Ręczna budowa mikromacierzy tkankowej metodą taśmową i ręcznym mikromacierzem

Summary

Ten protokół opisuje metodę taśmy, jak ręcznie konstruować mikromacierz tkankową przy użyciu bloków donorowych FFPE o różnych głębokościach.

Abstract

Mikrotablica tkankowa (TMA) jest ważnym narzędziem badawczym, w którym wiele próbek zatopionych w parafinie (FFPE) może być reprezentowanych w jednym bloku parafiny. Osiąga się to poprzez wykorzystanie rdzeni tkankowych wyekstrahowanych z obszaru zainteresowania różnych bloków FFPE dawcy i ułożenie ich w jeden blok parafinowy TMA. Po skonstruowaniu, skrawki z ukończonego TMA mogą być wykorzystane do przeprowadzenia badań immunohistochemicznych, chromogenicznych, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i RNA ISH w celu oceny ekspresji białek, a także zmian genomowych i transkrypcyjnych w wielu próbkach jednocześnie, minimalizując w ten sposób zużycie tkanek i zmniejszając koszty odczynników. Istnieje kilka różnych technik budowy TMA. Jedną z najczęściej stosowanych metod budowy jest metoda odbiorcza, która najlepiej sprawdza się w przypadku rdzeni o tej samej długości, dla których zalecana jest minimalna długość 4 mm. Niestety, bloki tkankowe mogą być mocno wycięte podczas procesu diagnostycznego, co często skutkuje "nieidealnymi" grubościami bloku dawczego poniżej 4 mm. Bieżący artykuł i film koncentrują się na metodzie dwustronnej taśmy klejącej; alternatywna ręczna, tania, łatwa w użyciu i szybka metoda konstruowania TMA o niskiej gęstości (<50 rdzeni), która jest wysoce kompatybilna z tymi nieidealnymi blokami dawczymi. Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku, jak skonstruować TMA przy użyciu tej metody, z naciskiem na krytyczne znaczenie przeglądu patologicznego i walidacji po budowie.

Introduction

Tkance z utrwaloną parafiną w formalinie (FFPE) są szeroko stosowane w morfologicznych i immunohistochemicznych badaniach ekspresji białek¹. Jednak badania odkrywcze często wymagają zbadania kilku markerów na dużej liczbie tkanek, co może doprowadzić do wyczerpania cennych tkanek. Wprowadzona w latach osiemdziesiątych XX wieku mikromacierz tkankowa (TMA) jest ważnym narzędziem badawczym, które gromadzi małe przykładowe obszary zainteresowania z wielu różnych bloków tkankowych FFPE w jeden blok parafinowy, umożliwiając badanie wielu próbek tkanek jednocześnie². W ten sposób TMA unikają nadmiernego wykorzystywania bardzo cennych i często rzadkich próbek tkanek, jednocześnie zmniejszając koszty związane z wykonywaniem dalszych aplikacji na wielu pojedynczych próbkach^3,4.

Istnieje kilka różnych technik budowy TMAs⁵, w tym podejścia automatyczne i półręczne^6,7. Większość tych ostatnich podejść wykorzystuje metodę biorcy, w której rdzenie tkanek wykrawane z bloków dawcy są wprowadzane do prefabrykowanej formy. Zaleca się jednak, aby do tej metody używać "idealnych" bloków dawcy o grubości co najmniej 4 mm^6,7. Niestety, bloki dawcze, szczególnie te, które zostały dokładnie pocięte w celach diagnostycznych przed udostępnieniem do badań, mają często grubość mniejszą niż 4 mm, co może wykluczyć je z zastosowania w budowie TMA metodą biorczą, jeśli ponowne osadzenie w celu uzyskania głębokości 4 mm nie jest możliwe lub pożądane. Co więcej, procedury te często mogą wykorzystywać stacjonarny ręczny mikromacierz tkankowy lub drogie zautomatyzowane instrumenty, które nie są łatwo dostępne lub niedostępne dla przeciętnego laboratorium badawczego. W przeciwieństwie do tego, metoda dwustronnej taśmy klejącej lub metoda taśmowa jest ręczną metodą budowy TMA, która jest kompatybilna z nieidealnymi blokami dawców, która wykorzystuje niedrogie, powszechnie dostępne, wielokrotnego użytku lub jednorazowe ręczne mikromacierze tkankowe^8,9,10. Ta metoda odwraca proces budowy poprzez odlewanie bloku wokół odwróconych pionowych rdzeni, które po zakończeniu są zlicowane z górną częścią TMA, niezależnie od długości rdzenia. W rezultacie, wszystkie próbki są obecne w sekcjach TMA po pierwszym przekroju, co pozwala konstruktorowi na maksymalne wykorzystanie tych nieidealnych bloków od samego początku. W związku z tym metoda taśmowa stanowi opłacalną i wykonalną alternatywę dla niewyspecjalizowanych laboratoriów badawczych.

