Artykuł metodologiczny

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

DOI:

10.3791/63081

⸱

21 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Food Nutrition and Human Health, School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, 2School of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Economics and Business, 3Perfect Life & Health Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Związane z wiekiem nieprawidłowe fałdowanie i agregacja patogennych białek są odpowiedzialne za kilka chorób neurodegeneracyjnych. Na przykład, choroba Huntingtona (HD) jest głównie napędzana przez powtórzenia nukleotydowe CAG, które kodują rozszerzony przewód glutaminowy w białku huntingtyny. Tak więc, hamowanie agregacji poliglutaminy (polyQ), a w szczególności neurotoksyczności związanej z agregacją, jest użyteczną strategią zapobiegania chorobie Huntingtona i innym chorobom związanym z poliQ. W artykule przedstawiono uogólnione protokoły eksperymentalne do oceny zdolności neuroprotekcyjnych badanych związków przeciwko HD przy użyciu uznanych modeli transgenicznych Caenorhabditis elegans polyQ. Szczep AM141 został wybrany do testu agregacji polyQ, ponieważ związany z wiekiem fenotyp dyskretnych agregatów fluorescencyjnych można łatwo zaobserwować w ścianie ciała w stadium dorosłym ze względu na specyficzną dla mięśni ekspresję białek fuzyjnych polyQ::YFP. W przeciwieństwie do tego, model HA759 z silną ekspresją dróg ekspandowanych poliQ w neuronach ASH jest używany do badania śmierci neuronów i zachowań chemounikania. Aby kompleksowo ocenić zdolność neuroprotekcyjną związków docelowych, powyższe wyniki testów są ostatecznie przedstawiane jako wykres radarowy z profilowaniem wielu fenotypów w sposób bezpośredniego porównania i bezpośredniego oglądania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępująca neurodegeneracja w chorobie Huntingtona obejmuje patogenną zmutowaną huntingtynę z nieprawidłowym odcinkiem polyQ kodowanym przez powtórzenia trinukleotydowe CAG1,2,3. Zmutowane białka huntingtyny z więcej niż 37 powtórzeniami glutaminy są podatne na agregację i akumulację w mózgach pacjentów z HD i modelach zwierzęcych4,5, co ostatecznie prowadzi do neurodegeneracji6. Pomimo braku jasności co do roli agregatów polyQ w patologii choroby5, hamowanie agregacji polyQ i związanej z tym toksyczności jest użyteczną strategią terapeutyczną w przypadku HD i innych chorób polyQ4,7,8.

Ze względu na zachowanie szlaków sygnalizacji neuronalnej i łatwe do skonstruowania modele chorób transgenicznych, Caenorhabditis elegans jest powszechnie stosowany jako główny organizm modelowy do badania zaburzeń neurologicznych9,10,11,12. Na przykład, transgeniczne modele C. elegans wyrażające podatne na agregację ekspansje polyQ mogą obiektywnie naśladować cechy podobne do HD, takie jak selektywna utrata komórek neuronalnych, tworzenie agregatów cytoplazmatycznych i defekty behawioralne13. Badanie potencjalnego wpływu próbek testowych na odwrócenie tych fenotypów w uznanych modelach nicieni polyQ doprowadziło do zidentyfikowania wielu obiecujących kandydatów terapeutycznych, np. polisacharydów7,14,15, oligosacharydy16, naturalne małe cząsteczki17,18 oraz ekstrakty i formuły ziołowe19,20.

Opisane tutaj są dwa główne modele polyQ C. elegans i odpowiednie protokoły dla potencjalnych zastosowań, czego przykładem jest badanie nad astragalanem, polisacharydem wyizolowanym z Astragalus membranaceus7. Do testu agregacji polyQ u C. elegans stosowanym modelem jest transgeniczny szczep AM141, który po osiągnięciu dorosłości wykazuje fluorescencyjne puncta rozproszone w mięśniu ściany ciała z powodu ekspresji białka fuzyjnego Q40::YFP, przewodu poliQ składającego się z 40 reszt (poliQ40) połączonych z żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP)21,22. Szczep HA759 został użyty do zbadania przeżycia neuronów i zachowania chemounikania, ponieważ wyraża zarówno białko zielonej fluorescencji (GFP), jak i Htn-Q150 (ludzki szlak poliQ pochodzący z huntingtyny składający się ze 150 reszt) silnie w neuronach ASH, ale słabo w innych neuronach, co skutkuje postępującą neurodegeneracją i śmiercią komórek ASH7,13. Kompleksowe podsumowanie potencjału neuroprotekcyjnego kandydatów terapeutycznych można uzyskać poprzez integrację wyników z różnych testów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby zapoznać się z recepturami rozwiązań używanych w tym protokole.

