Method Article

Zautomatyzowane przetwarzanie próbek proteomicznych typu shotgun przez robota laboratoryjnego typu open source

DOI:

10.3791/63092

⸱

October 28th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowy protokół i trzy skrypty Pythona są dostępne do obsługi zrobotyzowanego systemu obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym do wykonywania półautomatycznego przygotowania próbek białek do eksperymentów spektrometrii mas, obejmujących etapy usuwania detergentów, trawienia białek i odsalania peptydów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty proteomiczne oparte na spektrometrii mas wymagają wielu etapów przygotowania próbki, w tym enzymatycznego trawienia białek i oczyszczania, co może zająć znaczną ilość osobogodzin pracy na stanowisku i stanowić źródło zmienności między partiami. Automatyzacja laboratorium za pomocą robotów pipetujących może zmniejszyć nakład pracy ręcznej, zmaksymalizować wydajność i zwiększyć powtarzalność badań. Mimo to wysokie ceny wyjściowe standardowych stacji automatyki sprawiają, że są one nieosiągalne dla wielu laboratoriów akademickich. W tym artykule opisano proces przygotowania próbek proteomicznych przy użyciu niedrogiego systemu automatyzacji typu open source (Opentrons OT-2), w tym instrukcje dotyczące konfiguracji półautomatycznej redukcji białek, alkilacji, trawienia i oczyszczania; a także towarzyszące skrypty Pythona o otwartym kodzie źródłowym do programowania systemu OT-2 za pomocą interfejsu programowania aplikacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomika oparta na spektrometrii mas jest potężnym narzędziem do jednoczesnego pomiaru obfitości wielu białek w próbkach biologicznych. Eksperymenty proteomiczne z analizą bioinformatyczną są rutynowo wykorzystywane do identyfikacji biomarkerów i odkrywania powiązanych kompleksów biologicznych i szlaków leżących u podstaw mechanizmów patologicznych. Dzięki wysokiej swoistości analitowej i potencjalnej dokładności ilościowej, proteomika shotgun ma również doskonały potencjał do przyjęcia przez ośrodki badawcze i laboratoria diagnostyczne do analizy próbek klinicznych bez konieczności polegania na przeciwciałach1,2.

Aby przygotować próbki białek do analizy proteomicznej, białka wyekstrahowane z próbek biologicznych (np. komórek i tkanek) zazwyczaj muszą najpierw zostać przetworzone przy użyciu długich protokołów, w tym pomiaru stężenia białka w próbce, redukcji białka i alkilowania oraz trawienia enzymatycznego do peptydów. Co więcej, białka ekstrahowane w popularnych do lizy zawierających detergenty często wymagają dodatkowych etapów wymiany buforu lub usuwania detergentu przed analizą, ponieważ detergent może zakłócać trawienie trypsyny i znacznie pogarszać wydajność dalszej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w tandemie (LC-MS/MS) 3. Peptydy są zwykle dalej odsalane, suszone i odtwarzane w rozpuszczalnikach kompatybilnych z LC-MS/MS po trawieniu enzymatycznym. Te procedury biochemiczne białek mogą być pracochłonne i czasochłonne. W związku z tym nadal ograniczają przepustowość przepływów pracy proteomiki i przyczyniają się do zmienności pozyskiwanych danych4,5. Błędy i uprzedzenia ludzkie zostały uznane za kluczowe czynniki wpływające na wariancję i odtwarzalność danych6,7. Aby zminimalizować błędy ludzkie w procesach przygotowywania próbek metodą spektrometrii mas, zautomatyzowane systemy robotyczne pipetowania zostały wykorzystane w celu poprawy przepustowości i powtarzalności identyfikacji i kwantyfikacji białek na podstawie proteomiki typu shotgun i ukierunkowanej analizy spektrometrii mas, gdzie takie postępy zostały okrzyknięte jako kluczowe dla kontynuowania nacisku na powszechne przyjęcie technologii proteomicznych w krytycznych badaniach i warunkach klinicznych8,9,10,11,12,13. Jednak większość istniejących protokołów wykorzystuje zrobotyzowane platformy do obsługi cieczy, które wymagają znacznych inwestycji i szkoleń, co ogranicza ich użyteczność w wielu laboratoriach w środowisku akademickim lub w inny sposób przy ograniczonym budżecie.