Budowa TMA nie jest pozbawiona wyzwań, dlatego należy zachować ostrożność przy wyborze obszarów tkanek do ekstrakcji rdzeni, co sprawia, że kontrola patologiczna jest krytyczną częścią procesu budowy TMA^11,12. W związku z tym protokół ten ma na celu podkreślenie głębokiego znaczenia oceny patologicznej w budowie TMA poprzez podkreślenie niektórych patologicznych pułapek związanych z konstrukcją TMA, których osoby konstruujące i używające TMA powinny być świadome, oraz dlaczego przegląd patologiczny powinien być kontynuowany przez cały okres istnienia bloku TMA.

Ten protokół opisuje kroki podjęte w Technicznym Laboratorium Podstawowym AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) w celu skonstruowania TMA z nieidealnych bloków dawców przy użyciu metody taśmowej; gdzie ACSR jest finansowanym przez NIH repozytorium biologicznym poświęconym gromadzeniu i sprawiedliwej dystrybucji próbek biologicznych z tkanek raka HIV w celu promowania badań nad złośliwością HIV.

Protocol

Wszystkie bloki dawców zostały pozbawione elementów identyfikujących podczas pobierania i wykorzystane do budowy TMA zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IRB Mayo Clinic (PR16-000507 i PR2207-02).

1. Przegląd patologii

1. Pobrać bloki dawcy tkanek FFPE do wykorzystania w budowie TMA.
2. Prześlij świeżo wygenerowany preparat barwiony hematoksyliną i eozyną (H&E) class¹³ dla każdego bloku dawcy tkanki FFPE wybranego do oceny histologicznej przez certyfikowanego patologa w celu potwierdzenia diagnozy i adnotacji tkanki.
   UWAGA: Barwienie BHP może być wykonane we własnym zakresie lub wysłane do patologicznego laboratorium podstawowego leczenia w celu barwienia, tak jak miało to miejsce w tym protokole. Jednym z najważniejszych pojęć, o których należy pamiętać podczas konstruowania TMA, jest to, że tkanki w blokach dawcy FFPE są strukturami trójwymiarowymi (3D), których kształt, zawartość guza i żywotność tkanek mogą się znacznie zmieniać wraz ze wzrostem głębokości bloku. Patolog musi określić, na podstawie przeglądu wycinka tkanki barwionej H&E, który jest dwuwymiarową reprezentacją tkanki 3D, najlepszy obszar do ekstrakcji rdzenia tkanki.
3. Podczas przeglądu histologicznego upewnij się, że patolog identyfikuje i adnotuje tkanki, które są interesujące/nieinteresujące na szkiełkach barwionych H&E. Aby dodać adnotacje do slajdu, wykonaj poniższe czynności.
   1. Użyj pisaka do zaznaczania slajdów, aby zakreślić interesującą tkankę.
   2. Za pomocą tego samego pisaka do znakowania wytrzyj obszary w zakreślonym obszarze, których należy unikać.
   3. Użyj pisaka do znakowania, aby oznaczyć obszary uznane za idealne do pobierania próbek rdzeniowych i ekstrakcji.
      UWAGA: Należy pamiętać, że kształt i skład tkanki może się zmieniać wraz z głębokością tkanki w bloku. W związku z tym skład rdzenia tkanki może się zmieniać w zależności od tego, gdzie rdzeń został pobrany, co podkreśla potrzebę ciągłego patologicznego prowadzenia.
   4. W razie potrzeby należy przesłać dodatkową tkankę do barwienia immunohistochemicznego specyficznego dla choroby wraz z HS, aby wspomóc ocenę patologiczną. Przykłady takich barwień obejmują barwienie ERBB2 dla HER2 dodatniego raka piersi¹⁴, HHV-8 dla mięsaka Kaposiego¹⁵, CD20 dla chłoniaków B-komórkowych¹⁶, U6 jako globalny marker jakości RNA¹⁷, EBER do określenia pozytywności wirusa Epsteina-Barr¹⁸ oraz Vimentin jako potwierdzenie pochodzenia mezenchymalnego i markera kontroli jakości tkanek^19,20.

