Określanie podstawowego wydatku energetycznego i zdolności adipocytów termogenicznych do wydatkowania energii u otyłych myszy

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje protokół do pomiaru podstawowej przemiany materii i zdolności oksydacyjnej termogenicznych adipocytów u otyłych myszy.

Streszczenie

Pomiary wydatku energetycznego są niezbędne do zrozumienia, w jaki sposób zmiany w metabolizmie mogą prowadzić do otyłości. Podstawowy wydatek energetyczny można określić u myszy, mierząc zużycie tlenu w całym ciele, produkcję CO₂ i aktywność fizyczną za pomocą klatek metabolicznych. Termogeniczne brązowo-beżowe adipocyty (BA) znacząco przyczyniają się do wydatkowania energii przez gryzonie, szczególnie w niskich temperaturach otoczenia. W tym miejscu pomiary podstawowego wydatku energetycznego i całkowitej zdolności BA do wydatkowania energii u otyłych myszy opisano w dwóch szczegółowych protokołach: pierwszy wyjaśnia, jak skonfigurować test do pomiaru podstawowego wydatku energetycznego za pomocą analizy kowariancji (ANCOVA), niezbędnej analizy, biorąc pod uwagę, że wydatek energetyczny zmienia się wraz z masą ciała. Drugi protokół opisuje, jak mierzyć zdolność wydatkowania energii BA in vivo u myszy. Zabieg ten obejmuje znieczulenie, potrzebne do ograniczenia wydatku spowodowanego aktywnością fizyczną, a następnie wstrzyknięcie agonisty receptora beta3-adrenergicznego, CL-316,243, który aktywuje wydatek energetyczny w BA. Te dwa protokoły i ich ograniczenia są opisane na tyle szczegółowo, aby umożliwić udany pierwszy eksperyment.

Wprowadzenie

Metabolizm można zdefiniować jako integrację reakcji biochemicznych odpowiedzialnych za pobieranie, przechowywanie, transformację i rozkład składników odżywczych, które komórki wykorzystują do wzrostu i wykonywania swoich funkcji. Reakcje metaboliczne przekształcają energię zawartą w składnikach odżywczych w formę, która może być wykorzystana przez komórki do syntezy nowych cząsteczek i wykonywania pracy. Te reakcje biochemiczne są z natury nieefektywne w przekształcaniu tej energii w formę użyteczną do podtrzymania życia¹. Taka nieefektywność powoduje rozpraszanie energii w postaci ciepła, przy czym ta produkcja ciepła jest wykorzystywana do ilościowego określenia standardowego tempa metabolizmu (SMR) organizmu¹. Warunek standardowy został klasycznie zdefiniowany jako produkcja ciepła zachodząca u przytomnego, ale odpoczywającego dorosłego człowieka, który nie spożywa ani nie trawi pokarmu, w stanie termoneutralności i bez stresu¹. Podstawowa przemiana materii (BMR) lub podstawowy wydatek energetyczny u myszy jest określany jako SMR, ale u osób spożywających i trawiących pokarm pod wpływem łagodnego stresu termicznego (temperatury otoczenia 21-22 °C)¹. Wyzwania i trudności związane z bezpośrednim pomiarem produkcji ciepła sprawiły, że kalorymetria pośrednia, czyli obliczanie produkcji ciepła na podstawie pomiarów zużycia tlenu, stała się najpopularniejszym podejściem do wyznaczania BMR. Obliczenie BMR na podstawie zużycia tlenu jest możliwe, ponieważ utlenianie składników odżywczych przez mitochondria w celu syntezy ATP jest odpowiedzialne za 72% całkowitego tlenu zużywanego w organizmie, przy czym 8% całkowitego zużycia tlenu występuje również w mitochondriach, ale bez generowania ATP (oddychanie niesprzężone)¹. Większość z pozostałych 20% zużytego tlenu można przypisać utlenianiu składników odżywczych w innych lokalizacjach subkomórkowych (utlenianie peroksysomalnych kwasów tłuszczowych), procesom anabolicznym i tworzeniu reaktywnych form tlenu¹. W 1907 roku Lusk ustalił równanie, oparte na pomiarach empirycznych, szeroko stosowane do przekształcania zużycia tlenu i produkcji CO₂ w rozpraszanie energii w postaci ciepła. U ludzi mózg odpowiada za ~25% BMR, układ mięśniowo-szkieletowy za ~18,4%, wątroba za ~20%, serce za ~10%, a tkanka tłuszczowa za ~3-7%². U myszy udział tkanek w BMR jest nieco inny, przy czym mózg stanowi ~ 6,5%, mięśnie szkieletowe ~ 13%, wątroba ~ 52%, serce ~ 3,7%, a tkanka tłuszczowa ~ 5%³.

