Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni

.

Streszczenie

Badanie fizjologicznych właściwości określonych synaps w mózgu i tego, jak przechodzą one zmiany plastyczne, jest kluczowym wyzwaniem dla nowoczesnej neuronauki. Tradycyjne techniki elektrofizjologiczne in vitro wykorzystują stymulację elektryczną do wywołania transmisji synaptycznej. Główną wadą tej metody jest jej niespecyficzny charakter; Wszystkie aksony w obszarze elektrody stymulującej zostaną aktywowane, co utrudni przypisanie efektu do konkretnego połączenia aferentnego. Problem ten można rozwiązać, zastępując stymulację elektryczną stymulacją opartą na optogenetyce. Opisano metodę łączenia optogenetyki z zapisami in vitro patch-clamp. Jest to potężne narzędzie do badania zarówno podstawowej transmisji synaptycznej, jak i plastyczności synaptycznej precyzyjnie anatomicznie zdefiniowanych połączeń synaptycznych i ma zastosowanie do prawie każdej ścieżki w mózgu. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i postępowanie z wektorem wirusowym kodującym białko rodopsyny kanałowej do chirurgicznego wstrzyknięcia do interesującego obszaru presynaptycznego (przyśrodkowa kora przedczołowa) w mózgu gryzonia i tworzenia ostrych wycinków dalszych regionów docelowych (boczna kora śródwęchowa). Przedstawiono również szczegółową procedurę łączenia zapisów patch-clamp z aktywacją synaps przez stymulację światłem w celu zbadania krótko- i długoterminowej plastyczności synaptycznej. Omawiamy przykłady eksperymentów, które osiągają specyficzność szlaku i komórki poprzez połączenie optogenetyki i znakowania komórek zależnych od Cre. Na koniec opisano histologiczne potwierdzenie interesującego regionu presynaptycznego wraz z znakowaniem biocytyny komórki postsynaptycznej, aby umożliwić dalszą identyfikację dokładnej lokalizacji i typu komórki.

Wprowadzenie

Zrozumienie fizjologii synaps i tego, jak przechodzą one zmiany plastyczne, jest fundamentalne dla zrozumienia, jak funkcjonują sieci mózgowe w zdrowym mózgu¹, oraz jak działają nieprawidłowo w zaburzeniach mózgu. Zastosowanie ostrych wycinków mózgu ex vivo pozwala na rejestrację aktywności elektrycznej synaps z pojedynczych neuronów o wysokim stosunku sygnału do szumu przy użyciu nagrań z całych komórek. Kontrola potencjału błonowego i prosta manipulacja farmakologiczna pozwala na izolację podtypów receptorów. Nagrania te mogą być wykonane z wyjątkową szczegółowością w celu identyfikacji neuronu postsynaptycznego, w tym pozycji laminarnej i subregionalnej², morfologia komórkowa³, obecność markerów molekularnych⁴, jego projekcje aferentne⁵, a nawet jeśli był ostatnio aktywny⁶.

Osiągnięcie specyficzności presynaptycznych danych wejściowych jest jednak nieco trudniejsze. Konwencjonalna metoda wykorzystuje elektrody stymulacyjne do wzbudzania aksonów, które biegną w określonej blaszce. Przykładem tego jest hipokamp, gdzie miejscowa stymulacja w warstwie promienistej aktywuje synapsy, które rzutują z podpola CA3 do CA1⁷. W tym przypadku specyficzność presynaptyczna jest osiągana, ponieważ wejście CA3 reprezentuje jedyne wejście pobudzające zlokalizowane w warstwie promienistej, które rzutuje na komórki piramidalne CA1⁸. Ten wysoki stopień specyficzności wejściowej, który można osiągnąć przy konwencjonalnej elektrycznej presynaptycznej aktywacji aksonów CA3-CA1, jest jednak wyjątkiem, który znajduje odzwierciedlenie w intensywnych badaniach, którym poddano tę synapsę. W innych obszarach mózgu aksony z wielu szlaków aferentnych współistnieją w tej samej blaszce, na przykład w warstwie 1 kory nowej⁹, uniemożliwiając w ten sposób stymulację presynaptyczną specyficzną dla danych wejściowych za pomocą konwencjonalnych elektrod stymulujących. Jest to problematyczne, ponieważ różne wejścia synaptyczne mogą mieć rozbieżne właściwości fizjologiczne; W związku z tym ich kostymulacja może prowadzić do błędnej charakterystyki fizjologii synaptycznej.

