Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63073

⸱

20 października 2021

 ,  ,  , 
1Department of Medical Cell Biology, Institute for Anatomy and Cell Biology, Heidelberg University, 2Department of Neurogenetics, Max-Planck-Institute for Experimental Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół do określania różnic w podstawowym stanie redoks i redoks odpowiedzi na ostre perturbacje w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej za pomocą konfokalnej mikroskopii na żywo. Protokół może być stosowany do innych typów komórek i mikroskopów przy minimalnych modyfikacjach.

Streszczenie

Homeostaza mitochondriów redoks jest ważna dla żywotności i funkcji neuronów. Chociaż mitochondria zawierają kilka systemów redoks, bardzo obfity bufor redoks disiarczku tiolu, glutation, jest uważany za głównego gracza w obronie przeciwutleniającej. Dlatego pomiar potencjału redoks mitochondriów glutationu dostarcza przydatnych informacji na temat statusu redoks mitochondriów i stresu oksydacyjnego. Glutaredoksyna1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) jest genetycznie kodowanym, opartym na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP) wskaźnikiem ratiometrycznym potencjału redoks glutationu, który ma dwa wrażliwe na stan redoks piki wzbudzenia przy 400 nm i 490 nm z pojedynczym pikiem emisji przy 510 nm. W tym artykule opisano, jak przeprowadzić konfokalną mikroskopię na żywo Grx1-roGFP2 ukierunkowanego na mitochondria w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej. Opisano, jak ocenić potencjał redoks mitochondrialnego glutationu w stanie stacjonarnym (np. w celu porównania stanów chorobowych lub długotrwałego leczenia) oraz jak zmierzyć zmiany redoks po ostrym leczeniu (na przykładzie leku ekscytotoksycznego N-metylo-D-asparaginianu (NMDA)). Ponadto w artykule przedstawiono współobrazowanie Grx1-roGFP2 i wskaźnika potencjału błony mitochondrialnej, tetrametylorodaminy, estru etylowego (TMRE), w celu zademonstrowania, w jaki sposób Grx1-roGPF2 może być multipleksowany z dodatkowymi wskaźnikami do analiz wieloparametrycznych. Protokół ten zawiera szczegółowy opis sposobu (i) optymalizacji ustawień konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, (ii) stosowania leków do stymulacji, a następnie kalibracji czujnika za pomocą diamidu i ditiotreitolu oraz (iii) analizowania danych za pomocą ImageJ/FIJI.

Wprowadzenie

Kilka ważnych enzymów mitochondrialnych i cząsteczek sygnałowych podlega regulacji tiolowej redoks1. Co więcej, mitochondria są głównym komórkowym źródłem reaktywnych form tlenu i są selektywnie podatne na uszkodzenia oksydacyjne2. W związku z tym mitochondrialny potencjał redoks bezpośrednio wpływa na bioenergetykę, sygnalizację komórkową, funkcję mitochondriów i ostatecznie żywotność komórki3,4. Macierz mitochondrialna zawiera duże ilości (1-15 mM) buforu redoks disiarczku tiolu glutationu (GSH) w celu utrzymania homeostazy redoks i wzmocnienia obrony antyoksydacyjnej5,6. GSH może być kowalencyjnie przyłączany do białek docelowych (S-glutationylacja) w celu kontrolowania ich statusu i aktywności redoks i jest wykorzystywany przez szereg enzymów detoksykujących, które redukują utlenione białka. Dlatego potencjał redoks mitochondriów glutationu jest parametrem wysoce informacyjnym podczas badania funkcji i patofizjologii mitochondriów.

roGFP2 to wariant GFP, który stał się wrażliwy na redoks poprzez dodanie dwóch powierzchniowo wystawionych cystein, które tworzą sztuczną parę ditiol-dwusiarczek7,8. Ma pojedynczy pik emisyjny przy ~510 nm i dwa piki wzbudzenia przy ~400 nm i 490 nm. Co ważne, względne amplitudy dwóch pików wzbudzenia zależą od stanu redoks roGFP2 (Rysunek 1), co czyni to białko czujnikiem ratiometrycznym. W czujniku Grx1-roGFP2 ludzka glutaredoksyna-1 (Grx1) została połączona z N-końcem roGFP29,10. Kowalencyjne przyłączenie enzymu Grx1 do roGFP2 zapewnia dwie główne ulepszenia czujnika: sprawia, że odpowiedź czujnika jest specyficzna dla pary redoks glutationu GSH/GSSG (Rysunek 1) i przyspiesza równowagę między GSSG i roGFP2 o współczynnik co najmniej 100 0009. Dlatego Grx1-roGFP2 umożliwia specyficzne i dynamiczne obrazowanie komórkowego potencjału redoks glutationu.

