Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63103

⸱

7 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Department of Biomedical Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey, 2The Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Obecne innowacje terapeutyczne, takie jak terapia komórkowa CAR-T, są w dużym stopniu uzależnione od dostarczania genów za pośrednictwem wirusa. Technika ta, choć wydajna, wiąże się z wysokimi kosztami produkcji, co spowodowało zainteresowanie stosowaniem alternatywnych metod dostarczania genów. Elektroporacja to elektrofizyczne, niewirusowe podejście do wewnątrzkomórkowego dostarczania genów i innych materiałów egzogennych. Po zastosowaniu pola elektrycznego błona komórkowa tymczasowo umożliwia dostarczanie molekularne do komórki. Zazwyczaj elektroporacja jest wykonywana w makroskali w celu przetworzenia dużej liczby komórek. Podejście to wymaga jednak szeroko zakrojonego opracowania protokołu empirycznego, co jest kosztowne w przypadku pracy z pierwotnymi i trudnymi do transfekcji typami komórek. Długotrwały rozwój protokołu, w połączeniu z wymogiem dużych napięć w celu osiągnięcia wystarczających natężeń pola elektrycznego do przenikania ogniw, doprowadził do opracowania urządzeń do elektroporacji w mikroskali. Te urządzenia do mikroelektroporacji są produkowane przy użyciu popularnych technik mikrowytwarzania i pozwalają na większą kontrolę eksperymentalną z potencjałem utrzymania wysokiej przepustowości. Prace te opierają się na technologii elektroporacji mikroprzepływowej, która jest w stanie wykryć poziom przenikania błony komórkowej na poziomie pojedynczej komórki przy ciągłym przepływie. Technologia ta została jednak ograniczona do 4 komórek przetwarzanych na sekundę, a co za tym idzie, zaproponowano i przedstawiono tutaj nowe podejście do zwiększania przepustowości systemu. Ta nowa technika, oznaczona jako kontrola sprzężenia zwrotnego oparta na populacji komórek, uwzględnia reakcję przepuszczalności komórek na różne warunki pulsacji elektroporacji i określa najlepiej dopasowane warunki impulsu elektroporacyjnego dla badanego typu ogniwa. Następnie stosuje się tryb o wyższej przepustowości, w którym ten "optymalny" impuls jest podawany do zawiesiny ogniw podczas transportu. Szczegółowo przedstawiono etapy wytwarzania urządzenia, konfiguracji i przeprowadzania eksperymentów mikroprzepływowych oraz analizy wyników. Wreszcie, ta technologia mikroelektroporacji została zademonstrowana poprzez dostarczenie plazmidu DNA kodującego białko zielonej fluorescencji (GFP) do komórek HEK293.

Wprowadzenie

Obecne innowacje terapeutyczne w badaniach biomedycznych, takie jak terapia komórkami CAR-T (limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym) oraz edycja genetyczna z użyciem CRISPR (skumulowane regularnie rozmieszczone krótkie palindromiczne powtórzenia)/Cas9, w ogromnym stopniu opierają się na możliwości skutecznego i wydajnego dostarczania materiałów egzogennych do przestrzeni wewnątrzkomórkowej1. W terapii CAR-T złotym standardem etapu dostarczania genów podczas wytwarzania terapii komórkowej jest stosowanie wektorów wirusowych2. Chociaż dostarczanie genów za pośrednictwem wirusów jest wydajną metodą, wiąże się ono również z kilkoma wadami. Należą do nich koszty produkcji, cytotoksyczność, immunogenność, potencjał do mutagenezy/tumorogenezy oraz ograniczenia rozmiaru dostarczanych genów3. Ograniczenia te doprowadziły do badań i rozwoju alternatywnych, niewirusowych technologii dostarczania.