Pojawienie się optogenetyki, genetycznego kodowania światłoczułych białek błonowych (opsyn), takich jak rodopsyna kanałowa-2 (ChR2), pozwoliło na znaczne rozszerzenie możliwości badania izolowanych projekcji synaptycznych między regionami mózgu^10,11. W tym miejscu opisujemy uogólnione i tanie rozwiązanie do badania fizjologii i plastyczności synaps dalekiego zasięgu. Konstrukty optogenetyczne są dostarczane w bardzo specyficzny sposób przy użyciu wektorów wirusowych, co pozwala na niezwykle precyzyjną kontrolę interesującego nas regionu presynaptycznego. Projekcje eferentne będą wyrażać kanał aktywowany światłem, co pozwoli na aktywację tych włókien w obszarze docelowym. W ten sposób można badać dalekosiężne, anatomicznie rozproszone ścieżki, które nie mogą być niezależnie aktywowane przez tradycyjną, niespecyficzną stymulację elektryczną.

Opisujemy, jako przykładową ścieżkę, transdukcję przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) za pomocą wirusów związanych z adenowirusami (AAV) kodującymi pobudzające opsyny kanału kationowego. Następnie opisujemy przygotowanie ostrych wycinków z bocznej kory śródwęchowej (LEC), zapisy patch-clamp z neuronów piramidowych warstwy 5 LEC oraz wywołaną światłem aktywację glutaminergicznego projekcji mPFC-LEC (Ryc. 1). Opisujemy również ocenę histologiczną miejsca wstrzyknięcia w celu potwierdzenia lokalizacji interesującego regionu presynaptycznego i identyfikacji morfologii komórek postsynaptycznych.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Procedurach Naukowych dla Zwierząt w Wielkiej Brytanii (1986) i powiązanymi wytycznymi, jak również lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi.

1. Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa

UWAGA: Obecny protokół wymaga anatomicznej, ale nie postsynaptycznej specyficzności komórek.

