczęściej stosowanych metod6, ponieważ różne wirusy mogą wytwarzać różne formy CPE. W naszym przypadku zmiany morfologiczne komórek są podobne po zakażeniu zarówno wirusem grypy A (IAV), jak i wirusem zespołu rozrodczo-oddechowego świń (PRRSV), w którym zakażone komórki zaokrąglają się i odrywają od płytki. W przypadku PRRSV powoduje CPE znane jako "całkowite zniszczenie", w którym wszystkie komórki odłączają się od studni. Z drugiej strony, IAV może prezentować zarówno całkowite zniszczenie, jak i dodatkowe CPE znane jako "subtotalne zniszczenie", w którym niewielka liczba komórek nie odłącza się po infekcji7. Technika ta jest jednak czasochłonna w wykonaniu i wymaga użycia stosunkowo kosztownych odczynników. Ważne jest, aby pamiętać, że ICC nie oznacza CPE, ale raczej liczbę komórek, które zostały pomyślnie zainfekowane wirusem. Oznacza to, że komórki, które zostały pomyślnie zakażone pod koniec inkubacji, będą postrzegane jako pozytywne, nawet jeśli infekcja nie spowodowała jeszcze CPE, a zatem oczekuje się wyższego odsetka komórek ICC dodatnich w porównaniu z CPE. Z tego powodu w niniejszym badaniu opisano komplementarną metodę wizualnego wykrywania CPE w teście TCID50 opartym na fiolecie krystalicznym, substancji chemicznej o ładunku dodatnim, która przyczepia się do błon komórkowych i służy do barwienia przylegających komórek. Fiolet krystaliczny jest często wykorzystywany w badaniach wirusologicznych do pomiaru jednostek tworzących płytki nazębne, między innymi8.

W tym badaniu porównujemy czułość wykrywania CPE za pomocą mikroskopii niebarwionej z barwieniem fioletem krystalicznym i barwieniem immunocytochemicznym w oparciu o rozpoznawanie białek wirusowych, które są znane jako bardziej obiektywne ze względu na swoją wysoką czułość. Badanie to pokazuje, że zarówno barwienie fioletem krystalicznym, jak i immunocytochemiczne jest dokładniejsze niż wykrywanie CPE oparte na mikroskopii wzrokowej i może być wykorzystane do obiektywnej identyfikacji zakażonych studzienek w miareczkowaniu TCID50. Biorąc pod uwagę ich zdolność do osiągnięcia prawie identycznego poziomu dokładności w przypadku wirusów cytopatycznych testowanych w liniach komórkowych, fiolet krystaliczny jest przedstawiany jako szybszy i tańszy sposób określania miareczkowania wirusa w teście TCID50. Proponowana metoda wykorzystująca barwienie fioletem krystalicznym zajmuje łącznie 40 minut, z czego 15 minut na inkubację paraformaldehydu (PFA), 5 minut na inkubację fioletu krystalicznego i maksymalnie 15 minut na przygotowanie materiału, płukanie buforem i suszenie. Protokół immunocytochemiczny zastosowany do porównania trwa średnio 4 h 30 min i został przeprowadzony zgodnie z wcześniejszym opisem9,10. Proponowana metoda ma na celu pomoc w wizualizacji zakończonego miareczkowania wirusa. Czas infekcji i inkubacji może być przeprowadzany w różnym układzie w zależności od wirusa. Tutaj przetestowaliśmy dwa wirusy RNA o działaniu cytopatycznym na linie komórkowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Protokół miareczkowania

UWAGA: Użyj cytopatycznego wirusa infekującego przylegające komórki. Do tej demonstracji wykorzystano wirusa grypy A (IAV) pochodzącego od świń (A/California/07/2009/(H1N1)) oraz wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń (PRRSV) typu 2, szczep NC 1-7-4.

  1. Miareczkować te wirusy w 96-dołkowych płytkach przez 7 dni w komorze bezpieczeństwa biologicznego znajdującej się w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
    1. Aby wykonać te miareczkowania, wysiewaj 96-dołkowe płytki wymaganą linią komórkową. W przypadku PRRSV użyj linii komórkowej MA-104, a w przypadku IAV użyj linii komórkowej MDCK. Do hodowli komórkowej użyj pożywki DMEM uzupełnionej 10% FBS, L-Glutaminą i Penicyliną-Streptomycyną i hoduj komórki do zbieżności.
    2. Przed infekcją należy przemyć komórki za pomocą 200 μl PBS.
    3. Rozcieńczyć zapasy wirusa za pomocą serii 10-krotnych rozcieńczeń, mieszając 900 μl pożywki i 100 μl wirusa. Upewnij się, że probówka jest prawidłowo wirowana, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie pożywki i wirusa oraz uniknąć błędów rozcieńczenia.
    4. Zaznacz układ talerza na pokrywie. Umyj studzienki 1x buforem soli fosforanowej (PBS). Dodać 50 μl inokulum do odpowiednich studzienek zgodnie z wcześniej opisanymi metodami miareczkowania2,3.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 7 dni.

2. Ocena efektu cytopatycznego (CPE) za pomocą mikroskopii

  1. Po 7-dniowej inkubacji przemyć wszystkie studzienki dwukrotnie 200 μl 1x PBS.
  2. Oceń wszystkie dołki płytki pod mikroskopem świetlnym, aby wizualnie wykryć CPE. Zarówno w przypadku PRRSV, jak i IAV, ich CPE polega na śmierci komórki, a następnie oderwaniu się od płytki, co prowadzi do rozerwania monowarstwy. Jednak inne wirusy mogą prezentować różne typy CPE.