Co ciekawe, reakcje biochemiczne definiujące BMR nie są stałe i zmieniają się w odpowiedzi na różne potrzeby, takie jak praca zewnętrzna (aktywność fizyczna), rozwój (wzrost tkanek), stresy wewnętrzne (przeciwdziałanie infekcjom, urazom, rotacji tkanek) i zmiany temperatury otoczenia (ochrona przed zimnem)¹. Niektóre organizmy aktywnie rekrutują procesy do generowania ciepła w ekspozycji na zimno, co oznacza, że ciepło wytwarzane przez metabolizm nie jest tylko przypadkowym produktem ubocznym. Zamiast tego ewolucja wybrała mechanizmy regulacyjne, które mogłyby konkretnie zwiększyć produkcję ciepła poprzez zmianę szybkości reakcji metabolicznych¹. W związku z tym te same pomiary zużycia tlenu można wykorzystać do określenia zdolności organizmu do wytwarzania ciepła w odpowiedzi na zimno.

Dwa główne procesy przyczyniają się do wytwarzania ciepła podczas ekspozycji na zimno. Pierwszym z nich są dreszcze, które generują ciepło poprzez zwiększenie mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej i glikolizy w mięśniach, aby pokryć pracę fizyczną wykonywaną przez mimowolny skurcz mięśni. Dlatego ekspozycja na zimno zwiększy zużycie tlenu w mięśniach¹. Druga to termogeneza bez dreszczy, która zachodzi poprzez wzrost zużycia tlenu w brązowych i beżowych adipocytach (BA). Rozpraszanie energii w cieple w BA odbywa się za pośrednictwem mitochondrialnego białka rozprzęgającego 1 (UCP1), które umożliwia ponowne wejście protonów do macierzy mitochondrialnej, zmniejszając gradient mitochondrialnych protonów. Rozpraszanie gradientu protonów mitochondrialnych przez UCP1 zwiększa produkcję ciepła poprzez wzrost transferu elektronów i zużycia tlenu oraz energię uwalnianą przez rozpraszanie protonów per se bez generowania ATP (rozprzężony). Co więcej, termogeniczny BA może rekrutować dodatkowe mechanizmy, które zwiększają zużycie tlenu bez powodowania dużego rozproszenia w gradieniu protonów, poprzez aktywację daremnych cykli syntezy i konsumpcji oksydacyjnej ATP. Opisywane tu klatki metaboliczne, a mianowicie system CLAMS-Oxymax firmy Columbus Instruments, oferują możliwość pomiaru wydatku energetycznego w różnych temperaturach otoczenia. Jednak, aby określić zdolność termogeniczną BA za pomocą pomiarów zużycia tlenu w całym ciele, należy: (1) wyeliminować udział dreszczy i innych procesów metabolicznych innych niż BA w wydatku energetycznym oraz (2) specyficznie aktywować aktywność termogeniczną BA in vivo. Tak więc drugi protokół opisuje, jak selektywnie aktywować BA in vivo za pomocą farmakologii u znieczulonych myszy w temperaturze termoneutralnej (30 °C), ze znieczuleniem i termoneutralnością ograniczającą inne procesy termogeniczne inne niż BA (tj. aktywność fizyczna). Farmakologiczna strategia aktywacji BA polega na leczeniu myszy agonistą receptora β3-adrenergicznego CL-316,246. Powodem jest to, że ekspozycja na zimno sprzyja reakcji współczulnej, uwalniając noradrenalinę w celu aktywacji receptorów β-adrenergicznych w BA, która aktywuje UCP1 i utlenianie tłuszczu. Ponadto ekspresja receptora β3-adrenergicznego jest wysoce wzbogacona w tkance tłuszczowej u myszy.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles (UCLA). Myszom podawano dietę i wodę ad libitum w klatce metabolicznej, trzymanej w środowisku o kontrolowanej temperaturze (~21-22 lub 30 °C) z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności. Do tego badania wykorzystano 8-tygodniowe samice myszy karmione dietą wysokotłuszczową lub dietą chow przez 8 tygodni.