1. Wybierz odpowiednie zwierzę. W tym protokole wykorzystano samce szczurów zakapturzonych Lister typu dzikiego (300-350 g, w wieku około 3 miesięcy).
2. Wybierz odpowiedni konstrukt wirusowy. Jest kilka czynników, które należy wziąć pod uwagę (patrz Dyskusja). Obecny protokół wykorzystuje wirusa do ekspresji kanału optogenetycznego_{ChETA TC}¹², do transdukcji neuronów pobudzających (AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; miano: 3,3 x 10¹³ genomów wirusa/ml).
3. Ustal współrzędne i objętość wstrzyknięcia za pomocą atlasu mózgu, jak opisano wcześniej³⁵.
4. Stereotaktyczne wstrzyknięcie preparatu wirusowego
   UWAGA: Należy przestrzegać wszystkich odpowiednich krajowych i instytucjonalnych wytycznych dotyczących wykorzystywania zwierząt i opieki nad nimi. Wektory wirusowe są wstrzykiwane stereotaktycznie, jak opisano wcześniej¹³ z następującymi modyfikacjami.
   1. Preparat wirusowy należy przechowywać na lodzie podczas znieczulenia i przygotowania zwierzęcia.
   2. Wywołać znieczulenie w anestezjologicznej komorze indukcyjnej z 4% izofluranem. Monitoruj poziom znieczulenia, na który wskazuje wolniejsze regularne tempo oddychania (1 Hz) oraz brak odruchów pedałowania i rogówki (test, odpowiednio przez ściskanie palców u nóg i lekkie dotykanie kącika oka; nie powinna być wykryta żadna reakcja).
   3. Przedoperacyjne leki przeciwbólowe, takie jak meloksykam, należy podać co najmniej 30 minut przed zabiegiem inwazyjnym.
   4. Gdy zwierzę jest w pełni znieczulone, użyj maszynki do strzyżenia, aby usunąć sierść ze skóry głowy. Przełącz przepływ izofluranu na stożek nosowy ramy stereotaktycznej i zamontuj szczura w ramce. Nałóż nawilżający żel pod oczy na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.
   5. Zabieg powinien być przeprowadzony w warunkach aseptycznych. Przez cały czas trwania zabiegu należy używać sterylnych rękawiczek i narzędzi. Nałóż maść z lidokainą (5% w/w) przed dezynfekcją skóry głowy 4% w/v roztworem chlorheksydyny, a następnie przykryj ciało sterylnym serwetem. Za pomocą skalpela wykonaj podłużne nacięcie o długości około 15 mm na skórze głowy, aby odsłonić bregmę.
   6. Załaduj strzykawkę Hamilton do pompy strzykawkowej do mikroiniekcji przymocowanej do ruchomego ramienia zamontowanego na ramie stereotaktycznej.
   7. Umieścić 5 μl porcji wirusa w probówce o pojemności 0,2 ml i wirować przez kilka sekund, aż cała objętość znajdzie się na dnie probówki. Odpipetować pipetą 2 μl preparatu wirusowego do wieczka probówki.
   8. Napełnić strzykawkę preparatem wirusowym, najpierw oglądając końcówkę igły pod mikroskopem chirurgicznym, a następnie ręcznie umieścić bolus wirusa na końcu igły i wyjąć tłok strzykawki za pomocą elementów sterujących pompy.
   9. Ustawić objętość wtrysku pompy na 300 nL, a natężenie przepływu na 100 nL/min. Uruchomić pompę i potwierdzić prawidłowy przepływ, obserwując kroplę wirusa na końcu igły. Wchłoń wirusa na patyczek kosmetyczny i delikatnie wyczyść igłę 70% etanolem.
   10. Za pomocą regulacyjnych na ramie stereotaktycznej przejdź końcówką igły do bregmy (punktu na czaszce, w którym spotykają się szwy koronalne i strzałkowe) i zanotuj pomiary stereotaktyczne zaobserwowane na trzech skalach noniusza na ramie. Współrzędne względem bregmy szczura mPFC to przednio-tylne + 3,1 mm, przyśrodkowo-boczne ± 0,7 mm, grzbietowo-brzuszne - 4,5 mm; Dodaj/odejmij (jak wskazano) te odległości od współrzędnych Bregma, a następnie nawiguj igłą do współrzędnych przedniej-tylnej i przyśrodkowej i delikatnie opuść igłę na powierzchnię czaszki.
       UWAGA: Współrzędne mPFC podane powyżej są odpowiednie dla samców szczurów zakapturzonych lister o wadze 300-350 g; zmiany w szczepie szczurów, rozmiar mogą wymagać zmian w tych współrzędnych (patrz Dyskusja).
   11. Podnieś igłę z powierzchni czaszki i zaznacz ten punkt markerem permanentnym z cienką końcówką. Wykonaj w tym miejscu otwór na zadziory za pomocą mikrowiertła zamontowanego na ramieniu stereotaktycznym.
   12. Wbij igłę do mózgu w ustalonym wcześniej współrzędnym grzbietowo-brzusznym i wlej z góry określoną objętość (dla mPFC: 300 nL). Pozostawić igłę na miejscu na 10 minut, aby umożliwić dyfuzję bolusa. Po wyjęciu igły uruchom pompę, aby upewnić się, że igła nie jest zablokowana.
       UWAGA: Powoli wkładaj i wyjmuj igłę (~3 mm/min), aby zminimalizować uszkodzenie tkanki mózgowej i cofanie się wirusa do przewodu igły.
   13. Podawać podskórnie 2,5 ml podgrzanego roztworu chlorku sodu (0,9% w/v) i glukozy (5% w/v) w celu utrzymania nawodnienia.
   14. Powtórz krok 1.4.12 dla drugiej półkuli.
   15. Zszyj nacięcie skóry głowy, a po zakończeniu zabiegu podaj 2,5 ml roztworu chlorku sodu i glukozy oraz odpowiedni, instytucjonalnie zalecany, środek przeciwbólowy do leczenia bólu, np. buprenorfinę lub meloksykam. Nie pozostawiaj zwierzęcia nieprzytomnego bez opieki. Umieść szczura w podgrzewanym pudełku do rekonwalescencji, aż całkowicie odzyska przytomność. Wróć do klatki domowej z innymi zwierzętami dopiero po całkowitym wyzdrowieniu.
   16. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki pooperacyjnej i procedur trzymania gryzoni transfekowanych wirusem. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy odczekać co najmniej 2 tygodnie, aż transgen opsyny ulegnie odpowiedniej ekspresji.
       UWAGA: Czas potrzebny na transdukcję zależy od odległości i siły połączenia między regionami pre- i postsynaptycznymi. W przypadku mPFC do LEC wymagane jest 4-6 tygodni.

2. Przygotowanie ostrych wycinków mózgu

UWAGA: Tutaj opisujemy prostą metodę przygotowania wycinków mózgu, która w naszych rękach wystarcza do uzyskania wysokiej jakości plastrów korowych, hipokampowych i wzgórzowych od dorosłych myszy i szczurów.

