Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nieoznaczony model ksenoprzeszczepu do badania zachowania sferoid ludzkich komórek macierzystych w zarodkach piskląt

1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63067

⸱

15 października 2021

 , 
1Morphological Sciences Program, Biomedical Sciences Institute, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę przeszczepiania i identyfikacji sferoidów komórek ludzkich do zarodków piskląt. Ten model ksenoprzeszczepu wykorzystuje mikrośrodowisko embrionalne jako źródło sygnałów instruktażowych do badania migracji, różnicowania i tropizmu komórek i jest szczególnie odpowiedni do badania pierwotnych i/lub heterogenicznych populacji komórek.

Streszczenie

Ksenoprzeszczepy są cennymi metodami do badania zachowania ludzkich komórek in vivo. W szczególności środowisko embrionalne dostarcza wskazówek dotyczących migracji, różnicowania i morfogenezy komórek, z unikalnymi sygnałami instruktażowymi i tożsamością listka rozrodczego, które często są nieobecne w modelach ksenoprzeszczepów dorosłych. Ponadto modele embrionalne nie są w stanie odróżnić tkanek własnych od nie-własnych, eliminując ryzyko odrzucenia przeszczepu i potrzebę immunosupresji gospodarza. W pracy przedstawiono metodykę przeszczepiania sferoid komórek ludzkich do zarodków kurzych, które są dostępne, podatne na manipulacje i rozwijają się w temperaturze 37 °C.

Sferoidy pozwalają na wybór określonego regionu zarodka do przeszczepienia. Po przeszczepieniu komórki integrują się z tkanką gospodarza, umożliwiając śledzenie ich migracji, wzrostu i różnicowania. Model ten jest na tyle elastyczny, że pozwala na wykorzystanie różnych przylegających populacji, w tym heterogenicznych pierwotnych populacji komórek i komórek nowotworowych. Aby obejść potrzebę wcześniejszego znakowania komórek, opisano również protokół identyfikacji komórek dawcy poprzez hybrydyzację sond Alu specyficznych dla człowieka, co jest szczególnie ważne przy badaniu heterogenicznych populacji komórek. Co więcej, sondy DNA można łatwo przystosować do identyfikacji innych gatunków dawców. Protokół ten opisuje ogólne metody przygotowania sferoid, szczepienia zarodków kurczaka, utrwalania i przetwarzania tkanek do sekcji parafinowej i wreszcie identyfikacji komórek ludzkich za pomocą hybrydyzacji DNA in situ. Sugerowane kontrole, przykłady interpretacji wyników i różne zachowania komórek, które można oznaczyć, zostaną omówione oprócz ograniczeń tej metody.

Wprowadzenie

Ksenoprzeszczepy są użytecznymi narzędziami do badania zachowania ludzkich komórek in vivo. Modele te dostarczyły bezcennych informacji dla szerokiego zakresu tematów naukowych, takich jak biologia ludzkich komórek macierzystych1, obserwacja zdarzeń komórkowych w czasie rzeczywistym2 oraz badanie angiogenezy nowotworów i przerzutów3. Ponadto zbadano kilka aspektów biologii nowotworów, w tym nowotworzenie ksenoprzeszczepów specyficznych dla pacjenta4,5. Każdy z tych modeli ksenoprzeszczepów ma swoje zalety i wady, a zatem każdy z nich lepiej nadaje się do konkretnych pytań naukowych. Zarodki piskląt są popularnym modelem biologii rozwojowej, ponieważ są dostępnym modelem owodni, który jest podatny na manipulacje chirurgiczne. Przeszczepy heterologiczne pozwoliły badaczom na stworzenie precyzyjnych map losu6 lub zbadanie, czy cecha jest autonomiczna dla komórki, czy też jest poinstruowana przez środowisko7,8. Podobne uzasadnienie pozwala na wykorzystanie zarodka pisklęcia jako modelu ksenoprzeszczepu do badania zachowania komórek ludzkich.

Środowisko embrionalne aktywnie zarządza morfogenezą tkanek za pomocą sygnałów migracji i różnicowania, a także interakcji komórka-komórka. Tak więc, w porównaniu z dorosłymi modelami ksenoprzeszczepu, zarodek zapewnia bardziej pouczające środowisko do testowania zachowania przeszczepionych komórek, na przykład poprzez naśladowanie sygnałów obecnych w niszach dorosłych komórek macierzystych (np. BMP, WNT, NOTCH i SHH9). Ponadto, brak adaptacyjnego układu odpornościowego we wczesnym okresie rozwoju pozwala na wykonywanie ksenoprzeszczepów bez ryzyka odpowiedzi immunologicznej lub odrzucenia tkanki dawcy 10. W tym celu w poprzednich badaniach badano ksenoprzeszczepy komórek ludzkich do zarodków kurczaków. Potencjał neurogenny ludzkich komórek macierzystych został oceniony po wstrzyknięciu do cewy nerwowej lub naczyń krwionośnych11 oprócz integracji embrionalnych komórek macierzystych12 i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych13 do zarodka. Ludzkie komórki czerniaka zostały również przebadane przy użyciu środowiska embrionalnego pisklęcia, które ujawniło powiązania między ich nowotworzeniem a zachowaniem komórek grzebienia nerwowego14, a także przeprogramowaniem komórek nowotworowych za pomocą informacji z zarodka15. W artykule opisano protokół, który jest szczególnie przydatny do badania zachowania ludzkich pierwotnych i heterogenicznych populacji komórek.

W ostatnich dziesięcioleciach komponent zrębowy różnych tkanek był badany jako autologiczne źródło komórek progenitorowych/macierzystych oraz ze względu na jego właściwości proangiogenne i immunoregulacyjne, wcześniej znane jako "mezenchymalne komórki macierzyste"16,17,18. Pierwszą z tych populacji komórek, która została scharakteryzowana, była populacja komórek zrębowych/macierzystych szpiku kostnego (BMSC), które mają potencjał osteo-, adipo i, w mniejszym stopniu, chondrogenetyczny in vivo19,20. Komórki zrębu pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) to niejednorodna populacja uzyskana przez trawienie enzymatyczne próbek lipoaspiratu lub dermolipektomii, a następnie izolację frakcji zrębowo-naczyniowej (SVF) i wreszcie ekspansję w hodowli21. W hodowli komórki te charakteryzują się fenotypowo markerami wspólnymi z innymi populacjami mezenchymalnymi, takimi jak CD90, CD73, CD105 i CD44, unikalnymi markerami, takimi jak CD36, oraz brakiem markerów krwiotwórczych (CD45) lub śródbłonkowych (CD31)22. Dodatkowo, ADSC mają potencjał osteo-, adipo i chondrogenne in vitro, a liczbę komórek macierzystych/progenitorowych w tej populacji można określić za pomocą testu CFU-F, jednostki tworzącej kolonie fibroblastoidów22. In vivo stwierdzono, że komórki o fenotypie ADSC występują w przedziałach zrębu23 i/lub perivascular24. Staje się coraz bardziej oczywiste, że pomimo wspólnych markerów po hodowli in vitro, przedział zrębowy różnych tkanek odzwierciedla wewnętrzne cechy danego narządu, a te populacje komórek mają różne właściwości w zależności od ich źródła17,25,26,27. Ponadto, ponieważ komórki te są izolowane na podstawie ich przylegania do naczynia do hodowli komórkowej, mogą składać się z komórek z różnych listków zarodkowych28. W związku z tym zastosowanie metody ksenoprzeszczepu do badania potencjału różnicowania i tropizmu komórek zrębu w bezstronny sposób może dostarczyć cennych informacji o tych populacjach komórek, które pomogą w opracowaniu przyszłych terapii komórkowych.