1. Pomiar podstawowej przemiany materii (BMR)

1. Zmierz całkowitą masę ciała myszy za pomocą wagi z dokładnością w zakresie 0.1 g.
   UWAGA: Należy to zrobić przed umieszczeniem myszy w klatkach metabolicznych i po 2-3 dniach okresu aklimatyzacji do klatek metabolicznych.
2. Zmierz skład ciała, w tym tłuszcz i masę beztłuszczową u myszy nieznieczulonych, używając odpowiedniego systemu analizy składu ciała (patrz tabela materiałów).
   UWAGA: Pomiary te są potrzebne do określenia wydatku energetycznego i są wykonywane równolegle z pomiarami całkowitej masy ciała (krok 1.1).
3. Ustaw klatki metaboliczne i rozpocznij okres aklimatyzacji.
   UWAGA: System klatek metabolicznych zawiera obudowę, która pozwala użytkownikowi kontrolować temperaturę i światło w obudowie 12 klatek (Rysunek 1A,B). W każdej klatce znajduje się butelka z wodą, karmnik i siatka (Rysunek 1C). Siatka oddziela mysz od spodu klatki, umożliwiając zbieranie kału. Po zainstalowaniu klatki w każdej z góry określonej przestrzeni, pokrywa, która uszczelnia klatkę, zawiera szczelinę na butelkę z wodą, rurkę do pobierania próbek powietrza, system przepływu powietrza i czujnik aktywności fizycznej (Rysunek 1D).
   1. Włącz komorę temperaturową, system przepływu powietrza i komputer na 2 godziny przed rozpoczęciem testu.
   2. Po 2 godzinach otwórz oprogramowanie sterujące obudową (patrz Tabela materiałów) i przepływ powietrza i pozwól oprogramowaniu przetestować komunikację komputera ze sprzętem.
      UWAGA: Do niniejszej pracy wykorzystano oprogramowanie Oxymax.
   3. Po nawiązaniu komunikacji kliknij Plik, a następnie Otwórz konfigurację eksperymentu (Rysunek 2A) i wybierz konfigurację eksperymentu wstępnie zaprojektowaną przez dostawcę (lub skonfigurowaną na podstawie poprzedniego testu).
   4. Kliknij Eksperyment, a następnie kliknij Właściwości, co otworzy okno Właściwości eksperymentu (Rysunek 2B).
   5. W oknie Właściwości ustaw parametry obudowy środowiskowej, w tym temperaturę otoczenia (21 °C) i 12 godzin cykli świetlnych.
      UWAGA: Utrzymywanie otwartego i uruchomionego oprogramowania umożliwia przepływ powietrza do klatek i obudowy w celu utrzymania wybranej temperatury i cykli świetlnych. W ten sposób cały system może pracować z myszami w klatkach przez kilka dni, nawet bez pomiaru tlenu i CO_{2 .}
   6. Kliknij Eksperyment, a następnie kliknij Konfiguracja, a otworzy się okno Konfiguracja eksperymentu, w którym zdefiniowane są parametry każdej klatki metabolicznej.
   7. Przypisz każdy identyfikator myszy do indywidualnej klatki, w której znajduje się mysz (Rysunek 2C).
   8. Uwzględnij beztłuszczową masę ciała lub całkowitą masę ciała dla każdej myszy tylko wtedy, gdy nie obserwuje się różnic w masie ciała między grupami.
      UWAGA: Uzyskanie surowych wartości zużycia tlenu i wydatku energetycznego ułatwia analizy ANCOVA.
   9. Ustaw natężenie przepływu powietrza do klatki metabolicznej na 0,5-0,6 l/min.
   10. W oknie Konfiguracja eksperymentu wybierz ścieżkę i nazwę zapisywania pliku. Wybierz katalog kopii zapasowej (Rysunek 2D).
   11. Dodaj wstępnie zważoną ilość pokarmu do karmników, która pokrywa co najmniej spożycie pokarmu przez 1 dzień.