Ten artykuł opisuje protokół, który wykorzystuje tani, zrobotyzowany system obsługi cieczy OT-2 o otwartym kodzie źródłowym, do częściowej automatyzacji typowego procesu przygotowywania próbek proteomicznych typu shotgun. OT-2 ma niższy koszt niż wiele innych zrobotyzowanych systemów obsługi cieczy, a w chwili pisania tego tekstu kosztuje około 5,000 USD. Biorąc pod uwagę ceny różnych modułów i sprzętu laboratoryjnego, całkowity koszt przeprowadzenia eksperymentów w tym protokole w momencie pisania tego tekstu wynosi około 10 000 USD, co czyni go bardziej przystępnym dla znacznie szerszego zestawu laboratoriów w porównaniu z droższymi opcjami. OT-2 jest kompatybilny z programowaniem typu open source za pomocą skryptów Pythona i oferuje dużą elastyczność w projektowaniu protokołów DIY zdefiniowanych przez użytkownika. Korzystając z trzech opracowanych przez nas skryptów, poniższe protokoły obejmują wykonywanie typowego procesu przygotowania próbki proteomicznej typu shotgun na stacji OT-2 z archetypicznym wzorcem białka (albumina surowicy bydlęcej; BSA) oraz złożoną próbkę białka normalnego lizatu ludzkiego serca (Ryc. 1). Procedury przetwarzania (1) próbki BSA i (2) próbki złożonego lizatu sercowego są szczegółowo opisane odpowiednio w sekcjach 1, 2, 5, 6 i 3, 4, 5, 6 i 6 Protokołu. Kulki magnetyczne modyfikowane karboksylanem Sera-Mag są wykorzystywane w jednogarnkowym przygotowywaniu próbek wzmocnionych fazą stałą (SP3) w celu usunięcia detergentów i soli z próbek białek i peptydów. Tryptyczne trawienie z albuminy surowicy bydlęcej i białek ludzkiego serca jest następnie oczyszczane za pomocą kulek SP3 i przesyłane do analizy LC-MS/MS. Widma masowe są następnie analizowane za pomocą oprogramowania MaxQuant do identyfikacji peptydów i białek. Reprezentatywne wyniki przeprowadzone przez nas pokazują, że protokół osiąga doskonałe techniczne współczynniki zmienności (CV) przy jednoczesnej oszczędności czasu pracy na stole i nie ustępuje trawieniu ręcznemu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowane skrypty Pythona zostały zdeponowane na GitHubie pod adresem: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Kopia skryptów znajduje się w Pliku Uzupełniającym 1. Zapoznaj się z repozytorium GitHub, aby uzyskać najnowsze wersje.

1. Przygotowania eksperymentalne

  1. Sprawdź wymagany sprzęt przed uruchomieniem protokołu.
    UWAGA: Wymagane są następujące elementy sprzętowe: pipety OT-2, końcówki do pipet, zestaw stojaków na probówki 4 w 1, zestaw bloków aluminiowych, moduł magnetyczny, moduł temperatury, 96-dołkowe płytki głębinowe 2 ml (patrz Tabela materiałów).

