Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Kilka ważnych enzymów mitochondrialnych i cząsteczek sygnałowych podlega regulacji tiolowej redoks¹. Co więcej, mitochondria są głównym komórkowym źródłem reaktywnych form tlenu i są selektywnie podatne na uszkodzenia oksydacyjne². W związku z tym mitochondrialny potencjał redoks bezpośrednio wpływa na bioenergetykę, sygnalizację komórkową, funkcję mitochondriów i ostatecznie żywotność komórki^3,4. Macierz mitochondrialna zawiera duże ilości (1-15 mM) buforu redoks disiarczku tiolu glutationu (GSH) w celu utrzymania homeostazy redoks i wzmocnienia obrony antyoksydacyjnej5^,6. GSH może być kowalencyjnie przyłączany do białek docelowych (S-glutationylacja) w celu kontrolowania ich statusu i aktywności redoks i jest wykorzystywany przez szereg enzymów detoksykujących, które redukują utlenione białka. Dlatego potencjał redoks mitochondriów glutationu jest parametrem wysoce informacyjnym podczas badania funkcji i patofizjologii mitochondriów.

roGFP2 to wariant GFP, który stał się wrażliwy na redoks poprzez dodanie dwóch powierzchniowo wystawionych cystein, które tworzą sztuczną parę ditiol-dwusiarczek^7,8. Ma pojedynczy pik emisyjny przy ~510 nm i dwa piki wzbudzenia przy ~400 nm i 490 nm. Co ważne, względne amplitudy dwóch pików wzbudzenia zależą od stanu redoks roGFP2 (Rysunek 1), co czyni to białko czujnikiem ratiometrycznym. W czujniku Grx1-roGFP2 ludzka glutaredoksyna-1 (Grx1) została połączona z N-końcem roGFP2^9,10. Kowalencyjne przyłączenie enzymu Grx1 do roGFP2 zapewnia dwie główne ulepszenia czujnika: sprawia, że odpowiedź czujnika jest specyficzna dla pary redoks glutationu GSH/GSSG (Rysunek 1) i przyspiesza równowagę między GSSG i roGFP2 o współczynnik co najmniej 100 000⁹. Dlatego Grx1-roGFP2 umożliwia specyficzne i dynamiczne obrazowanie komórkowego potencjału redoks glutationu.

Obrazowanie Grx1-roGFP2 można wykonać na szerokiej gamie mikroskopów, w tym na mikroskopach fluorescencyjnych o szerokim polu, mikroskopach konfokalnych z wirującym dyskiem i laserowych skaningowych mikroskopach konfokalnych. Ekspresję czujnika w neuronach pierwotnych można osiągnąć za pomocą różnych metod, które obejmują lipofekcję¹¹, koprecypitację DNA/fosforanu wapnia¹², transfer genów za pośrednictwem wirusa lub wykorzystanie zwierząt transgenicznych jako źródła komórek (Rysunek 2). W eksperymentach w tym artykule użyto pseudotypowanych rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusem (rAAV) zawierających 1:1 proporcji białek kapsydu AAV1 i AAV2 ^13,14. W przypadku tego wektora maksymalna ekspresja czujnika jest zwykle osiągana 4-5 dni po zakażeniu i pozostaje stabilna przez co najmniej dwa tygodnie. Z powodzeniem zastosowaliśmy Grx1-roGFP2 w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej myszy i szczurów.

W tym artykule, ekspresja Grx1-roGFP2 ukierunkowanego na mitochondria w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej szczura jest używana do oceny podstawowego mitochondrialnego stanu redoks glutationu i jego ostrego zaburzenia za pośrednictwem rAAV. Dostępny jest protokół konfokalnego obrazowania na żywo ze szczegółowymi instrukcjami, jak (i) zoptymalizować ustawienia laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, (ii) przeprowadzić eksperyment z obrazowaniem na żywo oraz (iii) analizować dane za pomocą FIJI.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi, w tym z Dyrektywą Rady 2010/63/UE Parlamentu Europejskiego, i uzyskały pełną aprobatę etyczną Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (Urząd ds. Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu w Heidelbergu i Regierungspraesidium Karlsruhe, licencje T14/21 i T13/21). Pierwotne neurony hipokampa i kory mózgowej zostały przygotowane z nowonarodzonych szczeniąt myszy lub szczurów zgodnie ze standardowymi procedurami i były utrzymywane przez 12-14 dni, jak opisano wcześniej¹³.

1. Przygotowanie roztworów

1. Roztwory podstawowe do bufora obrazowania
   1. Przygotować każdy roztwór podstawowy zgodnie z tabelą 1 i przechowywać go w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania (>3 miesiące) podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

Tabela 1: Roztwory podstawowe dla bufora do obrazowania.