Obrazowanie Grx1-roGFP2 można wykonać na szerokiej gamie mikroskopów, w tym na mikroskopach fluorescencyjnych o szerokim polu, mikroskopach konfokalnych z wirującym dyskiem i laserowych skaningowych mikroskopach konfokalnych. Ekspresję czujnika w neuronach pierwotnych można osiągnąć za pomocą różnych metod, które obejmują lipofekcję11, koprecypitację DNA/fosforanu wapnia12, transfer genów za pośrednictwem wirusa lub wykorzystanie zwierząt transgenicznych jako źródła komórek (Rysunek 2). W eksperymentach w tym artykule użyto pseudotypowanych rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusem (rAAV) zawierających 1:1 proporcji białek kapsydu AAV1 i AAV2 13,14. W przypadku tego wektora maksymalna ekspresja czujnika jest zwykle osiągana 4-5 dni po zakażeniu i pozostaje stabilna przez co najmniej dwa tygodnie. Z powodzeniem zastosowaliśmy Grx1-roGFP2 w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej myszy i szczurów.

W tym artykule, ekspresja Grx1-roGFP2 ukierunkowanego na mitochondria w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej szczura jest używana do oceny podstawowego mitochondrialnego stanu redoks glutationu i jego ostrego zaburzenia za pośrednictwem rAAV. Dostępny jest protokół konfokalnego obrazowania na żywo ze szczegółowymi instrukcjami, jak (i) zoptymalizować ustawienia laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, (ii) przeprowadzić eksperyment z obrazowaniem na żywo oraz (iii) analizować dane za pomocą FIJI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi, w tym z dyrektywą 2010/63/UE Parlamentu Europejskiego, oraz posiadały pełną zgodę etyczną Home Office (Biuro Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu w Heidelbergu oraz Regierungspraesidium Karlsruhe, licencje T14/21 i T13/21). Pierwotne neurony hipokampa i kory przygotowano z nowonarodzonych myszy lub szczurów zgodnie ze standardowymi procedurami i utrzymywano przez 12-14 dni, jak opisano wcześniej13.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Roztworyy stokowe buforu do obrazowania
    1. Przygotować każdy roztwór stokowy zgodnie z Tabelą 1 i przechowywać w temperaturze 4 °C. W przypadku długoterminowego przechowywania (>3 miesiące), przechowywać alikwoty w temperaturze -20 °C.
Komponentmasa cząsteczkowaStężenie (M)Ilość (g)Objętość (mL)
NaCl58.44514.6150
KCl74.5531.125
MgCl22·6 h2O203.31.925
CaCl₂2·2H2O147.0111.4710
Glicyna75.070.10.37550
Sacharoza342.31.525.6750
Pirowinian sodu110.040.10.5550
HEPES238.3111.950
Glukoza180.152.545100

Tabela 1: Roztwory zapasowe do buforu obrazującego.

