Method Article

Zastosowanie pasywnego ruchu głowy do generowania zdefiniowanych przyspieszeń na głowach gryzoni

DOI:

10.3791/63100

⸱

July 21st, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation for Motor Functions, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities, 2Department of Assistive Technology, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities, 3Department of Metabolism and Endocrinology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Department of Rehabilitation Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 5Department of Clinical Research, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje specjalnie zaprojektowany system ''pasywnego ruchu głowy'', który odtwarza mechaniczne przyspieszenia na głowach gryzoni generowane podczas ich bieżni biegnącej z umiarkowanymi prędkościami. Pozwala na wypreparowanie czynników/elementów mechanicznych z dobroczynnego wpływu wysiłku fizycznego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ćwiczenia są powszechnie uznawane za skuteczne w przypadku różnych chorób i zaburzeń fizycznych, w tym tych związanych z dysfunkcją mózgu. Jednak mechanizmy molekularne stojące za korzystnymi efektami ćwiczeń są słabo poznane. Wiele treningów fizycznych, szczególnie tych klasyfikowanych jako ćwiczenia aerobowe, takie jak jogging i chodzenie, wytwarza siły impulsywne w momencie kontaktu stopy z podłożem. Dlatego spekulowano, że wpływ mechaniczny może być związany z tym, jak ćwiczenia przyczyniają się do homeostazy organizmu. W celu przetestowania tej hipotezy na mózgu, opracowano specjalnie zaprojektowany system "pasywnego ruchu głowy" (dalej określany jako PHM), który może generować przyspieszenia pionowe o kontrolowanych i zdefiniowanych wielkościach i trybach oraz odtwarzać mechaniczną stymulację, która może być stosowana do głów gryzoni podczas bieżni biegnącej z umiarkowaną prędkością, co jest typową interwencją w celu przetestowania efektów ćwiczeń u zwierząt. Korzystając z tego systemu, wykazano, że PHM rekapituluje sygnalizację receptora serotoniny (5-hydroksytryptaminy, zwanej dalej 5-HT) podtypu 2A (5-HT2A) w neuronach kory przedczołowej (PFC) myszy. Praca ta dostarcza szczegółowych protokołów stosowania PHM i pomiaru jego wynikowych przyspieszeń mechanicznych na głowach gryzoni.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ćwiczenia są korzystne w leczeniu lub zapobieganiu wielu zaburzeniom fizycznym, w tym chorobom związanym ze stylem życia, takim jak cukrzyca i nadciśnienie tętnicze1. W związku z tym zgromadzono również dowody dotyczące pozytywnego wpływu ćwiczeń na funkcje mózgu2. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw korzyści płynących z ćwiczeń dla mózgu pozostają przede wszystkim niewyjaśnione. Większość aktywności fizycznych i treningów generuje mechaniczne przyspieszenia przy głowie, przynajmniej w pewnym stopniu. Podczas gdy różne zjawiska fizjologiczne są regulowane mechanicznie, znaczenie obciążenia mechanicznego zostało w większości przypadków udokumentowane w układzie mięśniowo-szkieletowym3,4,5. Chociaż mózg jest również poddawany działaniu sił mechanicznych podczas aktywności fizycznej, w szczególności tak zwanych ćwiczeń uderzeniowych, mechaniczna regulacja fizjologicznych funkcji mózgu jest rzadko badana. Ponieważ generowanie mechanicznych przyspieszeń w głowie jest stosunkowo powszechne w treningach fizycznych, spekuluje się, że mechaniczna regulacja może być związana z korzyściami płynącymi z ćwiczeń dla funkcji mózgu.