2. Roztwory podstawowe leków i barwników
   1. Rozpuścić diamid (DA; używany do kalibracji maksymalnego stosunku 405:488) w wodzie, aby otrzymać 0,5 M roztwór podstawowy (np. 1 g w 11,615 ml wody). Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   2. Rozpuścić ditiotreitol (DTT; używany do kalibracji minimalnego stosunku 405:488) w wodzie, aby otrzymać 1 M roztwór podstawowy (np. 5 g w 32,425 ml wody). Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C maksymalnie przez 3 miesiące.
   3. Rozpuścić N-metylo-D-asparaginian (NMDA; stosowany do indukowania ekscytotoksyczności i utleniania mitochondriów) w wodzie, aby otrzymać 10 mM roztwór podstawowy (np. 25 mg w 16,991 ml wody). Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania (>6 miesięcy) podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
   4. Nadchloran estru etylowego tetrametylorodaminy (TMRE; małocząsteczkowy wskaźnik potencjału błony mitochondrialnej)
      1. Rozpuścić proszek TMRE w metanolu, aby uzyskać 20 mM zapasu (np. 25 mg w 2,427 ml metanolu).
      2. Rozcieńczyć zapas 20 mM w stosunku 1:1,000 w metanolu, aby uzyskać zapas 20 μM.
      3. Roztwory podstawowe 20 mM i 20 μM podatkować podlać, uszczelnić parafilmem i przechowywać w temperaturze -20 °C.
         UWAGA: Oba roztwory podstawowe są stabilne przez kilka lat. Użyj 1,000x roztworu podstawowego (20 μM) do eksperymentów.
3. Bufor obrazowania
   1. Przygotować 100 ml buforu do obrazowania, dodając wszystkie składniki z tabeli 2 do 80 ml sterylnej wody w cylindrze miarowym. Doprowadzić objętość do 100 ml sterylną wodą. Mieszać, ostrożnie potrząsając cylindrem miarowym, aż roztwór stanie się jednorodny.
      UWAGA: Zaleca się użycie osmometru do sprawdzenia osmolarności buforu. Powinien znajdować się jak najbliżej pożywki wzrostowej komórek. W tym przypadku jest to 315 mOsmol/L. Zwiększ lub zmniejsz stężenie sacharozy w zależności od potrzeb, aby dopasować osmolarność bufora do obrazowania i pożywki wzrostowej.
   2. Dostosować pH do 7,4. Przygotować porcje i przechowywać je w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni. W przypadku długotrwałego przechowywania podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem poczekaj, aż bufor obrazowania osiągnie temperaturę pokojową.

Tabela 2: Skład bufora obrazowania. Wskazane objętości służą do przygotowania 100 ml buforu do obrazowania.

4. Rozwiązania do stymulacji i kalibracji
   UWAGA: Zawsze należy przygotowywać świeże roztwory stymulacyjne, dodając roztwory podstawowe wskazanych leków do buforu obrazowania tuż przed eksperymentem. Roztwory do stymulacji i kalibracji będą dodawane do komory obrazowania sekwencyjnie podczas eksperymentu (patrz punkty 3-5). W zależności od rodzaju eksperymentu, wymagane są różne roztwory, aby osiągnąć to samo stężenie końcowe w odpowiedniej objętości końcowej w komorze obrazowania.
   1. Przygotować 3x roztwór NMDA (90 μM; końcowe stężenie w komorze: 30 μM) dodając 63 μL 10 mM podstawowego NMDA do 6,937 ml buforu obrazowego. Dodać 500 μl powstałego roztworu do komory (końcowa objętość: 1,5 ml).
   2. Przygotować 2x roztwór DA dla kroków 3 i 4 (1 mM; końcowe stężenie w komorze: 0,5 mM), dodając 14 μl 0,5 M daszka do 6,986 ml buforu do obrazowania. Dodać 1 ml do komory (końcowa objętość: 2 ml).
   3. Przygotować 4x roztwór DA dla etapu 5 (2 mM; końcowe stężenie w komorze: 0,5 mM), dodając 28 μl 0,5 M zapasu DA do 6,972 ml buforu obrazowania. Dodać 500 μl do komory (końcowa objętość: 2 ml).
   4. Przygotować 1x roztwór naziemnej telewizji cyfrowej (5 mM; końcowe stężenie w komorze: 5 mM), dodając 45 μl 1 M materiału DTT do 8955 μl buforu obrazowania. Dodać 1 ml tego roztworu do komory po odessaniu buforu obrazowania (końcowa objętość: 1 ml).

2. Wczytywanie komórek za pomocą TMRE

UWAGA: W tym protokole TMRE jest używany w trybie bez wygaszania¹⁵ przy końcowym stężeniu 20 nM. Ogólnie rzecz biorąc, należy stosować najniższe możliwe stężenie TMRE, które nadal zapewnia wystarczającą intensywność sygnału pod wybranym mikroskopem. Ze względu na nierównomierne parowanie objętość podłoża w różnych studniach może się różnić w długoterminowych kulturach pierwotnych. Aby zapewnić stałe stężenie TMRE we wszystkich studzienkach, nie należy dodawać TMRE bezpośrednio do studzienek. Zamiast tego należy zastąpić pożywkę w każdym dołku taką samą ilością pożywki zawierającej TMRE. Poniższy protokół jest przeznaczony dla neuronów pierwotnych w 24-dołkowych płytkach zawierających ~ 1 ml pożywki na dołek.

