Ten protokół opisuje metodę taśmy, jak ręcznie konstruować mikromacierz tkankową przy użyciu bloków donorowych FFPE o różnych głębokościach.
Artykuł metodologiczny
Ręczna budowa mikromacierzy tkankowej metodą taśmową i ręcznym mikromacierzem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikrotablica tkankowa (TMA) jest ważnym narzędziem badawczym, w którym wiele próbek zatopionych w parafinie (FFPE) może być reprezentowanych w jednym bloku parafiny. Osiąga się to poprzez wykorzystanie rdzeni tkankowych wyekstrahowanych z obszaru zainteresowania różnych bloków FFPE dawcy i ułożenie ich w jeden blok parafinowy TMA. Po skonstruowaniu, skrawki z ukończonego TMA mogą być wykorzystane do przeprowadzenia badań immunohistochemicznych, chromogenicznych, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i RNA ISH w celu oceny ekspresji białek, a także zmian genomowych i transkrypcyjnych w wielu próbkach jednocześnie, minimalizując w ten sposób zużycie tkanek i zmniejszając koszty odczynników. Istnieje kilka różnych technik budowy TMA. Jedną z najczęściej stosowanych metod budowy jest metoda odbiorcza, która najlepiej sprawdza się w przypadku rdzeni o tej samej długości, dla których zalecana jest minimalna długość 4 mm. Niestety, bloki tkankowe mogą być mocno wycięte podczas procesu diagnostycznego, co często skutkuje "nieidealnymi" grubościami bloku dawczego poniżej 4 mm. Bieżący artykuł i film koncentrują się na metodzie dwustronnej taśmy klejącej; alternatywna ręczna, tania, łatwa w użyciu i szybka metoda konstruowania TMA o niskiej gęstości (<50 rdzeni), która jest wysoce kompatybilna z tymi nieidealnymi blokami dawczymi. Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku, jak skonstruować TMA przy użyciu tej metody, z naciskiem na krytyczne znaczenie przeglądu patologicznego i walidacji po budowie.
Wprowadzenie
Tkance z utrwaloną parafiną w formalinie (FFPE) są szeroko stosowane w morfologicznych i immunohistochemicznych badaniach ekspresji białek1. Jednak badania odkrywcze często wymagają zbadania kilku markerów na dużej liczbie tkanek, co może doprowadzić do wyczerpania cennych tkanek. Wprowadzona w latach osiemdziesiątych XX wieku mikromacierz tkankowa (TMA) jest ważnym narzędziem badawczym, które gromadzi małe przykładowe obszary zainteresowania z wielu różnych bloków tkankowych FFPE w jeden blok parafinowy, umożliwiając badanie wielu próbek tkanek jednocześnie2. W ten sposób TMA unikają nadmiernego wykorzystywania bardzo cennych i często rzadkich próbek tkanek, jednocześnie zmniejszając koszty związane z wykonywaniem dalszych aplikacji na wielu pojedynczych próbkach3,4.
Istnieje kilka różnych technik budowy TMAs5, w tym podejścia automatyczne i półręczne6,7. Większość tych ostatnich podejść wykorzystuje metodę biorcy, w której rdzenie tkanek wykrawane z bloków dawcy są wprowadzane do prefabrykowanej formy. Zaleca się jednak, aby do tej metody używać "idealnych" bloków dawcy o grubości co najmniej 4 mm6,7. Niestety, bloki dawcze, szczególnie te, które zostały dokładnie pocięte w celach diagnostycznych przed udostępnieniem do badań, mają często grubość mniejszą niż 4 mm, co może wykluczyć je z zastosowania w budowie TMA metodą biorczą, jeśli ponowne osadzenie w celu uzyskania głębokości 4 mm nie jest możliwe lub pożądane. Co więcej, procedury te często mogą wykorzystywać stacjonarny ręczny mikromacierz tkankowy lub drogie zautomatyzowane instrumenty, które nie są łatwo dostępne lub niedostępne dla przeciętnego laboratorium badawczego. W przeciwieństwie do tego, metoda dwustronnej taśmy klejącej lub metoda taśmowa jest ręczną metodą budowy TMA, która jest kompatybilna z nieidealnymi blokami dawców, która wykorzystuje niedrogie, powszechnie dostępne, wielokrotnego użytku lub jednorazowe ręczne mikromacierze tkankowe8,9,10. Ta metoda odwraca proces budowy poprzez odlewanie bloku wokół odwróconych pionowych rdzeni, które po zakończeniu są zlicowane z górną częścią TMA, niezależnie od długości rdzenia. W rezultacie, wszystkie próbki są obecne w sekcjach TMA po pierwszym przekroju, co pozwala konstruktorowi na maksymalne wykorzystanie tych nieidealnych bloków od samego początku. W związku z tym metoda taśmowa stanowi opłacalną i wykonalną alternatywę dla niewyspecjalizowanych laboratoriów badawczych.
Budowa TMA nie jest pozbawiona wyzwań, dlatego należy zachować ostrożność przy wyborze obszarów tkanek do ekstrakcji rdzeni, co sprawia, że kontrola patologiczna jest krytyczną częścią procesu budowy TMA11,12. W związku z tym protokół ten ma na celu podkreślenie głębokiego znaczenia oceny patologicznej w budowie TMA poprzez podkreślenie niektórych patologicznych pułapek związanych z konstrukcją TMA, których osoby konstruujące i używające TMA powinny być świadome, oraz dlaczego przegląd patologiczny powinien być kontynuowany przez cały okres istnienia bloku TMA.