1. Przygotowanie materiałów do testu Caenorhabditis elegans

  1. Utrzymanie szczepów C. elegans
    1. Otrzymać szczepy C. elegans (AM141 i HA759) i Escherichia coli (OP50 i NA22) (patrz tabela materiałów).
    2. Utrzymuj nicienie na pożywce wzrostowej nicieni (NGM) wysiane E. coli OP50 w temperaturze 20 °C dla AM14121 lub 15 °C dla HA75923.
  2. Przygotowanie kultury bakterii E. coli OP50
    1. Wybierz pojedynczą kolonię E. coli OP50 z płytki smugowej Luria-Bertani (LB) i zaszczep ją w 50 ml płynnej kultury LB.
    2. Inkubować bakterie OP50 w wytrząsarce w temperaturze 37 °C i 200 obr./min do uzyskania gęstości optycznej ~0,5 przy 570 nm (OD570).
    3. Przechowuj kulturę bakterii OP50 w temperaturze 4 °C i zużyj ją w ciągu dwóch tygodni.
  3. Przygotowanie płytek NGM z bakteriami OP50
    1. Dodaj 20 g agaru, 2,5 g peptonu, 3,0 g NaCl i 975 ml wody dejonizowanej do butelki o pojemności 1 l. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 30 min.
    2. Umieść płynną butelkę agarową NGM na stole, aby ostygła do ~60 °C, a następnie dodaj następujące sterylne roztwory podstawowe: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg / ml cholesterolu i 25 ml 1 M fosforanu potasu (pH 6,0).
    3. Wlej 20 ml NGM do sterylnej szalki Petriego o średnicy 90 mm i pozostaw płytki na stole do ostygnięcia i zestalenia. Trzymaj talerze do góry nogami i pozwól im wyschnąć na ławce w temperaturze pokojowej przez 2 dni.
    4. Dozować 200 μl kultury bakterii OP50 na każdą płytkę NGM i równomiernie rozprowadzić za pomocą sterylnej pałeczki do powlekania szkłem. Zamknąć pokrywki i inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
    5. Przechowuj płytki NGM wysiane OP50 w plastikowym pudełku z pokrywką w temperaturze pokojowej i zużyj w ciągu dwóch tygodni.
  4. Przygotowanie populacji C. elegans zsynchronizowanej z wiekiem
    1. Zebrać grawitacyjne dorosłe nicienie do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 1000 × g przez 1 minutę. Przemyć trzykrotnie i ponownie zawiesić nicienie w buforze M9.
    2. Dodać równą objętość roztworu wybielacza i delikatnie mieszać przez 3-5 minut. Monitorować wybielanie co 15 s pod mikroskopem preparacyjnym.
      UWAGA: Roztwór wybielacza musi być przygotowany świeżo przed użyciem, mieszając równe objętości 10% NaOCl i 1 M NaOH (Tabela 1)20.
    3. Gdy większość nicieni zostanie rozbita, przerwij trawienie, rozcieńczając buforem M9. Szybko odwirować w celu usunięcia supernatantu i ponownie zawiesić osad w buforze M9, aby powtórzyć płukanie trzy razy.
    4. Zawiesić osad w podłożu S. Pozwól pozostałościom nicieni osiąść grawitacyjnie przez 2-3 minuty, podczas gdy jaja pozostaną w supernatancie.
    5. Zassać supernatant do nowej sterylnej probówki do mikrowirówki. Zebrać jaja przez odwirowanie w temperaturze 1000 × g przez 1 minutę.
    6. Odrzucić ~80% supernatantu i przenieść jaja do sterylnej kolby zawierającej 20 ml pożywki S. Umieścić kolbę w wytrząsarce i inkubować jaja przez noc bez jedzenia z prędkością 120 obr./min, aby uzyskać zsynchronizowane nicienie L1.

