$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Opisany tutaj protokół oferuje innowacyjne podejście do oceny zachowań obronnych wywoływanych przez wrodzone i wyuczone bodźce awersyjne. Komora testowa bez bezpiecznej kryjówki (ryc. 1) oraz obroża nasączona zapachem skóry/futra kotki domowej po owariektomii zostały wykorzystane do wywołania silnego i trwałego stanu zagrożenia u szczurów, który może być przydatny do zbadania obwodów nerwowych leżących u podstaw adaptacyjnych i nieadaptacyjnych reakcji obronnych.
Powszechnie wiadomo, że przejawianie określonych reakcji obronnych zależy od cech zarówno bodźca zagrożeniowego, jak i sytuacji/środowiska, w którym zwierzę ma do czynienia21,33. Unikanie, ocena ryzyka i zamrażanie są częścią szerokiego repertuaru reakcji obronnych zwierząt, które mogą być wywołane przez zagrażające bodźce 9,19. Wybór dominującej reakcji obronnej zależy jednak od warunków środowiskowych, takich jak odległość od zagrożenia33 lub obecność bezpiecznego miejsca wewnątrz komory badawczej21,33. Na przykład, gdy szczury są umieszczane na arenie z kryjówką, w obecności zapachu kota, wykazują zachowania obronne, takie jak pozycje rozciągające/opiekuńcze, głowa poza kryjówką i unikanie 6,24,25. Z kolei zamrożenie, czujne skanowanie i pozycje rozciągania/uczestniczenia są silnie wywoływane w sytuacjach, gdy ucieczka nie jest możliwa, a odległość do zagrożenia nie jest zbyt krótka33,34.
Badania wykazały, że narażenie na niekontrolowany stresor wywołuje różnorodne konsekwencje behawioralne, które różnią się od tych, które występują, gdy stresor jest kontrolowany 35,36,37,38. Na przykład nieunikniony, ale nie unikniony, wstrząs ogonowy prowadzi do dużego wzrostu serotoniny w jądrze szwu grzbietowego 3 5 i zachowań podobnych do lęku mierzonych 24 godziny po doświadczeniu awersyjnym36. Co więcej, niekontrolowane stresory zwiększają warunkowanie strachu u zwierząt36,37 i ludzi38. Naszym początkowym uzasadnieniem dla opracowania protokołu było wystawienie szczurów na sytuację, w której nie mogą kontrolować bodźca awersyjnego, a tym samym wykazywać silnych i trwałych reakcji na zagrożenie oraz rozwijać ulepszone uczenie się kontekstowe po jednorazowej i krótkiej ekspozycji na zapach kota.
W opisanym tutaj projekcie eksperymentalnym brak kryjówki wywołał silny i trwały stan obronny, który na przemian przechodził między zamrożeniem (tj. całkowitym bezruchem z wyjątkiem oddychania28) i oceną ryzyka (tj. czujne skanowanie i pozycje rozciągania/uczestniczenia29), które są zwykle uważane za behawioralne przejawy strachu i stanów podobnych do lęku u gryzoni (Figura 3). Warto zauważyć, że ten sam wzorzec reakcji obronnych wystąpił 24 godziny później, gdy szczury zostały ponownie wystawione na kontekst testowy, co wskazuje, że pojedyncza 10-minutowa ekspozycja na zapach sierści/skóry kota jest wystarczająca, aby wywołać długotrwałe kontekstowe uczenie się zagrożeń, jak wcześniej zgłaszano 7,10,11,14,15,34,39 (Figura 4).
Obroża dla kota z wewnętrzną filcową wyściółką została wykorzystana do skutecznego zbierania i wychwytywania zapachów/zapachów, a tym samym uzyskania wiarygodnej próbki bodźca zagrożenia, który wywołał silną reakcję obronną. Naukowcy wykorzystali bodźce awersyjne, takie jak odchody kota, mocz lub trimetylotiazolina (TMT, składnik odchodów lisów) w podobnych pracach. Niemniej jednak bodźce te wydają się być mniej predykcyjne co do natychmiastowej obecności drapieżnika, ponieważ są mniej zdolne do wywoływania uczenia się kontekstowego 40,41. Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami 2,4,8,9,10,11,20,34,39, zapach kota jest niezawodnym wrodzonym bodźcem awersyjnym, który może wywoływać trwałe reakcje obronne i kontekstową pamięć zagrożeń u szczurów. Z biegiem lat ten rodzaj etologicznego behawioralnego modelu zwierzęcego coraz bardziej przyciąga zainteresowanie naukowców do badania stresu i zaburzeń związanych ze stresem 13,14,15,16,17,23,42, takich jak te związane z nieprzystosowawczymi wspomnieniami strachu, takimi jak PTSD.