Ten protokół opisuje kroki podjęte w Technicznym Laboratorium Podstawowym AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) w celu skonstruowania TMA z nieidealnych bloków dawców przy użyciu metody taśmowej; gdzie ACSR jest finansowanym przez NIH repozytorium biologicznym poświęconym gromadzeniu i sprawiedliwej dystrybucji próbek biologicznych z tkanek raka HIV w celu promowania badań nad złośliwością HIV.
Protokół
Wszystkie bloki dawców zostały pozbawione elementów identyfikujących podczas pobierania i wykorzystane do budowy TMA zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IRB Mayo Clinic (PR16-000507 i PR2207-02).
1. Przegląd patologii
- Pobrać bloki dawcy tkanek FFPE do wykorzystania w budowie TMA.
- Prześlij świeżo wygenerowany preparat barwiony hematoksyliną i eozyną (H&E) class13 dla każdego bloku dawcy tkanki FFPE wybranego do oceny histologicznej przez certyfikowanego patologa w celu potwierdzenia diagnozy i adnotacji tkanki.
UWAGA: Barwienie BHP może być wykonane we własnym zakresie lub wysłane do patologicznego laboratorium podstawowego leczenia w celu barwienia, tak jak miało to miejsce w tym protokole. Jednym z najważniejszych pojęć, o których należy pamiętać podczas konstruowania TMA, jest to, że tkanki w blokach dawcy FFPE są strukturami trójwymiarowymi (3D), których kształt, zawartość guza i żywotność tkanek mogą się znacznie zmieniać wraz ze wzrostem głębokości bloku. Patolog musi określić, na podstawie przeglądu wycinka tkanki barwionej H&E, który jest dwuwymiarową reprezentacją tkanki 3D, najlepszy obszar do ekstrakcji rdzenia tkanki. - Podczas przeglądu histologicznego upewnij się, że patolog identyfikuje i adnotuje tkanki, które są interesujące/nieinteresujące na szkiełkach barwionych H&E. Aby dodać adnotacje do slajdu, wykonaj poniższe czynności.
- Użyj pisaka do zaznaczania slajdów, aby zakreślić interesującą tkankę.
- Za pomocą tego samego pisaka do znakowania wytrzyj obszary w zakreślonym obszarze, których należy unikać.
- Użyj pisaka do znakowania, aby oznaczyć obszary uznane za idealne do pobierania próbek rdzeniowych i ekstrakcji.
UWAGA: Należy pamiętać, że kształt i skład tkanki może się zmieniać wraz z głębokością tkanki w bloku. W związku z tym skład rdzenia tkanki może się zmieniać w zależności od tego, gdzie rdzeń został pobrany, co podkreśla potrzebę ciągłego patologicznego prowadzenia. - W razie potrzeby należy przesłać dodatkową tkankę do barwienia immunohistochemicznego specyficznego dla choroby wraz z HS, aby wspomóc ocenę patologiczną. Przykłady takich barwień obejmują barwienie ERBB2 dla HER2 dodatniego raka piersi14, HHV-8 dla mięsaka Kaposiego15, CD20 dla chłoniaków B-komórkowych16, U6 jako globalny marker jakości RNA17, EBER do określenia pozytywności wirusa Epsteina-Barr18 oraz Vimentin jako potwierdzenie pochodzenia mezenchymalnego i markera kontroli jakości tkanek19,20.
2. Przygotowanie do budowy TMA
- Po zakończeniu przeglądu patologicznego sporządź ostateczną listę bloków dawczych, które mają być użyte w budowie TMA i utwórz mapę TMA (Rysunek 1A). Mapa TMA jest schematem przedstawiającym, gdzie będą znajdować się rdzenie w wypełnionym TMA i montowanych na szkiełku próbkach tkanek uzyskanych z wynikowego TMA.
- W celach orientacyjnych upewnij się, że mapa TMA unika umieszczania rdzeni w równej macierzy, takiej jak macierz 3 x 3 lub 4 x 4, i zawiera co najmniej 1 znacznik orientacji.
UWAGA: Rdzenie orientacyjne mogą być rdzeniami pobranymi z beztkankowych kolorowych narzędzi orientacyjnych21, lub blokami tkanek zawierającymi wyraźnie różne tkanki z tematu TMA. W przeciwieństwie do metody odbiorcy, w której pionowe rdzenie są wkładane do wstępnie odlanej formy woskowej, metoda taśmowa tworzy TMA poprzez wlewanie stopionego wosku wokół odwróconych, wyprostowanych rdzeni. To odwrócenie procesu budowy wymaga drugiej mapy zwanej mapą budowy. - Utwórz mapę budowy, tworząc lustrzane odbicie mapy TMA (Rysunek 1B). Mapa budowy pokazuje, gdzie każdy rdzeń musi zostać umieszczony podczas budowy, aby pojawił się we właściwym miejscu w ukończonym TMA. Zapisz mapę budowy.
- Po utworzeniu map przygotuj metalową formę bazową TMA. Użyj jednorazowej papierowej siatki w kratkę, aby pokierować rozmieszczeniem rdzenia i wyregulować separację rdzenia.