2. Test agregacji PolyQ

  1. Przygotowanie nicieni do testu agregacji polyQ
    1. Przenieść 300-500 zsynchronizowanych larw L1 AM141 do każdej studzienki 48-dołkowej płytki z 500 μl pożywki S zawierającej OP50 (OD570 0,7-0,8) i 5 mg/ml astragalanu, zwykle po jednej studzience na zabieg przez jeden punkt czasowy.
    2. Uszczelnić płytkę parafilmem i inkubować w temperaturze 20 °C i 120 obr./min przez 24, 48, 72 i 96 godzin.
    3. Zebrać nicienie w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przemyć buforem M9 >3 razy przez odwirowanie (1000 × g przez 1 minutę) w celu usunięcia pozostałego OP50. Ponownie zawieś nicienie AM141 w buforze M9 i utrzymuj je w gotowości do akwizycji obrazu.
  2. Akwizycja obrazów fluorescencyjnych i analiza danych
    UWAGA: Dane są automatycznie analizowane za pomocą tego systemu obrazowania o wysokiej zawartości. Jeśli automatyczne urządzenie do obrazowania nie jest dostępne, można zastosować konwencjonalną metodę przygotowania podkładki agarozowej do akwizycji obrazu, aby osiągnąć podobną wydajność przy użyciu zwykłego mikroskopu fluorescencyjnego7,15,17 (patrz kroki 3.2 i 3.3).
    1. Przenieść 10-15 nicieni do każdej studzienki na płytce 384-dołkowej (końcowa objętość 80 μl na studzienkę). Ustaw 10 powtórzonych studzienek dla każdego zabiegu.
    2. Dodaj 10 μl 200 mM azydku sodu do każdej studzienki, aby sparaliżować nicienie i pozwolić im osiąść na dnie (5-10 min).
    3. Umieść płytkę w systemie obrazowania o wysokiej zawartości, aby uzyskać obrazy fluorescencyjne (informacje o urządzeniu i oprogramowaniu znajdują się w Tabeli materiałów).
    4. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów i skonfiguruj następujące parametry.
      1. Otwórz okno Ustawienia akwizycji płyt i utwórz nowy zestaw eksperymentów oraz nazwę.
      2. Wybierz Powiększenie jako 2x, Kamera w binning jako 1 i Typ płytki jako Płytka 384-dołkowa.
      3. Ustaw studnie i miejsca (pojedyncze miejsce), które mają być odwiedzane.
      4. Wybierz filtr izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) i włącz opcje ustawiania ostrości na podstawie obrazu.
      5. Ustaw ekspozycję na 300 ms.
        UWAGA: Powyższe ustawienia można przetestować i dostosować w celu optymalizacji parametrów obrazowania.
      6. Zapisz ustawienia pobierania obrazu i kliknij przycisk Pobierz płytę, aby uruchomić.
    5. Analizuj dane obrazu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
      1. Otwórz okno Review Plate Data (Dane płytki przeglądowej) i wybierz Płytkę testową do analizy obrazu.
      2. Kliknij dwukrotnie studzienkę testową, aby wyświetlić jej obraz.
      3. Wybierz metodę analizy Count Nuclei i kliknij przycisk Konfiguruj ustawienia, aby wyświetlić okno z następującymi ustawieniami.
      4. Zdefiniuj obraz źródłowy z kanału FITC i wybierz algorytm standardowy.
      5. Ustaw parametry analizy obrazu w następujący sposób: przybliżona minimalna szerokość = 10 μm (= 2 piksele); przybliżona maksymalna szerokość = 50 μm (= 12 pikseli); intensywność powyżej lokalnego tła = 1,000-2,000 poziomów szarości.
      6. Przetestuj bieżące ustawienia, aby zoptymalizować metodę analizy.
      7. Zapisz ustawienia i uruchom analizę na wszystkich odwiertach.
        UWAGA: Zakończenie analizy dla jednej płytki 384-dołkowej zajmuje ~20 minut.
      8. Wyeksportuj łączną liczbę jąder jako całkowitą liczbę agregatów Q40::YFP w każdym dołku.
    6. Policz liczbę nicieni w każdym dołku.
    7. Oblicz średnią liczbę agregatów Q40::YFP na nicienie w każdej grupie i zastosuj nieliniowe dopasowanie krzywej do danych z każdego punktu czasowego.
    8. Obliczyć wskaźnik inhibicji za pomocą równania (1) poniżej:
      Wskaźnik inhibicji = figure-protocol-1 (1)
      GdzieN kontrolna iN próbka są średnią liczbą agregatów Q40::YFP odpowiednio w grupie kontrolnej i badanej.