Protokół opisany tutaj (Rysunek 1) to metoda ksenoprzeszczepu, która wykorzystuje niski koszt i łatwość manipulacji zarodkami piskląt. Wcześniej był używany do badania zachowania ludzkich ADSC29, fibroblastów skóry29, komórek zrębowych pochodzących z krwi menstruacyjnej30 i komórek glejaka31. Metoda ta obejmuje przeszczepianie komórek w postaci sferoidów32, które można przygotować z dowolnej populacji przylegających komórek (Rysunek 2). Opisane zostaną również zabiegi chirurgiczne i przygotowanie niestandardowych materiałów chirurgicznych - mikroskalpeli i szklanych naczyń włosowatych (Ryc. 3). Komórki ludzkie są wykrywane w skrawkach histologicznych poprzez hybrydyzację specyficznych dla człowieka sond Alu (Rysunek 4), eliminując w ten sposób potrzebę wcześniejszego znakowania przeszczepionych komórek. Reprezentatywne wyniki opisują zachowanie ludzkiego ADSC przeszczepionego zarówno w obszarze somitycznym na poziomie pąka skrzydła (Ryc. 5, Ryc. 6 i Ryc. 7) i pierwszym łuku gardłowym (Ryc. 8), jak i ludzkie sferoidy pierwotnego glejaka przeszczepionego w prosencefalonie (Ryc. 8). Opisana zostanie migracja, różnicowanie i interakcja komórek z tkankami embrionalnymi piskląt, a także sugerowane testy w celu dalszego zbadania zachowania komórek za pomocą współbarwienia lub barwienia sąsiednich odcinków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury in vivo użyte w tym badaniu były zgodne ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi eksperymentalnymi dotyczącymi testów i badań na zwierzętach, zgodnie z brazylijskimi wytycznymi dotyczącymi eksperymentalnego wykorzystania zwierząt (L11794). Wszystkie protokoły stosowane w postępowaniu z zarodkami kurcząt zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Wykorzystywania Zwierząt w Eksperymentach Naukowych (Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Federalnego w Rio de Janeiro). Wykorzystanie komórek ludzkich zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Uniwersyteckiego Clementino Fraga Filho (numery 043/09 i 088/04). Użyto jaj wolnych od specyficznych patogenów (SPF) kurczaka rasy White Leghorn (Gallus gallus).

1. Przygotowanie sferoid komórkowych

UWAGA: Sferoidy komórkowe mogą być przygotowane z szeroką gamą typów komórek, o ile są one przylegające. W tym protokole wyizolowano ludzkie komórki zrębowe pochodzenia tłuszczowego (ADSC), jak opisano wcześniej21,27 (Rysunek 2A). Komórki uzyskano przez trawienie fragmentów tkanki tłuszczowej lub lipoaspiratów kolagenazą IA przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C pod mieszaniem, a następnie posiew w temperaturze 1−2 ×10 4 komórek/cm2 i inkubację przez noc. Nieprzylegające komórki zostały odrzucone, a przylegające komórki rozszerzono na 3-6 pasaży. ADSC były jednorodne pod względem ekspresji antygenów powierzchniowych CD105, CD90, CD13 i CD44 oraz ujemne dla antygenów krwiotwórczych CD45, CD14, CD34, CD3 i CD1927. Podczas gdy opisana tutaj metoda może być łatwo przeprowadzona przy użyciu minimalnej ilości materiałów wykraczających poza to, co jest rutynowo stosowane do hodowli komórek, optymalny czas agregacji i potrzeba częściowej dysocjacji powinny być określone empirycznie. Można zastosować alternatywne metody przygotowania sferoid komórkowych, takie jak metoda wiszącej kropli33 lub studnie pokryte agarozą34; Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji. Wszystkie zabiegi powinny być wykonywane na czystym stanowisku z zastosowaniem technik aseptycznych.

  1. Podgrzej sterylny PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), pożywkę hodowlaną i roztwór trypsyny do 37 °C przed manipulacją komórkami.
  2. Hodowla ADSC w DMEM o niskim poziomie glukozy uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 U / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny. Do przygotowania dwóch płytek sferoidowych należy użyć zlewającej się kolby o średnicy 25 cm2 z ADSC. Odrzucić pożywkę hodowlaną i umyć naczynie hodowlane trzy razy odpowiednią ilością sterylnego PBS (5 ml PBS na każde przemycie, jeśli używana jest kolba do hodowli komórkowych o średnicy 25 cm).
  3. Dodać tyle roztworu trypsyny (zawierającego 0,78 mM EDTA), aby pokryć komórki (1 ml roztworu trypsyny, jeśli używana jest kolba do hodowli komórkowych o średnicy 25 cm) i pozostawić kolbę hodowlaną na 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół, aby je rozdzielić. Dodać taką samą ilość pożywki hodowlanej zawierającej FBS w celu dezaktywacji trypsyny i przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  5. Wirować przez 10 minut w temperaturze 180 × g. Wyrzuć supernatant i postukaj w probówkę, aby poluzować osad.
  6. Zawiesić komórki w 500 μl-2 ml pożywki hodowlanej odpowiedniej dla typu komórki (patrz krok 1.2).
    UWAGA: Minimalne stężenie wynosi 5 × 105 komórek/ml dla komórek przylegających, takich jak ADSC i fibroblasty. Zlewającą się kolbę ADSC o długości 25cm2 należy ponownie zawiesić w 2 ml pożywki i rozsiać na 2 szalkach Petriego, używając 1 ml każda. Mniej przylegające komórki, takie jak glej, mogą odnieść korzyści z posiewu w ilości ~2 × 106 komórek/ml w mniejszej objętości.
  7. Ostrożnie przenieść zawiesinę komórkową na jedną stronę sterylnej szalki Petriego o średnicy 60 mm (niepowlekanej i niepoddanej obróbce, takiej jak płytki używane do przygotowywania płytek agarowych). Spróbuj ograniczyć pożywkę hodowlaną do najmniejszego możliwego obszaru (Rysunek 1B), opierając naczynie na kawałku złożonej, czystej gazy, aby utrzymać ją przechyloną w inkubatorze.
  8. Zawiesinę komórkową inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aż do utworzenia agregatów komórkowych (6-8 godzin po posianiu ADSC).
    UWAGA: Czas agregacji sferoidów może się różnić w zależności od typu komórki.
  9. W razie potrzeby (patrz dyskusja) należy częściowo rozdzielić agregaty dużych komórek, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówek o pojemności 1000 μl. Dysocjację sferoid ADSC należy przeprowadzić 6-8 godzin po posiewaniu.
  10. Umieść płytkę w inkubatorze, aż sferoidy będą gotowe do przesadzenia: okrągłe z zaznaczonymi krawędziami i niełatwo rozproszone (Rysunek 1C,D).
    UWAGA: Sferoidy ADSC są gotowe 2 dni po częściowej dysocjacji.