       UWAGA: Jeśli klatki mają zintegrowane wagi, żywność można dodać bezpośrednio, a oprogramowanie to zarejestruje.
   12. Dodaj butelki z wodą. Sprawdź, czy butelka jest prawidłowo zamknięta i nie przecieka.
   13. 24 godziny po dodaniu karmy zważyć pokarm pozostawiony na klatce.
       UWAGA: Gramy dodanego jedzenia minus gramy pozostałego jedzenia będą mierzyć spożycie pokarmu.
   14. Rozpocznij pomiary tlenu, CO₂ i aktywności (krok 1.4.10), gdy wartości spożycia pokarmu są takie same jak u myszy trzymanych w zwykłych klatkach.
       UWAGA: Tutaj okres aklimatyzacji (zwykle 2-3 dni) jest zakończony i można rozpocząć pomiary wydatku energetycznego.
4. Kalorymetria pośrednia i pomiary aktywności w celu oceny wydatku energetycznego
   1. Zmierz masę ciała, tłuszcz i masę beztłuszczową wszystkich myszy przed rozpoczęciem pomiarów.
      UWAGA: Są to wartości masy ciała i beztłuszczowej masy ciała używane do wykonywania analiz ANCOVA.
   2. Skalibruj detektor na bazie tlenku cyrkonu_O2 i CO₂ systemu CLAMS (patrz Tabela materiałów) z zalecanym stężeniem tlenu; zawsze ponownie kalibruj detektor przed rozpoczęciem nowego eksperymentu.
   3. Użyj gazu kalibracyjnego o znanym składzie (20,50% tlenu i 0,50% CO_{2 )}.
      UWAGA: Dostawcy gazu często określają ten gaz jako "Primary Standard Grade".
   4. Włącz i upewnij się, że ciśnienie wyjściowe w zbiorniku wynosi 5-10 psi.
   5. Otwórz oprogramowanie Calibration Utility, aby skalibrować i przetestować czujniki gazu (Rysunek 2E). Kliknij Eksperyment, a następnie Kalibruj.
   6. Naciśnij przycisk Start. Następnie poczekaj, aż czujniki zostaną przetestowane i oprogramowanie poprosi użytkownika o przekręcenie pokręteł czujnika gazu (Rysunek 2F), aż wartość tożsamości O₂ wyniesie 1 (Rysunek 2G-H). Kliknij przycisk Dalej po zakończeniu kroku.
      UWAGA: Jeśli narzędzie do kalibracji wykona wszystkie bieżące kroki, kalibracja automatycznie przejdzie do następnego kroku, gdy pasek postępu zostanie wypełniony.
   7. Sprawdź wyniki kalibracji po wykonaniu wszystkich kroków i przedstawieniu wyników.
   8. Wyłącz gaz kalibracyjny.
   9. Zmień karmę i dodaj wystarczającą ilość pokarmu na okres 48-72 godzin.
      UWAGA: Chociaż klatki mogą być otwierane podczas pomiarów wydatku energetycznego w celu monitorowania masy ciała i codziennej zmiany pokarmu, myszy mogą być zestresowane tymi manipulacjami, a pomiary są tracone po otwarciu klatek. Dlatego zaleca się unikanie jakichkolwiek manipulacji w okresie pomiaru.
   10. W oprogramowaniu kliknij Eksperyment, a następnie Uruchom, aby rozpocząć pomiary tlenu, CO₂ i aktywności (Rysunek 3A).
       UWAGA: Wykonywanie pomiarów można śledzić w czasie rzeczywistym w polu znajdującym się w lewej dolnej części oprogramowania (czerwony prostokąt, Rysunek 3B). Czerwony prostokąt w Rysunek 3B pokazuje, że system mierzy klatkę #1 w interwale #3, czyli w trzecim pomiarze. Jeden pomiar w jednej klatce może zająć około 1 minuty. W ten sposób, przy podłączonych 12 klatkach, zużycie tlenu można mierzyć mniej więcej co 12 minut. Zalecane są ciągłe pomiary przez minimum 48 godzin.
   11. Zatrzymaj eksperyment, klikając Eksperyment, a następnie Zatrzymaj (Rysunek 3C).
   12. Otwórz klatki, zważ myszy i jedzenie. Zbierz kał, aby obliczyć liczbę kalorii i lipidów wydalonych w okresie pomiarów 48-72 godzin.