2. Przygotowanie próbki metodą spektrometrii mas (MS) z pojedynczą albuminą surowicy bydlęcej (BSA)

  1. Otwórz skrypt NoSP3_digestion.py w edytorze tekstu i określ zmienne specyficzne dla eksperymentu zgodnie z potrzebami w sekcji DOSTOSUJ TYLKO TUTAJ.
    UWAGA: Zmienne specyficzne dla eksperymentu obejmują liczbę próbek i replikację; stężenie próbki; objętość odczynników ditiotreitol - DTT, jodoacetamid - IAA i trypsyna; czas inkubacji DTT i IAA oraz końcówka początkowa dla pipet P20/P50 i P300).
    1. Otwórz aplikację Opentrons i prześlij skrypt do zakładki PROTOKÓŁ w aplikacji Opentrons.
      UWAGA: Aplikację Opentrons można pobrać z Reference14 na komputer lokalny. W chwili pisania tego tekstu pipeta elektroniczna Opentrons P50 nie jest dostępna do kupienia w sklepie Opentrons. Została ona zastąpiona jednokanałową pipetą elektroniczną P20 kompatybilną z objętościami określonymi w protokole. W skrypcie znajdują się uwagi i instrukcje dotyczące wymiany pipety P50 na pipetę P20. Użytkownicy mogą być zmuszeni do przetestowania i zweryfikowania zgodności danej pipety z tym protokołem zgodnie z instrukcją API Opentrons.
  2. Otwórz zakładkę ROBOT i wykonaj kalibrację pokładu robota Kalibruj pokład w zakładce ROBOT, postępując krok po kroku zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie w aplikacji Opentrons.
    UWAGA: Ten krok jest wymagany tylko wtedy, gdy nie został wcześniej zaimplementowany lub robot został niedawno przeniesiony.
  3. Kliknij przycisk ZARZĄDZAJ PIPETAMI, aby przeprowadzić kalibrację długości końcówki, a następnie kalibrację przesunięcia pipety, aby skalibrować domyślną pozycję końcówki i kombinacji pipet.
    UWAGA: Ten krok jest wymagany, jeśli pipeta jest używana po raz pierwszy.
  4. Umieść wymagany sprzęt laboratoryjny i pipety w odpowiednim miejscu w zestawie OT-2 określonym w skrypcie Pythona (Rysunek 2).
    UWAGA: Upewnij się, że moduł temperatury jest podłączony i włączony, a aluminiowy blok jest umieszczony na górze modułu temperatury.
  5. Otwórz kartę KALIBRUJ i wykonaj kalibrację kombinacji sprzętu laboratoryjnego i pipet wymaganej w tym skrypcie Pythona.
    UWAGA: Aplikacja Opentrons zarejestruje parametry kalibracji, co nie jest konieczne w przypadku przyszłych zastosowań z tym samym sprzętem laboratoryjnym i pipetami.
  6. Przygotować 5 ml 100 ml roztworu wodorowęglanu amonu (ABC) (pH ~ 8,0), rozpuszczając 39,53 mg ABC w wodzie o spektrometrii mas do całkowitej objętości 5 ml w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Umieść bufor wodorowęglanu amonu w dołku A1 stojaka na probówki 4 w 1 z górnym uchwytem probówki 15 ml + 50 ml.
  7. Przygotować 1 ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w probówce o niskim poziomie wiązania białka o pojemności 2,0 ml (patrz tabela materiałów). Umieść próbkę w dołku A1 stojaka na probówki 4 w 1 z górnym uchwytem na probówki o pojemności 2 ml.
  8. Ręcznie umieść probówki o niskiej zawartości białka o pojemności 2,0 ml w dołkach A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2 itd. w aluminiowym bloku na górze modułu temperatury.
    UWAGA: Pipeta automatyczna domyślnie dozuje próbki w kolejności pionowej, zaczynając od A1 (pierwsza próbka) do ostatniej próbki. Można określić dozowanie poziome. Szczegółowe informacje można znaleźć na stronie 15. Całkowita liczba probówek, które należy przygotować, powinna być równa całkowitej liczbie próbek (tj. liczbie próbek biologicznych pomnożonej przez liczbę kontrprób technicznych na próbkę).
  9. Przygotować 1 ml 60 mM DTT, rozpuszczając 9,26 mg ciał stałych DTT w wodzie o spektrometrii mas do całkowitej objętości 1 ml. Umieść naziemną telewizję cyfrową w dołku A6 stojaka na probówki 4 w 1 z uchwytem na probówki 2 ml górą.
    UWAGA: Naziemna telewizja cyfrowa jest szkodliwa dla ludzkich oczu, skóry i układu oddechowego. Noś środki ochrony osobistej i obchodź się z nimi pod kapturem chemicznym. Zapoznaj się z kartą charakterystyki producenta, aby zapoznać się z odpowiednimi procedurami.
  10. Obserwuj, podczas gdy robot przekazuje odpowiednią objętość buforu ABC do probówek z próbkami w bloku aluminiowym.
    UWAGA: Całkowita objętość mieszanki ABC i białka w każdej probówce wynosi 100 μL, a objętość buforu ABC jest obliczana w skrypcie (V = 100 μL minus objętość 100 μg próbki białka).