1. Przygotuj roztwory do sekcji.
   1. Napełnij zlewkę o pojemności 250 ml ~200 ml lodowatego roztworu do cięcia sacharozy (189 mM sacharozy, 26 mM NaHCO₃, 10 mM D-glukozy, 5 mM MgSO₄, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄ i 0,2 mM CaCl₂ wytworzonego w ultraczystej wodzie (UPW) o rezystywności 18,2 MΩ cm w temperaturze 25 °C) lub objętości wystarczającej do napełnienia komory tkankowej wibratomu. Bąbelkować karbogenem (95%_O2, 5% CO₂) i trzymać na lodzie.
   2. Napełnij komorę zbiorczą plastrów sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO₃, 10 mM D-glukozy, 3 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,25 mM NaH₂PO₄ i 1 mM_MgSO4 wyprodukowanym w UPW) w temperaturze pokojowej, bąbelkowanym karbogenem. Komora do zbierania plastrów¹⁴ jest wykonana na zamówienie z stojaka na probówki do mikrowirówek przyklejonego do arkusza nylonowej siatki i umieszczonego w zlewce, w której jest zanurzony w CSF (Rysunek 2A).
   3. Napełnij probówkę o pojemności 50 ml 4% paraformaldehydem (PFA) w buforze fosforanowym (PB; 75,4 mM Na₂HPO_{4,7H 2}O i 24,6 mM NaH₂PO₄. H₂O).
      UWAGA: PFA jest toksyczny. Stosować w dygestorium.
2. Sekcja mózgu.
   1. Znieczulić szczura w komorze indukcyjnej przy użyciu 5% izofluranu, aż oddech będzie powolny i regularny (~1 Hz). Aby zapewnić wystarczający poziom znieczulenia, przetestuj na brak odruchów pedałowania i rogówki.
   2. Odetnij głowę zwierzęciu za pomocą gilotyny.
   3. Szybko wypreparuj cały mózg, jak wcześniej opisano¹⁵ i przenieś do roztworu do cięcia sacharozy. Wykonaj ten krok w ciągu 90 sekund od dekapitacji, aby uzyskać dobrą jakość wycinka i pomyślne nagranie całej komórki.
   4. Za pomocą metalowej łyżeczki podnieś mózg, wyrzuć nadmiar roztworu do krojenia i umieść go na kawałku bibuły filtracyjnej na blacie.
   5. Za pomocą skalpela lub żyletki szybko usuń móżdżek i przetnij mózg w płaszczyźnie koronalnej mniej więcej w połowie jego długości; tylna połowa to blok tkankowy LEC. Pamiętaj, aby dodać trochę nadmiaru tkanki oprócz obszaru, który ma zostać pokrojony, aby wykonać kolejne kroki. Zwróć zarówno ten blok tkankowy, jak i pozostałą część mózgu do roztworu do cięcia sacharozy.
   6. Umieść kroplę kleju cyjanoakrylowego na etapie tkanki wibratomowej. Rozprowadź go na cienkiej warstwie o powierzchni nieco większej niż blok tkanki utworzony w poprzednim kroku.
   7. Podnieś blok tkankowy LEC za pomocą łyżeczki, wylej nadmiar roztworu i przenieś na plaster kleju tak, aby przednie nacięcie koronowe przylegało.
   8. Zainstaluj stolik w komorze tkankowej wibratomu i szybko wlej wystarczającą ilość roztworu do cięcia sacharozy, aby zanurzyć tkankę; bąbelkować ten roztwór karbogenem. Ustaw blok tkankowy LEC z powierzchnią brzuszną w kierunku ostrza. Chociaż oświetlenie otoczenia w pomieszczeniu jest niewystarczające do aktywacji opsyny, unikaj używania dodatkowych źródeł światła, które mogą być obecne na wibratomie.
   9. Plastry o grubości 350 μm należy ciąć od strony brzusznej do grzbietowej, korzystając z dużej prędkości oscylacji ostrza (100 Hz) i powolnego posuwu ostrza (0,06 mm/s). Zazwyczaj można uzyskać siedem plasterków LEC na półkulę.
   10. Przenieś plastry do komory na plastry. Po zakończeniu zbierania plastrów przenieś komorę zbiorczą do łaźni wodnej o temperaturze 34 °C na 1 godzinę przed powrotem do temperatury pokojowej. Bąbelki z karbogenem w sposób ciągły. Plasterki będą wystarczająco zdrowe, aby można je było nagrywać przez co najmniej 6 godzin.
   11. Pozostałą część mózgu umieścić w PFA na 48 godzin w celu przeprowadzenia badania post-hoc miejsca wstrzyknięcia (patrz punkt 4).