UWAGA: Siatka szablonów 6 x 7 (42 punkty) dla maksymalnie 40 rdzeni (plus dla dwóch rdzeni/przerw orientacyjnych) do użytku z dostępnymi na rynku metalowymi formami bazowymi o wymiarach wewnętrznych 26 mm x 20 mm jest dostępna w dodatkowym pliku PDF. Wydrukuj i wytnij siatkę papieru. - Przytnij siatkę w kratkę na wymiar i przymocuj kawałek dwustronnej taśmy klejącej (DSST) z tyłu siatki. Umieść siatkę i taśmę DSST na metalowej tacy i dodaj drugi kawałek DSST na wierzchu siatki, tj. na wierzchu siatki papierowej w metalowej podstawie formy (Rysunek 2A).
3. Umiejscowienie rdzenia
- Nałóż patologicznie oceniany H&E na odpowiadający mu blok tkankowy i użyj oznaczeń patologa, aby określić, gdzie blok tkankowy ma zostać przebity (Rysunek 2B).
- Przebij blok dawcy FFPE za pomocą ręcznego przebijaka rdzeniowego (Rysunek 2C) w odpowiednim miejscu.
UWAGA: Stemple rdzeniowe są dostępne w różnych średnicach. W tej metodzie wykorzystuje się ręczny przebijak koronowy o średnicy 2 mm.- Jeśli używasz dziurkacza wielokrotnego użytku, upewnij się, że jest on czyszczony przed i po każdym wkłuciu w tkankę.
- Wysuń rdzeń z przebijaka rdzeniowego i użyj wykałaczki, aby umieścić wyrzucony rdzeń na krzyżu nitkowym siatki pokrytej DSST (Rysunek 2D). Upewnij się, że po umieszczeniu rdzenia na siatce jest on odwrócony i ustawiony pionowo tak, że tkankowy koniec rdzenia styka się z DSST (tkanka zadrukowaną do dołu). Upewnij się również, że rdzeń jest umieszczony w odpowiednim miejscu na siatce, jak oznaczono na mapie budowy.
- Powtarzaj, aż wszystkie bloki dawcze zostaną wydrążone, a rdzenie zostaną umieszczone we właściwych pozycjach.
4. Ukończenie TMA
- Włącz piekarnik stołowy, ustaw na 78 °C i odczekaj wystarczająco dużo czasu, aby osiągnąć odpowiednią temperaturę.
- Dla każdego TMA, który ma zostać zbudowany, rozpuść 45 g granulek parafiny w pojemniku żaroodpornym.
- Oznacz plastikową kasetę i umieść ją na metalowej podstawie zawierającej rdzenie (Rysunek 2E). Wysokość rdzeni nie powinna przekraczać głębokości metalowej tacy, ponieważ wysokie rdzenie zostaną przechylone lub przewrócone po umieszczeniu kasety na miejscu.
- Umieść formę z kasetą na tacy, aby złapać przelew i delikatnie przelej stopioną parafinę przez kasetę do tacki z rdzeniami (Rysunek 2F).
- Pozwól, aby stopiona parafina przelała się, aby upewnić się, że w korpusie TMA nie ma pęcherzyków powietrza. Upewnij się, że parafina wypełnia się do górnej części kasety, tak aby była osadzona i mocno związana z blokiem parafiny po zestaleniu się parafiny.
- Nie przesuwaj ani nie przeszkadzaj blokowi i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie wstaw do lodówki w temperaturze 4 °C na dodatkowe 30 minut, aby całkowicie zastygł.
- Po całkowitym zestaleniu delikatnie oddziel metalową formę bazową od bloku parafiny związanego z kasetą rdzeni.
UWAGA: DSST zachowuje swoją przyczepność w procesie budowy i często jest dołączany do nowo powstałego bloku parafinowego. W razie potrzeby delikatnie usuń DSST i siatkę z górnej części ukończonego bloku TMA.
5. Walidacja TMA
- Po zbudowaniu TMA użyj mikrotomu, aby przeciąć nowo ukończony TMA. Wytnij jeden lub więcej pełnopowierzchniowych odcinków tkanki.
- Przenieś sekcje do podgrzanej łaźni wodnej i zamontuj je na suwaku.
UWAGA: Nowo konstruowane bloki często wymagają licowania bloków (odcięcia nadmiaru parafiny) w celu uzyskania pełnych skrawków tkanek twarzy, które zawierają wszystkie rdzenie. - Po wyschnięciu prześlij świeżo wyciętą sekcję TMA montowaną na szkiełku do barwienia H&E 13 i w razie potrzeby wszelkich dodatkowych barwień immunohistochemicznych.
- Prześlij poplamione sekcje TMA H&E do oceny patologicznej.
UWAGA: Podczas przeglądu patologii TMA certyfikowany przez zarząd patolog, najlepiej ten sam patolog, który dokonał przeglądu bloków dawczych TMA, dokonuje przeglądu barwionych rdzeni TMA H&E, aby upewnić się, że pożądane tkanki będące przedmiotem zainteresowania są rzeczywiście obecne. Jeśli w kroku 1.3.4 przesłano jakiekolwiek dodatkowe barwniki immunohistochemiczne specyficzne dla tkanki lub choroby, barwienia te należy powtórzyć na odcinkach TMA i przedłożyć wraz z TMA H&E do oceny patologicznej. - Zapisz wyniki patologicznego przeglądu walidacyjnego TMA.
Wyniki
Opisana tutaj metoda konstrukcji TMA z wykorzystaniem taśmy jest metodą preferowaną w ACSR Technical Core Laboratory w celu oszczędzania tkanek, co z kolei pozwala na oszczędny i sprawiedliwy rozdział niezwykle cennych materiałów tkankowych pomiędzy badaczy.