2. Przeszczepianie sferoid do zarodków piskląt

  1. preparat
    1. Przygotuj jaja kurze, inkubując 15-30 jaj w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37,5 °C, aż do osiągnięcia pożądanego etapu Hamburgera-Hamiltona (HH)35: 40-45 godzin dla przeszczepów u somitów na poziomie pąków kończyn (HH11-12 lub 13-19 somitów) lub 29-33 godzin dla przeszczepów w okolicy głowowej (HH8-9 lub 5-8 somitów). Ustaw jaja poziomo i narysuj ołówkiem linię na wierzchu jaj przed inkubacją (Rysunek 3D).
      UWAGA: Czas inkubacji może się nieznacznie różnić w zależności od poszczególnych inkubatorów. Narysowanie linii zapewni, że górna część jaja, w której znajduje się zarodek, będzie mogła być łatwo zidentyfikowana, jeśli jajo zostanie obrócone przed eksperymentem.
    2. Przygotuj ostre igły ("mikroskalpele"), przymocowując igłę do szycia do metalowego uchwytu na igłę (Rysunek 3B). Używając naoliwionej osełki, naostrz igłę, aż będzie przypominać mały skalpel z cienką krawędzią (Rysunek 3C). Alternatywnie, przygotuj ostrą igłę wolframową metodą elektrolizy36.
    3. Przygotuj szklane kapilary, używając płomienia palnika Bunsena, aby na krótko stopić cienką część szklanej pipety Pasteura. Usuń stopioną część z płomieni i rozciągnij ją, aby utworzyć cienką kapilarę. Ostrożnie podziel kapilatę na dwie części, rozbijając ją mikrokleszkami. Przygotuj cienką kapilarnę do wstrzykiwania atramentu indyjskiego i grubą kapilarnę do przenoszenia sferoid (Rysunek 3B).
      UWAGA: Zmieniając siłę ciągnięcia, można tworzyć różne mierniki kapilarne. Naczynka powinny być przygotowane tuż przed zabiegiem.
    4. Przygotuj powierzchnię roboczą i inne materiały do manipulacji jajami (Rysunek 3A). Wszystkie materiały chirurgiczne należy wysterylizować w piekarniku o temperaturze 100 °C przez noc lub przy użyciu 70% etanolu bezpośrednio przed użyciem. Ciepły sterylny PBS do temperatury 37 °C. Przymocuj końcówkę o pojemności 200 μl (z barierą) do zespołu rurki aspiratora do wstrzykiwania atramentu indyjskiego i przenoszenia sferoidów.
      UWAGA: Używaj końcówek z barierami podczas przenoszenia sferoid komórek ludzkich.
    5. Tuż przed eksperymentem dodaj 2 krople roztworu podstawowego atramentu indyjskiego do szalki Petriego o średnicy 30 mm i wymieszaj ją z 1 ml sterylnego PBS. Wyjmij sferoidalną płytkę z inkubatora i umieść ją nad zamrażalnikiem do końca eksperymentu.
  2. Przygotowanie każdego jajka
    1. Wyjmij jedno jajko z inkubatora i umieść je na uchwycie na jajka. Zrób mały otwór w ostrym końcu jajka (Rycina 2D) i odessaj 1,5 ml białka za pomocą strzykawki i igły. Włóż igłę prostopadle do jajka, aby uniknąć uszkodzenia żółtka. Uszczelnij otwór za pomocą taśmy klejącej. Opcjonalnie powtórz ten krok dla wszystkich jaj przed eksperymentem i ponownie wysiaduj pozostałe jaja.
    2. Ostrożnie rozetnij okienko na górze jajka za pomocą nożyczek (Rysunek 3D). Za pomocą pipety dodaj 1-2 krople PBS na żółtko. W razie potrzeby usuń duże pęcherzyki białka (takie jak te widoczne na Rysunek 3F) za pomocą pipety.
    3. Przymocuj cienką kapilę do zespołu rurki aspiratora. Wypełnij szklaną kapilę częściowo roztworem atramentu indyjskiego przez aspirację. Wstrzyknij wystarczającą ilość tuszu indyjskiego do żółtka pod zarodkiem, aż zobaczysz struktury embrionalne (Rysunek 3E,F).
    4. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego policz liczbę somitów (Rysunek 4A). Pojedynczo ponumeruj jajka za pomocą ołówka (Rysunek 4B).
  3. Przeszczep sferoidów
      Zidentyfikuj obszar przeszczepu: mezoderma przyosiowa na poziomie pąka skrzydła (mezoderma presomityczna przypuszczalnych 15 do 20 somitów37) (Rysunek 3G i Rysunek 5A) lub przypuszczalny pierwszy obszar łuku gardłowego (między ektodermą a endodermą boczną do tylnego śródmózgowia/pierwszego rombomeru38) (
    1. Rysunek 8A).
    2. Przeciąć błonę witelinową nad obszarem docelowym za pomocą mikroskalpela.
    3. Za pomocą pary mikroskalpeli wykonaj płytkie nacięcie w obszarze, w którym zostanie wszczepiony sferoid (Rysunek 3H).
      UWAGA: Unikaj uszkodzenia leżącej pod spodem endodermy; W przeciwnym razie żółtko wycieknie (jeśli tak się stanie, wyrzuć jajko).
    4. Usuń cienką kapilę z aspiratora i zastąp ją grubą kapilarną. Obserwuj sferoidy pod mikroskopem stereoskopowym i wybierz sferoidę o mniej więcej tej samej wielkości co somit (Rysunek 2D). Zassać tę sferoidę do naczynia włosowatego.
    5. Delikatnie umieść sferoidę obok obszaru cięcia (Rysunek 3H). Za pomocą ostrych igieł wepchnij sferoidę w obszar cięcia ( Rysunek 3I,J).
    6. Dodaj 1-2 krople PBS na zarodek za pomocą pipety, aby upewnić się, że sferoida jest mocno włożona.
      UWAGA: Jeśli przeszczep zostanie usunięty, należy przeszczepić nowy sferoid (kroki 2.3.4 i 2.3.5).
    7. Oczyść wszelkie wycieki albuminy ze skorupki jajka za pomocą bibuły, aby upewnić się, że jajo może być całkowicie zamknięte, unikając zanieczyszczenia. Uszczelnij okienko w jajku za pomocą taśmy klejącej.
    8. Zwróć uwagę na przeszczepiony obszar (Rysunek 4A). Ostrożnie umieścić jajo z powrotem w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37,5 °C, aby uniknąć przemieszczenia włożonej sferoidy.
    9. Inkubuj jajo do pożądanego etapu.
      UWAGA: Gdy ksenoprzeszczep jest wykonywany do somitów na poziomie zawiązków kończyn, migrację i śmierć komórki z powodzeniem przeprowadzono na 3,5-dniowych zarodkach (HH21), a różnicowanie komórek i tropizm zaobserwowano w 6-dniowych zarodkach (HH29) (Ryc. 5A). Integrację z tkankami gospodarza przeprowadzono również w 8-dniowych zarodkach (HH33). Komórki dawcy przeszczepione na obszar łuku gardłowego badano na 4,5-dniowych zarodkach (HH25) (Ryc. 8A).