3. Testy neurotoksyczności za pośrednictwem PolyQ

  1. Leczenie C. elegans próbkami do badań
    1. Aby przygotować nicienie do testu neurotoksyczności polyQ, przenieś 300-500 zsynchronizowanych larw L1 HA759 do każdej studzienki 48-dołkowej płytki z 500 μl pożywki S zawierającej OP50 (OD570 0,7-0,8) i 5 mg / ml astragalanu, zwykle trzy powtórzone studzienki dla każdego zabiegu.
    2. Uszczelnić płytkę parafilmem i inkubować w temperaturze 15 °C i 120 obr./min przez 3 dni23.
    3. Zebrać nicienie przez odwirowanie i przemyć 3-5 razy buforem M9. Zawiesić nicienie w buforze M9 do wykorzystania w testach przeżycia i unikania neuronów.
  2. Przygotowanie podkładki agarozowej
    1. Dodać 2 g agarozy do 100 ml buforu M9 (2% m/v) i podgrzać roztwór agarozy w kuchence mikrofalowej do temperatury bliskiej wrzenia.
    2. Dozuj 0,5 ml stopionej agarozy na środek szkiełka mikroskopowego o grubości 1 mm umieszczonego między dwoma kawałkami szklanych płytek o grubości 2 mm. Przykryj kolejnym slajdem w pionie. Gdy agaroza ostygnie i zastygnie, delikatnie zdejmij górne szkiełko.
  3. Test przeżycia neuronów ASH
    1. Dodaj kroplę 20 mM azydku sodu na podkładkę agarozową. Przenieś 15-20 nicieni HA759 do kropli, aby je unieruchomić.
    2. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na nicienie. Szkiełko należy przechowywać pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w kamerę cyfrową. Wybierz soczewkę obiektywu 40x i filtr FITC, aby wykryć neurony ASH GFP-dodatnie w obszarze głowy nicieni.
    3. Wybierz losowo ponad 50 nicieni w każdej grupie, aby policzyć liczbę nicieni z obustronnymi neuronami ASH znakowanymi GFP w ich regionie głowy7. Oblicz wskaźnik przeżycia neuronów ASH za pomocą korektora (2) poniżej.
      Przeżycie neuronalne (%) = figure-protocol-2 (2)
      Gdzieprzeżycie N i Nogółem to odpowiednio liczba nicieni z neuronami ASH dodatnimi dla GFP i całkowita liczba badanych nicieni w każdej grupie.
  4. Test unikania osmotycznego
    1. Podziel bezżywnościową płytkę NGM (9 cm) na normalne (N) i strefy pułapki (T) za pomocą linii 8 M glicerolu (~30 μL) pośrodku. Rozprowadź linię azydku sodu o sile 200 mM (~20 μl) w odległości ~1 cm od linii glicerolu, aby sparaliżować nicienie przechodzące przez barierę glicerolową do strefy T.
    2. Przenieś ~ 200 nicieni każdy do strefy N trzech powtórzonych płytek dla każdej grupy. Dodaj kroplę 1% butanodionu (~ 2 μL) do strefy T (1 cm od krawędzi płytki), aby zwabić nicienie. Natychmiast przykryć pokrywę szalki Petriego i inkubować w temperaturze 23 °C przez 90 minut.
    3. Oceń liczbę nicieni w strefach N i T pod mikroskopem. Oblicz wskaźnik unikania za pomocą eq (3)20.
      Indeks unikania = figure-protocol-3 (3)
      Gdzie N i T są liczbą nicieni odpowiednio w strefach N i T. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowego (SD) trzech powtórzeń, reprezentatywnych dla >3 niezależnych eksperymentów.
    4. Wykonaj niesparowany, dwustronny test t, aby porównać dane z grupy traganka i grupy kontrolnej.