2. Przygotowanie do budowy TMA

1. Po zakończeniu przeglądu patologicznego sporządź ostateczną listę bloków dawczych, które mają być użyte w budowie TMA i utwórz mapę TMA (Rysunek 1A). Mapa TMA jest schematem przedstawiającym, gdzie będą znajdować się rdzenie w wypełnionym TMA i montowanych na szkiełku próbkach tkanek uzyskanych z wynikowego TMA.
2. W celach orientacyjnych upewnij się, że mapa TMA unika umieszczania rdzeni w równej macierzy, takiej jak macierz 3 x 3 lub 4 x 4, i zawiera co najmniej 1 znacznik orientacji.
   UWAGA: Rdzenie orientacyjne mogą być rdzeniami pobranymi z beztkankowych kolorowych narzędzi orientacyjnych²¹, lub blokami tkanek zawierającymi wyraźnie różne tkanki z tematu TMA. W przeciwieństwie do metody odbiorcy, w której pionowe rdzenie są wkładane do wstępnie odlanej formy woskowej, metoda taśmowa tworzy TMA poprzez wlewanie stopionego wosku wokół odwróconych, wyprostowanych rdzeni. To odwrócenie procesu budowy wymaga drugiej mapy zwanej mapą budowy.
3. Utwórz mapę budowy, tworząc lustrzane odbicie mapy TMA (Rysunek 1B). Mapa budowy pokazuje, gdzie każdy rdzeń musi zostać umieszczony podczas budowy, aby pojawił się we właściwym miejscu w ukończonym TMA. Zapisz mapę budowy.
4. Po utworzeniu map przygotuj metalową formę bazową TMA. Użyj jednorazowej papierowej siatki w kratkę, aby pokierować rozmieszczeniem rdzenia i wyregulować separację rdzenia.
   UWAGA: Siatka szablonów 6 x 7 (42 punkty) dla maksymalnie 40 rdzeni (plus dla dwóch rdzeni/przerw orientacyjnych) do użytku z dostępnymi na rynku metalowymi formami bazowymi o wymiarach wewnętrznych 26 mm x 20 mm jest dostępna w dodatkowym pliku PDF. Wydrukuj i wytnij siatkę papieru.
5. Przytnij siatkę w kratkę na wymiar i przymocuj kawałek dwustronnej taśmy klejącej (DSST) z tyłu siatki. Umieść siatkę i taśmę DSST na metalowej tacy i dodaj drugi kawałek DSST na wierzchu siatki, tj. na wierzchu siatki papierowej w metalowej podstawie formy (Rysunek 2A).

3. Umiejscowienie rdzenia

1. Nałóż patologicznie oceniany H&E na odpowiadający mu blok tkankowy i użyj oznaczeń patologa, aby określić, gdzie blok tkankowy ma zostać przebity (Rysunek 2B).
2. Przebij blok dawcy FFPE za pomocą ręcznego przebijaka rdzeniowego (Rysunek 2C) w odpowiednim miejscu.
   UWAGA: Stemple rdzeniowe są dostępne w różnych średnicach. W tej metodzie wykorzystuje się ręczny przebijak koronowy o średnicy 2 mm.
   1. Jeśli używasz dziurkacza wielokrotnego użytku, upewnij się, że jest on czyszczony przed i po każdym wkłuciu w tkankę.
3. Wysuń rdzeń z przebijaka rdzeniowego i użyj wykałaczki, aby umieścić wyrzucony rdzeń na krzyżu nitkowym siatki pokrytej DSST (Rysunek 2D). Upewnij się, że po umieszczeniu rdzenia na siatce jest on odwrócony i ustawiony pionowo tak, że tkankowy koniec rdzenia styka się z DSST (tkanka zadrukowaną do dołu). Upewnij się również, że rdzeń jest umieszczony w odpowiednim miejscu na siatce, jak oznaczono na mapie budowy.
4. Powtarzaj, aż wszystkie bloki dawcze zostaną wydrążone, a rdzenie zostaną umieszczone we właściwych pozycjach.

4. Ukończenie TMA

1. Włącz piekarnik stołowy, ustaw na 78 °C i odczekaj wystarczająco dużo czasu, aby osiągnąć odpowiednią temperaturę.
2. Dla każdego TMA, który ma zostać zbudowany, rozpuść 45 g granulek parafiny w pojemniku żaroodpornym.
3. Oznacz plastikową kasetę i umieść ją na metalowej podstawie zawierającej rdzenie (Rysunek 2E). Wysokość rdzeni nie powinna przekraczać głębokości metalowej tacy, ponieważ wysokie rdzenie zostaną przechylone lub przewrócone po umieszczeniu kasety na miejscu.
4. Umieść formę z kasetą na tacy, aby złapać przelew i delikatnie przelej stopioną parafinę przez kasetę do tacki z rdzeniami (Rysunek 2F).
5. Pozwól, aby stopiona parafina przelała się, aby upewnić się, że w korpusie TMA nie ma pęcherzyków powietrza. Upewnij się, że parafina wypełnia się do górnej części kasety, tak aby była osadzona i mocno związana z blokiem parafiny po zestaleniu się parafiny.
6. Nie przesuwaj ani nie przeszkadzaj blokowi i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie wstaw do lodówki w temperaturze 4 °C na dodatkowe 30 minut, aby całkowicie zastygł.
7. Po całkowitym zestaleniu delikatnie oddziel metalową formę bazową od bloku parafiny związanego z kasetą rdzeni.
   UWAGA: DSST zachowuje swoją przyczepność w procesie budowy i często jest dołączany do nowo powstałego bloku parafinowego. W razie potrzeby delikatnie usuń DSST i siatkę z górnej części ukończonego bloku TMA.

