Zautomatyzowane przetwarzanie próbek proteomicznych typu shotgun przez robota laboratoryjnego typu open source

Summary

Szczegółowy protokół i trzy skrypty Pythona są dostępne do obsługi zrobotyzowanego systemu obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym do wykonywania półautomatycznego przygotowania próbek białek do eksperymentów spektrometrii mas, obejmujących etapy usuwania detergentów, trawienia białek i odsalania peptydów.

Abstract

Eksperymenty proteomiczne oparte na spektrometrii mas wymagają wielu etapów przygotowania próbki, w tym enzymatycznego trawienia białek i oczyszczania, co może zająć znaczną ilość osobogodzin pracy na stanowisku i stanowić źródło zmienności między partiami. Automatyzacja laboratorium za pomocą robotów pipetujących może zmniejszyć nakład pracy ręcznej, zmaksymalizować wydajność i zwiększyć powtarzalność badań. Mimo to wysokie ceny wyjściowe standardowych stacji automatyki sprawiają, że są one nieosiągalne dla wielu laboratoriów akademickich. W tym artykule opisano proces przygotowania próbek proteomicznych przy użyciu niedrogiego systemu automatyzacji typu open source (Opentrons OT-2), w tym instrukcje dotyczące konfiguracji półautomatycznej redukcji białek, alkilacji, trawienia i oczyszczania; a także towarzyszące skrypty Pythona o otwartym kodzie źródłowym do programowania systemu OT-2 za pomocą interfejsu programowania aplikacji.

Introduction

Proteomika oparta na spektrometrii mas jest potężnym narzędziem do jednoczesnego pomiaru obfitości wielu białek w próbkach biologicznych. Eksperymenty proteomiczne z analizą bioinformatyczną są rutynowo wykorzystywane do identyfikacji biomarkerów i odkrywania powiązanych kompleksów biologicznych i szlaków leżących u podstaw mechanizmów patologicznych. Dzięki wysokiej swoistości analitowej i potencjalnej dokładności ilościowej, proteomika shotgun ma również doskonały potencjał do przyjęcia przez ośrodki badawcze i laboratoria diagnostyczne do analizy próbek klinicznych bez konieczności polegania na przeciwciałach^1,2<....

Protocol

Opracowane skrypty Pythona zostały zdeponowane na GitHubie pod adresem: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Kopia skryptów znajduje się w Pliku Uzupełniającym 1. Zapoznaj się z repozytorium GitHub, aby uzyskać najnowsze wersje.

1. Przygotowania eksperymentalne

1. Sprawdź wymagany sprzęt przed uruchomieniem protokołu.
   UWAGA: Wymagane są następujące elementy sprzętowe: pipety OT-2, końcówki do pipet, zestaw stojaków na probówki 4 w 1, zestaw bloków aluminiowych, moduł magnetyczny, moduł temperatury, 96-dołkowe płytki głębinowe 2 ml (patrz Tabela materiałów

Results

Dostępne są tutaj trzy skrypty Pythona, które są kompatybilne z robotem OT-2 i które przygotowują próbki do proteomiki spektrometrii mas za pomocą pojedynczego białka standardowego albuminy surowicy bydlęcej (techniczne repliki n = 5 trawień) i próbki lizatu ludzkiego serca zawierającej detergent (n = 5 trawień). Każdy produkt trawienia jest podzielony na dwie reakcje oczyszczania peptydów. Liczba zidentyfikowanych dopasowań widma peptydów (PSM), peptydów i białek w każdym przebiegu próbek BSA i serca jest pokazana w

Discussion

Krytyczne kroki w ramach protokołu
Aby uzyskać najlepszą wydajność, należy używać zweryfikowanego przez Opentrons sprzętu laboratoryjnego, modułów i materiałów eksploatacyjnych kompatybilnych z OT-2. Niestandardowe wyroby laboratoryjne można tworzyć zgodnie z instrukcjami Opentrons w Reference¹⁴. Upewnij się, że skalibrowałeś pokład OT-2, pipety i sprzęt laboratoryjny przy pierwszym użyciu. Bardzo ważne jest również przestrzeganie wytycznych producenta kulek SP3 dotyczących p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
300 i mikro; L końcówki do pipet	Opentrons
Zestaw stojaków na probówki 4 w 1	Opentrons		Każdy zestaw zawiera 2 podstawki i 4 uchwyty na probówki 1,5 ml, 2 ml, 15 ml + 50 ml, 15 ml i 50 ml. W tym badaniu używamy topów 2 ml i 15 ml + 50 ml.
Uznanie PepMap 100 C18 HPLC Kolumna	Thermo Scientific	#164568	3 μ m cząstka; 100 i Aring; por; 75 μ m x 150 mm
Acetonitryl LC-MS klasy	VWR
Zestaw bloków aluminiowych	Opentrons		Ten zestaw bloków zawiera 3 nakrętki, które są kompatybilne z 96-dołkowymi probówkami o pojemności 2,0 ml i paskiem PCR do użytku z modułem temperatury OT-2. W tym manuskrypcie używamy uchwytu na probówkę o pojemności 2,0 ml.
Wodorowęglan amonu	Sigma-Aldrich	# A6141
Wzorcowa albumina surowicy bydlęcej, 2 mg/ml	Thermo Scientific	#23210
Dimetylosulfotlenek (DMSO) Klasa LC-MS	Thermo Scientific	#85190
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	#D5545
Kolumny HPLC EASY-Spray	Thermo Scientific	#ES800A
EasynLC 1200 Nano LC	Thermo Scientific	#LC140
Odporny na etanol 195-200	Fisher	#04-355-720
Kwas mrówkowy klasy LC-MS	Thermo Scientific	#85178
Lizat ludzkiego serca	Novus Biologicals	NB820-59217
Jodoacetamid	Sigma-Aldrich	#I1149
Magnetyczny stojak	na probówkiThermo Scientific	#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43			Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini wirówka	Thermo Scientific	#75004061	wirówka stołowa do szybkiego wirowania
NEST 2 mL 96-dołkowa płytka głębinowa, V Dół	Opentrons
OT-2 moduł magnetyczny	Opentrons		GEN1
Pipeta jednokanałowa OT-2 P300	Opentrons		GEN1
Pipeta jednokanałowa OT-2 P50	Opentrons		GEN1
Robot pipetujący OT-2	Opentrons	OT-2
Pierce Ilościowy kolorymetryczny test peptydowy	Thermo Scientific	#23275
Probówki białkowe LoBind 2,0 ml	Eppendorf	#022431102
Baza danych sekwencji białek	UniProt/SwissProt		https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20recenzje:tak
Sera-Mag SpeedBead Modyfikowane karboksylanem cząstki magnetyczne, hydrofobowe	Cytiva	#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Cząstki magnetyczne modyfikowane karboksylanem, Hydrofilowy	Cytiva	#45152105050250
SpeedVac	Thermo Scientific		Parownik próżniowy
Thermo Q Exactive HF Spektrometr masowy	Thermo Scientific	#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Trypsyna MS	Grade Thermo Scientific	#90057
Woda LC-MS klasa	VWR	#BDH83645.400