  1. Roztwory zapasowe leków i barwników
    1. Rozpuścić diamid (DA; stosowany do kalibracji maksymalnego stosunku 405:488) w wodzie w celu otrzymania 0,5 M roztworu zapasowego (np. 1 g w 11,615 mL wody). Rozdzielić na aliquoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Rozpuścić ditiotreitol (DTT; stosowany do kalibracji minimalnego stosunku 405:488) w wodzie w celu otrzymania 1 M roztworu zapasowego (np. 5 g w 32,425 mL wody). Rozdzielić na aliquoty i przechowywać w temperaturze -20 °C maksymalnie przez 3 miesiące.
    3. Rozpuścić N-metylo-D-asparaginian (NMDA; stosowany do indukowania ekscytotoksyczności i utleniania mitochondriów) w wodzie w celu otrzymania 10 mM roztworu zapasowego (np. 25 mg w 16,991 mL wody). Przechowywać aliquoty w temperaturze -20 °C. Do długotrwałego przechowywania (>6 miesięcy) zachowywać aliquoty w temperaturze -80 °C.
    4. Perchloran etylowego estru tetrametylorodaminy (TMRE; małocząsteczkowy wskaźnik potencjału błony mitochondrialnej)
      1. Rozpuścić proszek TMRE w metanolu w celu otrzymania 20 mM roztworu zapasowego (np. 25 mg w 2,427 mL metanolu).
      2. Rozcieńczyć 20 mM roztwór zapasowy w stosunku 1:1 000 w metanolu, aby otrzymać roztwór zapasowy o stężeniu 20 µM.
      3. Rozdzielić roztwory zapasowe 20 mM i 20 µM na aliquoty, uszczelnić parafilmem i przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.
        UWAGA: Oba roztwory zapasowe są stabilne przez kilka lat. Do eksperymentów należy używać 1 000x roztworu zapasowego (20 µM).
  2. Bufor do obrazowania
    1. Przygotować 100 mL buforu do obrazowania, dodając wszystkie składniki z Tabeli 2 do 80 mL sterylnej wody w cylindrze miarowym. Uzupełnić objętość do 100 mL sterylną wodą. Wymieszać, ostrożnie wstrząsając cylindrem, aż roztwór stanie się jednorodny.
      UWAGA: Zaleca się użycie osmometru do sprawdzenia osmolarności buforu. Powinna ona być jak najbliższa osmolarności pożywki wzrostowej komórek. W tym przypadku wynosi ona 315 mOsmol/L. W razie potrzeby zwiększyć lub zmniejszyć stężenie sacharozy, aby dopasować osmolarność buforu do obrazowania i pożywki wzrostowej.
    2. Dostosować pH do wartości 7,4. Przygotować aliquoty i przechowywać w temperaturze 4 °C do dwóch tygodni. Do długotrwałego przechowywania zachowywać aliquoty w temperaturze -20 °C. Przed użyciem doprowadzić bufor do obrazowania do temperatury pokojowej.
KomponentRoztwór zapasowy (M)Stężenie końcowe (mM)Objętość (ml)
NaCl51142.3
KCl35.290.176
MgCl₂21.910.053
CaCl₂2120.2
Glicyna0.10.0050.005
Sacharoza1.5523.5
Pirogronian sodu0.10.50.5
HEPES1101
Glukoza2.550.2

Tabela 2: Skład buforu do obrazowania. Wskazane objętości są wykorzystywane do przygotowania 100 mL buforu do obrazowania.

  1. Roztwory do stymulacji i kalibracji
    UWAGA: Świeże roztwory stymulujące należy zawsze przygotowywać bezpośrednio przed eksperymentem, dodając roztwory zapasowe wskazanych leków do buforu obrazującego. Roztwory do stymulacji i kalibracji będą dodawane do komory obrazującej sekwencyjnie podczas eksperymentu (patrz sekcje 3-5). W zależności od rodzaju eksperymentu wymagane są różne roztwory, aby osiągnąć to samo stężenie końcowe w odpowiedniej objętości końcowej w komorze obrazującej.
    1. Przygotuj 3-krotny roztwór NMDA (90 µM; stężenie końcowe w komorze: 30 µM), dodając 63 µL zapasu NMDA o stężeniu 10 mM do 6,937 mL buforu obrazującego. Dodaj 500 µL otrzymanego roztworu do komory (objętość końcowa: 1,5 mL).
    2. Przygotuj 2-krotny roztwór DA do kroków 3 i 4 (1 mM; stężenie końcowe w komorze: 0,5 mM), dodając 14 µL zapasu DA o stężeniu 0,5 M do 6,986 mL buforu obrazującego. Dodaj 1 mL do komory (objętość końcowa: 2 mL).
    3. Przygotuj 4-krotny roztwór DA do kroku 5 (2 mM; stężenie końcowe w komorze: 0,5 mM), dodając 28 µL zapasu DA o stężeniu 0,5 M do 6,972 mL buforu obrazującego. Dodaj 500 µL do komory (objętość końcowa: 2 mL).
    4. Przygotuj 1-krotny roztwór DTT (5 mM; stężenie końcowe w komorze: 5 mM), dodając 45 µL zapasu DTT o stężeniu 1 M do 8955 µL buforu obrazującego. Po odessaniu buforu obrazującego dodaj 1 mL tego roztworu do komory (objętość końcowa: 1 mL).