5. Walidacja TMA

1. Po zbudowaniu TMA użyj mikrotomu, aby przeciąć nowo ukończony TMA. Wytnij jeden lub więcej pełnopowierzchniowych odcinków tkanki.
2. Przenieś sekcje do podgrzanej łaźni wodnej i zamontuj je na suwaku.
   UWAGA: Nowo konstruowane bloki często wymagają licowania bloków (odcięcia nadmiaru parafiny) w celu uzyskania pełnych skrawków tkanek twarzy, które zawierają wszystkie rdzenie.
3. Po wyschnięciu prześlij świeżo wyciętą sekcję TMA montowaną na szkiełku do barwienia H&E ¹³ i w razie potrzeby wszelkich dodatkowych barwień immunohistochemicznych.
4. Prześlij poplamione sekcje TMA H&E do oceny patologicznej.
   UWAGA: Podczas przeglądu patologii TMA certyfikowany przez zarząd patolog, najlepiej ten sam patolog, który dokonał przeglądu bloków dawczych TMA, dokonuje przeglądu barwionych rdzeni TMA H&E, aby upewnić się, że pożądane tkanki będące przedmiotem zainteresowania są rzeczywiście obecne. Jeśli w kroku 1.3.4 przesłano jakiekolwiek dodatkowe barwniki immunohistochemiczne specyficzne dla tkanki lub choroby, barwienia te należy powtórzyć na odcinkach TMA i przedłożyć wraz z TMA H&E do oceny patologicznej.
5. Zapisz wyniki patologicznego przeglądu walidacyjnego TMA.

Results

Opisana tutaj metoda budowy taśmy TMA jest metodą z wyboru stosowaną w Technicznym Laboratorium Głównym ACSR w celu konserwacji tkanek, co z kolei pozwala na oszczędną i sprawiedliwą dystrybucję bardzo cennych tkanek wśród badaczy.

Kluczowym elementem procesu budowy jest identyfikacja interesującej tkanki w danym bloku dawcy, z którego powinien być pobrany rdzeń TMA. Określa się to na podstawie oceny patologicznej, w której przeszkolony patolog przegląda świeżo wygenerowany preparat H&E (Rysunek 3). Za pomocą markera patolog zakreśla obszar na szkiełku H&E, co wskazuje, że rdzeń powinien zostać pobrany z bloku dawcy znajdującego się w tym okręgu (Ryc. 3). Patolog może również zaznaczyć dodatkowe obszary, takie jak obszary martwicze, których należy unikać, lub łagodne obszary, z których można uzyskać dodatkowe rdzenie tkanek (Ryc. 3). Rdzenie są następnie wykrawane ze wskazanych obszarów i włączane do budowy TMA.

Istnieją dwie główne metryki pomyślnego zakończenia TMA metodą taśmową. Pierwszym z nich jest obecność kropek rdzenia tkankowego w oczekiwanych miejscach i odległościach od siebie, co ocenia się za pomocą oględzin. Rysunek 4A,B przedstawia dwa całkowicie taśmowe TMA i odpowiadające im slajdy H&E. Oględziny bloków TMA pokazują, że rdzenie są obecne i regularnie rozmieszczone w każdym TMA. Niektóre z głównych problemów konstrukcyjnych, które mogą pojawić się podczas procesu budowy metodą taśmową, obejmują oddzielenie bloku i kasety z powodu przedwczesnego usunięcia metalowej podstawy przed zestaleniem wosku (Rysunek 4C). Innym potencjalnym problemem zaobserwowanym w TMA zbudowanych metodą taśmową jest przewracanie się rdzenia i/lub dryf rozmieszczenia osadzonych rdzeni (Rysunek 4D); problem, który może wynikać z nadmiernie burzliwego nalewania stopionej parafiny, który może być dodatkowo wzmocniony przez słabo przyczepny DSST. Rysunek 5 pokazuje obrazy H&E dla rdzeni TMA1. Wszystkie jądra z wyjątkiem jednego (punkt 1) są obecne w H&E TMA1. Rysunek 5 pokazuje również, że niektóre rdzenie są obecne jako kompletne okrągłe kropki tkankowe (np. plamki 4, 6, 13, 17), podczas gdy inne nie są całkowicie obecne (np. plamki 3, 8, 9, 12). Utrata tkanki występująca w tych ostatnich przypadkach nie jest rzadkością i może być spowodowana niewystarczającym cięciem potrzebnym do pełnego odsłonięcia wszystkich rdzeni. Alternatywnie, obecność niekompletnej lub całkowity brak tkanki (tj. plamka 1) może wynikać ze złej jakości tkanki tego rdzenia, co może skutkować utratą tkanki podczas procesu barwienia.

Drugi wskaźnik sukcesu jest oceniany pod kątem tego, czy rdzenie TMA przechwyciły tkankę będącą przedmiotem zainteresowania, czy nie. Osiąga się to poprzez patologiczny przegląd i walidację poszczególnych rdzeni TMA H&E (Figura 5) w porównaniu z wstępnie wyciętym blokiem dawcy H&E (Figura 3) oraz, w razie potrzeby/wykonano wszelkie inne dodatkowe barwienia immunohistochemiczne. Rysunek 6 przedstawia przykładowe barwienia wykonane na TMA1, w tym Vimentin, U6, EBER i CD20. Tkanki wimentyno-dodatnie (brązowa plama) wskazują, że wszystkie tkanki są pochodzenia mezenchymalnego i są dobrej jakości, które można barwić. Dodatnia wartość U6 (ciemnofioletowa/niebieska plama) wskazuje, że jakość RNA w tkance jest dobra i uzupełnia barwienia hybrydyzacji RNA in situ (ISH), takie jak EBER, które są ukierunkowane na transkrypty genów. Wyniki U6 to Rysunek 5 wskazuje, że jakość RNA jest wysoka w tkance chłoniaka (punkt 9) i normalna kontrola orientacji tkanki migdałków (punkt 22), ale nie w normalnej tkance w miejscu 19. W następstwie tego zabarwienie EBER było ujemne w normalnej tkance i kontroli orientacji, ale silnie dodatnie w tkance chłoniaka (plamka 9). Zgodnie z oczekiwaniami w przypadku tkanek pochodzenia limfatycznego, zarówno plamki 9, jak i 22 były wybarwione dodatnio na obecność markera komórek B CD20, ale plamka 19, która wywodzi się z normalnej tkanki rdzenia kręgowego, nie. Wyniki barwienia dla wszystkich rdzeni TMA są podsumowane w Tabeli 1 i potwierdzają adnotację tkankową dla tych rdzeni tkankowych TMA.