  11. Upewnij się, że robot przenosi 100 μg białka BSA do każdej probówki z buforem ABC.
    UWAGA: W typowym eksperymencie można użyć do 100 μg białek do trawienia białek, tj. 50 μl z 2,0 μg/μL dla tej próbki BSA.
  12. Ręcznie sprawdź, czy program robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że naziemna telewizja cyfrowa została załadowana do A6 stojaka na probówki o pojemności 2 ml znajdującego się w gnieździe 4 przed wznowieniem protokołu. Upewnij się, że rurka naziemnej telewizji cyfrowej jest umieszczona w studzience A6 i otwórz jej nakrętkę. Kliknij przycisk Wznów w aplikacji Opentrons, aby kontynuować. Upewnij się, że robot przenosi 10 μl roztworu DTT do każdej studzienki próbki, a następnie wykonuje pięć rund mieszania.
  13. Sprawdź, czy program robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że zamknięto nakrętki na probówkach z próbkami. Ręcznie zamknij nakrętki probówek i kliknij Wznów, aby kontynuować. Poczekaj, aż moduł temperatury robota zacznie podgrzewać aluminiowy blok, aż temperatura osiągnie 55 °C, a następnie wykonaj 5-minutową inkubację, aby próbki osiągnęły temperaturę 55 °C.
    UWAGA: Robot będzie utrzymywał temperaturę 55 °C przez 30 minut, aby umożliwić redukcję białka przez DTT podczas inkubacji.
  14. Podczas 30 minut inkubacji naziemnej telewizji cyfrowej należy przygotować 1 ml 187,5 mM jodoacetamidu (IAA), rozpuszczając 34,68 mg IAA w buforze ABC do całkowitej objętości 1 ml. Ręcznie owiń roztwór IAA folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło.
    UWAGA: IAA może powodować silne podrażnienie oczu i dróg oddechowych. Trzymaj go pod kapturem chemicznym, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej.
  15. Upewnij się, że moduł temperatury robota ostygnie po zakończeniu 30-minutowego kroku inkubacji naziemnej telewizji cyfrowej.
    UWAGA: Gdy temperatura modułu osiągnie 22 °C, moduł utrzymuje temperaturę przez 5 minut, aby umożliwić próbki pełne ostygnięcie.
  16. Odkręć probówki z próbkami, gdy program robota jest wstrzymany i wyświetl komunikat ostrzegawczy: Upewnij się, że otwierasz nakrętki na probówkach z próbkami. Kliknij Wznów, aby kontynuować.
  17. Ręcznie sprawdź, czy program robota został wstrzymany, wyświetlając komunikat ostrzegawczy: Upewnij się, że IAA został załadowany do B6 stojaka na probówki o pojemności 2 ml znajdującego się w gnieździe 4 przed wznowieniem protokołu. Potwierdź położenie stojaka rurki IAA i otwórz nasadkę tuby. Kliknij Wznów, aby kontynuować. Upewnij się, że robot przenosi 10 μl IAA do każdej probówki z próbką, a następnie wykonuje pięć rund mieszania.
  18. Zakryj probówki z próbkami, gdy program robota jest wstrzymany i wyświetl komunikat: Zamknij nakrętki na probówkach z próbkami i przykryj probówki z próbkami folią. Przykryj cały aluminiowy blok czystym kawałkiem folii. Kliknij Wznów, aby kontynuować. Czekać, aż próbki zostaną inkubowane w temperaturze 22 °C przez 30 minut. Upewnij się, że moduł temperatury robota dezaktywuje się po zakończeniu inkubacji IAA.
  19. Przygotować mieszaninę roztworu trypsyny podczas inkubacji IAA (etap 2.19) o końcowym stężeniu 0,2 μg/μl: rozpuścić 20 μg trypsyny do spektrometrii mas/sekwencjonowania w 100 μl wody o czystości MS.
  20. Umieść roztwór trypsyny w studzience C6 stojaka na probówki o pojemności 2 ml z otwartą nasadką probówki, gdy program robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat ostrzegawczy: Upewnij się, że trypsyna została załadowana do C6 stojaka na probówki o pojemności 2 ml znajdującego się w gnieździe 4 przed wznowieniem protokołu. Kliknij Wznów, aby kontynuować.
  21. Sprawdź, czy program robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat ostrzegawczy: Otwórz zaślepki na probówkach z próbkami w module temperatury. Odkręć probówki z próbkami i kliknij Wznów, aby kontynuować. Poczekaj, aż robot przeniesie 10 μl trypsyny do każdej probówki z próbką, a następnie wykona pięć rund mieszania.
  22. Owinąć nakrętki probówek z próbkami folią parafinową, przenieść wszystkie próbki do mieszalnika o kontrolowanej temperaturze i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16-20 godzin z wytrząsaniem 600 obr./min.
    UWAGA: Trawienie trypsyny można również przeprowadzić bezpośrednio na module temperatury w temperaturze 37 °C.