2. Obciążanie komórek TMRE

UWAGA: W niniejszym protokole TMRE jest stosowany w trybie bez gaszenia (non-quench mode)15 w końcowym stężeniu 20 nM. Generalnie należy stosować najniższe możliwe stężenie TMRE, które nadal zapewnia wystarczającą intensywność sygnału na wybranym mikroskopie. Ze względu na nierównomierne odparowywanie, objętość medium w różnych studzienkach może się różnić w długoterminowych kulturach pierwotnych. Aby zapewnić spójne stężenie TMRE we wszystkich studzienkach, nie należy dodawać TMRE bezpośrednio do studzienek. Zamiast tego należy zastąpić medium w każdej studzience taką samą ilością medium zawierającego TMRE. Poniższy protokół jest przeznaczony dla neuronów pierwotnych w płytkach 24-dołkowych zawierających ~1 mL medium na studzienkę.

  1. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek, pobierz 500 µL pożywki z każdej studzienki do jednej probówki stożkowej.
  2. Do probówki stożkowej dodaj 0,5 µL roztworu stokowego TMRE o stężeniu 20 µM na każdą studzienkę (np. 12 µL dla 24 studni).
  3. Ostrożnie odessaj pozostałą pożywkę z pierwszej studzienki i zastąp ją 500 µL pożywki zawierającej TMRE. Powtórz tę czynność dla pozostałych studzienek, kolejno jedna po drugiej.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek i nie zakłócać ich stanu.
  4. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze i odczekaj co najmniej 60 min w celu równowagi barwnika.
    UWAGA: Czas inkubacji z barwnikiem może zostać wydłużony do kilku godzin bez negatywnych skutków.
  5. Aby zapewnić stałe stężenie TMRE i utrzymanie stanu równowagi podczas całego eksperymentu obrazowania, upewnij się, że bufor do obrazowania oraz wszystkie roztwory stymulujące zawierają końcowe stężenie 20 nM TMRE.

3. Optymalizacja ustawień skaningowego mikroskopu konfokalnego

UWAGA: Ten krok ma na celu znalezienie najlepszego kompromisu między jakością obrazu a żywotnością komórek podczas obrazowania na żywo. Ta sekcja opisuje optymalizację ustawień dla obrazowania roGFP. W przypadku obrazowania multiparametrycznego należy przeprowadzić podobną optymalizację dla dodatkowych wskaźników, w tym sprawdzić stabilność linii bazowej pod kątem braku oznak blaknięcia lub fototoksyczności. 