3. Elektrofizjologia i stymulacja optogenetyczna

1. Identyfikacja komórki docelowej.
   1. Umieścić plasterek w zanurzonej komorze zapisowej w temperaturze 34 °C perfuzjowanej płynem CSF z szybkością 2 ml/min za pomocą pompy perystaltycznej. Unieruchomić plasterek za pomocą kotwicy do cięcia.
   2. Pod obiektywem o małym powiększeniu (4x) mikroskopu szerokokątnego wykorzystującego ukośne oświetlenie w podczerwieni przejdź do warstwy 5 LEC. Zmierz odległość od powierzchni powierzchni do wymaganej warstwy.
      UWAGA: Ukośne oświetlenie w podczerwieni uzyskano poprzez umieszczenie diody LED bliskiej podczerwieni około 3 mm poniżej szkiełka nakrywkowego komory nagraniowej pod kątem ~55° do płaszczyzny szkiełka nakrywkowego (Rysunek 2B). Różnicowy kontrast interferencyjny jest alternatywną i powszechnie stosowaną techniką obrazowania w elektrofizjologii warstw.
   3. Zmień na obiektyw zanurzeniowy w wodzie o dużym powiększeniu (40x) i zidentyfikuj neurony piramidowe. Zaznacz położenie komórki na monitorze komputera za pomocą taśmy.
      UWAGA: Neurony piramidowe mają z grubsza trójkątną morfologię z wydatnymi dendrytami wierzchołkowymi wystającymi w kierunku powierzchni wycinka (Ryc. 3A). Zdrowie komórek można ocenić na podstawie braku skondensowanego, widocznego jądra i kontroli błony plazmatycznej, która powinna wydawać się gładka. Jest mało prawdopodobne, że wyraźne znakowanie fluorescencyjne aksonów przez białko fuzyjne opsyny i fluoroforu będzie widoczne przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego. Aby uwidocznić projekcje aksonalne, należy przeprowadzić immunohistochemię post hoc przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko fluoroforowi opsyny i amplifikować przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem o tej samej lub podobnej długości fali.
2. Tworzenie opaski krosowej całej komórki.
   1. Wykonać mikropipetę ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do pipet i napełnić ją przefiltrowanym wewnątrzkomórkowym roztworem rejestrującym (120 mM k-glukonianu, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA i 0,25% biocytyny wytworzonej w UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Umieść napełnioną mikropipetę w uchwycie elektrody na patch-clamp amplifier headstage, upewniając się, że drut elektrody styka się z roztworem wewnątrzkomórkowym.
   2. Zastosować nadciśnienie doustnie, mocno w ustnik (taki jak strzykawka o pojemności 1 ml z usuniętym tłokiem) podłączonej rurką do bocznego portu uchwytu elektrody i utrzymuj ciśnienie, zamykając wbudowany zawór trójdrogowy. Podnieś obiektyw mikroskopu tak, aby utworzyła się menisk i włóż elektrodę do menisku, aż będzie widoczny pod mikroskopem.
   3. Otwórz okno Seal Test w WinLTP¹⁶ (lub innym oprogramowaniu do akwizycji/oscyloskopie) i gdy wzmacniacz jest w trybie cęgów napięciowych, zastosuj impuls kwadratowy 5 mV, aby określić, czy rezystancja pipety wynosi 3-6 MΩ.
   4. Zbliżyć się do zidentyfikowanej komórki i dotknąć jej końcówką pipety; powinno to spowodować wgłębienie w błonie komórkowej (Rysunek 3A; prawy panel) i niewielki wzrost oporu pipety (0,1 MΩ).
   5. Zwolnij nadciśnienie i zastosuj podciśnienie, stosując umiarkowane ssanie ustnika; powinno to spowodować znaczny wzrost oporu pipety (>1000 MΩ). Ciśnienie można teraz pozostawić neutralne. Zastosuj podciśnienie w stopniowo rosnącej rampie, aż do pęknięcia błony komórkowej, co spowoduje stany przejściowe pojemności całej komórki.
3. Rejestruj optogenetycznie wywołane zdarzenia synaptyczne.
   1. Wprowadź konfigurację cęgów prądowych.