       UWAGA: Kał może być przechowywany w temperaturze -20 °C do późniejszych analiz. Klatki te nie mogą być skutecznie używane do zbierania moczu.
   13. Kliknij Eksperymenty, a następnie Eksportuj i Eksportuj wszystkie tematy jako plik CSV (Rysunek 3D).
       UWAGA: Aby ułatwić analizy ANCOVA, konieczne jest eksportowanie wartości zużycia tlenu surowego (VO₂) i produkcji CO₂ (VCO₂) bez normalizacji na podstawie masy ciała.
5. Analiza danych i kontrola jakości
   1. W wyeksportowanym arkuszu CSV (Rysunek 3D) (z kroku 1.4.13) użyj surowych wartości zużycia tlenu (VO₂) i produkcji CO₂ (VCO₂) mierzonych co 12 minut w okresie 2-3 dni, które są automatycznie wyświetlane przez oprogramowanie i zawierają znacznik czasu, a mianowicie godzinę i datę ich pomiaru.
      UWAGA: Wartości VO₂ i VCO₂ zostaną automatycznie skorygowane, jeśli zostaną dodane wartości masy ciała lub beztłuszczowej masy.
   2. W wyeksportowanym arkuszu CSV użyj surowych wartości współczynnika wymiany oddechowej (RER: VCO₂/VO₂), które są automatycznie obliczane i wyświetlane przez oprogramowanie zgodnie z ich znacznikiem czasu.
      UWAGA: Wartości bliskie 1 pokazują, że mysz utlenia głównie węglowodany, podczas gdy wartości bliższe 0,7 oznaczają, że mysz głównie utlenia tłuszcz. RER powyżej 1 może wystąpić podczas ćwiczeń beztlenowych, ponieważ organizm wydala więcej_CO2, aby skompensować kwasicę spowodowaną mleczanem. RER wyższy niż 1 może wskazywać na stres. Wyeksportowany plik CSV zawiera również surowe wartości z wydatku energetycznego (EE) lub produkcji ciepła w kaloriach na minutę na mysz, mierzone co 12 minut w ciągu 2-3 dni. W tym miejscu wszystkie wymienione wartości zawierają sygnaturę czasową.
   3. Ponieważ dla ANCOVA potrzebne są pojedyncze wartości EE na mysz, należy uśrednić wartości EE zarejestrowane między 09:00-16:00 dla fazy światła (dziennej) i 19:00-04:00 dla fazy ciemnej (nocnej) na mysz i dzień.
      UWAGA: Można to zrobić ręcznie za pomocą programu Excel lub Graph Pad. Wybranie tych dwuczasowych okien czasowych pozwala uniknąć uśredniania pośrednich, stopniowych i niestabilnych wartości EE związanych z przejściem fazowym światło-ciemność.
   4. Dla okresu 48 godzin oblicz średnią z dwóch wartości światła dziennego i dwóch wartości ciemnych faz na mysz za pomocą programu Excel lub Graph Pad.
   5. Aby określić ilościowo całkowitą aktywność fizyczną, użyj programu Excel lub Graph Pad, aby zsumować liczbę przerw wiązki x, y i z zmierzoną w klatkach metabolicznych i wymienioną w pliku CSV dla każdej myszy.
      UWAGA: Całkowita aktywność x,y,z jest obliczana, wykonując najpierw średnią wartość każdego X, Y, Z na mysz i cykl. Następnie określa się sumę wszystkich średnich wartości X, Y, Z na mysz i cykl, aby wykreślić dane jak na rysunku 5E (będącej średnią z 2 dni).
   6. Alternatywnie, przedstaw dane przedstawiające każdą wartość pomiaru w czasie, co generuje krzywe ilustrujące zmiany EE podczas przejścia od cykli jasnych do ciemnych.
      UWAGA: Proszę zapoznać się z sekcją dyskusji na temat tego, jak i kiedy wykonywać analizy ANCOVA, a różne wzory używane do obliczania VO₂, VCO₂ i EE są podane w pliku uzupełniającym 1.