1. Pracując w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych, zbierz 500 μl pożywki z każdej studzienki do jednej stożkowej probówki.
2. Na dołek dodać 0,5 μl 20 μM wywaru TMRE do stożkowej probówki (np. 12 μL na 24 dołki).
3. Ostrożnie odessać pozostałą pożywkę z pierwszego dołka i zastąpić ją 500 μl pożywki zawierającej TMRE. Kontynuuj, studnia po studni, z pozostałymi studzienkami.
   UWAGA: Uważaj, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek i nie przeszkadzać komórkom.
4. Włóż komórki z powrotem do inkubatora i odczekaj co najmniej 60 minut na wyrównanie barwnika.
   UWAGA: Czas ładowania można wydłużyć do kilku godzin bez negatywnych skutków.
5. Aby zapewnić stałe stężenia i równowagę TMRE w całym eksperymencie obrazowania, należy uwzględnić końcowe stężenie 20 nM TMRE w buforze obrazowania i wszystkich roztworach stymulacyjnych.

3. Optymalizacja ustawień skaningowego mikroskopu konfokalnego

UWAGA: Ten krok ma na celu znalezienie najlepszego kompromisu między jakością obrazu a żywotnością komórek podczas obrazowania na żywo. W tej sekcji opisano optymalizację ustawień obrazowania roGFP. Jeśli przeprowadzane jest obrazowanie wieloparametryczne, należy przeprowadzić podobną optymalizację, w tym sprawdzenie, czy linia bazowa jest stabilna bez oznak bielenia lub fototoksyczności, w odniesieniu do dodatkowych wskaźników.

1. Uruchom mikroskop konfokalny i załaduj standardowe ustawienia do obrazowania GFP (wzbudzenie 488 nm, emisja 505 - 550 nm).
2. Ustaw detektor na 12 bitów lub 16 bitów.
   UWAGA: Zwykle 8 bitów nie wystarcza do obrazowania ilościowego.
3. Aktywuj tryb skanowania sekwencyjnego i dodaj drugą sekwencję/ścieżkę (wzbudzenie 405 nm, emisja 505 - 550 nm).
4. Dla obu kanałów wybierz tabelę wyszukiwania pseudokolorów, która wskazuje prześwietlone i niedoświetlone piksele (np. GLOW OU).
5. Wybierz cel, który jest odpowiedni dla interesującego Cię obiektu.
   UWAGA: 10x-40x nadają się do analizy pojedynczych komórek, 63x-100x nadają się do analizy pojedynczych mitochondriów.
6. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z komórkami w komorze obrazowania, dodaj 1 ml buforu do obrazowania i umieść komorę na mikroskopie.
7. Użyj okularu i przechodzącego światła, aby ustawić ostrość komórek.
   UWAGA: Nie używaj światła epifluorescencyjnego do lokalizowania i ogniskowania komórek. Nawet przy niskiej mocy wpłynie to niekorzystnie na ogniwa.
8. Nagrywaj obrazy w różnych formatach pikseli. Na podstawie tych obrazów wybierz najniższą liczbę pikseli, która daje akceptowalną rozdzielczość interesującej Cię struktury.
   UWAGA: Zazwyczaj piksele 512 x 512 dobrze sprawdzają się w obrazowaniu pojedynczych komórek z obiektywami 20x i 40x, a piksele 1024 x 1024 lub 2048 x2048 zwykle dobrze sprawdzają się w obrazowaniu pojedynczych mitochondriów z obiektywem 63x.
9. Nagrywaj obrazy o różnych rozmiarach otworków. Na podstawie tych obrazów wybierz największy rozmiar otworka, który daje akceptowalną rozdzielczość interesującej Cię struktury.
   UWAGA: Zazwyczaj dobrze sprawdza się 3-7 przewiewnych jednostek.
10. Rejestruj obrazy o różnej intensywności lasera.
    1. Dostosuj odpowiednio wzmocnienie i próg detektora. Na podstawie tych obrazów wybierz najniższą intensywność lasera, która zapewnia akceptowalną intensywność sygnału i stosunek sygnału do tła.
       1. Aby określić stosunek sygnału do tła, zmierz intensywność sygnału w obszarze zainteresowania (ROI), który zawiera komórki lub mitochondria (ROI1) oraz w obszarze zainteresowania bez komórek lub mitochondriów (ROI2). Następnie podziel intensywność ROI1 przez intensywność ROI2.
          UWAGA: Dąż do stosunku sygnału do tła wynoszącego >3 i intensywności sygnału poszczególnych ROI wynoszącej 200-1,000 dla wzbudzenia 405 nm z 1-3% mocą lasera i intensywności indywidualnych ROI 300-1,500 dla wzbudzenia 488 nm z 1% mocą lasera.
11. Rejestruj obrazy z różnymi prędkościami skanowania i średnią liczbą klatek. Nagraj 4-5 obrazów dla każdej kombinacji ustawień. Na podstawie tych serii obrazów wybierz najwyższą szybkość i najniższe średnie ustawienia, które zapewniają akceptowalny szum obrazu i zmienność między obrazami.
    UWAGA: Prędkość skanowania 600 Hz i 1-2 klatki do uśredniania działają dobrze w większości przypadków.
12. Korzystając z nowego szkiełka nakrywkowego, nagraj serię poklatkową ze zoptymalizowanymi ustawieniami.
    UWAGA: Czas trwania i interwał obrazu serii powinny być zbliżone do tych z planowanych eksperymentów.
13. Na koniec serii poklatkowej dodaj 1 ml roztworu 2x DA do komory nagrywania. Obraz przez dodatkowe 2 min.
14. Odessać bufor obrazowania za pomocą pompy perystaltycznej lub pipety ręcznej. Dodaj 1 ml 1x roztwór naziemnej telewizji cyfrowej. Obraz przez dodatkowe 5 min.
15. Przeanalizuj eksperyment poklatkowy (patrz punkt 5).
    1. Sprawdź, czy żaden z dwóch kanałów nie jest prześwietlony lub niedoświetlony podczas leczenia DA i DTT przy zoptymalizowanych ustawieniach.
    2. Upewnij się, że żaden z dwóch kanałów nie wykazuje znacznego wybielenia podczas nagrywania poklatkowego; dąż do utraty intensywności <2% między pierwszym a ostatnim obrazem.
    3. Sprawdź, czy stosunek 405:488 nie zmienia się znacząco podczas obrazowania.
16. Powtórz całą procedurę w sposób iteracyjny, używając kilku szkiełek nakrywkowych, aż zostaną zdefiniowane ustawienia, które konsekwentnie zapewniają akceptowalne wyniki.