3. Oczyszczanie peptydów za pomocą koralików paramagnetycznych SP3

  1. Następnego dnia po całonocnym trawieniu trypsyny krótko odwiruj próbki za pomocą mikrowirówki stołowej (≤2 000 x g) (patrz Tabela materiałów) i umieść próbki na magnetycznym stojaku na probówki. Odstawić próbki na 2 minuty.
    1. Ostrożnie przenieść supernatant za pomocą pipety do nowego zestawu probówek wirówkowych o niskim poziomie wiązania białka. Próbki należy przechowywać w lodówce i przejść do etapów 3.2–3.9.
      UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Otwórz skrypt SP3_peptide_cleanup.py Python w edytorze tekstu i określ zgodnie z potrzebami w sekcji DOSTOSUJ TYLKO TUTAJ.
    UWAGA: Zmienne specyficzne dla eksperymentu obejmują liczbę próbek i kontrprób, objętość peptydów do przeniesienia, objętość odczynników (kulki, acetonitryl, DMSO), końcówkę początkową dla pipet P20/P50 i P300 oraz początek w płytce głębinowej na module magnetycznym. Każda próbka mineralizowana przez BSA zawiera około 120 μl objętości mineralizacji, która zostanie podzielona na dwie kontrpróby techniczne po 55 μl w każdej kontrpróbie. Aby wyczyścić tylko połowę skrótu, zmień zmienną liczby replikacji na 1.
  3. Prześlij skrypt do zakładki PROTOKÓŁ w aplikacji Opentrons.
  4. Umieść wymagany sprzęt laboratoryjny i pipety w odpowiednim miejscu w zestawie OT-2 określonym w skrypcie Pythona (Rysunek 3). Upewnij się, że moduł magnetyczny jest włączony i podłączony do robota. Umieść nową płytkę głębinową o pojemności 2 ml 96 dołków (patrz Tabela materiałów) na górze modułu magnetycznego.
  5. Otwórz kartę KALIBRUJ i wykonaj kalibrację kombinacji sprzętu laboratoryjnego i pipet wymaganej w tym skrypcie języka Python.
    UWAGA: Kalibracja dla tych samych kombinacji sprzętu laboratoryjnego i pipet musi być wykonana tylko raz, a aplikacja Opentrons zarejestruje parametry kalibracji.
  6. Umieścić strawione próbki (supernatant zebrany w kroku 3.1) do stojaka na probówki o pojemności 2,0 ml w porządku pionowym w studzienkach A1, B1.
  7. Przygotuj 15 ml acetonitrylu kompatybilnego z LC-MS/MS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i umieść probówkę w studzience A3 w stojaku na probówki 4 w 1 z górnym uchwytem na probówki 15 ml + 50 ml.
  8. Przygotuj 5 ml 2% DMSO, dodając 100 μl DMSO z 4,9 ml wody klasy spektrometrii mas w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Umieść probówkę w studzience A1 w stojaku na probówki 15 ml + 50 ml.
  9. Oznacz pustą probówkę stożkową o pojemności 50 ml jako odpad i umieść ją w studzience B3 w stojaku na probówki 15 ml + 50 ml.
  10. Przygotuj koraliki SP3 zgodnie z Reference16.
    1. Przygotuj odpowiednią ilość zmieszanych kulek w probówce do mikrowirówek o pojemności 2,0 ml.
      UWAGA: Każda reakcja oczyszczania peptydów wymaga 10 μl zmieszanych kulek. Na przykład przygotuj co najmniej 40 μl zmieszanych kulek do czterech reakcji czyszczenia.
    2. Pozostaw mieszaninę kulek na stojaku magnetycznym na 2 minuty. Ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety i zmierz objętość supernatantu za pomocą pipety.
    3. Oblicz pozostałą objętość kulek i dodaj 5-10 razy więcej wody niż spektrometria mas (np. 100-200 μl wody na 20 μl kulek) i wiruj (prędkość 10) przez 10 s. Umieść koraliki na stojaku magnetycznym na 2 minuty.
    4. Powtórz kroki mycia wodą, w sumie trzy prania.
    5. Zawiesić końcowe kulki w wodzie klasy MS do końcowego stężenia 50 μg/μL. Umieść umyte kulki magnetyczne w studzience A6 w stojaku na probówki 2.0 mL.
      UWAGA: Zaleca się ponowne zawieszenie kulek w stężeniu 10 μg/μL16. W obecnych pracach optymalizacyjnych końcowe stężenie zostało zmodyfikowane do 50 μg/μl, aby zminimalizować całkowitą objętość mieszaniny perełka, peptyd i acetonitryl.
  11. Upewnij się, że robot przenosi 55 μl przefermentowanych próbek do studzienek w płytkach głębinowych na module magnetycznym.
  12. Sprawdź, czy protokół robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że przygotowane koraliki zostały załadowane do A6 stojaka na probówki o pojemności 2 ml znajdującego się w gnieździe 4 przed wznowieniem protokołu. Wiruj kulki, a następnie krótko wiruj przez 5 sekund na mini wirówce stołowej i umieść kulki w dołku A6 stojaka na probówki o pojemności 2 ml z otwartą nakrętką. Czekaj, aż robot wymiesza kulki 10 razy przez pięć rund, pipetując w górę iw dół.
    UWAGA: Robot przenosi 10 μl kulek do każdej strawionej próbki na płytkach głębinowych, a następnie pięciokrotnie miesza.
  13. Upewnij się, że robot przenosi 1,292 μl acetonitrylu do każdej studzienki i natychmiast miesza 10 razy, pipetując w górę iw dół, aby ułatwić wiązanie peptydów i kulek.
    UWAGA: Każdy transfer jest wykonywany w kilku rundach, ponieważ pipeta P300 może jednorazowo przenieść tylko do 300 μl.
  14. Upewnij się, że robot wymieszał wszystkie próbki pięć razy, pipetując w górę i w dół na płytce głębinowej.
  15. Poczekaj, aż moduł magnetyczny zostanie zazębiony, a próbki będą inkubowane na module przez 2 minuty.
  16. Czuwaj, gdy prędkości pipetowania, zasysania i dozowania są ustawione na spadek o 25 μl/s z domyślnych 150 μl/s.
    UWAGA: Robot powoli usuwa supernatant z każdej studzienki i wyrzuca go do rurki odpływowej, gdy moduł magnetyczny jest włączony.
  17. Poczekaj, aż prędkości pipetowania, aspiracji i dozowania powrócą do ustawień domyślnych. Zwróć uwagę, że moduł magnetyczny odłącza się.
  18. Sprawdź, czy program robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że nakrętka rurki ACN jest zdjęta. Ręcznie odkręć rurkę acetonitrylu i umieść ją z powrotem w stojaku na probówki. Kliknij Wznów, aby kontynuować. Upewnij się, że robot przenosi 1 ml acetonitrylu do umycia każdej próbki i natychmiast miesza 10 razy.
  19. Upewnij się, że robot miesza wszystkie próbki 10 razy, aby je umyć.
  20. Czuwać, gdy moduł magnetyczny jest włączony i inkubować próbki przez 2 minuty.
  21. Poczekaj, aż robot zmieni prędkość aspiracji pipetowania na wolną, a następnie powoli usunie supernatant i dozuje go do probówki odpływowej.
  22. Obserwuj, jak robot inkubuje próbki na module magnetycznym przez 60 sekund, aby umożliwić odparowanie resztkowego acetonitrylu, a następnie zmienia domyślne prędkości aspiracji pipetowania. Obserwuj, że moduł magnetyczny zostaje odłączony.
  23. Sprawdź, czy program robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Ponownie Vortex DMSO i otwórz nasadki. Ręcznie wiruj 2% DMSO przez 10 s i umieść go z powrotem w studzience A1 w stojaku na probówki 15 ml-50 ml. Kliknij Wznów, aby kontynuować.
  24. Upewnij się, że robot przenosi 80 μl 2% DMSO do każdego dołka i natychmiast miesza 10 razy.
  25. Upewnij się, że robot miesza wszystkie próbki 10 razy przez dodatkowe pięć rund.
  26. Czuwać, gdy moduł magnetyczny jest włączony i inkubować próbki przez 2 minuty.
  27. Obserwuj, jak robot zmienia prędkość aspiracji pipety na niską (25 μl/s) i powoli przenosi supernatant do pustych studzienek w płytce głębokiej.
  28. Poczekaj, aż robot inkubuje próbki na module magnetycznym przez 2 minuty, aby usunąć resztki kulek z próbek.
  29. Sprawdź, czy program robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Umieść nowe probówki o pojemności 2 ml w stojaku na probówki o pojemności 2 ml i upewnij się, że liczba probówek odpowiada całkowitej liczbie próbek.
  30. Umieścić pierwszą probówkę mikrowirówkową o pojemności 2 ml w studzience bezpośrednio za końcową próbką mineralizowaną BSA. Kliknij Wznów, aby kontynuować.
    UWAGA: Na przykład sześć próbek mineralnych BSA badanych w tym protokole znajduje się w studzienkach A1, B1, C1, D1, A2 i B2. Dlatego nowy zestaw probówek o pojemności 2,0 ml umieszcza się w studzienkach B3, C3, D3, ... i tak dalej.
  31. Obserwuj, jak robot przenosi 88 μl próbek z dołków w płytce głębinowej do nowego zestawu probówek o pojemności 2,0 ml.
    UWAGA: Przenoszona objętość (1,1 x 80 μl) w protokole jest zoptymalizowana tak, aby zapewnić, że cała objętość próbki jest zasysana do końcówek pipet.
  32. Czuwaj, aż robot zmieni prędkość aspiracji pipety na domyślną i odłączy moduł magnetyczny.
  33. Oczyszczone peptydy należy ręcznie wysuszyć w wyparce próżniowej (patrz tabela materiałów) i przejść do sekcji 5 lub przechowywać wysuszone próbki w temperaturze -20 °C.