4. Tworzenie wykresu radarowego

  1. Otwórz oprogramowanie do tworzenia wykresów i zaimportuj dane z różnych testów do nowego arkusza. Wprowadź kolumnę A(X) jako tytuły osi promieniowych, kolumnę A(Y) jako dane z grupy kontrolnej, a kolumnę B(Y) jako dane z grupy badanej.
  2. Wybierz wymagane dane i kliknij Działka | Specjalizacja: Przycisk Radar w menu paska narzędzi do generowania wykresu radarowego.
  3. Kliknij dwukrotnie oś promieniową i dostosuj etykiety Skala, Znacznik i Znacznik każdej osi zgodnie z potrzebami.
  4. Kliknij Plik w menu i wybierz Eksportuj wykresy, aby zapisać obraz jako *.tiff.
    UWAGA: Witryny internetowe z oprogramowaniem w Tabeli materiałów zawierają szczegółowe dokumenty pomocy i samouczki wideo dotyczące tworzenia wykresów radarowych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgeniczny szczep poliQ AM141 silnie eksprymuje białka fuzyjne Q40::YFP w komórkach mięśniowych ściany ciała7,21. Jak pokazano w Rysunek 1A, dyskretny zagregowany fenotyp tego szczepu można zidentyfikować za pomocą protokołu automatycznego obrazowania i analizy opisanego w tym artykule. Ilość agregatów Q40::YFP w nicieniach AM141 istotnie wzrosła po 48 godzinach od stadium L1. Jednak ta tendencja do wzrostu została zahamowana przez leczenie tragankiem (Ryc. 1B), wykazując potencjał ochronny traganka przed agregacją polyQ. Zazwyczaj 72 godziny lub 96 godzin mogą być wygodnie używane jako punkty czasowe do liczenia agregatów Q40::YFP w celu oceny efektu antyagregacji badanych próbek. W tym protokole agregaty fluorescencyjne nicieni AM141 zostały wychwycone przez zautomatyzowany system obrazowania, chociaż do tego celu można również użyć mikroskopów fluorescencyjnych7.

Szczep HA759 C. elegans wykazuje ekspresję zarówno markera GFP, jak i Htn-Q150 w swoich neuronach czuciowych ASH, co prowadzi do postępującej utraty i dysfunkcji tych neuronów11,13. Nicienie zamontowano na 2% poduszkach agarozowych w celu określenia żywotności neuronów ASH (Ryc. 2A) i zwizualizowano mikroskopowo w celu wykrycia neuronów ASH. Utrata fluorescencji GFP w obustronnych neuronach ASH w obszarach głowy nicieni wskazuje na śmierć neuronów ASH (Figura 2B). Wskaźnik przeżywalności neuronów ASH w nicieniach HA759 wynosi <40% w grupie kontrolnej po inkubacji w temperaturze 15 °C przez 3 dni7,20, co wskazuje na neurotoksyczność za pośrednictwem polyQ. W związku z tym ten test przeżycia neuronów ASH może być wykorzystany do wizualnej oceny wpływu badanych związków na neurony C. elegans, np. neuroprotekcyjnego działania glikanu astragalan, ale nie Poria (Rysunek 2C).

Ponieważ dysfunkcja zachowania jest głównym objawem klinicznym w chorobach polyQ, test unikania chemosensorycznego (Rysunek 3A) z użyciem dużej liczby nicieni HA759 jest zaprojektowany jako uproszczony test do zbadania wpływu próbek testowych na funkcjonalną utratę neuronów ASH, w której pośredniczy agregacja polyQ. Jak pokazano na Rysunek 3B, wskaźnik unikania nicieni HA759 w nieleczonej grupie kontrolnej wynosił ~0,5, podobnie jak wcześniej14. Co ciekawe, wskaźnik unikania wzrósł do >0,6 u nicieni leczonych astragalanem w temperaturze 15 °C przez 3 dni (Ryc. 3B), wykazując neuroprotekcyjne działanie polisacharydu przeciwko zaburzeniom zachowania.

Aby ocenić ogólną zdolność neuroprotekcyjną badanych związków, dane z powyższych indywidualnych testów mogą być zintegrowane i przedstawione jako wykres radarowy dla wielu fenotypów, co czyni je cechą jednoczącą fenotypy polyQ nadającą się do bezpośredniego porównania i bezpośredniego oglądania. Jak pokazano na Rysunek 4, pole trójkąta w grupie leczonej tragankiem jest większe niż w grupie kontrolnej, co wskazuje na działanie anty-polyQ polisacharydu.