4. Ocena podstawowego stanu redoks

1. Uruchom mikroskop i załaduj zoptymalizowane ustawienia z sekcji 3.
2. Ustaw średnią klatek na 3-5.
3. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z komórkami w komorze obrazowania, dodaj 1 ml buforu do obrazowania i umieść komorę na mikroskopie.
4. Użyj okularu i przechodzącego światła, aby ustawić ostrość komórek.
   UWAGA: Nie używaj światła epifluorescencyjnego do lokalizowania i ogniskowania komórek. Nawet przy niskiej mocy wpłynie to niekorzystnie na ogniwa.
5. Przełącz się w tryb skanowania i użyj kanału 488 nm w podglądzie na żywo, aby ustawić ostrość i zlokalizować komórki do obrazowania.
6. Użyj funkcji wielopunktowej, aby wybrać 3-5 pól widzenia na szkiełku nakrywkowym.
7. Nagraj obraz linii bazowej.
8. Dodać 1 ml 2x roztworu DA do komory.
9. Po 1, 2 i 3 minutach użyj podglądu na żywo, aby potwierdzić/wyregulować ostrość, a następnie nagraj obraz.
   UWAGA: Komórki są zwykle w pełni utlenione po 2 minutach.
10. Zastąp bufor w komorze obrazowania 1 ml roztworu 1x DTT.
11. Po 3 i 5 minutach użyj podglądu na żywo, aby potwierdzić/wyregulować ostrość, a następnie nagraj obraz.
    UWAGA: Komórki są zwykle całkowicie zredukowane po 4-5 minutach.

5. Obrazowanie na żywo ostrych zabiegów

UWAGA: Poniższy protokół opisuje obrazowanie mitochondrialnej odpowiedzi redoks na leczenie NMDA. Interwały między obrazami i czas trwania eksperymentu mogą wymagać dostosowania do innych metod leczenia.

1. Uruchom mikroskop i załaduj zoptymalizowane ustawienia z sekcji 3.
2. Ustaw interwał poklatkowy na 30 s, a czas trwania na 25 minut.
3. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z komórkami w komorze obrazowania, dodaj 1 ml buforu do obrazowania i umieść komorę na mikroskopie.
   UWAGA: Aby uniknąć dryfu ostrości termicznej, pozostaw komórki na stoliku mikroskopu na 10-15 minut przed rozpoczęciem obrazowania poklatkowego.
4. Użyj okularu i przechodzącego światła, aby ustawić ostrość komórek.
   UWAGA: Nie używaj światła epifluorescencyjnego do lokalizowania i ogniskowania komórek. Nawet przy niskiej mocy wpłynie to niekorzystnie na ogniwa.
5. Przełącz się w tryb skanowania i użyj kanału 488 nm w podglądzie na żywo, aby ustawić ostrość i zlokalizować komórki do obrazowania.
6. Opcjonalnie: Aby zwiększyć liczbę rejestrowanych komórek w przebiegu, użyj funkcji wielopunktowej, aby zobrazować 2-3 pola widzenia na szkiełko nakrywkowe.
7. Rozpocznij akwizycję poklatkową i zapisz 5 zdjęć jako 2-minutowe nagranie bazowe.
8. Dodać 500 μl 3x roztworu NMDA do komory (końcowe stężenie 30 μM) i zarejestrować dodatkowe 20 obrazów jako 10-minutową odpowiedź NMDA.
   UWAGA: Neurony są bardzo wrażliwe na zmiany osmolarności. Dlatego należy zminimalizować parowanie bufora obrazowania. W przypadku dłuższych zabiegów komora obrazowania powinna być przykryta pokrywą.
9. Dodaj 500 μL roztworu 4x DA do komory i zapisz 6 dodatkowych obrazów (maksymalna kalibracja 3 minuty).
10. Odessać bufor z komory obrazowania i zastąpić go 1 ml 1x roztworu naziemnej telewizji cyfrowej. Zarejestruj jeszcze 10 obrazów (minimalna kalibracja 5 minut).
11. Zakończ nagrywanie i zapisz serię obrazów.