      UWAGA: W większości przypadków transmisja synaptyczna dalekiego zasięgu jest glutaminergiczne, dlatego zapis przy potencjałach błonowych zbliżonych do potencjału odwrócenia chlorków najlepiej wyizoluje transmisję za pośrednictwem receptora AMPA (AMPAR) i zminimalizuje pomiar wywołanego hamowania sprzężenia zwrotnego (FFI). Odwrócenie chlorków zależy od składu wewnątrzkomórkowego roztworu zapisującego i aCSF i można je obliczyć za pomocą równania Goldmana-Hodgkina-Katza; dla powyższych rozwiązań było to -61,3 mV. Neurony piramidowe warstwy 5 LEC miały średni spoczynkowy potencjał błonowy wynoszący -62 mV i, w razie potrzeby, były utrzymywane na tym poziomie przez wstrzyknięcie stałego prądu. Alternatywnie, ogniwa mogą być napięte do pożądanego potencjału. Aby zarejestrować dalekosiężne projekcje hamujące ¹⁶ lub aby zarejestrować FFI, zacisk napięcia przy potencjale odwrócenia kationu w celu wyizolowania przewodnictwa chlorku GABA-ergicznego. Gdy neurony zaciskają napięcie przy potencjałach błonowych powyżej progu potencjału czynnościowego, stosuje się wewnątrzkomórkowy roztwór na bazie cezu zawierający bramkowane napięciem blokery kanałów sodowych w celu poprawy zacisku napięcia i zapobieżenia inicjacji potencjałów czynnościowych (130 mM CsMeSO₄, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM chlorek QX 314, 4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% biocytyny wytwarzanej w UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm).
   2. Korzystając z oprogramowania do akwizycji danych, wyślij sygnały logiki tranzystor-tranzystor (TTL) do sterownika LED, aby aktywować zamontowaną diodę LED 470 nm. Zamontowana dioda LED jest kierowana na ścieżkę światła mikroskopu za pomocą kostek filtrujących i odpowiedniego układu optycznego (Rysunek 2B) w celu przyłożenia impulsów świetlnych do warstwy za pomocą obiektywu 40x w celu wywołania optogenetycznych pobudzających potencjałów postsynaptycznych (oEPSPs).
      UWAGA: Impulsy świetlne mogą być stosowane perysomatycznie / nad dendrytami, co spowoduje aktywację opsyn w aksonach i presynaptycznym bulionie, lub badacz może przesunąć cel na aksony z dala od zarejestrowanej komórki, aby uniknąć nadmiernej stymulacji (patrz Dyskusja). Maksymalna amplituda oEPSP zależy od siły projekcji synaptycznej, skuteczności zastrzyków wirusowych i zastosowanej opsyny. oEPSP można miareczkować do żądanej amplitudy, zmieniając natężenie i/lub czas trwania światła¹⁸; zmiana czasu trwania impulsów świetlnych (typowy czas trwania między 0,2-5 ms przy maksymalnej mocy wyjściowej LED, co daje gęstość światła 4,4 mW/mm¹⁹) daje bardziej spójne amplitudy oEPSP niż zmiana mocy wyjściowej diody LED.
   3. Zbadaj presynaptyczne właściwości uwalniania (zmiana napięcia) poprzez dostarczanie ciągów wielu impulsów świetlnych o różnych odstępach między bodźcami (Rysunek 3E); należy zachować ostrożność przy interpretacji transmisji wywołanej optogenetycznie (patrz Dyskusja).
   4. Zbadaj długoterminową plastyczność, powtarzając przywoływanie oEPSPs¹⁹ lub zastosowanie ligandów. Monitoruj amplitudę oEPSP przez 5-10 minut, aby zapewnić stabilność przed indukcją plastyczności, a następnie monitoruj, aż do osiągnięcia stabilnej amplitudy (zwykle 30-40 min).
      UWAGA: Większość obecnych opsyn nie jest w stanie niezawodnie wywołać wielu potencjałów czynnościowych przy wysokich częstotliwościach, np. 100 bodźców dostarczanych przy 100 Hz, jak to jest zwykle używane do indukcji LTP.
   5. Aby potwierdzić, że oEPSP są monosynaptyczne, należy przeprowadzić nadmierną aktywację transdukowanego szlaku, umieszczając obiektyw nad trzpieniem dendrytycznym i stymulując w obecności 0,5 μM tetrodotoksyny i 100 μM aminopirydyny. Zastosowanie tetrodotoksyny zniesie transmisję, jeśli odpowiedzi są zależne od potencjału czynnościowego, a późniejsze włączenie aminopirydyny częściowo przywróci transmisję, jeśli oEPSP są generowane monosynaptycznie^19,20.
   6. Aby biocytyna mogła wypełnić neuron, odczekaj co najmniej 15 minut po wejściu w konfigurację całej komórki. W zacisku napięciowym monitoruj pojemność membrany i rezystancję wejściową.
   7. Powoli wycofaj pipetę wzdłuż kąta natarcia z dala od somy komórki, obserwując powolny zanik stanów przejściowych pojemności i prądu membranowego, co wskazuje na ponowne uszczelnienie błony komórkowej i utworzenie zewnętrznej plamy na końcówce pipety. Zwróć uwagę na orientację wycinka i położenie komórek w wycinku. Umieścić plaster w PFA na 24-dołkowej płytce i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przenieść do 0,1 M PB.
      UWAGA: Plastry można przechowywać do tygodnia. Jeśli wymagane jest dłuższe przechowywanie, należy regularnie zmieniać PB lub używać PB zawierającego azydek sodu (0,02%-0,2% azydku sodu).