2. Pomiar zdolności adipocytów termogenicznych do wydatkowania energii

1. Skonfiguruj pomiary i zabiegi na myszach. Patrz krok 1 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat preparatów eksperymentalnych do monitorowania zużycia tlenu, ponieważ zdolność termogeniczna adipocytów jest determinowana pośrednio przez zużycie tlenu zgodnie z krokami 2.1.1-2.2.2.
   UWAGA: Protokół ten wymaga znieczulenia myszy i ostrego leczenia agonistą receptora beta-3 CL-316,243 (patrz Tabela materiałów), co daje szybką ocenę zdolności termogenicznej BA.
   1. Przeprowadź analizę składu ciała i zważ myszy. Włącz CLAMS, ustaw temperaturę na 30 °C (termoneutralność) i poczekaj 2 godziny, aż cały system się nagrzeje.
   2. Skonfiguruj pozostałe warunki testu, w tym światło, przypisz identyfikator myszy do każdej klatki i dodaj wartość masy ciała każdej myszy w odpowiedniej klatce, jeśli nie obserwuje się różnicy w masie ciała między grupami.
   3. Skalibrować detektor tlenu/CO₂ jak w krokach 1.4.2-1.4.7.
   4. Rozpocznij eksperyment w oprogramowaniu.
   5. Wstrzyknąć każdej myszy pentobarbital (60-120 mg/kg) i umieścić każdą mysz w przypisanej jej klatce metabolicznej (krok 2.1.2).
      UWAGA: Dawka pentobarbitalu wymagana do utrzymania myszy w stanie uśpienia w temperaturze termoneutralnej (30 °C) różni się w zależności od szczepu myszy i genotypu. Zaleca się przetestowanie różnych dawek pentobarbitalu od 50 do 120 mg/kg i wybranie tej, która utrzymuje znieczulenie myszy przez 2-3 godziny w temperaturze 30 °C. Skuteczne znieczulenie jest niezbędne, aby usunąć udział aktywności fizycznej w wydatku energetycznym.
   6. Aby zapewnić znieczulenie, obserwuj myszy po wstrzyknięciu pentobarbitalu, aż całkowicie zasną, a ich zmniejszone tempo zużycia tlenu stanie się stabilne.
   7. Poczekaj, aby uzyskać co najmniej 3 stabilne kolejne wskaźniki zużycia tlenu przed wstrzyknięciem CL-316,243.
      UWAGA: W oczekiwaniu na ustabilizowanie się zużycia tlenu należy przygotować strzykawki z CL-316,243 dla każdej myszy (1 mg/kg).
   8. Otwórz klatkę #1 i wstrzyknij CL-316,243 podskórnie natychmiast po jednym pomiarze VO₂ i VCO₂ w klatce #1. Umieść mysz z powrotem w klatce #1 natychmiast po wstrzyknięciu.
      UWAGA: Pomiary są wskazywane w czasie rzeczywistym w lewej dolnej części oprogramowania (Rysunek 3B, czerwony prostokąt).
   9. Poczekaj, aż klatka #2 zostanie zmierzona (Rysunek 3B, czerwony prostokąt), a następnie postępuj jak w kroku 2.1.8 dla klatki #2.
      UWAGA: Wstrzyknięcie CL-316,243 bezpośrednio po pomiarze pozwala na utrzymanie stałej czasowej pomiędzy iniekcjami. Na przykład, jeśli uruchomionych jest 12 myszy/klatek, z pomiarami zbieranymi w poszczególnych klatkach sekwencyjnie, a zbieranie trwa 55 s na klatkę, należy wstrzykiwać jedną mysz co minutę. Przy tych szybkościach wstrzykiwania pierwszy pomiar nastąpi po 12 minutach od wstrzyknięcia we wszystkich 12 klatkach.
   10. Kontynuuj pomiary wydatku energetycznego, aż wartości wydatku energetycznego ustabilizują się przez 5-6 kolejnych pomiarów, zwykle 90-180 minut po wstrzyknięciu.
       UWAGA: Myszy mogą obudzić się z narkozy podczas eksperymentów. Myszy te muszą zostać usunięte z analizy. Dlatego wcześniejsze przetestowanie dawek pentobarbitalu zwiększy efektywność badań.
   11. Przerwij pomiary wydatku energetycznego, ale trzymaj myszy w klatkach w temperaturze 30 °C, dopóki się nie obudzą.
   12. Po tym, jak myszy w pełni się obudzą, sprawdź stan zdrowia myszy i przywróć je do początkowych klatek.
   13. Wyeksportuj dane każdej myszy jako plik CSV za pomocą oprogramowania sprzętowego, jak opisano w sekcji 1.4.13.
2. Analiza danych
   UWAGA: Analiza danych została przeprowadzona za pomocą programu Excel lub Graphpad
   1. Wykreśl 3-5 kolejnych wartości VO₂, VCO₂ i EE, które są stabilne i stałe w czasie, ponieważ są to wartości reprezentujące tempo metabolizmu, gdy myszy są w pełni znieczulone.
   2. Następnie należy nanieść na wykres pierwszy i następne kolejne pomiary VO₂, VCO₂ i EE uzyskane po wstrzyknięciu.
      UWAGA: Wartości bezwzględne EE i krotny wzrost EE wywołany wstrzyknięciem wskazują na funkcję termogeniczną BA⁷.