figure-results-1
Rysunek 1: Wpływ astragalanu na agregację polyQ40. (A) Reprezentatywne obrazy nicieni AM141 po leczeniu astragalanem lub bez niego przez 96 godzin w temperaturze 20 °C. Obrazy fluorescencyjne (lewe panele) zostały uzyskane z płytek 384-dołkowych przy użyciu systemu obrazowania i analizy o wysokiej zawartości, a agregaty Q40::YFP (prawe panele) zostały automatycznie zidentyfikowane przez system. Wstawki to powiększone widoki obrazów nicieni pokazujące agregaty polyQ. Podziałka = 500 μm. (B) Kwantyfikacja agregatów Q40::YFP. Liczbę agregatów Q40::YFP w nicieniach AM141 monitorowano za pomocą systemu obrazowania o wysokiej zawartości co 24 godziny przez 4 dni po leczeniu astragalanem lub bez niego w temperaturze 20 °C. Około 100-150 nicieni w każdej grupie oceniano dla agregatów w każdym punkcie czasowym. Wyniki przedstawiono jako dopasowane krzywe oparte na średniej liczbie agregatów na nicienie. Skróty: polyQ = poliglutamina; YFP = żółte białko fluorescencyjne; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wpływ astragalanu na śmierć neuronów ASH za pośrednictwem Htn-Q150. (A) Schemat ideowy przygotowania preparatu agarozowego. (B) Reprezentatywne mikrofotografie nicieni HA759 z przeżywalnością i śmiercią neuronów ASH przy użyciu 400-krotnego powiększenia. Podziałka = 20 μm. Nicienie HA759 sfotografowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego po leczeniu astragalanem lub bez niego w temperaturze 15 °C przez 3 dni od L1. (C) Ochronne działanie traganka przed śmiercią neuronów ASH za pośrednictwem polyQ. Jako kontrolę użyto glikanu Poria, polisacharydu z kokosów Poria. Dane przedstawiono jako średnie ± SD trzech powtórzeń, reprezentatywnych dla więcej niż trzech niezależnych eksperymentów. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu niesparowanego, dwustronnego testu t w celu porównania danych z grupy kontrolnej z danymi z grup glikanów traganka i Poria. *p < 0,05; ns = brak znaczącego. Skrót: GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wpływ astragalanu na dysfunkcję behawioralną za pośrednictwem Htn-Q150. (A) Schemat ideowy płytki testowej unikania. (B) Reprezentatywne wyniki testu unikania. Wskaźnik unikania zdefiniowano jako stosunek nicieni w strefie N do całkowitej liczby nicieni na płytce. Wyniki przedstawiono jako średnie ± SD trzech powtórzeń, reprezentatywnych dla trzech niezależnych eksperymentów. Analizę statystyczną wskaźnika unikania przeprowadzono za pomocą niesparowanego, dwustronnego testu t. **p < 0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Ogólna zdolność neuroprotekcyjna astragalanu. Dane z trzech różnych testów są importowane do oprogramowania OriginPro w celu utworzenia wykresu radarowego, który jest prezentowany w celu sprofilowania ogólnego wpływu astragalanu na wiele fenotypów, w których pośredniczy polyQ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ agregacja poliQ i proteotoksyczność są ważnymi cechami zaburzeń polyQ, takich jak choroba Huntingtona13, zalecamy stosowanie wielu modeli i metod w celu kompleksowej oceny zdolności neuroprotekcyjnych badanych związków, w tym testu agregacji polyQ w szczepie AM141, testu przeżycia neuronów ASH w szczepie HA759 oraz testu unikania chemosensorycznego w szczepie HA759. Przedstawione tutaj protokoły zostały wykorzystane do oceny zdolności neuroprotekcyjnych badanych próbek wobec toksyczności polyQ, w tym hamującego wpływu zarówno na agregację polyQ, jak i związaną z tym neurotoksyczność 7,14,15,16,17,19,20, wykazując ich potencjał w odkrywaniu leków na HD i inne choroby polyQ.

Wprowadzono zautomatyzowany system obrazowania i analizy do wykrywania i zliczania agregatów polyQ w teście agregacji polyQ. Zaletą tej metody jest wysoka przepustowość i oszczędność czasu, a także znaczne zmniejszenie liczby błędów subiektywnych w pracochłonnym procesie liczenia. W przypadku całej płytki 384-dołkowej akwizycja i analiza obrazu zajmuje tylko <1 godzinę. Jednak konwencjonalna metoda obrazowania mikroskopowego również wykazała podobną wydajność w tym laboratorium bez użycia automatycznego urządzenia do obrazowania7.

W typowym teście agregacji Q40::YFP dla każdego punktu czasowego zaleca się łącznie 100-150 nicieni na zabieg, który można przeprowadzić w dołach replikowanych zawierających 10-15 nicieni każdy. Należy jednak zauważyć, że larwy L1 mogą być bardziej wrażliwe na niektóre zabiegi lub wyższe stężenia. W związku z tym wyższe dawki badanych związków mogą hamować ich wzrost, prowadząc do wyników fałszywie dodatnich z powodu powolnego wzrostu, a tym samym opóźnionej agregacji polyQ. Zazwyczaj można przeprowadzić test oczyszczania z żywności, aby rozwiązać ten problem i zapewnić odpowiedni zakres stężeń badanych związków23.