  1. Uruchom mikroskop konfokalny i załaduj standardowe ustawienia dla obrazowania GFP (pobudzenie 488 nm, emisja 505 - 550 nm).
  2. Ustaw detektor na 12 bitów lub 16 bitów.
    UWAGA: Zazwyczaj 8 bitów jest niewystarczające do obrazowania ilościowego.
  3. Aktywuj tryb skanowania sekwencyjnego i dodaj drugą sekwencję/ścieżkę (pobudzenie 405 nm, emisja 505 - 550 nm).
  4. Dla obu kanałów wybierz tabelę mapowania pseudokolorów, która wskazuje piksele prześwietlone i niedoświetlone (np. GLOW OU).
  5. Wybierz obiektyw odpowiedni dla badanego obiektu.
    UWAGA: Powiększenia 10x-40x są odpowiednie do analizy pojedynczych komórek, a 63x-100x do analizy pojedynczych mitochondriów.
  6. Zamocuj szkiełko cover-slip z komórkami w komorze obrazowania, dodaj 1 mL buforu do obrazowania i umieść komorę na mikroskopie.
  7. Użyj okularu i światła przechodzącego, aby ustawić ostrość na komórkach.
    UWAGA: Nie używaj światła epifluorescencyjnego do lokalizacji i ustawiania ostrości komórek. Nawet przy niskiej mocy wpłynie to niekorzystnie na komórki.
  8. Rejestruj obrazy przy różnych formatach pikseli. Na podstawie tych obrazów wybierz najmniejszą liczbę pikseli, która zapewnia akceptowalną rozdzielczość badanej struktury.
    UWAGA: Zazwyczaj 512 x 512 pikseli sprawdza się w obrazowaniu pojedynczych komórek z obiektywami 20x i 40x, a 1024 x 1024 lub 2048 x 2048 pikseli zazwyczaj sprawdza się w obrazowaniu pojedynczych mitochondriów z obiektywem 63x.
  9. Rejestruj obrazy przy różnych rozmiarach otworu pinhole. Na podstawie tych obrazów wybierz największy rozmiar otworu, który zapewnia akceptowalną rozdzielczość badanej struktury.
    UWAGA: Zazwyczaj sprawdza się zakres 3-7 jednostek Airy.
  10. Rejestruj obrazy przy różnych intensywnościach lasera.
    1. Odpowiednio dostosuj wzmocnienie i próg detektora. Na podstawie tych obrazów wybierz najniższą intensywność lasera, która zapewnia akceptowalną intensywność sygnału oraz stosunek sygnału do tła.
      1. Aby wyznaczyć stosunek sygnału do tła, zmierz intensywność sygnału w obszarze zainteresowania (ROI) zawierającym komórki lub mitochondria (ROI1) oraz w ROI bez komórek lub mitochondriów (ROI2). Następnie podziel intensywność ROI1 przez intensywność ROI2.
        UWAGA: Dąż do uzyskania stosunku sygnału do tła >3 i intensywności sygnału dla poszczególnych ROI na poziomie 200-1 000 dla pobudzenia 405 nm przy mocy lasera 1-3% oraz intensywności ROI na poziomie 300-1 500 dla pobudzenia 488 nm przy mocy lasera 1%.
  11. Rejestruj obrazy przy różnych prędkościach skanowania i różnej liczbie uśrednianych klatek. Nagraj 4-5 obrazów dla każdej kombinacji ustawień. Na podstawie tych serii obrazów wybierz najwyższą prędkość i najniższe ustawienia uśredniania, które zapewniają akceptowalny poziom szumu i zmienność między obrazami.
    UWAGA: W większości przypadków dobrze sprawdza się prędkość skanowania 600 Hz i uśrednianie 1-2 klatek.
  12. Używając nowego szkiełka cover-slip, nagraj serię time-lapse z zoptymalizowanymi ustawieniami.
    UWAGA: Czas trwania i odstępy między obrazami w serii powinny odpowiadać tym z planowanych eksperymentów.
  13. Na koniec serii time-lapse dodaj do komory pomiarowej 1 mL 2x roztworu DA. Obrazuj przez dodatkowe 2 min.
  14. Odsuń bufor do obrazowania za pomocą pompy perystaltycznej lub pipety ręcznej. Dodaj 1 mL 1x roztworu DTT. Obrazuj przez dodatkowe 5 min.
  15. Przeanalizuj eksperyment time-lapse (patrz sekcja 5).
    1. Upewnij się, że przy zoptymalizowanych ustawieniach żaden z dwóch kanałów nie jest prześwietlony ani niedoświetlony podczas traktowania DA i DTT.
    2. Upewnij się, że w żadnym z dwóch kanałów nie występuje znaczny bleaching podczas rejestracji time-lapse; dąż do spadku intensywności <2% między pierwszym a ostatnim obrazem.
    3. Zweryfikuj, czy stosunek 405:488 nie zmienia się znacząco podczas obrazowania.
  16. Powtórz całą procedurę iteracyjnie, używając kilku szkiełek cover-slip, aż zostaną określone ustawienia, które konsekwentnie zapewniają akceptowalne wyniki.

4. Ocena podstawowego stanu redoks

  1. Uruchom mikroskop i wczytaj zoptymalizowane ustawienia z sekcji 3.
  2. Ustaw uśrednianie klatek (frame average) na 3-5.
  3. Zamocuj szkiełko nakrywkowe z komórkami w komorze obrazowania, dodaj 1 mL buforu do obrazowania i umieść komorę na mikroskopie.
  4. Użyj okularu i światła przechodzącego, aby ustawić ostrość na komórkach.
    UWAGA: Nie używaj światła epifluorescencyjnego do lokalizacji i ustawiania ostrości komórek. Nawet przy małej mocy wpłynie to niekorzystnie na komórki.
  5. Przełącz na tryb skanowania (scanning) i użyj kanału 488 nm w trybie podglądu na żywo (live view), aby ustawić ostrość i zlokalizować komórki do obrazowania.
  6. Użyj funkcji wielopunktowej (multipoint function), aby wybrać 3-5 pól widzenia na szkiełku nakrywowym.
  7. Zarejestruj obraz bazowy.
  8. Dodaj do komory 1 mL 2x roztworu DA.
  9. Po 1, 2 i 3 min użyj trybu podglądu na żywo (live view), aby potwierdzić/skorygować ostrość, a następnie zarejestruj obraz.
    UWAGA: Komórki są zazwyczaj w pełni utlenione po 2 min.
  10. Zastąp bufor w komorze obrazowania 1 mL 1x roztworu DTT.
  11. Po 3 i 5 min użyj trybu podglądu na żywo (live view), aby potwierdzić/skorygować ostrość, a następnie zarejestruj obraz.
    ​UWAGA: Komórki są zazwyczaj w pełni zredukowane po 4-5 min.