6. Analiza danych

1. Import danych i wstępne przetwarzanie obrazów na FIDŻI
   1. Użyj importera formatów biologicznych, aby otworzyć grupę obrazów z kroku 4 lub plik obrazu z kroku 5. Kliknij Wtyczki | Formaty biologiczne | Importer formatów biologicznych. W oknie dialogowym użyj opcji Widok stosu z: Hyperstack, ustaw Tryb kolorów: domyślny, wybierz opcję Autoskalowanie i nie dziel na osobne okna.
      UWAGA: Funkcja automatycznego skalowania optymalizuje wyświetlanie danych na ekranie komputera. Nie zmienia intensywności pikseli.
   2. Jeśli poszczególne obrazy z kroku 4 zostały otwarte, kliknij Obraz | Stosy | Narzędzia | Połącz się, aby scalić je w stos z jednym obrazem.
   3. Jeśli podczas serii obrazów występuje dryf XY, kliknij Wtyczki | StackReg w celu zarejestrowania obrazów. W oknie dialogowym wybierz opcję Sztywna bryła lub Przesunięcie.
   4. Zmień format obrazu na 32-bitowy, klikając Obraz | Rodzaj | Wersja 32-bitowa.
   5. Podziel kanały kolorów na osobne okna, klikając Obraz | Kolor | Podziel kanały.
   6. Wybierz kanał 1 (405 nm) i dostosuj próg, aby wybrać mitochondria do analizy, klikając Obraz | Dostosuj | Próg. W oknie dialogowym wybierz opcję Domyślne, Czerwone, Ciemne tło i Histogram stosu i poczekaj, aż wybrane piksele zmienią kolor na czerwony. Kliknij przycisk Zastosuj. Wybierz opcję Ustaw piksele tła na NaN i przetwarzaj wszystkie obrazy.
      UWAGA: Aby uniknąć potencjalnej stronniczości obserwatora, należy zastosować automatyczne określanie progów. FIJI oferuje kilka zautomatyzowanych metod (takich jak Default, Huang, Intermodes, Otsu), które można wybrać z menu rozwijanego w oknie dialogowym progu. Zazwyczaj metoda Domyślna daje dobry wynik. Zaleca się porównanie kilku metod podczas pierwszej analizy, aby znaleźć najlepszą metodę progowania dla danego zestawu obrazów. Po wybraniu metody należy ją zastosować do wszystkich obrazów.
   7. Powtórz krok 6.1.6 dla kanału 2 (488 nm).
   8. Utwórz obraz proporcji, aby zwizualizować stosunek 405:488 nm, klikając Process | Kalkulator obrazów. W oknie dialogowym wybierz Obraz 1: kanał 1, Operacja: Dzielenie, Obraz 2: kanał 2, Utwórz nowe okno, Przetwarzaj wszystkie obrazy.
   9. Zmień tabelę odnośników obrazu o proporcji do pseudokoloru. Na przykład, aby zmienić na Fire, kliknij Obraz | Tabele przeglądowe | Ogień.
2. Analiza obrazu
   1. Na obrazie proporcji narysuj ROI wokół poszczególnych komórek lub mitochondriów. Po narysowaniu każdego ROI dodaj go do Menedżera ROI. Analizowanie | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji | Dodaj. (skrót klawiaturowy: 'T') Wybierz opcję Pokaż wszystko.
      UWAGA: Ponieważ piksele tła zostały ustawione na "nie liczbę" (NaN) w krokach 6.1.6 i 6.1.7, nie będą miały wpływu na wynik pomiaru. Dlatego dopuszczalne jest uwzględnienie niektórych pikseli tła w ROI.
   2. Zmierz proporcje 405:488 poszczególnych komórek, klikając Menedżer ROI | ctrl+A, aby zaznaczyć wszystkie ROI | Więcej | Wiele miar. W oknie dialogowym wybierz opcję Zmierz wszystkie plasterki i Po jednym wierszu na plasterek.
   3. Eksportuj pomiary do arkusza kalkulacyjnego.
   4. Wybierz obraz 405 nm. Zmierz intensywność wszystkich zwrotów z inwestycji, jak w kroku 6.2.2. przy użyciu ROI, które są przechowywane w menedżerze ROI.
   5. Eksportuj pomiary do arkusza kalkulacyjnego.
   6. Wybierz obraz 488 nm. Zmierz intensywność wszystkich zwrotów z inwestycji, jak w kroku 6.2.2. przy użyciu ROI, które są przechowywane w menedżerze ROI.
   7. Eksportuj pomiary do arkusza kalkulacyjnego.
   8. Zapisz ROI na przyszłość, klikając ROI Manager | ctrl+A, aby zaznaczyć wszystkie ROI | Więcej | Zapisz.
   9. Zalecane: Generowanie wykresów intensywności w funkcji czasu dla śladów 405 i 488 nm. Sprawdź, czy w żadnym z kanałów nie ma wyraźnego bielenia (intensywność sygnału na końcu serii obrazowania powinna wynosić ≥98% pierwszego obrazu) i czy dwie ścieżki poruszają się w przeciwnych kierunkach podczas odpowiedzi czujnika (np. ślad 405 nm powinien wzrosnąć podczas utleniania, a ślad 488 nm powinien się zmniejszyć).
3. Normalizacja danych
   1. Dla każdego ROI z obrazu współczynnika określ maksymalną wartość podczas leczenia DA (R_max) i minimalną wartość podczas leczenia DTT (R_min).
   2. Oblicz znormalizowany współczynnik w następujący sposób:
      