3. Wycinanie tkanek, utrwalanie, przetwarzanie i przygotowanie skrawków histologicznych

  1. Rozwarstwienie i utrwalenie
    1. Przygotuj utrwalacz (co najmniej 1 ml/zarodek): etanol 100%-formaldehyd 37%-lodowaty kwas octowy w stosunku 6:3:1. Wyczyść powierzchnię roboczą, parę mikrokleszczyków, nożyczki chirurgiczne lub nożyczki do tęczówki i łyżkę cedzakową. Napełnij szklaną szalkę Petriego o średnicy 60 mm zimnym PBS i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym.
    2. Otwórz jajko, wycinając taśmę klejącą.
    3. Przetnij błony wokół zarodka i usuń go za pomocą łyżki cedzakowej.
    4. Przenieś zarodek na szalkę Petriego. Jeśli zarodek ma 5 dni (HH26) lub więcej, należy go natychmiast odciąć przed jakąkolwiek manipulacją ex ovo.
    5. Usuń wszelkie pozostałe błony za pomocą mikrokleszczy i nożyczek. Delikatnie wymieszaj próbkę w PBS, aby zmyć wszelkie pozostałe kropelki żółtka.
    6. Jeśli ksenoprzeszczep został wykonany na poziomie skrzydła, odrzuć głowę. Jeśli komórki zostały przeszczepione do obszaru głowowego, odetnij i odrzuć dolną połowę ciała, upewniając się, że obszar serca pozostaje nienaruszony.
    7. Przenieść każdą próbkę do oddzielnej probówki o pojemności 2,0 ml zawierającej 1 ml utrwalacza. Zidentyfikuj rurki pojedynczo, tak jak poprzednio (Rysunek 4B). Inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C z mieszaniem.
    8. Użyj osadu komórek lub sferoidów (Rysunek 4F) jako kontroli pozytywnej. W tym celu odwirować zawiesinę komórkową (krok 1.5) lub sferoidy komórkowe (krok 1.10) w temperaturze 180 × g przez 10 minut w probówce o pojemności 1,5 ml, wyrzucić pożywkę hodowlaną i dodać 1 ml utrwalacza bez naruszania osadu. Inkubować probówkę przez noc w temperaturze 4 °C bez mieszania i postępować w taki sam sposób, jak w przypadku próbek piskląt.
  2. Odwodnienie i osadzanie
    1. Odwodnić zarodki przez kolejne płukania 1 ml 70%, 80%, 90% i 100% etanolu w 1x PBS przez co najmniej 1 godzinę każde z mieszaniem.
    2. Próbki inkubować przez noc w 1 ml 100% etanolu w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
    3. Próbki inkubować w 1 ml 100% ksylenu przez 1 godzinę w dygestorium. Powtórz jeszcze dwa razy.
    4. Przenieść zawartość probówki do bloku barwiącego i wyrzucić ksylen. Dodaj tyle stopionej parafiny, aby przykryć zarodek i przykryj blok barwiący szklaną pokrywką. Inkubować przez noc w suszarce o temperaturze 65 °C.
    5. Przygotuj ciepłą płytę i formę do bloków parafinowych do zatapiania.
      UWAGA: Para rozciągniętych spinaczy do papieru jest przydatna do pozycjonowania zarodka.
    6. Napełnij formę stopioną parafiną i przenieś do niej zarodek. Ustaw zarodek tak, aby uzyskać poprzeczny przekrój tułowia (Ryc. 5A) lub przekrój czołowy głowy (Ryc. 8A).
    7. Włóż papierową plakietkę z nazwą do parafiny, naprzeciwko powierzchni, która ma być cięta, aby pomóc przeciąć zarodek we właściwej orientacji (Rysunek 4C).
    8. Jeśli jest używany, umieść kasetę do zatapiania na próbce. Poczekaj, aż blok całkowicie ostygnie przed wyjęciem go z formy. Alternatywnie, przymocuj utwardzony blok parafiny do kasety lub innego uchwytu bloku za pomocą stopionej parafiny i pozwól mu ponownie ostygnąć.
  3. Cięcia
    1. Przygotuj materiały do cięcia. Rozgrzej gorącą płytę do temperatury 42 °C i przykryj karton lub płytę styropianową czystą folią aluminiową o wymiarach około 30 cm x 20 cm. Wyczyść wszystkie powierzchnie przed użyciem.
      UWAGA: Używaj rękawiczek, aby uniknąć zanieczyszczenia nukleazami, zwłaszcza jeśli niektóre sekcje będą używane do hybrydyzacji RNA in situ. Z tego samego powodu należy unikać używania kąpieli histologicznej do rozciągania skrawków parafiny, chyba że woda i powierzchnie mogą być wcześniej dokładnie oczyszczone.
    2. Odetnij nadmiar parafiny za pomocą ostrza do mikrotomu. Utwórz skos po obu stronach, w kształcie trapezu, aby łatwo oddzielić każdą sekcję za pomocą ostrza skalpela w późniejszym kroku (Rysunek 3A).
    3. Przymocuj blok do mikrotomu. Ostrożnie ustaw blok, aby upewnić się, że lewa i prawa strona są równoległe do siebie. Wykonaj dokładniejszą regulację po wycięciu kilku odcinków próbki i obserwacji ich pod mikroskopem.
    4. Po osiągnięciu obszaru docelowego (zawiązka kończyny lub pierwszego łuku gardłowego) wytnij odcinki 7 μm i umieść wstęgi parafinowe na płytce pokrytej folią aluminiową. Przekrój cały region docelowy (Rysunek 4C).
    5. W celu przygotowania odcinków seryjnych należy pokryć odpowiednią liczbę szkiełek szkiełkowych kroplami sterylnej wody dejonizowanej. Przenoś poszczególne sekcje na szkiełka sekwencyjnie, za pomocą szczotek i skalpela. Przenieś sąsiednie sekcje na różne slajdy, aby utworzyć sekcje szeregowe (Rysunek 4D). Przygotuj serię 3 szkiełek dla 3,5-dniowych zarodków, 4 szkiełek dla 4,5-dniowego dziecka i 5 szkiełek dla 6-dniowych zarodków. Zabarwić sąsiednie odcinki różnymi sondami, przeciwciałami lub klasycznymi barwnikami histologicznymi.
      UWAGA: Ta sama seria może zawierać wiele sąsiadujących ze sobą szkiełek, jeśli duża część zarodka zostanie podzielona na sekcje. Na każdy slajd można przenieść wiele sekcji, zachowując pewną przestrzeń między sekcjami, aby umożliwić ich rozciągnięcie. Nie kładź jeszcze szkiełka na ciepłej płycie.
    6. Po przeniesieniu wszystkich sekcji na zjeżdżalnie dodaj więcej wody, aż wszystkie sekcje będą unosić się nad jedną kroplą wody. Umieść szkiełko na ciepłym talerzu i pozwól sekcjom się rozciągnąć. Zdejmij szkiełko z ciepłej płyty i usuń wodę, ostrożnie przechylając szkiełko do bibuły.
      UWAGA: Nie pozwól, aby sekcje bezpośrednio dotykały szkiełka przed rozciągnięciem.
    7. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