5-HTSygnalizacja receptora 2A jest niezbędna w regulacji emocji i zachowań wśród różnych sygnałów biochemicznych, które funkcjonują w układzie nerwowym. Bierze udział w wielu chorobach psychicznych6,7,8, w przypadku których udowodniono, że ćwiczenia są skuteczne terapeutycznie. Receptor 5-HT2A jest podtypem receptora 5-HT2, który należy do rodziny serotoniny, a także jest członkiem rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), której sygnalizacja jest modulowana przez jego internalizację, zależną od ligandu lub -niezależną9. Drganie głowy jest charakterystycznym zachowaniem gryzoni, którego ilość (częstotliwość) wyraźnie reprezentuje intensywność sygnalizacji receptora 5-HT2A w neuronach kory przedczołowej (PFC) 10,11. Wykorzystując ścisłą specyficzność tej halucynogennej odpowiedzi na podawane 5-HT (reakcja skurczu głowy, zwana dalej HTR; patrz film uzupełniający 1), przetestowano wspomnianą powyżej hipotezę dotyczącą mechanicznych implikacji wpływu ćwiczeń na funkcje mózgu. W związku z tym przeanalizowaliśmy i porównaliśmy HTR myszy poddanych wymuszonym ćwiczeniom (bieganie na bieżni) lub mechanicznej interwencji naśladującej ćwiczenia (PHM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Centrum Rehabilitacji dla Osób Niepełnosprawnych. 8-9 tygodniowe samce szczurów Sprague-Dawley zostały użyte do pomiaru przyspieszenia na głowie podczas biegania na bieżni i PHM. 9-10 tygodniowe samce myszy C57BL/6 zostały użyte do testów zachowania i analiz histologicznych PFC. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródeł komercyjnych (patrz Tabela Materiałów).

1. Pomiar wielkości przyspieszeń wzdłuż osi x, y i z podczas biegania na bieżni

  1. Znieczulić szczura inhalacją 1,5% izofluranu.
    UWAGA: Szczury wykorzystano po co najmniej 1 tygodniu aklimatyzacji do środowiska laboratoryjnego. Upewnij się, że szczur nie reaguje na szczypanie palca tylnej kończyny.
  2. Zamocuj akcelerometr (patrz Tabela materiałów) na czubku głowy szczura za pomocą taśmy chirurgicznej.
  3. Po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia umieść szczura w bieżni (patrz Tabela materiałów) i ustaw bieżnię na umiarkowaną prędkość (20 m/min)12 (Rysunek 1A).
    UWAGA: Zajęło co najmniej 20 minut, aby potwierdzić pełne wyzdrowienie szczura ze znieczulenia po zakończeniu inhalacji izofluranu i rozpocząć eksperyment na bieżni. Upewnij się, że szczur reaguje na szczypanie palca tylnej kończyny, będąc w stanie chodzić lub biegać bez widocznego zataczania się.
  4. Zmierz wielkość przyspieszeń pionowych podczas biegania na bieżni dla szczurów za pomocą oprogramowania użytkowego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Wyodrębnij 10 fal szeregowych i indywidualnie oblicz średnie przyspieszenia wzdłuż osi 3-wymiarowych (osie x, y i z, Rysunek 1B). Maksymalne wielkości określono ilościowo, definiując fale zsynchronizowane krokowo (częstotliwość ~2 Hz) jako przyspieszenia wywołane bieganiem na bieżni (Rysunek 1C). Do tego badania wykorzystano szczury, ponieważ ich większy rozmiar ciała był odpowiedni do wiarygodnego pomiaru przyspieszenia pionowego na głowie, co nie było możliwe u myszy. Jednak myszy wykorzystano do dalszych badań ze względu na łatwość i wiarygodność analizy ilościowej reakcji skurczu głowy.

2. Dostosowanie systemu PHM i zastosowanie PHM u myszy

  1. Wstępnie ustaw amplitudę oscylacji platformy i prędkość obrotową krzywki w kształcie śmigła w systemie PHM (Rysunek 1D), tak aby wielkość i częstotliwość przyspieszenia pionowego odpowiadały wartościom uzyskanym w kroku 1.4.
    UWAGA: System PHM składa się z metalowej ramy i drewnianej platformy. Prędkość silnika można zmieniać i kontrolować, regulując pokrętło podłączone do wbudowanego sterownika (patrz Tabela materiałów). Skala tarczy 600 odpowiada 2 Hz, Rysunek 1E. Krzywka w kształcie śmigła ma cztery łopatki o wysokości skoku 5 mm (Rysunek 1F).
  2. Znieczulić mysz poprzez inhalację 1,2% izofluranu.
    UWAGA: Myszy wykorzystano po co najmniej 1 tygodniu aklimatyzacji do środowiska laboratoryjnego. Upewnij się, że mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca tylnej kończyny.
  3. Umieść mysz w pozycji leżącej, tak aby głowa i reszta ciała znajdowały się odpowiednio na platformie oscylacyjnej i statycznej.
    UWAGA: Utrzymuj mysz w znieczuleniu (1,2% izofluranu).
  4. Włącz silnik, aby oscylować platformą w pionie, i zastosuj PHM do myszy.
    UWAGA: Prędkość silnika została dostosowana do oscylacji platformy z częstotliwością 2 Hz (patrz krok 2.1). Znieczul i umieść mysz sterującą na platformie PHM podobnie, ale pozostaw silnik wyłączony.