Kluczowym elementem procesu konstrukcji jest identyfikacja interesującej tkanki w danym bloku dawcy, z którego powinien zostać pobrany rdzeń TMA. Jest to ustalane podczas przeglądu patomorfologicznego, w ramach którego przeszkolony patolog analizuje świeżo przygotowany preparat barwiony H&E (Rycina 3). Za pomocą markera patolog obrysowuje obszar na preparacie H&E, co wskazuje, że rdzeń powinien zostać pobrany z bloku dawcy wewnątrz tego obszaru (Rycina 3). Patolog może również zaznaczyć dodatkowe obszary, takie jak obszary martwicze, których należy unikać, lub obszary łagodne, z których można pobrać dodatkowe rdzenie tkankowe (Rycina 3). Następnie rdzenie są wycinane z zaznaczonych obszarów i włączane do konstrukcji TMA.
Istnieją dwa główne wskaźniki sukcesu wykonania TMA metodą taśmową. Pierwszym z nich jest obecność kropek rdzeni tkankowych w oczekiwanych pozycjach i w odpowiednich odstępach od siebie, co ocenia się poprzez inspekcję wizualną. Rycina 4A,B przedstawia dwa pomyślnie wykonane TMA metodą taśmową oraz odpowiadające im skrawki barwione H&E. Inspekcja wizualna bloków TMA wykazuje, że rdzenie są obecne i rozmieszczone regularnie w każdym TMA. Do głównych problemów konstrukcyjnych, które mogą wystąpić podczas procesu tworzenia metodą taśmową, należy oddzielenie bloku od kasety z powodu przedwczesnego usunięcia podstawy metalowej przed zestaleniem wosku (Rycina 4C). Innym potencjalnym problemem obserwowanym w TMA wykonanych metodą taśmową jest przechylenie rdzeni i/lub przesunięcie pozycji osadzonych rdzeni (Rycina 4D); problem ten może wynikać z nadmiernie turbulentnego wlewania stopionej parafiny, co może być dodatkowo potęgowane przez słabą adhezję DSST. Rycina 5 przedstawia obrazy H&E rdzeni z TMA1. Wszystkie rdzenie poza jednym (punkt 1) są obecne na skrawku H&E z TMA1. Rycina 5 pokazuje również, że niektóre rdzenie występują jako pełne, okrągłe kropki tkankowe (np. punkty 4, 6, 13, 17), podczas gdy inne nie są w pełni obecne (np. punkty 3, 8, 9, 12). Utrata tkanki zaobserwowana w tych ostatnich przypadkach nie jest rzadkością i może wynikać z niewystarczającej liczby cięć niezbędnych do pełnego odsłonięcia wszystkich rdzeni. Alternatywnie, obecność niekompletna lub całkowity brak tkanki (np. punkt 1) może wynikać z niskiej jakości tkanki w danym rdzeniu, co może prowadzić do utraty tkanki podczas procesu barwienia.
Drugim miernikiem sukcesu jest ocena tego, czy rdzenie TMA objęły interesującą tkankę. Osiąga się to poprzez patologiczna ocena i walidacja poszczególnych bloków TMA H&rdzenie E (Rysunek 5) w porównaniu do wcześniej wyciętego bloku dawcy H&Es (Rysunek 3), a w razie potrzeby wykonano inne dodatkowe barwienia immunohistochemiczne. Rycina 6 przedstawia przykładowe barwienia wykonane na TMA1, w tym wimentyny, U6, EBER oraz CD20. Tkanki wykazujące pozytywny wynik w kierunku wimentyny (brązowe barwienie) wskazują, że wszystkie tkanki pochodzą z tkanki mezenchymalnej i są dobrej jakości, co umożliwia ich barwienie. Pozytywny wynik w kierunku U6 (ciemnofioletowe/niebieskie barwienie) wskazuje na dobrą jakość RNA w tkance i potwierdza obecność RNA in situ barwienia metodą hybrydyzacji in situ (ISH), takie jak EBER, które są ukierunkowane na transkrypty genów. Wyniki dla U6 prowadzą do Rycina 5 wskazują, że jakość RNA jest wysoka w tkance chłoniaka (punkt 9) oraz w kontroli orientacji tkanki normalnego ciała migdałowatego (punkt 22), ale nie w tkance normalnej w punkcie 19. W dalszej kolejności barwienie EBER było negatywne w tkance normalnej i kontroli orientacji, lecz silnie dodatnie w tkance chłoniaka (punkt 9). Zgodnie z oczekiwaniami dla tkanek pochodzenia limfatycznego, oba punkty (9 i 22) wykazały dodatnie barwienie na marker limfocytów B CD20, natomiast punkt 19, pochodzący z normalnej tkanki rdzenia kręgowego, nie wykazał takiego barwienia. Wyniki barwienia dla wszystkich rdzeni TMA zestawiono w Tabela 1 or potwierdź adnotacje tkankowe dla tych rdzeni tkankowych TMA.