      UWAGA: Spowoduje to ustawienie maksymalnego współczynnika na 1.0, a minimalnego współczynnika na 0.
4. Analiza morfologii mitochondriów
   1. Aby uzyskać pomiary morfologii mitochondriów równolegle z intensywnością roGFP w kroku 6.2.6, przejdź do Analiza | Ustaw Measurements (Wymiary) i sprawdź Deskryptory kształtu oraz Fit ellipse.
      UWAGA: Oprócz średniej intensywności, pomiary w oknie wyników będą obejmować długość osi głównej (Major), długość osi minor (Minor), współczynnik proporcji (AR; oś główna podzielona przez oś mniejszą; mitochondria okrągłe mają AR ~1, mitochondria wydłużone mają większą AR), a także pomiary okrągłości (Circ.) i okrągłości (Round).

Kwantyfikacja różnic w mitochondrialnym stanie redoks w stanie ustalonym po wycofaniu czynnika wzrostu
Aby zademonstrować ilościowe określenie różnic w stanie stacjonarnym w mitochondrialnym stanie redoks, neurony pierwotne wyhodowane w standardowym pożywce porównano z neuronami hodowanymi bez czynników wzrostu przez 48 godzin przed obrazowaniem. Wycofanie czynnika wzrostu powoduje apoptotyczną śmierć komórki neuronalnej po 72 h16. Komórki zobrazowano po 48 godzinach, aby sprawdzić, czy jest to poprzedzone zmianami w mitochondrialnym stanie redoks. Pierwotne neurony korowe szczura wyhodowane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-L-ornityną zostały zakażone rAAV-mito-Grx1-roGFP2 w dniach in vitro 6 (DIV6) i zostały zobrazowane w DIV12. Obrazowanie na żywo przeprowadzono w temperaturze pokojowej zgodnie z sekcją 4 niniejszego protokołu na odwróconym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w obiektyw 40x/1,10 zanurzenia w wodzie. Ustawienia konfokalne to 7 przewiewnych jednostek otworkowych, rozmiar piksela 568,7 nm (512 x 512 pikseli), prędkość skanowania 600 Hz, moc lasera 405 nm 3%, moc lasera 488 nm 1%, szerokość pasma emisji 505-550 nm i średnia klatek 4. Nie było istotnej różnicy między surowymi stosunkami 405:488 nm w tych dwóch warunkach (Rysunek 3B). Po normalizacji danych podzbiór komórek o zwiększonym stosunku 405:488 nm został wykryty w grupie wycofania czynnika wzrostu (Rysunek 3C). Wskazuje to, że mitochondrialne zmiany redoks mogą poprzedzać śmierć komórki neuronalnej i podkreśla znaczenie normalizacji danych max/min dla porównania podstawowych stanów redoks między grupami.