Rysunek 1: Mapy TMA. Po wybraniu wszystkich bloków FFPE i elementów sterujących orientacją tworzona jest szczegółowa mapa, znana jako mapa TMA (A), przedstawiająca, gdzie w gotowym bloku będzie zlokalizowany każdy rdzeń bloku dawcy. Ważne jest, aby pamiętać, że podczas konstruowania TMA metodą taśmową, mapa konstrukcyjna (B) jest lustrzanym odbiciem mapy TMA, ponieważ metoda ta odwraca proces budowy, rozlewając stopioną parafinę wokół pionowych rdzeni tkankowych, zamiast wkładać rdzenie do formy prefabrykowanej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Budowanie TMA metodą taśmową. (A) Warstwa 2 kawałków dwustronnej taśmy klejącej (DSST) i papierowej siatki w następującej kolejności na spodzie metalowej podstawy; umieść pierwszy kawałek DSST (wkładka 2A), następnie jednorazową siatkę papierową, a następnie drugi kawałek DSST na dnie formy z metalową podstawą. (B) Dla każdego bloku dawcy generowany jest nowy morfolog i badany przez patologa, który zaznacza H&E, aby oznaczyć tkankę będącą przedmiotem zainteresowania, miejsce przebicia bloku i, w stosownych przypadkach, gdzie należy unikać dziurkowania w celu ekstrakcji rdzenia tkankowego. (C) Przebić blok dawcy ręcznym stemplem TMA do utylizacji lub wielokrotnego użytku. (D) Za pomocą kilofa igłowego każdy rdzeń umieszcza się w pozycji pionowej, guzem skierowanym w dół na DSST zakrywającym siatkę. (E) Ostrożnie umieść wstępnie oznakowaną plastikową kasetę na metalowej tacy zawierającej pionowe rdzenie. (F) Stopiona parafina jest delikatnie wlewana do tacy przez kratę kasety, aby otoczyć i zanurzyć pionowe rdzenie pod kasetą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Plama H&E bloku dawcy. Wybarwienia H&E z każdego bloku dawczego są poddawane przeglądowi jakości z patologiem szkoleniowym, który opatruje markerem na wybarwionym H&E szkiełko, aby wskazać obszary/tkanki będące przedmiotem zainteresowania (tj. żywe tkanki nowotworowe (CA) lub łagodne (BN)) do pobrania rdzenia, a także obszary, których należy unikać (tj. martwicze obszary tkanki). Odpowiednie obszary bloku tkankowego, wskazane przez adnotację H&E, są następnie identyfikowane, dziurkowane i włączane do budowanego TMA. Powstały w ten sposób stempel rdzeniowy TMA H&E można następnie odnieść z powrotem do niewykratego obszaru bloku dawcy H&E, aby potwierdzić, że tkanka będąca przedmiotem zainteresowania została uchwycona w stemplu rdzeniowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki. (A,B) Pomyślnie ukończone TMA metodą taśmową i towarzyszące im H&E do oceny patologicznej. (C) Oddzielenie plastikowej kasety i bloku parafinowego, gdy kaseta jest przedwcześnie wyjmowana z metalowej formy podstawowej. (D) Ukończona metoda taśmowa TMA pokazująca przewrócone i zmigrowane rdzenie powstałe w wyniku turbulentnego wylewania stopionej parafiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Podstawowe systemy zarządzania bezpieczeństwem i higieną pracy TMA. Przekrój barwiony H&E dla TMA1, pokazujący indywidualne H&E dla każdego rdzenia tkankowego użytego do budowy TMA (plamki 1-21), a także rdzenie orientacyjne (plamki 22 i 23). Pokazane obrazy zostały uzyskane za pomocą obiektywu 4x, wyposażonego w kamerę cyfrową podłączoną do oprogramowania do obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przykładowy immunohistochemiczny i RNA ISH. Pełne wycinki twarzy z TMA1 oceniano za pomocą IHC pod kątem ekspresji wimentyny i CD20 oraz za pomocą RNA ISH w celu oceny jakości RNA (U6) i statusu EBV za pomocą EBER ISH. Obrazy pokazują przykładowe obrazy dla trzech rdzeni, w tym jednej tkanki nowotworowej (punkt 9), jednej normalnej tkanki (punkt 19), a także jednej z dwóch kontroli orientacji (punkt 22). Pozytywność wimentyny jest oznaczana przez brązowe zabarwienie, dodatniość U6 jest oznaczana przez niebieskie / fioletowe zabarwienie, EBER przez niebieskie / fioletowe barwienie, a CD20 przez brązowe zabarwienie. Pokazane obrazy zostały uzyskane za pomocą obiektywu 4x, wyposażonego w kamerę cyfrową podłączoną do oprogramowania do obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przegląd skonstruowanych tkanek TMA i wykonanych barwień: Tabela przedstawia czy (a) tkanka jest obecna w każdym z reprezentatywnych miejsc TMA (b) guz jest obecny w każdym miejscu tkanki barwionej H&E i (c) wyniki wszelkich dodatkowych barwień immunohistologicznych wykonanych na sąsiednich odcinkach TMA: "-" oznacza wynik negatywny, n/d = nie zrobione. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Jednym z najbardziej krytycznych elementów procesu budowy TMA jest przegląd patologiczny bloków dawczych FFPE, z których zostaną pozyskane rdzenie TMA⁴. Podczas przeglądu certyfikowany przez komisję patolog bada reprezentatywny wycinek tkanki barwionej H&E z każdego bloku dawczego. Konieczne jest, aby H&E był generowany przy użyciu świeżo ściętego przekroju tkanki, tak aby był jak najlepszym odwzorowaniem odpowiadającego mu bloku dawczego. Nie zaleca się stosowania starszych HS, biorąc pod uwagę, że tkanki FFPE są trójwymiarowymi strukturami, których profil tkankowy może się znacznie zmieniać wraz z głębokością bloku i rozległym przekrojem; mogło to mieć miejsce od czasu wygenerowania H&E, co potencjalnie spowodowało, że jego reprezentacja bloku FFPE była niedokładna. Proces przeglądu ma zasadnicze znaczenie dla wyboru odpowiednich przypadków i identyfikacji obszarów tkanek, z których należy pobrać rdzenie, a także identyfikacji obszarów, których należy unikać podczas pobierania rdzeni. W przypadku braku oceny patologicznej znacznie wzrasta prawdopodobieństwo włączenia nieodpowiednich tkanek. Włączenie takich tkanek może spowodować, że skonstruowany TMA stanie się nieskuteczny i nieodpowiedni do zamierzonego celu. Co ważne, nieświadome korzystanie z takich nieskutecznych TMA ma ogromny potencjał, aby skutkować fałszywymi i wprowadzającymi w błąd danymi. To, w połączeniu z wiedzą, że profil tkanek FFPE, a tym samym ich pochodnych rdzeni, może się znacznie zmieniać wraz ze wzrostem głębokości, podkreśla znaczenie ciągłego przeglądu patologii przez cały okres życia zbudowanego bloku TMA. Idealnie byłoby, gdyby H&E były generowane przy użyciu co 15^lub 20^sekcji , aby zapewnić, że wszelkie zmiany w profilach tkankowych rdzeni są rejestrowane i rejestrowane. Standardy BHP powinny być generowane i weryfikowane co najmniej na początku i na końcu projektu w celu monitorowania tych potencjalnych zmian. W świetle tych punktów i znaczenia TMA jako narzędzia badawczego, konieczne jest, aby przegląd patologiczny był mocno osadzony w procesie budowy TMA i przez cały okres życia bloku TMA.