Rycina 1: Mapy TMA. Po wybraniu wszystkich bloków FFPE i kontroli orientacji tworzona jest szczegółowa mapa, znana jako mapa TMA (A), określająca miejsce rozmieszczenia rdzeni z bloków każdego dawcy w gotowym bloku. Należy zauważyć, że przy konstruowaniu TMA metodą taśmy, mapa konstrukcyjna (B) jest obrazem lustrzanym mapy TMA, ponieważ metoda ta odwraca proces konstrukcji – stopiona parafina jest wlewana wokół pionowych rdzeni tkankowych, zamiast umieszczać rdzenie w wcześniej przygotowanej formie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Budowa TMA przy użyciu metody taśmowej. (A) Na dnie metalowej formy podstawowej ułóż w następującej kolejności dwa kawałki dwustronnej taśmy klejącej (DSST) oraz papierową siatkę; umieść pierwszy kawałek DSST (wkładka 2A), następnie jednorazową papierową siatkę, a potem drugi kawałek DSST na dnie metalowej formy podstawowej. (B) Dla każdego bloku dawcy przygotowywany jest nowy preparat barwiony H&E, który jest oceniany przez patomorfologa; zaznacza on na preparacie H&E tkankę badaną, miejsce wykonania wycięcia w bloku oraz, jeśli dotyczy, obszary, których należy unikać podczas pobierania rdzenia tkanki. (C) Wykonaj wycięcie w bloku dawcy za pomocą jednorazowego lub wielorazowego ręcznego wiertła do TMA. (D) Za pomocą igłowego chwytaka każdy rdzeń jest umieszczany pionowo, stroną guza do dołu, na taśmie DSST pokrywającej siatkę. (E) Ostrożnie umieść wcześniej opisaną plastikową kasetkę na wierzchu metalowej tacki zawierającej pionowo ustawione rdzenie. (F) Roztopioną parafinę powoli wlewa się do tacki przez kratkę kasetki, aby otoczyć i zanurzyć pionowe rdzenie pod kasetką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3Blok donora H&Barwienie eosiną. H&Przebarwione przekroje z każdego bloku dawcy poddawane są przeglądowi kontroli jakości z patologiem prowadzącym szkolenie, który nanosi adnotacje na H&Zaznaczyć markerem barwiony preparat, aby wskazać obszary/tkanki zainteresowania (tj. żywotne tkanki nowotworowe (CA) lub łagodne (BN)) do pobrania rdzeni, a także obszary, których należy unikać (tj. obszary tkanki martwiczej). Odpowiednie obszary bloku tkankowego, zgodnie z oznaczeniami na adnotowanym H&Następnie identyfikuje się obszary E, wycina je i włącza do tworzonej macierzy tkankowej (TMA). Powstały rdzeń TMA H&Następnie można odnieść wartość E do niewykutego obszaru bloku dawcy H&Aby potwierdzić, że tkanka zainteresowania została pobrana za pomocą wycinaka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki. (A,B) Pomyślnie wykonane TMA metodą taśmową oraz towarzyszące im barwienia H&E do oceny patomorfologicznej. (C) Rozdzielenie plastikowej kasety i bloku parafiny w przypadku przedwczesnego wyjęcia kasety z metalowej formy podstawowej. (D) Gotowe TMA wykonane metodą taśmową, wykazujące przewrócone i przemieszczone rdzenie w wyniku turbulentnego wlewania stopionej parafiny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Barwienie H&E rdzeni TMA. Przekrój barwiony H&E dla TMA1, przedstawiający poszczególne barwienia H&E dla każdego rdzenia tkankowego użytego do konstrukcji TMA (punkty 1-21) oraz rdzeni orientacyjnych (punkty 22 i 23). Przedstawione obrazy uzyskano przy użyciu obiektywu 4x, wyposażonego w kamerę cyfrową podłączoną do oprogramowania do obrazowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6Przykładowe immunohistochemia i RNA ISH. Pełne przekroje twarzy z TMA1 oceniono metodą IHC pod kątem ekspresji wimentyny i CD20 oraz metodą RNA ISH w celu oceny jakości RNA (U6) i statusu EBV poprzez ISH EBER. Na zdjęciach przedstawiono przykładowe obrazy trzech rdzeni, w tym jednej tkanki nowotworowej (punkt 9), jednej tkanki prawidłowej (punkt 19) oraz jednej z dwóch kontroli orientacyjnych (punkt 22). Pozytywność wimentyny oznaczona jest brązowym barwieniem, pozytywność U6 – barwieniem niebiesko-fioletowym, pozytywność EBER – barwieniem niebiesko-fioletowym, a pozytywność CD20 – barwieniem brązowym. Przedstawione obrazy uzyskano przy użyciu obiektywu 4x, wyposażonego w kamerę cyfrową podłączoną do oprogramowania do obrazowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Tabela 1: Przegląd przygotowanych tkanek TMA i wykonanych barwień: Tabela przedstawia, czy (a) tkanka jest obecna w każdym z reprezentatywnych punktów TMA, (b) guz jest obecny w każdym punkcie tkanki barwionym H&E oraz (c) wyniki dodatkowych barwień immunohistochemicznych wykonanych na sąsiednich sekcjach TMA: "-" oznacza wynik negatywny, n/d = nie wykonano. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Plik uzupełniający. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Jednym z najbardziej krytycznych elementów procesu budowy TMA jest przegląd patologiczny bloków dawczych FFPE, z których zostaną pozyskane rdzenie TMA4. Podczas przeglądu certyfikowany przez komisję patolog bada reprezentatywny wycinek tkanki barwionej H&E z każdego bloku dawczego. Konieczne jest, aby H&E był generowany przy użyciu świeżo ściętego przekroju tkanki, tak aby był jak najlepszym odwzorowaniem odpowiadającego mu bloku dawczego. Nie zaleca się stosowania starszych HS, biorąc pod uwagę, że tkanki FFPE są trójwymiarowymi strukturami, których profil tkankowy może się znacznie zmieniać wraz z głębokością bloku i rozległym przekrojem; mogło to mieć miejsce od czasu wygenerowania H&E, co potencjalnie spowodowało, że jego reprezentacja bloku FFPE była niedokładna. Proces przeglądu ma zasadnicze znaczenie dla wyboru odpowiednich przypadków i identyfikacji obszarów tkanek, z których należy pobrać rdzenie, a także identyfikacji obszarów, których należy unikać podczas pobierania rdzeni. W przypadku braku oceny patologicznej znacznie wzrasta prawdopodobieństwo włączenia nieodpowiednich tkanek. Włączenie takich tkanek może spowodować, że skonstruowany TMA stanie się nieskuteczny i nieodpowiedni do zamierzonego celu. Co ważne, nieświadome korzystanie z takich nieskutecznych TMA ma ogromny potencjał, aby skutkować fałszywymi i wprowadzającymi w błąd danymi. To, w połączeniu z wiedzą, że profil tkanek FFPE, a tym samym ich pochodnych rdzeni, może się znacznie zmieniać wraz ze wzrostem głębokości, podkreśla znaczenie ciągłego przeglądu patologii przez cały okres życia zbudowanego bloku TMA. Idealnie byłoby, gdyby H&E były generowane przy użyciu co 15lub 20sekcji , aby zapewnić, że wszelkie zmiany w profilach tkankowych rdzeni są rejestrowane i rejestrowane. Standardy BHP powinny być generowane i weryfikowane co najmniej na początku i na końcu projektu w celu monitorowania tych potencjalnych zmian. W świetle tych punktów i znaczenia TMA jako narzędzia badawczego, konieczne jest, aby przegląd patologiczny był mocno osadzony w procesie budowy TMA i przez cały okres życia bloku TMA.