Elektroporacja, będąca alternatywą dla dostarczania genów za pomocą wektorów wirusowych, polega na zastosowaniu optymalnego kształtu impulsu elektrycznego w celu przeprowadzenia transfekcji komórek DNA, RNA oraz białek. Po przyłożeniu zewnętrznego pola elektrycznego błona komórkowa zostaje chwilowo naruszona, co czyni komórkę podatną na wewnątrzkomórkowe dostarczenie egzogennych materiałów, które w przeciwnym razie byłyby nieprzepuszczalne4. W porównaniu do dostarczania za pomocą wirusów, elektroporacja jest korzystna, ponieważ jest ogólnie bezpieczna, łatwa w obsłudze i charakteryzuje się niskimi kosztami operacyjnymi. Elektroporacja pozwala na dostarczanie zarówno małych, jak i dużych ładunków molekularnych i może być efektywna w transfekcji komórek niezależnie od ich linii5. Aby uzyskać pożądane rezultaty po elektroporacji, tzn. dobrą żywotność i wysoką wydajność elektrotansfekcji, konieczna jest współoptymalizacja wielu parametrów eksperymentalnych. Należą do nich typ komórek6, gęstość komórek, stężenie cząsteczek7, właściwości buforu do elektroporacji (np. skład molekularny, przewodność i osmolarność)8, rozmiar i geometria elektrod9 oraz kształt impulsu elektrycznego (forma, polaryzacja, liczba impulsów)10 (ilustracja znajduje się na Rysunku 1). Chociaż każdy z tych parametrów może mieć znaczący wpływ na wyniki eksperymentów z elektroporacją, kształt impulsu był szczególnie szczegółowo badany, ponieważ energia elektryczna przyłożonego impulsu (lub impulsów) leży u podstawy wewnętrznego kompromisu między wynikową żywotnością komórek a wydajnością elektrotansfekcji8.

Typowo eksperymenty z elektroporacji przeprowadza się w skali makroskopowej, w której komórki zawieszone są w setkach mikrolitrów buforu pomiędzy zestawem dużych, równoległych elektrod płytkowych w kuwecie do elektroporacji. Elektrody te są zazwyczaj wykonane z aluminium, a odległość między nimi wynosi od 1 do 4 mm. Po ręcznym naniesieniu komórek za pomocą pipety, kuwetę podłącza się elektrycznie do dużego generatora impulsów elektrycznych, za pomocą którego użytkownik może ustawić i zastosować parametry kształtu impulsu w celu przeprowadzenia elektroporacji zawiesiny komórkowej. Chociaż elektroporacja w skali makroskopowej lub masowa pozwala na przetwarzanie gęstości komórkowych >106 komórek/ml, cecha ta może prowadzić do strat podczas optymalizacji ustawień kształtu impulsu elektrycznego. Jest to szczególnie istotne w przypadku elektroporacji pierwotnych typów komórek, w których liczba komórek w populacji może być ograniczona. Ponadto, ze względu na dużą odległość między elektrodami, generator impulsów musi być w stanie dostarczać wysokie napięcia w celu osiągnięcia odpowiedniej natężenia pola elektrycznego >1 kV/cm11Wysokie napięcia te powodują rezystancywną dyssypację mocy w buforze elektrolitycznym, co prowadzi do wydzielania ciepła Joule'a, które może negatywnie wpływać na żywotność komórek.12Wreszcie, przeprowadzanie elektroporacji gęstej zawiesiny komórek będzie nieustannie obciążone immanentną zmiennością wynikającej efektywności elektrotransfekcji oraz żywotności komórek. Każda komórka w zawiesinie może być poddana różnej natężeniu pola elektrycznego ze względu na obecność komórek sąsiadujących. W zależności od tego, czy natężenie oddziałującego pola elektrycznego ulegnie zwiększeniu, czy zmniejszeniu, żywotność komórek lub efektywność elektrotransfekcji mogą zostać odpowiednio negatywnie dotknięte.11Wspomniane wady elektroporacji w skali makro doprowadziły do poszukiwań i rozwoju alternatywnych technologii działających w skali mikro, które umożliwiają lepszą kontrolę na poziomie pojedynczych komórek.