Dynamiczne zmiany w mitochondrialnym stanie redoks po leczeniu neuronów NMDA
Receptor glutaminianu typu NMDA (NMDAR) odgrywa kluczową rolę w plastyczności neuronów, ale może również pośredniczyć w uszkodzeniu neuronów i śmierci komórki. Patologiczna aktywacja NMDAR prowadzi do kilku niekorzystnych skutków dla mitochondriów, które obejmują przeciążenie macierzy wapniowej, utlenianie i fragmentację mitochondriów oraz przejście przepuszczalności mitochondriów. W poprzednim badaniu wyżej opisany protokół został wykorzystany do zbadania związku przyczynowo-skutkowego między wywołanym przez NMDA mitochondrialnym przeciążeniem wapnia a utlenianiem mitochondriów13. Pierwotne neurony hipokampa szczura wyhodowane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną/lamininą zostały zakażone rAAV-mito-Grx1-roGFP2 na DIV4 i zobrazowane na DIV12. Obrazowanie na żywo przeprowadzono w temperaturze 37 °C na mikroskopie konfokalnym z odwróconym dyskiem wirującym, wyposażonym w obiektyw wielofunkcyjny 20x/0,75 (zastosowano zanurzenie w wodzie) i system inkubacji na stoliku. Mito-Grx1-roGFP2 był wzbudzany sekwencyjnie co 20 s za pomocą linii laserowych 405 nm i 488 nm, a emisja była zbierana za pomocą filtra emisyjnego 527/55 nm dla obu długości fal wzbudzenia. Leczenie neuronów 30 μM NMDA spowodowało utlenianie mitochondriów w ciągu kilku minut (Rysunek 4A,B). Warto zauważyć, że kwasica mitochondrialna wywołana przez NMDA spowodowała znaczne wygaszenie fluorescencji roGFP2, zgodnie z dobrze znaną czułością pH8. Aby potwierdzić, że to zależne od pH hartowanie nie wpłynęło na stosunek 405:4889, mitochondria zostały w pełni utlenione przez DA przed dodaniem NMDA w eksperymencie kontrolnym. Wstępne traktowanie DA wyklucza dalsze utlenianie mitochondriów przez NMDA, a zatem stosunek 405:488 nie zmienił się w tym eksperymencie pomimo znacznego wygaszenia intensywności fluorescencji roGFP2 (Figura 4C).

Wieloparametryczna analiza zmian w mitochondriach dendrytycznych wywołanych przez NMDA
Aby ocenić sekwencję czasową wywołanych przez NMDA zmian w morfologii mitochondriów, potencjale błonowym i stanie redoks, przeprowadzono równoległe obrazowanie fluorescencji TMRE i mito-Grx1-roGFP2 w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Pierwotne neurony korowe szczura wyhodowane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-L-ornityną zostały zakażone rAAV-mito-Grx1-roGFP2 na DIV6 i zobrazowane na DIV12. Obrazowanie na żywo przeprowadzono w temperaturze pokojowej na odwróconym konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym przy użyciu obiektywu zanurzeniowego 63x/1,40 oleju, prędkości skanowania 600 Hz, rozmiaru piksela 90,2 nm (1024 x 1024 pikseli przy 2-krotnym zoomie skanowania), wielkości otworka 3 przewiewnych jednostek i średniej klatki 2. Co 30 s rejestrowano trzy obrazy w trybie sekwencyjnym: wzbudzenie 405 nm/emisja 505-550 nm; wzbudzenie 488 nm/emisja 505-550 nm; Wzbudzenie 552 nm/emisja 560-600 nm. Leczenie neuronów 60 μM NMDA spowodowało utratę sygnału TMRE i wzrost stosunku roGFP 405:488 nm, po którym nastąpiło pewne opóźnione zaokrąglenie mitochondriów (Figura 5).