5. Obrazowanie na żywo w warunkach ostrego traktowania

UWAGA: Poniższy protokół opisuje obrazowanie odpowiedzi redoks mitochondriów na traktowanie NMDA. Interwały obrazowania i czas trwania eksperymentu mogą wymagać dostosowania w przypadku innych metod traktowania.

  1. Uruchom mikroskop i wczytaj zoptymalizowane ustawienia z sekcji 3.
  2. Ustaw interwał time-lapse na 30 s oraz czas trwania na 25 min.
  3. Zamocuj szkiełko nakrywkowe z komórkami w komorze obrazowania, dodaj 1 mL buforu do obrazowania i umieść komorę na mikroskopie.
    UWAGA: Aby uniknąć termicznego dryftu ostrości, pozostaw komórki na stoliku mikroskopu na 10-15 min przed rozpoczęciem obrazowania time-lapse.
  4. Użyj okularu i światła przechodzącego, aby ustawić ostrość na komórkach.
    UWAGA: Nie używaj światła epifluorescencyjnego do lokalizacji i ustawiania ostrości komórek. Nawet przy niskiej mocy wpłynie to niekorzystnie na komórki.
  5. Przełącz do trybu skanowania i użyj kanału 488 nm w podglądzie na żywo (live view), aby ustawić ostrość i zlokalizować komórki do obrazowania.
  6. Opcjonalnie: Aby zwiększyć liczbę rejestrowanych komórek w jednej serii, użyj funkcji wielopunktowej (multipoint function), aby obrazować 2-3 pola widzenia na szkiełko nakrywkowe.
  7. Rozpocznij akwizycję time-lapse i zarejestruj 5 obrazów jako 2-minutowy pomiar bazowy.
  8. Dodaj do komory 500 µL 3x roztworu NMDA (stężenie końcowe 30 µM) i zarejestruj kolejne 20 obrazów jako 10-minutową odpowiedź na NMDA.
    ​UWAGA: Neurony są bardzo wrażliwe na zmiany osmolarity. Dlatego należy zminimalizować parowanie buforu do obrazowania. Przy dłuższych zabiegach komora obrazująca powinna być przykryta pokrywką.
  9. Dodaj do komory 500 µL 4x roztworu DA i zarejestruj kolejne 6 obrazów (3-minutowa kalibracja maksymalna).
  10. Odsącz bufor z komory obrazującej i zastąp go 1 mL 1x roztworu DTT. Zarejestruj kolejne 10 obrazów (5-minutowa kalibracja minimalna).
  11. Zakończ rejestrację i zapisz serię obrazów.