Bloki FFPE są często szeroko sekcjonowane podczas rutynowego przetwarzania diagnostycznego przed wydaniem do celów badawczych. W rezultacie, głębokość bloku dawczego, a tym samym długość rdzenia bloku dawcy, jest często mniejsza niż idealna metoda biorcza wynosząca 4 mm. Tutaj pokazaliśmy, jak konstruować TMA za pomocą protokołu budowy metody taśmowej, którego główną zaletą jest jego kompatybilność z rdzeniami z nieidealnych bloków tkankowych FFPE. Chociaż metoda taśmowa ma dużą wartość badawczą i oferuje niedrogą, wygodną i dostępną metodę konstruowania bloków TMA, nie jest pozbawiona wyzwań i ograniczeń. W porównaniu zarówno z automatycznymi, jak i ręcznymi metodami odbioru, które mogą pomieścić 100-1000 rdzeni w jednym bloku TMA, w przypadku TMA zbudowanych przy użyciu metody taśmowej⁹ zaleca się maksymalnie 40 rdzeni. Kolejnym ograniczeniem jest łatwość budowy. W metodzie biorczej wykrawane rdzenie są po prostu wkładane do prefabrykowanej formy, która zapewnia stabilność rdzenia poprzez zamknięcie każdego rdzenia w jego własnej, indywidualnej studzience, zapobiegając w ten sposób migracji rdzenia, a także sprzyjając bardzo regularnemu umieszczaniu i oddzielaniu rdzeni²². Co więcej, metoda odbiorcy oferuje opcjonalną wygodę polegającą na tym, że jest w pełni ręczna, półręczna i w pełni zautomatyzowana. Natomiast metoda ręczna taśmy wymaga starannego, delikatnego ułożenia każdego rdzenia ręcznie za pomocą szpikulca. Chociaż brak formy prefabrykowanej w metodzie taśmowej wyklucza bardzo regularne umieszczanie i rozdzielanie występujące w przypadku metody odbiorcy, wada ta została przezwyciężona poprzez włączenie siatki w kratkę. Ważne jest, aby kratka w kratkę była przymocowana do środka metalowej tacy, aby uniknąć umieszczania krawędzi bloku, co zwiększa ryzyko utraty rdzenia, jeśli nie ma wystarczającej ilości parafiny utrzymującej rdzeń na miejscu. Należy również zauważyć, że małe separacje rdzeni możliwe do osiągnięcia metodą odbiorczą nie mogą być osiągnięte metodą taśmową ze względu na ręczne umieszczanie rdzenia i konieczność dopasowania igły między sąsiednimi rdzeniami. Rdzenie są umieszczane w wolnostojącym, wyprostowanym układzie, przy czym najmniejsza powierzchnia lub powierzchnia podstawy rdzenia styka się z pokrytą siatką DSST. Taka konfiguracja zapewnia znacznie mniejszą stabilność rdzenia niż metoda biorcza i zwiększa ryzyko przewrócenia się rdzenia i/lub migracji podczas nalewania stopionej parafiny. Rzeczywiście, jednym z najbardziej krytycznych kroków w protokole jest wlanie stopionej parafiny. Istotne jest, aby zrobić to szybko po wyjęciu z pieca, aby upewnić się, że parafina jest całkowicie płynna, a nalewanie odbywa się delikatnie, z minimalnymi turbulencjami. Co ciekawe, Chen i wsp. opracowali bardzo nowatorskie urządzenie pomocnicze, podobne do szablonu z równomiernie rozmieszczonymi otworami o średnicy 2 mm o wymiarach 7 x 11, które umieszcza się na pustym bloku parafiny w celu prowadzenia igieł podczas tworzenia bloku biorczego i podczas wkładania rdzeni bloku dawcy²³. Chociaż takie urządzenie zostało zaprojektowane z myślą o budowie bloków odbiorczych, można je łatwo dostosować do metody taśmowej, aby kierować rozmieszczeniem, regulować separację i zwiększać stabilność rdzenia podczas procesu budowy.