4. Synteza sond Alu znakowanych digoksygeniną metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

  1. Przygotuj roztwór podstawowy następujących starterów specyficznych dla człowieka39: AluFw: 5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3' i AluRev: 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'.
  2. Przygotuj 50 μl następującej reakcji PCR40: 1x bufor PCR, 2,0 mM MgCl2, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dATP, 0,065 mM dTTP, 0,035 mM dig-11-dUTP, 0,4 μM AluFw startery, 0,4 μM AluRev startery, 0,05 U/μL polimerazy Taq i 1 ng/μL ludzkiego genomowego DNA.
  3. Uruchom PCR przy użyciu następujących ustawień: początkowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 4 minuty, a następnie 40 cykli w temperaturze 94 °C przez 20 s, 60 °C przez 20 s i 72 °C przez 20 s, a następnie końcowa denaturacja w temperaturze 72 °C przez 5 minut.
  4. Zmierz stężenie sondy za pomocą spektrofotometru. Przechowuj sondy w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Produkt PCR powinien mieć 200-300 pz długo po elektroforezie w 2% żelu agarozowym29.

5. Hybrydyzacja sekcji in situ z sondami Alu

  1. Dzień 1: Permeabilizacja i hybrydyzacja
    UWAGA: Do wszystkich czynności wykonywanych w dniu 1 należy używać wysterylizowanego szklanego słoika szkiełkowego.
    1. Rozgrzej jedno pranie PBT (0,1% Tween 20 w PBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przygotuj wilgotną komorę z 50% formamidu/50% wodą dejonizowaną.
      UWAGA: Oblicz objętość wszystkich prań na podstawie rozmiaru szklanego słoika. O ile nie określono inaczej, wszystkie płukania wykonuje się przez zanurzenie szkiełek w roztworze.
    2. Usunąć parafinę przez trzy kolejne płukania ksylenem, każde po 5 minut, w dygestorium.
    3. Ponownie nawodnij serię przez dwa prania w 100% etanolu przez 5 minut każde, a następnie pranie 90/70/30% etanolem w PBS przez 2 minuty każde.
    4. Pierz w PBT (0,1% Tween 20 w PBS) trzy razy po 5 minut każdy.
    5. W celu zapewnienia przepuszczalności należy dodać 2 μg/ml proteinazy K do podgrzanego PBT, zanurzyć szkiełka w roztworze i inkubować je przez 14 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    6. Utrwalić skrawki przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie/PBS na 20 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Myć PBS przez 5 min.
    8. Po wytarciu nadmiaru PBS z każdego szkiełka, przykryj skrawki 300 μl buforu hybrydyzacyjnego (50% dejonizowanego formamidu, 4x SSC pH 5,0, 1x roztwór Denhardta, 5% siarczan dekstranu, 100 μg/ml DNA plemników łososia) (Tabela 1). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 42 °C w komorze formamidu.
    9. Przygotować roztwór 0,2 ng/ml sondy Alu w buforze hybrydyzacyjnym. Przechylić szkiełko, aby usunąć bufor hybrydyzacyjny i dodać 120 μl roztworu sondy Alu na sekcje. Przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym, uważając, aby nie powstały bąbelki.
      UWAGA: Na tym etapie nie należy używać parafilmu do przykrywania szkiełek, ponieważ topi się on w temperaturach powyżej 70 °C.
    10. Podgrzej szkiełka na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C przez 5 min.
      UWAGA: Nie wdychać oparów formamidu.
    11. Inkubować szkiełka w temperaturze 42 °C w komorze formamidu przez noc.
  2. Dzień 2: Mycie rygorystyczne i immunohistochemia
    1. Przygotować 20 razy bufor SSC (3 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu, pH 7,5) (Tabela 1). Podgrzej dwa razy więcej niż 0,1 x solony bufor cytrynianu sodu (SSC) o pH 7,5 do temperatury 42 °C.
    2. Napełnij szklany słoik szkiełkowy 2x buforem SSC, pH 7,5. Delikatnie umieść szkiełka w roztworze i poczekaj, aż szkiełka nakrywkowe same się oderwą. Usunąć szkiełka nakrywkowe za pomocą szczypiec i inkubować szkiełka w buforze 2x SSC przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Ponownie umyć szkiełka 2x buforem SSC, pH 7,5, przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Umyć szkiełka dwukrotnie 0,1x buforem SSC o pH 7,5 w temperaturze 42 °C przez 5 minut każde.
    5. Przemyć szkiełka dwukrotnie MABT (bufor kwasu maleinowego z Tween; 0,1 M kwas maleinowy, 0,15 M chlorek sodu, 0,1% Tween 20, pH 7,5) (Tabela 1) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Wytrzeć nadmiar buforu z każdego szkiełka i przykryć sekcje 400 μl roztworu blokującego (10% inaktywowanej normalnej surowicy koziej, 2% odczynnika blokującego w MABT). Inkubować przez 2 godziny w wilgotnej komorze (przygotowanej z wodą dejonizowaną) w temperaturze pokojowej.
    7. Przechylić szkiełka, aby usunąć płyn i dodać 150 μl fragmentów anty-DIG Fab sprzężonych z fosfatazą alkaliczną w rozcieńczeniu 1:2,000 w roztworze blokującym. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym lub parafilmem i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez 16 godzin.
  3. Dzień 3: Rozwój koloru
    1. Delikatnie usunąć szkiełka nakrywkowe lub parafilm z słoika z MABT (jak w kroku 5.2.2) i inkubować szkiełka w MABT przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Umyj MABT jeszcze trzy razy po 30 minut każdy.
    3. Przemywać MAB (bufor kwasu maleinowego; 0,1 M kwas maleinowy, 0,15 M chlorek sodu, pH 7,5) (Tabela 1) przez 30 min.
    4. Przemyć dwa razy NTM (bufor NaCl-Tris-MgCl2; 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM chlorek sodu, 50 mM chlorek magnezu) (Tabela 1) przez 10 minut każdy.
    5. Dodać roztwór barwiący (0,45 μl/ml chlorku 4-nitro niebieskiego tetrazolu, 3,5 μl/ml fosforanu 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu p-toluidyny w NTM) (Tabela 1) do słoika do barwienia i zanurzyć szkiełka w roztworze. Przykryj słoik folią aluminiową i pozwól kolorowi rozwinąć się przez noc w temperaturze 37 °C.
  4. Dzień 4: Przeciwbarwienie i montaż
    1. Umyj szkiełka trzykrotnie PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut każda.
      UWAGA: Upewnij się, że roztwór barwiący jest prawidłowo utylizowany jako odpad halogenowy.
    2. Zamontuj szkiełka w takiej postaci, w jakiej są, dodając krople wodnego medium montażowego i przykrywając sekcje szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Alternatywnie przejdź do barwienia przeciwstawnego na czerwono szybko jądrowo lub na niebiesko alcyjskim.
    3. Zetrzyj nadmiar PBS i dodaj 500 μl roztworu do barwienia przeciwjądrowego o stężeniu 0,1% red41 (Tabela 1) na sekcje i inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze przez 10 minut. Wskazówka, aby usunąć nadmiar szybkiego jądra czerwonego i przystąp do odwadniania (krok 5.4.5).
    4. Zanurzyć skrawki w 0,5% roztworze błękitu alcian (przeciwbarwienie chrząstki)42 na 10 min; płukać w wodzie destylowanej i inkubować w 1% kwasie fosfomolibdynowym przez 10 min. Ponownie spłukać wodą i przystąpić do odwadniania.
      UWAGA: Jeśli pominięto płukanie kwasem fosfomolibdenowym, błękit alciański staje się jądrowym barwnikiem przeciwstawnym.
    5. Odwodnić w etanolu 70/95/100/100% przez 5 minut.
    6. Umyć ksylenem trzy razy przez 5 minut za każdym razem w dygestorium.
    7. Mocować za pomocą podłoża montażowego na bazie ksylenu i szklanych szkiełek nakrywkowych.
    8. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez co najmniej 16 godzin w dygestorium.