Nicienie transgeniczne HA759 stosowane w testach neurotoksyczności polyQ koekspresją OSM-10::GFP i Htn-Q150, umożliwiając jednoznaczną identyfikację obustronnych neuronów czuciowych ASH. W związku z tym przeżycie neuronów ASH ocenia się na podstawie obecności lub braku ekspresji GFP; zwykle ~ 40-75% neuronów ASH w nicieniach kontrolnych jest martwych23,24. Co ciekawe, genetyczne tło mutacji pqe-1 (wzmacniacz poliglutaminy-1) w szczepie HA759 (pqe-1; Htn-Q150) przyspiesza toksyczność za pośrednictwem polyQ, prowadząc do śmierci większości neuronów ASH w ciągu trzech dni, nawet w temperaturze 15 °C, a zatem szczep ten jest hodowany w temperaturze 15 °C w celu przeprowadzenia testu przeżycia neuronów, jak wcześniej donoszono 23,24.

Utrata funkcjonalna neuronów ASH w nicieniach HA759 może wystąpić przed wykryciem śmierci komórki i agregatów białkowych13; w związku z tym test zachowania unikającego osmotycznego jest niezbędny do oceny toksyczności za pośrednictwem poliQ. Aby zminimalizować potencjalny wpływ mniej aktywnych nicieni HA759 w niskiej temperaturze na eksperymenty behawioralne, płytki testowe unikania inkubuje się w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 23 °C, a nie w temperaturze 15 °C, jak w teście przeżycia neuronów przy użyciu tego szczepu. Ponadto doniesiono, że nicienie transgeniczne Htn-Q150/OSM-10::GFP są bardzo wrażliwe na dotyk nosa; w związku z tym alternatywnym wykrywaniem funkcji neuronów ASH jest test dotyku nosa13.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy byłym członkom Huang Lab, którzy pomogli rozwinąć i ulepszyć protokoły użyte w tym artykule, w szczególności Hanrui Zhang, Lingyun Xiao i Yanxia Xiang. Prace te były wspierane przez Projekt 111 (grant nr B17018) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Hebei (numer grantu H2020207002).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
C. elegans szczepy
AM141
rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]		Caenorhabditis Genetics Center (CGC)https://cgc.umn.edu/strain/AM141
HA759
rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]		Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
https://cgc.umn.edu/strain/HA759E. coli szczepy
NA22Caenorhabditis Genetics Center (CGC)https://cgc.umn.edu/strain/NA22
OP50Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
https://cgc.umn.edu/strain/OP50Reagent
AgarShanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd.EQ1001-500Ghttps://www.ekear.com
AgaroseBiowest111860
ButanedioneSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80042427https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59
5d0
CholesterolSigma-AldrichC8667https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
GlycerolAladdin Co., Ltd.G116203
https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html PeptoneGuangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd.050170Bhttps://www.huankai.com/show/21074.html
Azydek soduSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80115560https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af
551e96ff5f07cd
Wodorotlenek soduSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10019718https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817
d3d8c68ec25e6
Roztwór podchlorynu soduFabryka odczynników chemicznych w Kantonie7681-52-9http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
TryptoneOxoid Ltd.LP0042Bhttps://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
Ekstrakt drożdżowyOxoid Ltd.LP0021Bhttps://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B
Equipment
384-dołkowa płytka do hodowli komórkowejNest Biotechnology Co., Ltd.761001
https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 48-dołkowa płytka do hodowli komórkowejNest Biotechnology Co., Ltd.748001https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
szalka Petriego 90 mmSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.F611003
Autoklaw https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 MikroskopPanasonicMLS-3781L-PC
ChongQing Optical Co., Ltd.ZSA0745http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64
Mikroskop fluorescencyjnyGuangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.Mshot MF31-LEDhttps://www.mshot.com/article/442.html
System obrazowania o wysokiej zawartościUrządzenia molekularneImageXpresshttps://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
MikrowirówkaGeneCompanyhttps://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
cyfrowa GENESPEED X1Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.MS60https://www.mshot.com/article/677.html
Kuchenka mikrofalowaMidea Corp.  M1-211Ahttps://www.midea.cn/10000/10000000001
00511264425.html
Parafilm MSigma-AldrichP7793-1EAhttps://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
ShakerZhicheng Inc.ZWY-2102C
http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.htmlSoftware
Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazuMolecular DevicesMetaXpresshttps://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress
OriginProOriginLab Corp.Wersja 9.8.5.2041. Wprowadzenie do oprogramowania: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin
2. Instrukcja tworzenia wykresu radarowego: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph
3. Film instruktażowy dotyczący tworzenia wykresu radarowego: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813
preparacyjny Mikroskop Kamera