Bloki FFPE są często szeroko sekcjonowane podczas rutynowego przetwarzania diagnostycznego przed wydaniem do celów badawczych. W rezultacie, głębokość bloku dawczego, a tym samym długość rdzenia bloku dawcy, jest często mniejsza niż idealna metoda biorcza wynosząca 4 mm. Tutaj pokazaliśmy, jak konstruować TMA za pomocą protokołu budowy metody taśmowej, którego główną zaletą jest jego kompatybilność z rdzeniami z nieidealnych bloków tkankowych FFPE. Chociaż metoda taśmowa ma dużą wartość badawczą i oferuje niedrogą, wygodną i dostępną metodę konstruowania bloków TMA, nie jest pozbawiona wyzwań i ograniczeń. W porównaniu zarówno z automatycznymi, jak i ręcznymi metodami odbioru, które mogą pomieścić 100-1000 rdzeni w jednym bloku TMA, w przypadku TMA zbudowanych przy użyciu metody taśmowej9 zaleca się maksymalnie 40 rdzeni. Kolejnym ograniczeniem jest łatwość budowy. W metodzie biorczej wykrawane rdzenie są po prostu wkładane do prefabrykowanej formy, która zapewnia stabilność rdzenia poprzez zamknięcie każdego rdzenia w jego własnej, indywidualnej studzience, zapobiegając w ten sposób migracji rdzenia, a także sprzyjając bardzo regularnemu umieszczaniu i oddzielaniu rdzeni22. Co więcej, metoda odbiorcy oferuje opcjonalną wygodę polegającą na tym, że jest w pełni ręczna, półręczna i w pełni zautomatyzowana. Natomiast metoda ręczna taśmy wymaga starannego, delikatnego ułożenia każdego rdzenia ręcznie za pomocą szpikulca. Chociaż brak formy prefabrykowanej w metodzie taśmowej wyklucza bardzo regularne umieszczanie i rozdzielanie występujące w przypadku metody odbiorcy, wada ta została przezwyciężona poprzez włączenie siatki w kratkę. Ważne jest, aby kratka w kratkę była przymocowana do środka metalowej tacy, aby uniknąć umieszczania krawędzi bloku, co zwiększa ryzyko utraty rdzenia, jeśli nie ma wystarczającej ilości parafiny utrzymującej rdzeń na miejscu. Należy również zauważyć, że małe separacje rdzeni możliwe do osiągnięcia metodą odbiorczą nie mogą być osiągnięte metodą taśmową ze względu na ręczne umieszczanie rdzenia i konieczność dopasowania igły między sąsiednimi rdzeniami. Rdzenie są umieszczane w wolnostojącym, wyprostowanym układzie, przy czym najmniejsza powierzchnia lub powierzchnia podstawy rdzenia styka się z pokrytą siatką DSST. Taka konfiguracja zapewnia znacznie mniejszą stabilność rdzenia niż metoda biorcza i zwiększa ryzyko przewrócenia się rdzenia i/lub migracji podczas nalewania stopionej parafiny. Rzeczywiście, jednym z najbardziej krytycznych kroków w protokole jest wlanie stopionej parafiny. Istotne jest, aby zrobić to szybko po wyjęciu z pieca, aby upewnić się, że parafina jest całkowicie płynna, a nalewanie odbywa się delikatnie, z minimalnymi turbulencjami. Co ciekawe, Chen i wsp. opracowali bardzo nowatorskie urządzenie pomocnicze, podobne do szablonu z równomiernie rozmieszczonymi otworami o średnicy 2 mm o wymiarach 7 x 11, które umieszcza się na pustym bloku parafiny w celu prowadzenia igieł podczas tworzenia bloku biorczego i podczas wkładania rdzeni bloku dawcy23. Chociaż takie urządzenie zostało zaprojektowane z myślą o budowie bloków odbiorczych, można je łatwo dostosować do metody taśmowej, aby kierować rozmieszczeniem, regulować separację i zwiększać stabilność rdzenia podczas procesu budowy.