6. Akwizycja obrazu

  1. Po dokładnym wysuszeniu zamontowanych szkiełek zbadaj wszystkie sekcje pod kątem obecności przeszczepionych komórek ludzkich za pomocą pionowego mikroskopu jasnego pola (Rysunek 4E). Poszukaj niebiesko-fioletowych komórek Alu-dodatnich ( Rysunek 4F,G) i zaznacz sekcje zawierające komórki Alu-dodatnie za pomocą markera (Rysunek 4E).
    UWAGA: Oznaczenie sekcji komórkami Alu-dodatnimi ułatwi ich odnalezienie podczas fotografowania i porównywania sąsiednich slajdów poplamionych innymi markerami.
  2. Należy pamiętać, aby sfotografować skrawki zawierające ksenoprzeszczep w tej samej kolejności, w jakiej są one umieszczone na szkiełku (kierunek przednio-tylny). Nazwij każde zdjęcie, podając wszystkie istotne informacje, takie jak: [data ksenoprzeszczepu]_[typ komórki]_[wiek embrionalny]_[typ sondy]_[numer sekcji]_001. Dołącz pliki metadanych, aby później dodać podziałkę liniową.
  3. Jeśli inne preparaty z tej samej serii są barwione innym markerem, np. hybrydyzacją RNA in situ lub immunohistochemią, sfotografuj i nazwij sąsiednie sekcje (Rysunek 6) w ten sam sposób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Identyfikacja Aludodatnie ADSC w skrawkach histologicznych
Alu sekwencje te są elementami powtarzalnymi, które stanowią około 10% ludzkiego genomu, co czyni je doskonałymi celami do identyfikacji ludzkich komórek w sposób specyficzny gatunkowo43. In situ Hybrydyzację z sondami DNA można wykorzystać do identyfikacji elementów genomowych w skrawkach histologicznych, w tym w pierwotnych komórkach ludzkich