3. Bieganie myszką na bieżni

  1. Umieść mysz na bieżni i ustaw bieżnię na umiarkowaną prędkość (10 m/min)13.

4. Kwantyfikacja reakcji myszy na drganie głowy (HTR)

  1. Ustaw kamerę wideo (liczba klatek na sekundę: 24 kl./s), aby nagrywać całą przestrzeń w przezroczystej plastikowej obudowie.
    UWAGA: Plastikowa klatka służyła do utrzymywania myszy w polu nagrywania wideo.
  2. Dootrzewnowo podawać myszom 5-hydroksytryptofan (5-HTP) (100 mg/kg) (patrz tabela materiałów), prekursor 5-HT.
  3. Umieść mysz w przezroczystej klatce i rozpocznij nagrywanie przez 30 minut.
  4. Przejrzyj nagrane wideo (prędkość 1/2x lub 1/3x), ręcznie licząc drgania głowy.
    UWAGA: Analitycy nie byli ślepi na procedurę eksperymentalną. Charakterystyczny "tikopodobny" gwałtowny ruch myszy (patrz film uzupełniający 1) został zaliczony jako drganie głowy, które rzadko występuje w normalnym środowisku hodowlanym.

5. Analiza immunohistochemiczna PFC myszy

  1. Po zakończeniu testów HTR znieczulij mysz, podając mieszaninę midazolamu (4,0 mg/kg), butorfanolu (4,0 mg/kg) i medetomidyny (0,3 mg/kg), perfuzuj z 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS, a następnie wytnij mózg zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami14,15.
  2. Po utrwaleniu mózgów w 4% PFA w PBS przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 4 °C i przechowywać w 30% sacharozy/PBS, aż opadną. Zamrozić osadzony związek o optymalnej temperaturze skrawania (związek OCT, patrz Tabela materiałów).
  3. Pobrać kriosekcje mózgu myszy z pudełka ze szkiełkami (patrz Tabela materiałów). Pozostawić szkiełka na czystych chusteczkach w temperaturze pokojowej, aż próbki całkowicie się odwodnią.
    UWAGA: Przekroje strzałkowe o grubości dwudziestu mikrometrów (boczne +0,5–1,5 mm) przygotowano z zamrożonych próbek zanurzonych w związku OCT za pomocą kriostatu (patrz tabela materiałów).
  4. Za pomocą pisaka blokującego płyny (patrz Tabela materiałów) narysować okrąg wokół tkanki poddanej kriosekcji na szkiełku, aby ograniczyć obszar rozprowadzania roztworu (0,1% Tween-20 w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS-T).
  5. Umieść zwilżone chusteczki na dnie tacki z szkiełkami, aby stworzyć wilgotne środowisko.
  6. Po przesiąknięciu TBS-T blokować 4% surowicą osła (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  7. Opłucz szkiełka raz przez 5 minut zanurzenia w TBS-T.
  8. Na każde szkiełko nanieść 100 μl odpowiednio rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego i mieszanki DAPI (patrz tabela materiałów), przykryć tackę, aby uniknąć wysuszenia próbki, i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
  9. Spłukać TBS-T trzy razy (po 5 minut inkubacji).
  10. Na każde szkiełko nanieść 100 μl odpowiednio rozcieńczonego, dopasowanego gatunkowo fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego (sprzężonego z Alexa Fluor 488, 568 lub 645) (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  11. Spłukać TBS-T trzy razy (po 5 minut inkubacji).
  12. Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego (patrz Tabela materiałów). Przykryj szkiełka szkiełkami nakrywkowymi.
  13. Zobacz próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczytowa wielkość pionowych przyspieszeń na głowach szczurów podczas ich bieżni biegnącej z umiarkowaną prędkością (20 m/min) wynosiła około 1,0 × g (Rysunek 1C). System PHM (Rysunek 1D) został skonfigurowany do generowania pionowych szczytów przyspieszenia 1,0 × g na głowach gryzoni

.