3. Protokół barwienia

UWAGA: Efekt cytopatyczny (CPE) oceniano za pomocą barwienia fioletem krystalicznym

.
  1. Po 7-dniowej inkubacji umyj wszystkie studzienki dwukrotnie 200 μl 1x PBS.
  2. Utrwal komórki, dodając 50 μl / studzienkę 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 200 μl 1x PBS. Następnie dodać 50 μl/studzienkę fioletu krystalicznego rozcieńczonego do 4% w wodzie i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Krystalicznie fioletowa substancja chemiczna barwi komórki, które pozostają przyczepione do płytki w momencie utrwalania, pozostawiając sekcje studzienki, w których komórki odłączyły się, jako niezabarwione.
  4. Na koniec odessać fiolet krystaliczny ze studzienek i opcjonalnie pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu przez 2-5 minut w temperaturze pokojowej lub umyć płytkę 200 μl wody, aby usunąć nadmiar plamy przed wizualizacją.
  5. Użyj wcześniej opisanych metod, aby matematycznie obliczyć miano. W tym przypadku zastosowano formułę Karbera i formułę Muencha odpowiednio dla PRRSV i IAV2,3. Szczegóły tych równań przedstawiono w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych.

4. Znakowanie immunocytochemiczne (ICC)

UWAGA: Znakowanie immunocytochemiczne dla obu wirusów zostało przeprowadzone zgodnie z wcześniej opisanymi metodami9,10,11.

  1. Po 7-dniowej inkubacji miareczkowania utrwalić komórki za pomocą PFA, jak opisano w kroku 3.2.
  2. Przemyć płytki roztworem złożonym ze 100 ml 1 M chlorowodorku Tris, 1 g saponiny i 8,5 g NaCl w 900 ml H2O. Następnie wykonaj dwa dodatkowe płukania mieszaniną 1x PBS i 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i inkubuj z tym roztworem Tris-Saponin-NaCl w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.
  3. Inkubować wszystkie studzienki z pierwotnym przeciwciałem przez 2 godziny w temperaturze RT.
    UWAGA: Objętość przeciwciał pierwszorzędowych dla każdego wirusa wynosiła 100 μl i została przygotowana przy użyciu rozcieńczenia 1:300 2% FBS w 1x PBS.
  4. Umyj komórki dwukrotnie roztworem Tris, Saponiny i NaCl przygotowanym w kroku 4.2.
  5. Inkubować wszystkie studzienki z przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze RT.
    UWAGA: Objętość przeciwciała drugorzędowego wynosiła 100 μl i została przygotowana przy użyciu rozcieńczenia 1:250 2% FBS w 1x PBS.
  6. Przemyj komórki rozcieńczeniem Tris, Saponiny i NaCl, jak opisano w kroku 4.2.
  7. Odessać poprzednie rozcieńczenie i inkubować płytki w roztworze aminoetylokarbazolu (AEC) o stężeniu 200 μl/basenik w końcowym rozcieńczeniu 1:50 w wodzie, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta, przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Po inkubacji odrzucić roztwór AEC i dodać 100 μl/basenik 1x PBS do obrazowania za pomocą mikroskopii.
  9. Matematycznie wyznacz miano zgodnie z opisem w kroku 3.5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Równania używane do matematycznego obliczania miana były wcześniej opisane2,3.

Krótko mówiąc, dla PRRSV stosujemy metodę Karbera:

Miano (TCID50) = 10 T + 1,3 gdzie:

Równanie dynamiki obrotu, T = d + (r / N) × (n + N/2), analiza wzoru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miareczkowanie wirusów jest rutynowo stosowane w badaniach wirusologicznych, przy czym najczęściej stosuje się wykrywanie PFU i testy TCID50 1,2,3,4. Obie metody polegają na wykrywaniu CPE w zakażonych komórkach i chociaż można je wizualnie ocenić za pomocą mikroskopii, zwykle stosuje się barwienie w celu uzyskania bardziej obiektywnego wyniku lub nawet skrócenia czasu inkubacji. W prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują dr Frankowi Scholle za jego pomocne komentarze w manuskrypcie, Chloe Mariant za pomoc przy obrazach mikroskopowych oraz Teresie M. Tiedge za pomocną korektę języka angielskiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowychGenesee25-221Przezroczysty, płaskodenny
roztwór AECThermo Fisher1122
Crystal violetThermo FisherC581-25; C581-100
DMEMCorning10-017-CV
Płodowa surowica bydlęcaBioWestS1480
ParaformaldehideThermo FisherJ19943
Pierwotne przeciwciało przeciw grypieBiossBS-0344R
Pierwotne przeciwciało PRRSVBiossBS-10043R
SaponinThermo Scientific
Przeciwciało wtórneInvitrogen31460
Chlorowodorek TrisThermo ScientificAM9856
AAA1882014

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
  2. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
  3. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
  4. Spearman, C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae. British Journal of Psychology. 2 (3), 227(1908).
  5. Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. Virus assay methods: accuracy and validation. Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).
  6. Kim, J., Chae, C. A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).
  7. Suchman, E., Blair, C. Cytopathic effects of viruses protocols. American Society of Microbiology. , (2007).
  8. Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. Influenza Virus. , Springer. 59-88 (2018).
  9. Tingstedt, J. -E., Nielsen, J. Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study. Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).
  10. Guarner, J., et al. Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs. American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).
  11. Nicholls, J. M., et al. Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods. Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Crystal Violet StainingTCID50 AssayCell StainingVirus StockPlaque AssayImmunocytochemical StainingInfluenza A VirusPRRSV

Powiązane artykuły