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół (ryc. 1) przedstawia wykonalną opcję badania przesiewowego zachowania pierwotnych populacji komórek ludzkich in vivo, wykorzystując zarodki piskląt jako model. W artykule opisano tworzenie sferoid komórkowych (ryc. 2), przeszczepienie sferoidy do zarodka pisklęcia (ryc. 3), przetwarzanie próbek i hybrydyzację in situ (ryc. 4), reprezentatywne wyniki ludzkich ADSC...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Universidade Federal de Rio de Janeiro (UFRJ dla J.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq dla J.B.) oraz Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ dla J.B.). Dziękujemy firmie T. Jaffredo (CNRS, Paryż, Francja) za sondę Runx2 (Cbfa1). Przeciwciało HNK1 uzyskano z Developmental Studies Hybridoma Bank opracowanego pod auspicjami NICHD i utrzymywanego przez The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242 USA. Dziękujemy V. Moura-Neto za udzielenie dostępu do mikrotomu oraz R. Lentowi za udzielenie dostępu do mikroskopu. Dziękujemy firmie E. Steck za pomoc w syntezie sond Alu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zwierzęta
jaja Gallus gallusGranja Tolomeibez SPFKurczak biały leghorn
Odczynniki
Alcian Blue 8GXSigma-aldrichA5268
Podkłady AluFwSigma-aldrichOLIGO 5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG Karabin AGG T-3'
Podkłady AluRevSigma-aldrichOLIGO 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'
Siarczan glinuSigma-aldrich368458Do przygotowania szybkiego czerwonego roztworu jądrowego
Anty-Digoxigenin-AP, fragmenty FabIdentyfikator rejestru przeciwciałRoche11093274910
Przeciwciało anty-Human Natural Killer 1 (HNK1, CD57)Badania rozwojowe Identyfikator rejestru przeciwciał Hybridoma Bank3H5: AB_2314644
Anty-mysz, koza IgM-HRPSanta Cruz Biotechnologiasc-2973Identyfikator rejestru przeciwciał: AB_650513
anty-mysie, kozie IgG (H+L)-HRPNovexG-21040Identyfikator rejestru przeciwciał: AB_2536527
Przeciwciało przeciw aktynie mięśni gładkich/ACTA2Identyfikator rejestru przeciwciałDakoM085129
AquatexMerck1085620050Wodny środek montażowy
Fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolylu Sól p-toluidyny (BCIP)Sigma-aldrichB8503-100MG
Odczynnik blokującyRoche11096176001
Kwas cytrynowyVETEC238Do przygotowania buforu SSC
Kolagenaza typu IASigma-aldrichSCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP zestawRoche11969064001
Denhardt roztwór 50XInvitrogen750018Do przygotowania buforu hybrydyzacyjnego
Sól sodowa siarczanu dekstranuThermo Scientific15885118Do przygotowania buforu hybrydyzacyjnego
Mieszanka do znakowania DIG RNA11277073910zawiera Dig-11-dUTP
DMEM o niskiej zawartości glukozySigma-aldrichD5523
3,3′-diaminobenzydyny (DAB)Sigma-aldrichD5905-50TAB
N,N-Dimethylformamide (DMF)Sigma-aldrich227056Do przygotowania roztworu NBT i BCIP
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-aldrichE6758Do przygotowania roztworu trypsyny
Entellan newMerck107961Niewodne podłoże montażowe
EtanolProquí miosN/A
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher12657029Inaktywowana w temperaturze 56 & C przed użyciem
Formaldehyd 37% roztwórProquí miosN/A
FormamidVetecV900064
Lodowaty kwas octowyProquí miosN/A
India tuszPelikan221143
roztwór L-glutaminy (200 mM)Gibco25030-149
Chlorek magnezuMerck8147330100Do przygotowania buforu NTM
Kwas maleinowySigma-aldrichM0375-500GDo przygotowania buforu MAB
MetanolProquí mios
Normalna surowica koziaSigma-aldrichNS02LInaktywowana w 56 & stopniach; C przed użyciem
4-nitro niebieski chlorek tetrazolowy (NBT)Roche11585029001
Jądrowa szybka czerwieńSigma-aldrich60700
Paraplast PlusSigma-aldrichP3558
Sól sodowa penicyliny GSigma-aldrichP3032
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Sigma-aldrichP3813
Kwas fosfomolibdenowyMerck100532
Proteinaza KGibco BRL25530-015
DNA plemników łososiaInvitrogen15632011Do przygotowania buforu hybrydyzacyjnego
Chlorek soduSigma-aldrichS9888Do przygotowania buforu SSC, MAB i NTM
Siarczan streptomycynySigma-aldrichS6501
Zestaw polimerazy TaqCenbiot EnzimasN/A
Tris-HClSigma-aldrichT5941
TrypsynaSigma-aldrichT4799
Tween 20Sigma-aldrichP1379
KsylenProquí miosN/A
Mikroskop i urządzenia
Mikroskop pionowy AxioplanCarl Zeiss MicroscopyN/A
Oprogramowanie AxiovisionCarl Zeiss MicroscopyN/A
Inkubator komórekThermoForma3110
Inkubator jaj - 50 jajGP
Lampa na gęsiej szyiBiocamN/ADo manipulacji jajami
oprogramowanie Fidżi; Wtyczka licznika komórekImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Kaptur z przepływem laminarnymTROX1385
Nanodrop LiteThermoScientific ND-LITE-PR
Mikrotom obrotowyLeica BiosystemsRM2125 RTSDo cięcia
Mikroskop stereoskopowyLabomedLuxeo 4DDo manipulacji
jajamiPiec do sterylizacjiREALIS7261690Do sterylizacji materiałów chirurgicznych
Consumables
0,2 mL (PCR) polipropylenowe probówki wirówkoweEppendorf30124707
15 mL polipropylenowe stożkowe probówkiCorningCLS430791
1,5 ml polipropylenowe probówkiAxygenMCT-150-C
2 ml polipropylenowe probówkiAxygenMCT-200-C
50 ml polipropylenowe stożkowe probówkiCorningCLS430829
Końcówki barierowe (filtracyjne), 200 μ Rozmiar LInvitrogenAM12655Do manipulacji jajami
Wydobyty blok szklany (bloczek witrażowy) ze szkłem osłonowymHecht Karl 42020010
Kasety do zatapianiaSimportM480Używany jako uchwyt bloku parafinowego
Szkiełka nakrywkowe szklane, 24 x 40 mmKasviK5-2440
Szklane pipety Pasteura 230 mmNORMAX5426023Do przygotowania szklanych naczyń włosowatych
MikrotomyLeica BiosystemsHIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818Do cięcia
Parafilm MParafilmP7793
Plastikowa szalka Petriego, 30 mmKasviK13-0035Do manipulacji jajami
Plastikowa szalka Petriego, 60 mmProlab0303-8Do przygotowania sferoid komórkowych. Nie powinien być leczony z powodu zrostu komórek. 
Szkiełka ze szkła silanizowanego (Starfrost)Knittel Glass198Do cięcia
strzykawki 1 ml , Igły 26 G (0,45 x 13 mm)Descarpack32972Do manipulacji jajami (aspiracja białka)
Narzędzia chirurgiczne
Rurka aspiratoraDrummond2-000-000Do manipulacji jajami
NożyczkipreparacyjneFine Science Tools14061-11Do manipulacji jajami
Mikrokleszcze (pęseta)Fine Science Tools00108-11Do manipulacji jajami i przygotowania szklanych naczyń włosowatych
Uchwyt na igłę (regulowany uchwyt do igły do preparowania)Fisherbrand8955Do manipulacji jajami
Osełka olejowa, ziarnistość 10.000N/AN/ADo ostrzenia igieł
Para małych Pędzle malarskieN/AN/DDo obróbki sekcji parafinowych. Można użyć dowolnej marki.
Igły do szyciaN/AN/ADo ostrzenia mikroskalpeli. Można użyć dowolnej marki.
Sterylny skalpel jednorazowy nr 23Swann-Norton110Do cięcia
Rękojeść skalpela chirurgicznegoSwann-Norton914Do cięcia
Nożyczki do tęczówki Wecker, ostre/ostreSurtexSS-641-11Do manipulacji jajami
: AB_514497 Przeciwciała : AB_2811108 Roche wirówkowe wirówkowe wirówkowe wirówkowe