Aplikacja PHM (2 Hz, 30 min/dzień przez 7 dni) u myszy znacznie osłabiła ich HTR w porównaniu do myszy kontrolnych (codziennie znieczulan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opracowanego systemu aplikacji PHM, wykazaliśmy, że sygnalizacja 5-HT w neuronach PFC jest regulowana mechanicznie. Ze względu na złożoność efektów ćwiczeń trudno było precyzyjnie przeanalizować konsekwencje ćwiczeń w kontekście promocji zdrowia. Nacisk kładziony jest na aspekty mechaniczne, aby wykluczyć udział lub udział zdarzeń metabolicznych, które mogą wystąpić wraz z czynnościami fizycznymi lub później, takich jak zużycie energii. Oczekuje się, że opisana tutaj metoda będzie szerzej przydatna w badani...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma konkurencyjnych interesów związanych z pracą opisaną w niniejszym artykule.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Fundusz Badań Wewnętrznych z japońskiego Ministerstwa Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej; Dotacje na badania naukowe przyznawane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); Program wspierany przez MEXT dla Fundacji Badań Strategicznych na Uniwersytetach Prywatnych, 2015-2019 z japońskiego Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (S1511017); Fundacja Nauki i Inżynierii Naito. Badania te otrzymały również finansowanie z Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), które jest wspierane przez Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) oraz National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P2CHD086843.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5-hydroksytryptofan (5-HTP)Sigma-AldrichH9772Prekursor serotoniny (5-HT)
Bezszczotkowy sterownik silnikaSilnik orientalnyBMUD30-A2Zmieniacz prędkości wbudowany sterownik silnika
C57BL/6 myszyDrożdże orientalne firmyC57BL/6JMyszy użyte w tym badaniu
KriostatLeicaCM33050SMikrotom do cięcia zamrożonych próbek
Silnik prądu stałegoSilnik orientalnyBLM230-GFV2Silnik
przeciw kozom osioł Alexa Fluor 568InvitrogenA-11057Przeciwciało wtórne stosowane do barwienia immunohistochemicznego
Osioł anty-mysz Alexa Fluor 647InvitrogenA-31571Przeciwciało wtórne stosowane do barwienia immunohistochemicznego
Osioł anty-królik Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206Przeciwciało drugorzędowe stosowane do barwienia immunohistochemicznego
Surowica osłaSigma-AldrichS30-100MLBloker niespecyficznego wiązania przeciwciał w barwieniu immunohistochemicznym
Mikroskop fluorescencyjnyKeyenceBZ-9000Mikroskop fluorescencyjny
Kozioł poliklonalny receptor anty-5-HT2ASanta Cruz Biotechnologysc-15073Przeciwciało pierwotne stosowane do barwienia immunohistochemicznego
IsofluranePfizerv002139Znieczulenie wziewne
KimWipeNIPPON PAPER CRECIAS-200Ściereczka papierowa do czyszczenia powierzchni, części, narzędzi w laboratorium
Bloker płynówDaido SangyoPAP-SMarker używany do nadania powierzchni szkiełka wodoodporności
Mysz monoklonalna anty-NeuN (klon A60)EMD Millipore (Merck)MAB377Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do barwienia immunohistochemicznego
NinjaScan-LightSwitchscienceSSCI-023641Akcelerometr do pomiaru przyspieszeń
OCT związek SakuraFinetek45833Środek do zatapiania do przygotowania zamrożonych skrawków tkanek
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36934Podłoże montażowe zapobiegające blaknięcie mąki
Królik poliklonalny anty-c-FosSanta Cruz Biotechnologysc-52Przeciwciało pierwotne stosowane do barwienia immunohistochemicznego
Pudełko na suwakiAS ONE03-448-1Nieprzezroczyste pudełko do przechowywania szkiełek
Spike2Cambridge electronic design limited (CED)N/AOprogramowanie aplikacyjne używane do analizy przyspieszenia
Szczury Sprague-DawleyJaponia SLCSlc:SDSzczury użyte w tym badaniu