6. Analiza danych

  1. Import danych i wstępne przetwarzanie obrazów w programie FIJI
    1. Użyj funkcji Bio-Formats Importer, aby otworzyć grupę obrazów z kroku 4 lub plik obrazu z kroku 5. Kliknij Plugins | Bio-Formats | Bio-Formats Importer. W oknie dialogowym wybierz View stack with: Hyperstack, ustaw Color mode: default, zaznacz Autoscale i nie dziel obrazów na osobne okna.
      UWAGA: Funkcja Autoscale optymalizuje wyświetlanie danych na ekranie komputera. Nie zmienia ona intensywności pikseli.
    2. Jeśli otwarto poszczególne obrazy z kroku 4, kliknij Image | Stacks | Tools | Concatenate, aby połączyć je w jeden stos obrazów.
    3. Jeśli w serii obrazów występuje dryft XY, kliknij Plugins | StackReg, aby zarejestrować obrazy. W oknie dialogowym wybierz Rigid Body lub Translation.
    4. Zmień format obrazu na 32 bity, klikając Image | Type | 32-bit.
    5. Rozdziel kanały kolorystyczne do osobnych okien, klikając Image | Color | Split Channels.
    6. Wybierz kanał 1 (405 nm) i dostosuj próg, aby zaznaczyć mitochondria do analizy, klikając Image | Adjust | Threshold. W oknie dialogowym wybierz Default, Red, Dark background oraz Stack histogram i poczekaj, aż zaznaczone piksele staną się czerwone. Kliknij Apply. Zaznacz Set Background Pixels to NaN oraz Process all images.
      UWAGA: Aby uniknąć potencjalnego błędu obserwatora, należy stosować zautomatyzowane wyznaczanie progu. FIJI oferuje kilka zautomatyzowanych metod (takich jak Default, Huang, Intermodes, Otsu), które można wybrać z menu rozwijanego w oknie dialogowym progu. Zazwyczaj metoda Default daje dobre wyniki. Zaleca się porównanie kilku metod podczas pierwszej analizy w celu znalezienia najlepszej metody progowania dla danego zestawu obrazów. Po wybraniu metody należy ją zastosować do wszystkich obrazów.
    7. Powtórz krok 6.1.6 dla kanału 2 (488 nm).
    8. Utwórz obraz stosunku (ratio), aby zwizualizować stosunek 405:488 nm, klikając Process | Image calculator. W oknie dialogowym wybierz Image 1: channel 1, Operation: Divide, Image 2: channel 2, Create new window, Process all images.
    9. Zmień tablicę wyszukiwania (lookup table) obrazu stosunku na pseudokolor. Na przykład, aby zmienić na Fire, kliknij Image | Lookup Tables | Fire.
  2. Analiza obrazu
    1. Na obrazie stosunku narysuj ROI wokół poszczególnych komórek lub mitochondriów. Po narysowaniu każdego ROI dodaj go do ROI Manager za pomocą Analyze | Tools | ROI Manager | Add (skrót klawiszowy: 'T'). Zaznacz Show All.
      UWAGA: Ponieważ piksele tła zostały ustawione jako „nie liczba” (NaN) w krokach 6.1.6 i 6.1.7, nie będą one wpływać na wynik pomiaru. W związku z tym dopuszczalne jest włączenie niektórych pikseli tła do ROI.
    2. Zmierz stosunki 405:488 poszczególnych komórek, klikając ROI Manager | ctrl+A, aby zaznaczyć wszystkie ROI | More | Multi Measure. W oknie dialogowym zaznacz Measure all slices oraz One row per slice.
    3. Eksportuj pomiary do programu arkusza kalkulacyjnego.
    4. Wybierz obraz 405 nm. Zmierz intensywność wszystkich ROI w sposób opisany w kroku 6.2.2, korzystając z ROI zapisanych w managerze ROI.
    5. Eksportuj pomiary do programu arkusza kalkulacyjnego.
    6. Wybierz obraz 488 nm. Zmierz intensywność wszystkich ROI w sposób opisany w kroku 6.2.2, korzystając z ROI zapisanych w managerze ROI.
    7. Eksportuj pomiary do programu arkusza kalkulacyjnego.
    8. Zapisz ROI do późniejszego wykorzystania, klikając ROI Manager | ctrl+A, aby zaznaczyć wszystkie ROI | More | Save.
    9. Zalecane: Wygeneruj wykresy intensywności w czasie dla śladów 405 i 488 nm. Upewnij się, że w żadnym z kanałów nie występuje wyraźny bleaching (intensywność sygnału na końcu serii obrazowania powinna wynosić ≥98% pierwszego obrazu) oraz że dwa ślady poruszają się w przeciwnych kierunkach podczas odpowiedzi sensora (np. ślad 405 nm powinien rosnąć podczas utleniania, podczas gdy ślad 488 nm powinien maleć).
  3. Normalizacja danych
    1. Dla każdego ROI z obrazu stosunku wyznacz maksymalną wartość podczas traktowania DA (Rmax) oraz minimalną wartość podczas traktowania DTT (Rmin).
    2. Oblicz znormalizowany stosunek w następujący sposób:
      figure-protocol-1
      UWAGA: Pozwoli to ustawić maksymalny stosunek na 1,0, a minimalny na 0.
  4. Analiza morfologii mitochondriów
    1. Aby uzyskać pomiary morfologii mitochondriów równolegle do intensywności roGFP w kroku 6.2.6, przejdź do Analyze | Set Measurements i zaznacz Shape descriptors oraz Fit ellipse.
      UWAGA: Oprócz średniej intensywności, pomiary w oknie results będą zawierać długość osi głównej (Major), długość osi mniejszej (Minor), współczynnik proporcji (AR; oś główna podzielona przez oś mniejszą; okrągłe mitochondria mają AR ~1, wydłużone mitochondria mają większy AR), a także pomiary kolistości (Circ.) i zaokrąglenia (Round).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ilościowe określenie różnic w stacjonarnym stanie redoks mitochondriów po wycofaniu czynników wzrostu