Jednym z najważniejszych efektorów stabilności rdzenia jest liczba rdzeni wchodzących w skład metody taśmowej TMA. Dzieje się tak dlatego, że wraz ze wzrostem liczby rdzeni średnica rdzenia musi się zmniejszać, aby pomieścić rosnącą liczbę rdzeni, co z kolei zmniejsza ślad rdzenia przylegający do DSST. Minimalna średnica rdzenia 1 mm jest zalecana do budowy TMA metodą taśmową, ponieważ stwierdziliśmy, że rdzenie o mniejszych średnicach są szczególnie niestabilne i podatne na przewracanie się nawet przy bardzo delikatnym wylewaniu parafiny. W niedawnym badaniu, w którym przeanalizowano dwie różne metody wewnętrzne, w których użyto igieł 16 G (średnica rdzenia 1,1 mm) i stempla o średnicy 4 mm, stwierdzono znaczne straty tkanek w przypadku rdzeni 1,1 mm (26,5%), ale nie 4 mm²⁴. Wydaje się to wskazywać, że małe rdzenie mogą być problematyczne w pracy, nie tylko podczas budowy. Co więcej, mniejsze średnice mogą nie reprezentować oryginalnego bloku dawcy, a także większe rdzenie, co utrudnia interpretację patologiczną i zwiększa prawdopodobieństwo niedokładnej reprezentacji tkanki dawcy.

Włączenie i rozmieszczenie bloków orientacyjnych ma ogromne znaczenie w konstrukcji TMA. Ma to jednak szczególne znaczenie w przypadku TMA konstruowanych metodą taśmową. Wynika to z faktu, że metoda taśmowa odwraca proces budowy, zwiększając tym samym ryzyko dezorientacji przestrzennej. Zalecamy dołączenie do trzech rdzeni orientacyjnych w każdym bloku i umieszczenie ich z dala od rdzeni próbki w celu jak najlepszej orientacji bloku. Rdzenie orientacyjne mogą być rdzeniami pobranymi z bloków tkanek zawierających wyraźnie różne tkanki z tematu skonstruowanego TMA lub narzędzi orientacyjnych w kolorze tkankowym²¹, przy czym to ostatnie jest szczególnie pomocne dla osób niebędących patologami. W połączeniu z nieregularnym rozmieszczeniem rdzenia z wzorem matrycy, rdzenie orientacyjne minimalizują ryzyko dezorientacji.