BieżniaMuromachiMK-680System używany w eksperymentach wymuszonego biegania szczurów i myszy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lackland, D. T., Voeks, J. H. Metabolic syndrome and hypertension: regular exercise as part of lifestyle management. Current Hypertension Reports. 16 (11), 1-7 (2014).
  2. Heyn, P., Abreu, B. C., Ottenbacher, K. J. The effects of exercise training on elderly persons with cognitive impairment and dementia: a meta-analysis. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 85 (10), 1694-1704 (2004).
  3. Saitou, K., et al. Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).
  4. Sakitani, N., et al. Application of consistent massage-like perturbations on mouse calves and monitoring the resulting intramuscular pressure changes. Journal of Visualized Experiments. (151), e59475(2019).
  5. Miyazaki, T., et al. Mechanical regulation of bone homeostasis through p130Cas-mediated alleviation of NF-κB activity. Scientific Advances. 5 (9), (2019).
  6. Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annual Review of Medicine. 60 (1), 355-366 (2009).
  7. Canli, T., Lesch, K. -P. Long story short: the serotonin transporter in emotion regulation and social cognition. Nature Neuroscience. 10 (9), 1103-1109 (2007).
  8. Roth, B., Hanizavareh, S. M., Blum, A. Serotonin receptors represent highly favorable molecular targets for cognitive enhancement in schizophrenia and other disorders. Psychopharmacology. 174 (1), 17-24 (2003).
  9. Bhattacharyya, S., Puri, S., Miledi, R., Panicker, M. M. Internalization and recycling of 5-HT2A receptors activated by serotonin and protein kinase C-mediated mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14470-14475 (2002).
  10. Canal, C. E., Morgan, D. Head-twitch response in rodents induced by the hallucinogen 2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine: a comprehensive history, a re-evaluation of mechanisms, and its utility as a model. Drug Testing and Analysis. 4 (7-8), 556-576 (2012).
  11. Halberstadt, A. L., Geyer, M. A. Characterization of the head-twitch response induced by hallucinogens in mice: detection of the behavior based on the dynamics of head movement. Psychopharmacology (Berl). 227 (4), 727-739 (2013).
  12. Kim, S. -E., et al. Treadmill exercise prevents aging-induced failure of memory through an increase in neurogenesis and suppression of apoptosis in rat hippocampus. Experimental Gerontology. 45 (5), 357-365 (2010).
  13. Li, H., et al. Regular treadmill running improves spatial learning and memory performance in young mice through increased hippocampal neurogenesis and decreased stress. Brain Research. 1531, 1-8 (2013).
  14. González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT2A receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
  15. Ryu, Y., et al. Mechanical regulation underlies effects of exercise on serotonin-induced signaling in the prefrontal cortex neurons. iScience. 23 (2), 100874(2020).
  16. Shefer, G., Rauner, G., Stuelsatz, P., Benayahu, D., Yablonka-Reuveni, Z. Moderate-intensity treadmill running promotes expansion of the satellite cell pool in young and old mice. FEBS Journal. 280 (17), 4063-4073 (2013).
  17. Wang, J., et al. Moderate exercise has beneficial effects on mouse ischemic stroke by enhancing the functions of circulating endothelial progenitor cell-derived exosomes. Experimental Neurology. 330, 113325(2020).
  18. Pacák, K. Stressor-specific activation of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis. Physiological Research. 49, 11-17 (2000).
  19. Okamoto, M., Soya, H. Mild exercise model for enhancement of hippocampal neurogenesis: A possible candidate for promotion of neurogenesis. The Journal of Physical Fitness and Sports Medicine. 1 (4), 585-594 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Passive Head MotionVertical AccelerationTreadmill RunningMechanical StimulationPrefrontal Cortex5 HT2A ReceptorHead Twitch ResponseImmunostaining ProtocolFluorescence MicroscopySerotonin Signaling

Related Articles