Aby zademonstrować ilościowe określenie różnic w stacjonarnym stanie redoks mitochondriów, porównano pierwotne neurony hodowane w standardowej pożywce z neuronami hodowanymi bez czynników wzrostu przez 48 h przed obrazowaniem. Wycofanie czynników wzrostu prowadzi do apoptycznej śmierci komórek neuronalnych po 72 h16. Komórki obrazowano po 48 h, aby sprawdzić, czy proces ten ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ilościowe i dynamiczne pomiary mitochondrialnego stanu redoks dostarczają ważnych informacji na temat fizjologii mitochondriów i komórek. Dostępnych jest kilka fluorogenicznych sond chemicznych, które wykrywają reaktywne formy tlenu, "stres redoks" lub "stres oksydacyjny". Jednak te ostatnie terminy nie są dobrze zdefiniowane i często brakuje im specyficzności 9,17,18. W porównaniu z barwnikami chemicznymi, Grx1-roGFP2 ma kilka ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; DLA 2289: BA 3679/4-2). A.K. jest wspierany przez stypendium ERASMUS+. Dziękujemy Iris Bünzli-Ehret, Ricie Rosner i Andrei Schlicksupp za przygotowanie neuronów pierwotnych. Dziękujemy dr Tobiasowi Dickowi za dostarczenie pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Eksperymenty pokazane w Rysunek 4 zostały przeprowadzone w Centrum Obrazowania Nikona na Uniwersytecie w Heidelbergu. Rysunek 2 został przygotowany za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynniki
chlorek wapnia (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC3306
Diamid (DA)Sigma-AldrichD3648
Ditiothreitol (DTT)Carl Roth GmbH6908.1
Glukoza (roztwór podstawowy 2,5 M)Sigma-AldrichG8769
GlukozaSigma-AldrichG7528
GlicynaneoFroxx GmbHLC-4522.2
HEPES (roztwór podstawowy 1 M)Sigma-Aldrich15630-080
HEPESSigma-AldrichH4034
Chlorek magnezu (MgCl2· 6H2O)Sigma-Aldrich442611-M
N-metylo-D-asparaginian (NMDA)Sigma-AldrichM3262
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP3911
Chlorek sodu (NaCl)neoFroxx GmbHLC-5932.1
Pirogronian sodu (0,1 M roztwór podstawowy)Sigma-AldrichS8636
Pirogronian soduSigma-AldrichP8574
SacharozaCarl Roth GmbH4621.1
Nadchloran estru etylowego tetrametylorodaminy (TMRE)Sigma-Aldrich87917
equipment
komora obrazowaniaLife Imaging Services (Bazylea, Szwajcaria)10920Komora Ludin Typ 3 dla & Oslash;
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyLeicaDMI6000
laserowy skaningowy mikroskop konfokalny, jednostka skanującaPompaSP8
VWRPP1080 181-4001
, kameraHamamatsuC9100-02 EMCCD
konfokalny z wirującym dyskiem, system inkubacjiTokaiHitINU-ZILCF-F1
konfokalny z wirującą tarczą, mikroskopNikonTi
konfokalny z wirującą tarczą, jednostka skanującaYokagawaCSU-X1
software
FIJIhttps://fiji.sc
wtyczka StackReg
https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.javaTurboReg
12 mm, mikroskop perystaltyczna Leica Mikroskop konfokalny mikroskop mikroskop mikroskop https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java wtyczki

Bibliografia

  1. Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
  2. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  3. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  4. Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
  5. Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
  6. Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
  7. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  8. Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  9. Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
  10. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
  11. Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
  12. Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
  13. Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
  14. Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604(2009).
  17. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  18. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  19. Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
  20. Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
  21. Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
  22. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
  23. Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
  24. Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
  25. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
  26. Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Stan redoks mitochondriówpotencjał redoks glutationukonfokalna mikroskopia żywych komóreksensor Grx1-roGFP2potencjał błonowy mitochondriówtraktowanie NMDAanaliza w programie ImageJobrazowanie współmierne z TMRE
Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.