Wyraźna różnica w długości rdzenia pomiędzy TMA skonstruowanymi metodą taśmową a metodą biorczą wynika z uwzględnienia głębokości bloku dawczego w procesie decyzyjnym przy wyborze metody budowy. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje próg, w którym TMA są konstruowane przy użyciu metody taśmy i biorcy, gdy bloki dawcy mają głębokość odpowiednio <4 mm i 4 mm. Należy zauważyć, że uwzględnienie głębokości bloku donorowego w wyborze metody budowy nie jest uniwersalne. Chociaż możliwe jest, że TMA mogą być konstruowane przy użyciu dowolnej metody, niezależnie od głębokości bloku dawcy, wyższe rdzenie mogą zakłócać i/lub zostać przewrócone lub przechylone przez umieszczenie plastikowej kasety podczas budowy TMA przy użyciu metody taśmowej. Decyzja o uwzględnieniu lub pominięciu kryteriów w procesie decyzyjnym zależy od udogodnień dostępnych dla laboratorium, kosztów i pożądanego produktu końcowego. Zgodnie z parametrami tego protokołu, liczba odcinków TMA montowanych na suwaku, które można uzyskać za pomocą metody taśmowej zbudowanej TMA, jest znacznie mniejsza niż uzyskana przy użyciu metody biorczej skonstruowanej TMA. Chociaż możliwe jest ponowne zablokowanie tkanek FFPE w celu zwiększenia głębokości bloku dawcy i uczynienia ich zgodnymi z metodą biorcy, prawdopodobieństwo osiągnięcia tej samej orientacji tkanki w obrębie rebloku jest niskie. To z kolei może wymagać rozległej okładziny blokowej w celu uzyskania pełnego przekroju twarzy, co prawdopodobnie wiązałoby się ze znaczną utratą tkanki. Po licowaniu bloków, metoda taśmowa skonstruowana TMA daje około 50 montowanych na suwaku sekcji TMA ze wszystkimi obecnymi rdzeniami. Jednak dokładna liczba będzie się różnić w zależności od bloku i zależy od długości rdzeni użytych do budowy TMA oraz grubości ciętych sekcji (5 μm w porównaniu z 4 μm). Ponadto należy również zauważyć, że ze względu na różne długości rdzeni, rdzenie będą się wyczerpywać w różnym czasie, gdy TMA jest stopniowo dzielony na sekcje; Jest to cecha, która ponownie podkreśla potrzebę ciągłego przeglądu patologicznego.

Chociaż metoda taśmowa oferuje znaczące korzyści i zalety w porównaniu z metodą taśmową, w tym mniej żmudne i szybsze procesy konstrukcyjne, metoda taśmowa nie jest skierowana do doświadczonych laboratoriów o wysokiej przepustowości. Jest on skierowany do przeciętnych laboratoriów, szczególnie tych o ograniczonych zasobach, z dostępem do bloków dawczych o różnej głębokości, ale nie do usług budowlanych TMA. Jednak w przyszłych zastosowaniach metoda ta może zostać zautomatyzowana w celu zwiększenia puli kwalifikujących się próbek w laboratoriach o wysokiej przepustowości i wyeliminowania konieczności ponownego blokowania bloków dawczych. Podsumowując, opisany protokół budowy metody taśmowej TMA można łatwo ustalić w niewyspecjalizowanych laboratoriach bez konieczności stosowania drogiego sprzętu. Zaleca się jednak, aby nowi użytkownicy korzystali z bloków tkankowych FFPE bez wartości, beztkankowych kolorowych narzędzi orientacyjnych²¹ lub nawet kolorowych bloków parafinowych bez tkanki na początku, aby zapoznać się z techniką metody taśmowej przed przejściem do budowy TMA przy użyciu cennych tkanek. Chociaż ich budowa nie jest pozbawiona potencjalnych pułapek, z których powinni zdawać sobie sprawę zarówno osoby konstruujące, jak i używające bloków TMA, ta pozornie nieoszlifowana "domowa" metoda budowy TMA może przynieść wysokiej jakości, biologicznie istotne TMA do badań. Rzeczywiście, skrawki TMA wywodzące się z TMA skonstruowanych metodą taśmową należą do jednych z najbardziej poszukiwanych próbek tkanek w biorepozytorium ACSR.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop BX51	Olympus	BX51
cellSens oprogramowanie do obrazowania	Olympus	x
Waciki	FisherBrand	22-456-880
Taśma dwustronna (usuwana)	Aparat do 383534
DP72	Olympus	DP72
Ekonomiczny piekarnik laboratoryjny	FisherBrand	13246516GAQ
Kleszcze	Różne	x
Formuła "R" (parafina)	Szkiełka mikroskopowe Leica	3801450
Glass	FisherBrand	12-550-15
Niskoprofilowe ostrza do mikotomii	Accu-Edge	4689
Mikrotom	Leica	RM2265
Marker permanentny	Mikroskop elektronowy Sciences	72109-12
Ręczny zestaw mikromatryc tkankowych Quick Ray	Unitma	UT06
Formy bazowe ze stali nierdzewnej	FisherBrand	22-038-209
Kaseta na tkanki Taca chłodząca	Mikroskop elektronowy Sciences	63314
Kaseta do przetwarzania / zatapiania tkanek	FisherBrand	15-182-701E
Kąpiel wodna	Triangle Biomedical Sciences	TFB-120
Drewniany kij	FisherBrand	22363158