Protokół ten ma być stosowany w połączeniu z różnymi technikami eksperymentalnymi, w tym na przykład z biologią molekularną i komórkową oraz elektrofizjologią u zwierząt czuwających i zachowujących się, które dają możliwość odpowiedzi na otwarte pytania i lepszego zrozumienia adaptacyjnych i nieadaptacyjnych reakcji na zagrożenia. W tym badaniu przetestowaliśmy ideę, że, region mózgu zaangażowany w przetwarzanie emocji, jest niezbędny do wyrażania zachowań obronnych. Eksperymenty behawioralne połączono z immunohistochemią c-Fos w celu zmapowania wzorców aktywności neuronalnej w w odpowiedzi na zapach kota i domózgowe wlewy agonisty receptora GABA-A, muscymolu, w celu odwracalnego wyciszenia i określenia jego udziału we wrodzonych i wyuczonych reakcjach zagrożenia na zapach drapieżnika. Odkrycia te ujawniły, że zapach kota wywołał wzrost aktywności neuronalnej w (Figura 5), a wyciszenie doprowadziło do poważnego deficytu kontekstowej pamięci zagrożeń (Figura 6).
Chociaż opisany tutaj protokół jest technicznie prosty do wdrożenia i wykonania, może pojawić się kilka komplikacji. Na przykład zanieczyszczenie krzyżowe zapachem kota może wystąpić, jeśli nienoszona obroża wejdzie w kontakt ze zużytą obrożą dla kota. W związku z tym obroże muszą być przechowywane oddzielnie podczas wszystkich zabiegów, a rękawiczki należy zmieniać po umieszczeniu zużytej obroży w komorze testowej. Jeśli eksperymentator chce przeprowadzić warunki zapachowe i bezzapachowe przy użyciu tej samej komory testowej, eksperymenty muszą być wykonywane w różnych dniach. Do tych eksperymentów można użyć dwóch identycznych komór testowych34, a szczury powinny być trzymane w oddzielnych pomieszczeniach, aby uniknąć komunikacji społecznej43. Problemem może być również stres wywołany ekspozycją na nowe bodźce w nieznanym środowisku. W związku z tym zwierzęta muszą mieć co najmniej trzy dni przyzwyczajenia się do środowiska testowego i procedur mających na celu zmniejszenie stresu i postawy obronnej powszechnie wykazywanych przez szczury w nowych sytuacjach. Ponadto czas wymagany na okres przyzwyczajenia powinien być dłuższy niż okres testowy. Na przykład, jeśli test trwa 10 minut, na okres przyzwyczajenia należy przeznaczyć 20 lub 30 minut.
Wreszcie, zachowania obronne powinny być najlepiej oceniane w ciemnej fazie cyklu, kiedy szczury są aktywne. Szczury muszą być utrzymywane w odwróconym cyklu światło/ciemność, aby umożliwić przeprowadzenie procedur doświadczalnych, gdy zarówno szczur, jak i eksperymentator znajdują się w fazie aktywnej. Zmiana cyklu światło/ciemność trwa nie dłużej niż 10 dni, a z doświadczenia wynika, że większość szczurów w tym stanie reaguje odpowiednio na zapach kota. Istnieje jednak kilka badań, które pokazują, że szczury Sprague-Dawley są mniej podatne na długotrwałe uwarunkowanie zagrożeń i niepokój niż szczury Wistar44. W związku z tym możliwe jest, że użycie szczurów rasy Wistar zamiast szczurów szczepu Sprague-Dawley może przynieść bardziej solidne wyniki.
Podsumowując, zapach kota jest etologicznie istotnym zagrażającym bodźcem, który wywołuje wiarygodne reakcje neuronalne, endokrynologiczne i behawioralne u szczurów. Spotkanie z zapachem kota w nieuniknionej komorze prowadzi do silnej i długotrwałej reakcji strachu/lęku u szczurów, co skutkuje szybkim i trwałym kontekstowym uczeniem się zagrożeń. Opisany powyżej protokół może być użytecznym narzędziem do badania strachu oraz adaptacyjnych i nieadaptacyjnych mechanizmów kodowania pamięci zagrożeń.