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  2. Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nature Biotechnology. 28 (3), 256-263 (2010).
  3. Lieberman, A. P., Shakkottai, V. G., Albin, R. L. Polyglutamine repeats in neurodegenerative diseases. Annual Review of Pathology. 14, 1-27 (2019).
  4. Sakahira, H., Breuer, P., Hayer-Hartl, M. K., Hartl, F. U. Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 4 16412-16418 (2002).
  5. Bäuerlein, F., Fernández-Busnadiego, R., Baumeister, W. Investigating the structure of neurotoxic protein aggregates inside cells. Trends in Cell Biology. 30 (12), 951-966 (2020).
  6. Tu, Z., Yang, W., Yan, S., Guo, X., Li, X. J. CRISPR/Cas9: a powerful genetic engineering tool for establishing large animal models of neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 35(2015).
  7. Zhang, H., et al. Inhibition of polyglutamine-mediated proteotoxicity by Astragalus membranaceus polysaccharide through the DAF-16/FOXO transcription factor in Caenorhabditis elegans. Biochemical Journal. 441 (1), 417-424 (2012).
  8. Koyuncu, S., et al. The ubiquitin ligase UBR5 suppresses proteostasis collapse in pluripotent stem cells from Huntington's disease patients. Nature Communications. 9 (1), 2886(2018).
  9. Dimitriadi, M., Hart, A. C. Neurodegenerative disorders: insights from the nematode Caenorhabditis elegans. Neurobiology of Disease. 40 (1), 4-11 (2010).
  10. Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Experimental Neurology. 250, 94-103 (2013).
  11. Wang, Q., et al. Caenorhabditis elegans in Chinese medicinal studies: making the case for aging and neurodegeneration. Rejuvenation Research. 17 (2), 205-208 (2014).
  12. Hassan, W. M., Dostal, V., Huemann, B. N., Yerg, J. E., Link, C. D. Identifying Aβ-specific pathogenic mechanisms using a nematode model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 36 (2), 857-866 (2015).
  13. Faber, P. W., Alter, J. R., MacDonald, M. E., Hart, A. C. Polyglutamine-mediated dysfunction and apoptotic death of a Caenorhabditis elegans sensory neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (1), 179-184 (1999).
  14. Zhang, J., et al. Antioxidant and neuroprotective effects of Dictyophora indusiata polysaccharide in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 192, 413-422 (2016).
  15. Xiang, Y., et al. Epimedium polysaccharide alleviates polyglutamine-induced neurotoxicity in Caenorhabditis elegans by reducing oxidative stress. Rejuvenation Research. 20 (1), 32-41 (2017).
  16. Zhong, G., et al. Physicochemical and geroprotective comparison of Nostoc sphaeroides polysaccharides across colony growth stages and with derived oligosaccharides. Journal of Applied Phycology. 33 (2), 939-952 (2021).
  17. Xiao, L., et al. Salidroside protects Caenorhabditis elegans neurons from polyglutamine-mediated toxicity by reducing oxidative stress. Molecules. 19 (6), 7757-7769 (2014).
  18. Cordeiro, L. M., et al. Rutin protects Huntington's disease through the insulin/IGF1 (IIS) signaling pathway and autophagy activity: Study in Caenorhabditis elegans model. Food and Chemical Toxicology. 141, 111323(2020).
  19. Yang, X., et al. The neuroprotective and lifespan-extension activities of Damnacanthus officinarum extracts in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 141 (1), 41-47 (2012).
  20. Xiao, L., et al. The traditional formula Kai-Xin-San alleviates polyglutamine-mediated neurotoxicity by modulating proteostasis network in Caenorhabditis elegans. Rejuvenation Research. 23 (3), 207-216 (2020).
  21. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  22. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  23. Voisine, C., et al. Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2 (6), 504(2007).
  24. Faber, P. W., Voisine, C., King, D. C., Bates, E. A., Hart, A. C. Glutamine/proline-rich PQE-1 proteins protect Caenorhabditis elegans neurons from huntingtin polyglutamine neurotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 17131-17136 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neurotoksyczno poliglutaminymodel choroby Huntingtonazwi zki neuroprotekcyjnetest agregacji PolyQszczep AM141prze ywalno neuron w ASHzachowanie chemoawersyjnemikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie wysokoprzepustowe High Content Imaging

Powiązane artykuły