Bibliografia

  1. Herbert, K. E., Lévesque, J. P., Haylock, D. N., Prince, M. The use of experimental murine models to assess novel agents of hematopoietic stem and progenitor cell mobilization. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 14 (6), 603-621 (2008).
  2. Parada-Kusz, M., et al. Generation of mouse-zebrafish hematopoietic tissue chimeric embryos for hematopoiesis and host-pathogen interaction studies. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (11), (2018).
  3. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  4. Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicological Research. 30 (1), 1-5 (2014).
  5. Ben-David, U., et al. Patient-derived xenografts undergo mouse-specific tumor evolution. Nature Genetics. 49 (11), 1567-1575 (2017).
  6. le Douarin, N., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. Cambridge. (1999).
  7. Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).
  8. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  9. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  10. Douarin, N., et al. le et al. Evidence for a thymus-dependent form of tolerance that is not based on elimination or anergy of reactive T cells. Immunological Reviews. 149 (1), 35-53 (1996).
  11. Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), e2071(2010).
  12. Goldstein, R. S. Transplantation of human embryonic stem cells and derivatives to the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 584, 367-385 (2010).
  13. Akhlaghpour, A., et al. Chicken interspecies chimerism unveils human pluripotency. Stem Cell Reports. 16 (1), 39-55 (2021).
  14. Kulesa, P. M., Morrison, J. A., Bailey, C. M. The neural crest and cancer: A developmental spin on melanoma. Cells Tissues Organs. 198 (1), 12-21 (2013).
  15. Hendrix, M. J. C., et al. Reprogramming metastatic tumour cells with embryonic microenvironments. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 246-255 (2007).
  16. Singer, N. G., Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells: Mechanisms of inflammation. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6, 457-478 (2011).
  17. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: Revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  18. Griffin, M. D., et al. Concise review: Adult mesenchymal stromal cell therapy for inflammatory diseases: How well are we joining the dots. Stem Cells. 31 (10), 2033-2041 (2013).
  19. Owen, M., Friedenstein, A. J. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Foundation Symposium. 136, 42-60 (1988).
  20. Bianco, P., Robey, P. G., Saggio, I., Riminucci, M. "Mesenchymal" stem cells in human bone marrow (skeletal stem cells): A critical discussion of their nature, identity, and significance in incurable skeletal disease. Human Gene Therapy. 21 (9), 1057-1066 (2010).
  21. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  22. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  23. Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: Localization, morphology and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
  24. Zannettino, A. C. W., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214 (2), 413-421 (2008).
  25. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (9), 2806-2812 (2012).
  26. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  27. Baptista, L. S., et al. marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: How close are they. Journal of Stem Cells. , 73-90 (2007).
  28. Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS ONE. 8 (12), 84206(2013).
  29. Cordeiro, I. R., et al. Chick embryo xenograft model reveals a novel perineural niche for human adipose-derived stromal cells. Biology Open. 4 (9), 1180-1193 (2015).
  30. Santos, R. deA., et al. Intrinsic angiogenic potential and migration capacity of human mesenchymal stromal cells derived from menstrual blood and bone marrow. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 1-23 (2020).
  31. Menezes, A., et al. Live cell imaging supports a key role for histone deacetylase as a molecular target during glioblastoma malignancy downgrade through tumor competence modulation. Journal of Oncology. 2019, 9043675(2019).
  32. Brito, J. M., Teillet, M. A., le Douarin, N. M. Induction of mirror-image supernumerary jaws in chicken mandibular mesenchyme by Sonic Hedgehog-producing cells. Development. 135 (13), 2311-2319 (2008).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments JoVE. (51), e2720(2011).
  34. de Barros, A. P. D. N., et al. Osteoblasts and bone marrow mesenchymal stromal cells control hematopoietic stem cell migration and proliferation in 3D in vitro model. PLoS One. 5 (2), 9093(2010).
  35. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1951).
  36. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  37. Tickle, C. How the embryo makes a limb: Determination, polarity and identity. Journal of Anatomy. 227 (4), 418-430 (2015).
  38. Couly, G., Grapin-Botton, A., Coltey, P., le Douarin, N. M. The regeneration of the cephalic neural crest, a problem revisited: The regenerating cells originate from the contralateral or from the anterior and posterior neural fold. Development. 122 (11), 3393-3407 (1996).
  39. Walker, J. A., et al. Human DNA quantitation using Alu element-based polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 315 (1), 122-128 (2003).
  40. Steck, E., Burkhardt, M., Ehrlich, H., Richter, W. Discrimination between cells of murine and human origin in xenotransplants by species specific genomic in situ hybridization. Xenotransplantation. 17 (2), 153-159 (2010).
  41. Sams, A., Davies, F. M. R. Commercial varieties of nuclear fast red. Stain Technology. 42 (6), 269-276 (1967).
  42. Lison, L. Alcian blue 8 g with chlorantine fast red 5 B. A technic for selective staining of mucopolysaccharides. Biotechnic and Histochemistry. 29 (3), 131-138 (1954).
  43. Cordaux, R., Batzer, M. A. The impact of retrotransposons on human genome evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 691-703 (2009).
  44. Brüstle, O., et al. Chimeric brains generated by intraventricular transplantation of fetal human brain cells into embryonic rats. Nature Biotechnology. 16 (11), 1040-1044 (1998).
  45. Warncke, B., Valtink, M., Weichel, J., Engelmann, K., Schäfer, H. Experimental rat model for therapeutic retinal pigment epithelium transplantation - Unequivocal microscopic identification of human donor cells by in situ hybridisation of human-specific Alu sequences. Virchows Archiv. 444 (1), 74-81 (2004).
  46. Kasten, P., et al. Ectopic bone formation associated with mesenchymal stem cells in a resorbable calcium deficient hydroxyapatite carrier. Biomaterials. 26 (29), 5879-5889 (2005).
  47. Baptista, L., et al. Adipose tissue of control and ex-obese patients exhibit differences in blood vessel content and resident mesenchymal stem cell population. Obesity Surgery. 19 (9), 1304-1312 (2009).
  48. Christ, B., Huang, R., Scaal, M. Formation and differentiation of the avian sclerotome. Anatomy and Embryology. 208 (5), 333-350 (2004).
  49. Scaal, M., Christ, B. Formation and differentiation of the avian dermomyotome. Anatomy and Embryology. 208 (6), 411-424 (2004).
  50. Tucker, G. C., Delarue, M., Zada, S., Boucaut, J. C., Thiery, J. P. Expression of the HNK-1/NC-1 epitope in early vertebrate neurogenesis. Cell and Tissue Research. 251 (2), 457-465 (1988).
  51. Creuzet, S., Schuler, B., Couly, G., le Douarin, N. M. Reciprocal relationships between Fgf8 and neural crest cells in facial and forebrain development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4843-4847 (2004).
  52. Charrier, J. B., Lapointe, F., le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Dual origin of the floor plate in the avian embryo. Development. 129 (20), 4785-4796 (2002).
  53. Kordes, U., Cheng, Y. C., Scotting, P. J. Sox group e gene expression distinguishes different types and maturational stages of glial cells in developing chick and mouse. Developmental Brain Research. 157 (2), 209-213 (2005).
  54. Stricker, S., Fundele, R., Vortkamp, A., Mundlos, S. Role of Runx genes in chondrocyte differentiation. Developmental Biology. 245 (1), 95-108 (2002).
  55. Grottkau, B. E., Lin, Y. Osteogenesis of adipose-derived stem cells. Bone Research. 1 (2), 133(2013).
  56. Culling, C. F. A. Handbook of histopathological and histochemical techniques. Including museum techniques. , Elsevier. (1974).
  57. Francis, P. H., Richardson, M. K., Brickell, P. M., Tickle, C. Bone morphogenetic proteins and a signalling pathway that controls patterning in the developing chick limb. Development. 120 (1), 209-218 (1994).
  58. Huber, K., et al. Persistent expression of BMP-4 in embryonic chick adrenal cortical cells and its role in chromaffin cell development. Neural Development. 3, 28(2008).
  59. Pouget, C., Gautier, R., Teillet, M. A., Jaffredo, T. Somite-derived cells replace ventral aortic hemangioblasts and provide aortic smooth muscle cells of the trunk. Development. 133 (6), 1013-1022 (2006).
  60. Kirby, M. L., Hutson, M. R. Factors controlling cardiac neural crest cell migration. Cell Adhesion and Migration. 4 (4), 609-621 (2010).
  61. Isern, J., et al. The neural crest is a source of mesenchymal stem cells with specialized hematopoietic stem cell niche function. eLife. 3, 03696(2014).
  62. Yamazaki, S., et al. Nonmyelinating schwann cells maintain hematopoietic stem cell hibernation in the bone marrow niche. Cell. 147 (5), 1146-1158 (2011).
  63. Carr, M. J., et al. Mesenchymal precursor cells in adult nerves contribute to mammalian tissue repair and regeneration. Cell Stem Cell. 24 (2), 240-256 (2019).
  64. Walker, J. A., et al. Quantitative intra-short interspersed element PCR for species-specific DNA identification. Analytical Biochemistry. 316 (2), 259-269 (2003).
  65. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  66. Yong, K. S. M., Her, Z., Chen, Q. Humanized mice as unique tools for human-specific studies. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 66 (4), 245-266 (2018).
  67. Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025(2020).
  68. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  69. Puente, B. N., et al. The oxygen-rich postnatal environment induces cardiomyocyte cell-cycle arrest through DNA damage response. Cell. 157 (3), 565-579 (2014).
  70. Colton, C. K. Implantable biohybrid artificial organs. Cell Transplantation. 4 (4), 415-436 (1995).
  71. Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ludzkie kom rki macierzystemigracja kom rekr nicowanie kom rekhybrydyzacja in situsondy Aluci cie w parafinietransplantacja zarodkowa

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.