4. Przygotowanie próbki MS z lizatem białka ludzkiego serca (5 mg/mL) z kulkami paramagnetycznymi SP3

  1. Otwórz skrypt SP3_digestion.py Python i określ wartości zmiennych w sekcji DOSTOSUJ TYLKO TUTAJ.
    UWAGA: Zmienne obejmują liczbę próbek i kontrpróby, stężenie próbki, objętość odczynników (DTT, IAA, trypsyna, kulki, 100% i 80% etanolu), czas inkubacji DTT i IAA, końcówkę początkową dla pipet P20/P50 i P300 oraz początek studni w płytce głębinowej na module magnetycznym.
  2. Wykonaj kroki 2.2-2.23 w sekcji 2 dla przygotowania próbki SM z pojedynczą albuminą surowicy bydlęcej z pojedynczym białkiem do inkubacji DTT i IAA. Zapoznaj się z Rysunek 1, aby zapoznać się z konfiguracją pokładu robota w tych krokach.
  3. Przygotować świeżą mieszankę kulek SP3 (20 μl kulek na reakcję oczyszczania) do oczyszczania białek (jak określono w kroku 3.10) podczas etapów inkubacji DTT i IAA (kroki 2.15 i 2.19). Umieść koraliki w dołku D6 na stojaku na probówki o pojemności 2 ml.
  4. Sprawdź, czy program robota został wstrzymany z komunikatem: Otwórz nakrętki probówek. Ręcznie odkręć probówki z próbkami w aluminiowym bloku na górze modułu temperatury i kliknij Wznów, aby kontynuować.
  5. Upewnij się, że robot przenosi wszystkie próbki z probówek o pojemności 2.0 ml na nową płytkę głębinową umieszczoną na górze modułu magnetycznego.
  6. Sprawdź, czy program robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że przygotowane koraliki zostały załadowane do D6 stojaka na probówki o pojemności 2 ml znajdującego się w gnieździe 4 przed wznowieniem protokołu. Otwórz nakrętkę rurki koralików i kliknij Wznów, aby kontynuować.
  7. Obserwuj, jak robot przenosi 20 μl kulek do każdego dołka w płytce głębokiej z pięcioma rundami mieszania kulek i pięcioma rundami mieszania mieszaniny próbka-kulki.
  8. Sprawdź, czy program robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że 100 procent etanolu zostało załadowane do A3 stojaka na probówki 15 ml-50 ml znajdującego się w gnieździe 5 przed wznowieniem protokołu. Przygotuj 10-20 ml 100% etanolu (tj. 200-procentowego etanolu, patrz tabela materiałów) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i umieść ją w dołku A3 stojaka. Kliknij Wznów, aby kontynuować.
  9. Czekaj, aż robot przeniesie 140 μl 100% etanolu do każdego dołka w płytce, a następnie 10 rund mieszania, aby ułatwić wiązanie peptydów z kulkami.
  10. Upewnij się, że robot miesza każdą próbkę, pipetując w górę i w dół 10 razy w każdej rundzie, co daje łącznie pięć rund mieszania.
  11. Czuwać, gdy moduł magnetyczny jest włączony i inkubować próbki na module przez 2 minuty.
  12. Obserwuj, jak robot zmienia prędkość pipetowania na niską (25 μl/s) i zasysa supernatant z każdej studzienki i dozuje go do probówki odpływowej.
  13. Poczekaj, aż robot zmieni prędkość pipetowania z powrotem na domyślną i odłączy moduł magnetyczny.
  14. Sprawdź, czy program robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że 80 procent etanolu zostało załadowane do A4 stojaka na probówki 15 ml-50 ml znajdującego się w gnieździe 5 przed wznowieniem protokołu. Ręcznie przygotuj 20 ml 80% etanolu, mieszając 4 ml wody klasy MS z 16 ml 100% etanolu (tj. 200 proof). Umieść 80% etanolu w studzience A4 w stojaku na tuby. Kliknij Wznów, aby kontynuować. Upewnij się, że robot przenosi 1 ml 80% etanolu do każdej studzienki i natychmiast miesza 10 razy.
  15. Obserwuj, jak robot zmienia prędkość pipetowania na niską (25 μl/s), zasysa supernatant z każdej studzienki i dozuje do rurki odpływowej. Poczekaj, aż robot zmieni prędkość pipetowania z powrotem na domyślną i odłączy moduł magnetyczny.
  16. Otwórz nasadkę roztworu ABC, gdy program robota zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat: Otwórz nasadkę na rurce ABC. Kliknij Wznów, aby kontynuować. Czuwaj, aż robot odłączy moduł magnetyczny, przeniesie 250 μl ABC do każdej studzienki i natychmiast wymiesza 10 razy.
    UWAGA: Ten krok polega na umyciu próbek za pomocą ABC.
  17. Upewnij się, że robot włącza moduł magnetyczny i inkubuje próbki na module przez 2 minuty.
  18. Obserwuj, jak robot zmienia prędkość pipetowania na niską (25 μl/s) i przenosi supernatant z każdej studzienki do probówki odpływowej. Poczekaj, aż robot przeniesie 100 μl buforu ABC do każdej studzienki i natychmiast wymiesza 10 razy.
  19. Sprawdź, czy program robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że nowe probówki zbiorcze zostały umieszczone w aluminiowym bloku o pojemności 2.0 ml przed wznowieniem protokołu. Umieść nowy zestaw probówek wirówkowych do mikrowirówek o niskiej retencji białek w aluminiowym bloku natychmiast po ostatniej probówce z próbką, która początkowo znajdowała się w bloku. Kliknij Wznów, aby kontynuować. Czuwaj, podczas gdy robot przenosi każdą próbkę z bufora ABC do nowych probówek o pojemności 2,0 ml.
    UWAGA: Sprawdź studzienki i w razie potrzeby ręcznie przenieś pozostałą próbkę do probówek.
  20. Przygotuj odpowiednią ilość trypsyny klasy MS (10 μl na próbkę), rozpuszczając 20 μg trypsyny klasy MS w wodzie klasy MS do końcowego stężenia 0,2 μg/μl, gdy program robota zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat: Upewnij się, że trypsyna (0,2 μg/μl) została załadowana do C6 stojaka na probówki o pojemności 2 ml znajdującego się w gnieździe 4 przed wznowieniem protokołu. Upewnij się, że robot przenosi 10 μl trypsyny do każdej probówki z próbką, a następnie następuje pięć rund mieszania.
  21. Owinąć nakrętki probówek z próbkami folią parafinową, przenieść wszystkie próbki do mieszalnika o kontrolowanej temperaturze i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16-20 godzin z wytrząsaniem z prędkością 1 000 obr./min.
    UWAGA: Zaleca się przeprowadzanie trawienia z wytrząsaniem z prędkością 1,000 obr./min, aby zminimalizować wytrącanie się kulek podczas inkubacji przez noc.