4. Histologia

1. Krojenie miejsca wstrzyknięcia
   1. Po utrwaleniu należy krioprotycznie chronić tkankę w 30% sacharozie (w/v) w PB, aż do zatonięcia (początkowo będzie unosić się w roztworze sacharozy), zwykle przez noc w temperaturze pokojowej lub 24-48 godzin w temperaturze 4 °C.
   2. Używając pożywki o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), przymocuj blok tkanki do dysku próbki kriostatu. Zamrozić blok tkankowy, wykonując czynności opisane w punktach 4.1.3–4.1.4.
   3. Umieść izopentan w odpowiednim pojemniku. Zanurz tylko krążek próbki, upewniając się, że tkanka znajduje się powyżej poziomu izopentanu. Opuścić pojemnik z izopentanem do ciekłego azotu (lub suchego lodu) i pozostawić tkankę do zamrożenia.
   4. Po całkowitym zamrożeniu (cały blok tkanki staje się blady i twardy), pozostaw blok tkanki w komorze kriostatu w temperaturze -20 °C na 30 minut, aby temperatura bloku się wyrównała.
   5. Wyciąć odcinki o grubości 40 μm w kriostacie w temperaturze -20 °C. Za pomocą cienkiego pędzla poprowadzić sekcje z ostrza. Zamrożone sekcje należy przykleić do szklanego szkiełka mikroskopowego o temperaturze pokojowej, pokrytego poli-L-lizyną, dotykając szkiełka do sekcji.
   6. Dodać około 150 μl podłoża mocującego do każdego szkiełka podstawowego i przykryć szkiełkiem nakrywkowym; usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, delikatnie naciskając szkiełko nakrywkowe. Przykryj szkiełka w celu ochrony przed fotowybielaniem i schnij na powietrzu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 12 godzin (lub przez noc). Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zbadaj lokalizację miejsca wstrzyknięcia wirusa.
2. Protokół barwienia biocytyny
   UWAGA: Ten protokół można zastosować do grubych odcinków; Plastry nie muszą być ponownie dzielone na sekcje.
   1. Umyj plastry mózgu solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ i 1,8 mM KH₂PO₄) sześć razy przez 10 minut na pranie. Użyj pipety transferowej, aby opróżnić studzienki po każdym kroku.
   2. Inkubować plastry w 3% H₂O₂ (w/v) w PBS przez 30 minut, aby zablokować wszelką aktywność endogennej peroksydazy. To generuje pęcherzyki tlenu.
   3. Umyj plastry mózgu PBS sześć razy przez 10 minut na pranie lub do momentu, gdy nie będą widoczne dalsze pęcherzyki tlenu. Inkubować wycinki mózgu w 1% (v/v) roztworze biotynylowanego kompleksu HRP (ABC) w PBS zawierającym 0,1% (v/v) Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
   4. Umyj plastry mózgu PBS sześć razy przez 10 minut na pranie.
   5. Inkubować każdy plasterek w roztworze 3,3′-diaminobenzydyny (DAB) przez kilka minut, aż barwienie struktur neuronalnych biocytyną stanie się widoczne (trwa około 5-10 minut).
      UWAGA: DAB jest toksyczny. Stosować w dygestorium.
      UWAGA: Czas inkubacji DAB może być nieprzewidywalny, uważnie monitoruj tkankę w miarę rozwoju koloru.
   6. Zatrzymać reakcję, przenosząc plastry do zimnego (4 °C) PBS. Umyj plastry mózgu PBS sześć razy przez 10 minut na pranie. Użyj pędzla, aby zamontować plastry mózgu na szkiełkach mikroskopowych pokrytych poli-L-lizyną.
   7. Usuń nadmiar PBS czystą chusteczką. Przykryj każdą plastrę około 200 μl podłoża montażowego; Przykryj szkiełkami nakrywkowymi i delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby wypchnąć pęcherzyki powietrza. Suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 12 godzin (lub przez noc). Za pomocą mikroskopu świetlnego zbadaj lokalizację i szczegóły morfologiczne komórki (komórek).
      UWAGA: Biocytynę można alternatywnie uwidocznić za pomocą streptawidyny sprzężonej z fluoroforem; Jednak obrazowanie może wymagać resekcji lub użycia mikroskopu konfokalnego²¹.

Wyniki

W tym protokole opisujemy, jak badać fizjologię i plastyczność synaps dalekiego zasięgu za pomocą wirusowego dostarczania konstruktów optogenetycznych. Protokół można bardzo łatwo dostosować do badania prawie każdego połączenia dalekiego zasięgu w mózgu. Jako przykład opisujemy wstrzyknięcie AAV kodujących opsynę do mPFC szczura, przygotowanie ostrych wycinków z LEC, nagrania patch-clamp z neuronów piramidalnych warstwy 5 LEC oraz wywołaną światłem aktywację końcówek mPFC w LEC (Rysunek 1).