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie funkcji Grx1-roGFP2 i widm wzbudzenia roGFP2. (A) Stres oksydacyjny i działanie antyoksydacyjnych systemów obronnych utleniają komórkową pulę glutationu. Grx1 w białku fuzyjnym Grx1-roGPF2 sprzyja szybkiej równowadze stanu redoks roGFP2 ze stanem redoks puli glutationu. Status redoks puli roGFP2 można ocenić, monitorując stosunek emisji fluorescencji GFP przy 510 nm po wzbudzeniu przy 405 nm i 488 nm. Zredukowane gatunki są pokazane na niebiesko; Utlenione gatunki są pokazane na czerwono. (B) Widma wzbudzenia w pełni zredukowanego (niebieskiego) i utlenionego (czerwonego) roGFP2. Po utlenieniu roGFP2 emisja fluorescencji przy wzbudzeniu 400 nm wzrasta, podczas gdy emisja przy wzbudzeniu 490 nm maleje. Ten rysunek został zmodyfikowany w stosunku do poprzedniej publikacji13. Widma wzbudzenia w B zostały narysowane na podstawie Rysunek 1B z 8. Linie przerywane w B wskazują długości fal powszechnie stosowanych linii laserowych 405 nm i 488 nm. Skróty: GSH = glutation; GSSG = utleniony glutation; Grx = glutaredoksyna; roGFP = wrażliwy na redoks wariant białka zielonej fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przebieg pracy metody. Ekspresję wrażliwego na wzbudzenie białka fluorescencyjnego redoks roGFP2 w neuronach można osiągnąć za pomocą kilku metod, które obejmują transfekcję, lipofekcję, transfer genów wirusa i transgeniczne zwierzęta. Czujnik może być używany do badania neuronalnego stanu redoks w hodowanych neuronach pierwotnych, eksplantatach tkanek ex vivo i nienaruszonych zwierzętach. Obrazowanie roGFP2 można wykonywać na różnych mikroskopach, w tym mikroskopach fluorescencyjnych o szerokim polu, mikroskopach konfokalnych i mikroskopach 2-fotonowych. Analizę danych obrazowania roGFP2 można przeprowadzić za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ/FIJI. Skrót: roGFP = wrażliwy na redoks wariant białka zielonej fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wycofanie czynnika wzrostu powoduje utlenianie mitochondriów neuronalnych. (A) Reprezentatywne obrazy w proporcji 405:488 nm neuronów hodowanych w obecności (+ GF) lub braku (- GF) czynników wzrostu przez 48 godzin przed obrazowaniem. Skale oznaczone kolorami reprezentują nieznormalizowane proporcje 405:488 nm (niższe proporcje odpowiadają stanowi zredukowanemu, wyższe współczynniki odpowiadają stanowi utlenionemu). Podziałka = 50 μm. (B) Kwantyfikacja stosunku 405:488 nm w poszczególnych neuronach. (C) Max/min skalibrowany stosunek 405:488 nm poszczególnych neuronów. Okrągłe symbole reprezentują pojedyncze komórki; słupek reprezentuje średnią. N = 40-44 komórki z 3 szkiełek nakrywkowych z jednego preparatu. Skrót: GF = czynnik wzrostu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Utlenianie mitochondriów neuronalnych wywołane przez NMDA. (A) Reprezentatywne obrazy o stosunku 405:488 nm przed i po leczeniu NMDA 30 μM oraz po kalibracji max/min za pomocą DA i DTT. Przy tym powiększeniu sygnał roGFP jest najczęściej wykrywany w dendrytach soma i proksymalnych. Skala oznaczona kolorami reprezentuje nieznormalizowane proporcje 405:488 nm (niższe współczynniki odpowiadają stanowi zredukowanemu; wyższe współczynniki odpowiadają stanowi utlenionemu). Podziałka liniowa = 50 μm. (B) Kwantyfikacja przebiegu obrazowania pokazana w A. NMDA indukuje szybkie i trwałe utlenianie mitochondriów, które można skalibrować za pomocą DA i DTT. (C) Kwasica mitochondrialna wywołana przez NMDA powoduje spadek fluorescencji GFP zarówno przy wzbudzeniu 405 nm, jak i 488 nm (górny panel). Aby wyizolować efekt zależny od pH i potwierdzić, że stosunek 405:488 nm jest niewrażliwy na pH, neurony najpierw maksymalnie utleniono za pomocą DA, a następnie poddano prowokacji NMDA w obecności DA (dolny panel). W tych warunkach NMDA nadal powoduje kwasicę mitochondrialną, ale nie dalsze utlenianie mitochondriów. W związku z tym, chociaż zarówno ślad 405 nm, jak i 488 nm wykazują spadek intensywności fluorescencji spowodowany pH, stosunek 405:488 nm pozostaje stabilny. Ten rysunek został zmodyfikowany z 13. Skróty: GFP = zielone białko fluorescencyjne; roGFP = wrażliwy na redoks wariant białka zielonej fluorescencji; NMDA = N-metylo-D-asparaginian; DA = diamid; DTT = ditiotreitol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wywołane przez NMDA zmiany w potencjale błonowym, stanie redoks i morfologii mitochondriów dendrytycznych. (A) Trzy obrazy w dużym powiększeniu z eksperymentu poklatkowego, uzyskane w czasie t = 1, 4 i 9 min, pokazujące mitochondria dendrytyczne i aksonalne. Koloryzacja reprezentuje intensywność TMRE (patrz pasek kalibracji). (B) Obrazy o proporcjach roGFP 405:488 nm z tego samego eksperymentu poklatkowego co w (A) przy t = 1, 4 i 9 min. Należy zauważyć, że ze względu na ograniczoną skuteczność infekcji AAV, tylko podzbiór neuronów wyraża mito-Grx1-roGFP2, a zatem nie wszystkie mitochondria TMRE-dodatnie są roGFP-dodatnie. Kolorowy pasek kalibracji reprezentuje nieznormalizowane proporcje 405:488 nm (niższe współczynniki odpowiadają stanowi zredukowanemu; wyższe współczynniki odpowiadają stanowi utlenionemu). (C) Kwantyfikacja intensywności TMRE, stosunku roGFP 405:488 nm i okrągłości pojedynczego mitochondrium (oznaczone strzałkami w A, B). Po 1 minucie zapisu linii bazowej do roztworu kąpieli dodano 60 μM NMDA. Podziałka = 5 μm. Oś y w C przedstawia stosunek roGFP 405:488 nm względem linii podstawowej T0 (zielona linia przerywana), intensywność fluorescencji TMRE względem linii podstawowej T0 (czerwona linia przerywana) oraz deskryptor kształtu FIJI/ImageJ "okrągłość" (linia ciągła). Skróty: GFP = roGFP = wrażliwy na redoks wariant białka zielonej fluorescencji; mito-Grx1-roGFP2 = glutaredoksyna-1 połączona z N-końcem roGFP; AAV = wirus związany z adenowirusem; TMRE = tetrametylorodamina, ester etylowy; NMDA = N-metylo-D-asparaginian. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.