5. Oczyszczanie peptydów za pomocą koralików paramagnetycznych SP3

  1. Postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku 2, Czyszczenie peptydów za pomocą kulek paramagnetycznych SP3.

6. Chromatografia cieczowa i spektrometria mas

  1. Zawiesić peptydy BSA (kroki 2-3) i lizatu serca (krok 4) w 0,1% kwasie mrówkowym, dodając 1 ml 99% kwasu mrówkowego klasy LC-MS w wodzie MS do całkowitej objętości 1 l,
    UWAGA: Kwas mrówkowy jest mocnym kwasem. Jest silnie dla oczu, skóry i układu oddechowego. Z ostrożnym konstrukcją należy obchodzić się pod kapturem chemicznym, nosząc środki ochrony indywidualnej.
  2. Określ ilościowo stężenie peptydu po trawieniu za pomocą ilościowego zestawu do oznaczania peptydów17 i wstrzyknij 0,5 μg roztworu BSA i 1,5 μg roztworu trawionego przez serce do analizy LC-MS/MS.
  3. Skonfiguruj program chromatografii cieczowej do analizy LC-MS/MS.
    UWAGA: W typowej konfiguracji trawione peptydy mogą być ładowane do kolumny C18 z odwróconymi fazami (cząstka 3 μm; pory 100 A; 75 μm x 150 mm; patrz Tabela materiałów) przy użyciu parametrów podanych w pliku uzupełniającym 2.
  4. Pozyskać dane proteomiczne typu shotgun za pomocą spektrometru mas (patrz tabela materiałów) przy użyciu parametrów podanych w pliku uzupełniającym 3.
  5. Przeszukaj bazę danych białek w celu identyfikacji białek.
    1. Pobierz i zainstaluj wymagane oprogramowanie, MaxQuant.
      UWAGA: Oprogramowanie MaxQuant (v.1.6.10.43) zostało tutaj użyte do wykonania następujących kroków (patrz Tabela materiałów).
    2. Pobierz wyselekcjonowaną bazę danych ludzkiego proteomu z wysokiej jakości bazy danych sekwencji białek (UniProt/SwissProt) (patrz tabela materiałów). Kliknij przycisk Pobierz i wybierz FASTA (kanoniczny).
      UWAGA: Opcjonalnie można pobrać plik FASTA (niekanoniczny), aby w razie potrzeby uwzględnić izoformy białek każdego genu w bazie danych.
    3. W interfejsie oprogramowania MaxQuant określ plik FASTA, który ma być używany jako baza danych białek, przechodząc do panelu Parametry globalne i kliknij kartę Sekwencje; następnie kliknij przycisk Dodaj, aby określić ścieżkę do pliku FASTA.
    4. W interfejsie oprogramowania MaxQuant określ pozyskane pliki widma mas surowych do analizy, przechodząc do panelu Surowe dane i klikając przycisk Załaduj i wybierz plik (pliki) raw.
    5. Skonfiguruj parametry wyszukiwania, jak pokazano w tabeli 1. W razie potrzeby włącz kwantyfikację bez etykiet (LFQ).
    6. Poczekaj na zakończenie wyszukiwania i zlokalizuj liczbę dopasowań widma peptydów (PSM), które przekraczają progi FDR 1%, w pliku msms.txt w folderze /combined/txt.
      UWAGA: W porównaniach przeprowadzonych tutaj dla sekcji reprezentatywnych wyników, PSM zmapowane do wielu białek zostały odfiltrowane, a PSM zmapowane do jednego unikalnego białka zostały zachowane w celu zliczenia liczby PSM, peptydów i białek (Rysunek 4 i Rysunek 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępne są tutaj trzy skrypty Pythona, które są kompatybilne z robotem OT-2 i które przygotowują próbki do proteomiki spektrometrii mas za pomocą pojedynczego białka standardowego albuminy surowicy bydlęcej (techniczne repliki n = 5 trawień) i próbki lizatu ludzkiego serca zawierającej detergent (n = 5 trawień). Każdy produkt trawienia jest podzielony na dwie reakcje oczyszczania peptydów. Liczba zidentyfikowanych dopasowań widma peptydów (PSM), peptydów i białek w każdym przebiegu próbek BSA i serca jest pokazana w