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę badania wysoce specyficznych projekcji synaptycznych dalekiego zasięgu przy użyciu kombinacji chirurgii stereotaktycznej w celu dostarczenia AAV kodujących konstrukty optogenetyczne i elektrofizjologii w ostrych wycinkach mózgu (ryc. 1). Razem techniki te oferują narzędzia do charakteryzowania fizjologii i plastyczności obwodów mózgowych z dużą precyzją w dalekiego zasięgu i anatomicznie rozproszonych ścieżkach, które wcześniej były niedostępne prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka 0,2 ml	Fisher Scientific Ltd	12134102
10 µ Pipeta L	Gilson	FD10001
24-dołkowa płytka	SARSTEDT	83.3922
3-drogowy zawór luer	Cole-Parmer	WZ-30600-02
Podłoże 3,3′-diaminobenzydyny (DAB)	Vector Laboratories	SK-4105
40x obiektyw	Olympus	LUMPLFLN40XW
4-aminopirydyna	Hello Bio	HB1073
Obiektyw 4x	Olympus	PLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry	Addgene	35512	Miano wirusa: 3,3x1013 GC/ml
Soczewka achromatyczna	Edmund Optics	49363	Skupia się na widmie widzialnym i bliskiej podczerwieni
Mikrowirówka stołowa	Benchmark Scientific	C1005*
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Kapilara ze szkła borokrzemianowego	Warner Instruments	G150F-6
Burr	Narzędzia do precyzyjnej nauki	19008-07
Kamera CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
- Qimaging Retiga Electro	Photometrics	01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol	Tocris	2810
Peeling chirurgiczny z chlorheksydyną	Vetasept	XHG008
Maszynki do strzyżenia	Andis	22445	AGC Super 2-biegowa maszynka do strzyżenia z odłączanym ostrzem
Kolimacyjna soczewka kondensatora	ThorLabs	ACL2520-A
Szkiełka nakrywkowe	Fisher Scientific Ltd	10011913
Kriostat	Leica	CM3050 S
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	C1426
Klej cyjanoakrylowy	Rapid Electronics Ltd	84-4557
Urządzenie do akwizycji danych	National Instruments	USB-6341 BNC
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G8270
Lustro dichroiczne 500 nm długoprzepustowe	Edmund Optics	69899
Lustro dichroiczne 600 nm długoprzepustowe	Edmund Optics	69901
Kostka zwierciadła dichroicznego	ThorLabs	CM1-DCH/M
	EGTA Millpore	324626
Uchwyt elektrody z portem bocznym	HEKA	895150
Filtr	emisyjny Chroma	59022m
Filtr wzbudzenia	Chroma	ET570/20x
Żel pod oczy	Dechra	Lubrithal
Drobny pędzel	Naukowe Materiały laboratoryjne	BRU2052
Świat gilotyny	Instrumenty precyzyjne	DCAP
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Roztwór nadtlenku wodoru	Sigma-Aldrich	H1009	30% (w/w)
Izofluran	Henry Schein	988-3245
Isopentane	Sigma-Aldrich	M32631
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
k-glukonian	Sigma-Aldrich	G4500
Kinematyczna kostka filtra fluorescencyjnego	ThorLabs	DFM1T1
Sterownik LED	ThorLabs	LEDD1B
Maść lidokainowa	Teva	80007150
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Mikrowiertarka	Aparat Harvard	75-1887
Ściągacz mikroelektrod	Instrumenty Sutter	P-87
Strzykawka do mikroiniekcji	Hamilton	7634-01/00
Igła do mikroiniekcji	Hamilton	7803-05	Specyfikacja niestandardowa: rozstaw 33, długość 15mm, styl punktowy 4 - 12°
Pompa strzykawkowa do mikroiniekcji	World Precision Instruments	UMP3T-1
Zamontowana niebieska dioda LED	ThorLabs	M470L5
Zamontowana zielona dioda LED	ThorLabs	M565L3
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
NIR LED	OSRAM		SFH4550Innym powszechnie stosowaną metodą jest refrakcyjne obrazowanie w podczerwieni warstwy, optyka z kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC)
Medium OCT	VWR International	RAYLLAMB/OCT	Optymalna temperatura cięcia medium
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
Wzmacniacz zaciskowy	Molecular Devices	700A
Pompa perystaltyczna	World Precision Instruments	Ministar
Szkiełka mikroskopowe pokryte poli-L-lizyną	Fisher Scientific Ltd	23-769-310
Komora nagraniowa	Warner Instruments	RC-26G
Ostrze skalpela	Swann Morton	#24
Kotwica Slice	Warner Instruments	SHD-26-GH/15
Ramka stereotaktyczna	Kopf	Model 902
Stereotaktyczny uchwyt do mikrowiertarki	Harvard Apparatus	75-1874
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389
Mikroskop chirurgiczny	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
Suture	Ethicon	W577H
Filtr strzykawkowy do zapisu wewnątrzkomórkowego rozwiązanie	Thermo Scientific Nalgene	171-0020
Cytrynian tetrodotoksyny	Hello Bio	HB1035
Pipety transferowe	Fisher Scientific Ltd	10458842
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Pionowy mikroskop fluorescencyjny	Leica	DM6 B
VECTASHIELD Antifade Medium montażowe z DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10
Zestaw VECTASTAIN ABC-HRP Vector	Laboratories	PK-4000
Vibratome	Campden Instruments	7000smz-2
WinLTP	https://www.winltp.com/	wersja 2.32	Oprogramowanie do akwizycji danych
Solution
aCSF
			do cięcia sacharozy
PFA
Intracellular?