Jednym z najważniejszych efektorów stabilności rdzenia jest liczba rdzeni wchodzących w skład metody taśmowej TMA. Dzieje się tak dlatego, że wraz ze wzrostem liczby rdzeni średnica rdzenia musi się zmniejszać, aby pomieścić rosnącą liczbę rdzeni, co z kolei zmniejsza ślad rdzenia przylegający do DSST. Minimalna średnica rdzenia 1 mm jest zalecana do budowy TMA metodą taśmową, ponieważ stwierdziliśmy, że rdzenie o mniejszych średnicach są szczególnie niestabilne i podatne na przewracanie się nawet przy bardzo delikatnym wylewaniu parafiny. W niedawnym badaniu, w którym przeanalizowano dwie różne metody wewnętrzne, w których użyto igieł 16 G (średnica rdzenia 1,1 mm) i stempla o średnicy 4 mm, stwierdzono znaczne straty tkanek w przypadku rdzeni 1,1 mm (26,5%), ale nie 4 mm24. Wydaje się to wskazywać, że małe rdzenie mogą być problematyczne w pracy, nie tylko podczas budowy. Co więcej, mniejsze średnice mogą nie reprezentować oryginalnego bloku dawcy, a także większe rdzenie, co utrudnia interpretację patologiczną i zwiększa prawdopodobieństwo niedokładnej reprezentacji tkanki dawcy.
Włączenie i rozmieszczenie bloków orientacyjnych ma ogromne znaczenie w konstrukcji TMA. Ma to jednak szczególne znaczenie w przypadku TMA konstruowanych metodą taśmową. Wynika to z faktu, że metoda taśmowa odwraca proces budowy, zwiększając tym samym ryzyko dezorientacji przestrzennej. Zalecamy dołączenie do trzech rdzeni orientacyjnych w każdym bloku i umieszczenie ich z dala od rdzeni próbki w celu jak najlepszej orientacji bloku. Rdzenie orientacyjne mogą być rdzeniami pobranymi z bloków tkanek zawierających wyraźnie różne tkanki z tematu skonstruowanego TMA lub narzędzi orientacyjnych w kolorze tkankowym21, przy czym to ostatnie jest szczególnie pomocne dla osób niebędących patologami. W połączeniu z nieregularnym rozmieszczeniem rdzenia z wzorem matrycy, rdzenie orientacyjne minimalizują ryzyko dezorientacji.
Wyraźna różnica w długości rdzenia pomiędzy TMA skonstruowanymi metodą taśmową a metodą biorczą wynika z uwzględnienia głębokości bloku dawczego w procesie decyzyjnym przy wyborze metody budowy. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje próg, w którym TMA są konstruowane przy użyciu metody taśmy i biorcy, gdy bloki dawcy mają głębokość odpowiednio <4 mm i 4 mm. Należy zauważyć, że uwzględnienie głębokości bloku donorowego w wyborze metody budowy nie jest uniwersalne. Chociaż możliwe jest, że TMA mogą być konstruowane przy użyciu dowolnej metody, niezależnie od głębokości bloku dawcy, wyższe rdzenie mogą zakłócać i/lub zostać przewrócone lub przechylone przez umieszczenie plastikowej kasety podczas budowy TMA przy użyciu metody taśmowej. Decyzja o uwzględnieniu lub pominięciu kryteriów w procesie decyzyjnym zależy od udogodnień dostępnych dla laboratorium, kosztów i pożądanego produktu końcowego. Zgodnie z parametrami tego protokołu, liczba odcinków TMA montowanych na suwaku, które można uzyskać za pomocą metody taśmowej zbudowanej TMA, jest znacznie mniejsza niż uzyskana przy użyciu metody biorczej skonstruowanej TMA. Chociaż możliwe jest ponowne zablokowanie tkanek FFPE w celu zwiększenia głębokości bloku dawcy i uczynienia ich zgodnymi z metodą biorcy, prawdopodobieństwo osiągnięcia tej samej orientacji tkanki w obrębie rebloku jest niskie. To z kolei może wymagać rozległej okładziny blokowej w celu uzyskania pełnego przekroju twarzy, co prawdopodobnie wiązałoby się ze znaczną utratą tkanki. Po licowaniu bloków, metoda taśmowa skonstruowana TMA daje około 50 montowanych na suwaku sekcji TMA ze wszystkimi obecnymi rdzeniami. Jednak dokładna liczba będzie się różnić w zależności od bloku i zależy od długości rdzeni użytych do budowy TMA oraz grubości ciętych sekcji (5 μm w porównaniu z 4 μm). Ponadto należy również zauważyć, że ze względu na różne długości rdzeni, rdzenie będą się wyczerpywać w różnym czasie, gdy TMA jest stopniowo dzielony na sekcje; Jest to cecha, która ponownie podkreśla potrzebę ciągłego przeglądu patologicznego.