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne kroki w ramach protokołu
Aby uzyskać najlepszą wydajność, należy używać zweryfikowanego przez Opentrons sprzętu laboratoryjnego, modułów i materiałów eksploatacyjnych kompatybilnych z OT-2. Niestandardowe wyroby laboratoryjne można tworzyć zgodnie z instrukcjami Opentrons w Reference14. Upewnij się, że skalibrowałeś pokład OT-2, pipety i sprzęt laboratoryjny przy pierwszym użyciu. Bardzo ważne jest również przestrzeganie wytycznych producenta kulek SP3 dotyczących p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez nagrody NIH F32-HL149191 dla YH; R00-HL144829 do EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 do MPL. Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3 są tworzone za pomocą internetowego narzędzia do ilustracji naukowych, BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
300 i mikro; L końcówki do pipetOpentrons
Zestaw stojaków na probówki 4 w 1OpentronsKażdy zestaw zawiera 2 podstawki i 4 uchwyty na probówki 1,5 ml, 2 ml, 15 ml + 50 ml, 15 ml i 50 ml. W tym badaniu używamy topów 2 ml i 15 ml + 50 ml.
Uznanie PepMap 100 C18 HPLC KolumnaThermo Scientific#1645683 μ m cząstka; 100 i Aring; por; 75 μ m x 150 mm
Acetonitryl LC-MS klasyVWR
Zestaw bloków aluminiowychOpentronsTen zestaw bloków zawiera 3 nakrętki, które są kompatybilne z 96-dołkowymi probówkami o pojemności 2,0 ml i paskiem PCR do użytku z modułem temperatury OT-2. W tym manuskrypcie używamy uchwytu na probówkę o pojemności 2,0 ml.
Wodorowęglan amonuSigma-Aldrich# A6141
Wzorcowa albumina surowicy bydlęcej, 2 mg/mlThermo Scientific#23210
Dimetylosulfotlenek (DMSO) Klasa LC-MSThermo Scientific#85190
DithiothreitolSigma-Aldrich#D5545
Kolumny HPLC EASY-SprayThermo Scientific#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
Odporny na etanol 195-200Fisher#04-355-720
Kwas mrówkowy klasy LC-MSThermo Scientific#85178
Lizat ludzkiego sercaNovus BiologicalsNB820-59217
JodoacetamidSigma-Aldrich#I1149
Magnetyczny stojakna probówkiThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini wirówkaThermo Scientific#75004061wirówka stołowa do szybkiego wirowania
NEST 2 mL 96-dołkowa płytka głębinowa, V DółOpentrons
OT-2 moduł magnetycznyOpentronsGEN1
Pipeta jednokanałowa OT-2 P300OpentronsGEN1
Pipeta jednokanałowa OT-2 P50OpentronsGEN1
Robot pipetujący OT-2OpentronsOT-2
Pierce Ilościowy kolorymetryczny test peptydowyThermo Scientific#23275
Probówki białkowe LoBind 2,0 mlEppendorf#022431102
Baza danych sekwencji białekUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20recenzje:tak
Sera-Mag SpeedBead Modyfikowane karboksylanem cząstki magnetyczne, hydrofoboweCytiva#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Cząstki magnetyczne modyfikowane karboksylanem, HydrofilowyCytiva#45152105050250
SpeedVacThermo ScientificParownik próżniowy
Thermo Q Exactive HF Spektrometr masowyThermo Scientific#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Trypsyna MSGrade Thermo Scientific#90057
Woda LC-MS klasaVWR#BDH83645.400
#JT9829 mini Moduł temperaturowy Opentrons GEN1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  2. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
  3. Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
  4. Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
  5. Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
  6. Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
  7. Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
  8. van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
  9. Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111(2020).
  10. Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
  11. Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
  12. Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
  13. Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
  14. Web URL. , Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021).
  15. Web URL. , Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021).
  16. Web URL. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021).
  17. Web URL. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021).
  18. Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Shotgun ProteomicsSample PreparationLab AutomationOpen Source RobotProtein DigestionMass SpectrometryLiquid Handling SystemPython Automation ScriptsProtein ReductionPeptide Cleanup

Related Articles