Wyniki

Rysunek 4 przedstawia wartości VO₂, VCO₂, wydzielanie ciepła/wydatek energetyczny (EE), współczynnik wymiany oddechowej (RER) oraz wartości aktywności fizycznej w osiach X, Y, Z uzyskane przy użyciu klatek metabolicznych systemu CLAMS. Wartości VO₂ i VCO₂ dostarczane przez system CLAMS to objętość gazu (mL) na minutę, którą można podzielić przez masę ciała lub wartości beztłuszczowej masy ciała, wprowadzając te dane do oprogramowania CLAMS przed ro...

Dyskusja

Kalorymetria pośrednia jest od lat stosowana do oceny wydatku energetycznego całego ciała⁴. Opisany tutaj protokół zapewnia prostą metodę pomiaru podstawowej przemiany materii i określania zdolności termogenicznej BA in vivo przy użyciu klatek metabolicznych.

Opisana tu metoda kalorymetrii pośredniej potwierdza, że dzielenie wartości wydatku energetycznego przez wartości masy ciała może być mylące. Na przykład można stwierdzić, że wydatek energetyczny jest syst...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System CLAMS-Oxymax	Columbus Instruments	Podajnik centralny CLAMS-ENC-ENC	Zawiera obudowę środowiskową i czujnik tlenu z tlenku cyrkonu
Komputer stacjonarny z oprogramowaniem Oxymax	HP/Columbus	N/A	PC należy zakupić osobno
Dzbanek Drierite (siarczan wapnia ze wskaźnikiem chlorku kobaltu)	Fisher Scientific	23-116681	Potrzebna do wysuszenia gazu wchodzącego do czujnika tlenu, wilgoć może uszkodzić czujnik
NMR dla składu ciała	Echo-MRI	Echo-MRI 100	Zmierz masę beztłuszczową i tłuszczową u żywych myszy. Jest to niezbędne do analiz ANCOVA.
CL-316-243	Sigma	C5976	Wstrzykiwany myszom podskórnie w celu aktywacji termogenezy
Dieta	wysokotłuszczowa Diety badawcze	D12266B	Dostarczane myszom przed i podczas pomiarów
Pentobarbital / Nembutal	w DLAM	Nie dotyczy	Znieczulenie dla myszy
Podstawowy gaz klasy standardowej (zbiornik i regulator)	Praxair	NI CD5000O6P-K / PRS 2012-2331-590	20,50% tlenu, 0,50% CO2 zrównoważone azotem używanym do kalibracji

Apteka