Chociaż metoda taśmowa oferuje znaczące korzyści i zalety w porównaniu z metodą taśmową, w tym mniej żmudne i szybsze procesy konstrukcyjne, metoda taśmowa nie jest skierowana do doświadczonych laboratoriów o wysokiej przepustowości. Jest on skierowany do przeciętnych laboratoriów, szczególnie tych o ograniczonych zasobach, z dostępem do bloków dawczych o różnej głębokości, ale nie do usług budowlanych TMA. Jednak w przyszłych zastosowaniach metoda ta może zostać zautomatyzowana w celu zwiększenia puli kwalifikujących się próbek w laboratoriach o wysokiej przepustowości i wyeliminowania konieczności ponownego blokowania bloków dawczych. Podsumowując, opisany protokół budowy metody taśmowej TMA można łatwo ustalić w niewyspecjalizowanych laboratoriach bez konieczności stosowania drogiego sprzętu. Zaleca się jednak, aby nowi użytkownicy korzystali z bloków tkankowych FFPE bez wartości, beztkankowych kolorowych narzędzi orientacyjnych21 lub nawet kolorowych bloków parafinowych bez tkanki na początku, aby zapoznać się z techniką metody taśmowej przed przejściem do budowy TMA przy użyciu cennych tkanek. Chociaż ich budowa nie jest pozbawiona potencjalnych pułapek, z których powinni zdawać sobie sprawę zarówno osoby konstruujące, jak i używające bloków TMA, ta pozornie nieoszlifowana "domowa" metoda budowy TMA może przynieść wysokiej jakości, biologicznie istotne TMA do badań. Rzeczywiście, skrawki TMA wywodzące się z TMA skonstruowanych metodą taśmową należą do jednych z najbardziej poszukiwanych próbek tkanek w biorepozytorium ACSR.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez NIH funded AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) biorepository (www.acsr1.com), UM1CA181255.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop BX51 | Olympus | BX51 | |
| cellSens oprogramowanie do obrazowania | Olympus | x | |
| Waciki | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Taśma dwustronna (usuwana) | Aparat do 383534 | ||
| DP72 | Olympus | DP72 | |
| Ekonomiczny piekarnik laboratoryjny | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Kleszcze | Różne | x | |
| Formuła "R" (parafina) | Szkiełka mikroskopowe Leica | 3801450 | |
| Glass | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Niskoprofilowe ostrza do mikotomii | Accu-Edge | 4689 | |
| Mikrotom | Leica | RM2265 | |
| Marker permanentny | Mikroskop elektronowy Sciences | 72109-12 | |
| Ręczny zestaw mikromatryc tkankowych Quick Ray | Unitma | UT06 | |
| Formy bazowe ze stali nierdzewnej | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Kaseta na tkanki Taca chłodząca | Mikroskop elektronowy Sciences | 63314 | |
| Kaseta do przetwarzania / zatapiania tkanek | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Kąpiel wodna | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Drewniany kij | FisherBrand | 22363158 |
Bibliografia
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. BioTechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Jawhar, N. M. Tissue microarray: A rapidly evolving diagnostic and research tool. Annals of Saudi Medicine. 29 (2), 123-127 (2009).
- Fowler, C. B., et al. Tissue microarrays: construction and uses. Methods in Molecular Biology. 724, 23-35 (2011).
- Voduc, D., Kenney, C., Nielsen, T. O. Tissue microarrays in clinical oncology. Seminars in Radiation Oncology. 18 (2), 89-97 (2008).
- Vogel, U. Overview on techniques to construct tissue arrays with special emphasis on tissue microarrays. Microarrays (Basel). 3 (2), 103-136 (2014).
- Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjostedt, E., Ponten, F. Production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas. Journal of Visualized Experiments. (63), e3620(2012).
- Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. Journal of Visualized Experiments. (91), e51893(2014).
- Pires, A. R., Andreiuolo Fda, M., de Souza, S. R. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology. 1, 14(2006).
- Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 28 (4), 325-330 (2020).
- Wilkens, L. Verfahren und Vorrichtung zur Präparation von Gewebeproben (Method and Apparatus for the Preparation of Tissue Samples). German patent DE. 102, 102 03 524 A1 (2003).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue microarrays. Methods in Molecular Biology. 1381, 53-65 (2016).
- Bubendorf, L., Nocito, A., Moch, H., Sauter, G. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized pathology archives for high-throughput in situ studies. The Journal of Pathology. 195 (1), 72-79 (2001).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ahn, S., Woo, J. W., Lee, K., Park, S. Y. HER2 status in breast cancer: changes in guidelines and complicating factors for interpretation. Journal of Pathology and Translational Medicine. 54 (1), 34-44 (2020).
- Fukumoto, H., Kanno, T., Hasegawa, H., Katano, H. Pathology of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Frontiers in Microbiology. 2, 175(2011).
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 4 end. 2, 449-452 (2017).
- Ramsower, C., et al. Assessment of 2-year storage conditions on protein, RNA, and DNA in unstained human tissue sections, including a novel multiplex digital gene expression profiling method with implications for biobanking. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Weiss, L. M., Chen, Y. Y. EBER in situ hybridization for Epstein-Barr virus. Methods in Molecular Biology. 999, 223-230 (2013).
- Yang, Y., DeYoung, B., Qasem, S. 314 vimentin stain: A useful stain or an ancient change. American Journal of Clinical Pathology. 149, suppl_1 135(2018).
- Battifora, H. Assessment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. American Journal of Clinical Pathology. 96 (5), 669-671 (1991).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the correct tissue every time in multi-tissue blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868(2015).
- Fedor, H. L., De Marzo, A. M. Practical methods for tissue microarray construction. Methods in Molecular Medicine. 103, 89-101 (2005).
- Chen, Y. J., et al. An introduction of an easy-operating and economical technique for tissue microarray preparation. Journal of Clinical Pathology. 73 (7), 403-407 (2020).
- Gomez-de Maria, C., et al. Tissue arrays: Two simple and economical methods for manual construction. Archivos Espanoles de Urologia. 71 (10), 832-839 (2018).
Przedruki i uprawnienia