Dziedzina BioMEMS, czyli biomedycznych mikro-elektro-mechanicznych systemów, wywodzi się z postępu technologicznego dokonanego w przemyśle mikroelektronicznym. W szczególności opiera się ona na wykorzystaniu procesów mikrofabrykacji do opracowywania mikrourządzeń służących rozwojowi badań biomedycznych. Postępy te obejmują opracowanie macierzy mikroelektrod do monitorowania elektrycznego in vivo13, pojemnościowych mikroelektrod do elektroporacji in situ14, zminiaturyzowanych urządzeń typu organ-on-a-chip15, mikrofluidycznych systemów diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care)16, biosensorów17 oraz systemów dostarczania leków18, w tym urządzeń do nano- i mikroelektroporacji19,20,21. Dzięki możliwości projektowania i wytwarzania urządzeń w tej samej skali rozmiarów co komórki biologiczne, technologie nano- i mikroelektroporacji wykazują przewagę nad ich odpowiednikami w skali makro22,23. Urządzenia te do elektroporacji eliminują konieczność stosowania impulsów o wysokim napięciu, ponieważ zazwyczaj integruje się w nich zestawy elektrod z odstępami rzędu od 10 do 100 µm. Cecha ta drastycznie zmniejsza natężenie prądu przepływającego przez elektrolit, co z kolei redukuje akumulację toksycznych produktów elektrolizy oraz efekty wydzielania ciepła Joule'a w tych systemach. Kanały w mikro skali zapewniają również niezawodne przyłożenie znacznie bardziej jednorodnego pola elektrycznego do komórek podczas aplikacji impulsu, co prowadzi do bardziej powtarzalnych wyników24. Ponadto powszechnym jest integrowanie urządzeń do mikroelektroporacji z platformą mikrofluidyczną, co umożliwia przyszłą integrację z w pełni zautomatyzowaną technologią – jest to niezwykle pożądana zdolność w produkcji terapii komórkowych25. Wreszcie, elektroporacja w mikro skali pozwala na elektryczne badanie zdarzeń elektroporacyjnych. Na przykład stopień permeabilizacji błony komórkowej może być monitorowany w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej komórki26,27. Celem niniejszej metody jest opis mikrofabrykacji, działania systemu oraz analizy mikrofluidycznego urządzenia do mikroelektroporacji pojedynczych komórek, zdolnego do pomiaru stopnia permeabilizacji błony komórkowej w celu optymalizacji protokołów elektroporacji przy jednoczesnym zwiększeniu wydajności w stosunku do dotychczasowych rozwiązań.

Przeprowadzanie elektroporacji na poziomie pojedynczych komórek nie jest już nową techniką, ponieważ po raz pierwszy została ona zademonstrowana przez Rubinsky'ego i współpracowników w 2001 roku wraz z opracowaniem technologii statycznej elektroporacji komórkowej28. Ich mikro urządzenie było innowacyjne, gdyż jako pierwsi wykazali oni zdolność do elektrycznego monitorowania procesu elektroporacji. Doprowadziło to do dalszego rozwoju technologii statycznej elektroporacji pojedynczych komórek, zdolnych do elektrycznego wykrywania stopnia permeabilizacji błony komórkowej w sposób zrównoleglony, aby zwiększyć przepustowość urządzeń. Jednakże, nawet przy zastosowaniu paralelizacji i przetwarzania wsadowego, urządzenia te wykazują znaczny niedobór w całkowitej liczbie komórek, które mogą przetworzyć w jednostce czasu29,30. Ograniczenie to doprowadziło do opracowania urządzeń przepływowych, zdolnych do przeprowadzania mikro-elektroporacji na poziomie pojedynczych komórek przy znacznie większych przepustowościach31. Ta zmiana konstrukcyjna, z środowiska statycznego na przepływowe, ogranicza możliwość elektrycznego monitorowania stopnia permeabilizacji błony komórkowej po zastosowaniu impulsu elektroporacyjnego. Metoda opisana w niniejszej pracy wypełnia lukę między tymi dwiema technologiami; jest to technologia mikro-elektroporacji zdolna do elektrycznego wykrywania, impulsowania i monitorowania stopnia permeabilizacji błony komórkowej pojedynczych komórek w sposób seryjny, w przepływie ciągłym.

Technologia ta została niedawno opisana przez Zheng i wsp. W tamtej pracy przedstawiono możliwości tej technologii poprzez przeprowadzenie badania parametrycznego, w którym zmieniano zarówno amplitudę, jak i czas trwania impulsu elektroporacyjnego, a następnie analizowano wynikający z tego sygnał elektryczny, wskazujący na permeabilizację błony komórkowej32. Wyniki wykazały, że zwiększenie intensywności impulsu elektroporacyjnego (tj. zwiększenie przyłożonego pola elektrycznego lub wydłużenie czasu trwania impulsu) powodowało wzrost mierzonej permeabilizacji błony komórkowej. Aby dalej zwalidować system, do zawiesiny komórkowej dodano jodek propidyny33, powszechnie stosowany fluorescencyjny wskaźnik skutecznej elektroporacji, a bezpośrednio po przyłożeniu impulsu elektrycznego wykonano obraz fluorescencyjny. Sygnał optyczny, czyli intensywność fluorescencji jodku propidyny wewnątrz komórki, był silnie skorelowany z elektrycznym pomiarem stopnia permeabilizacji błony komórkowej, co potwierdziło niezawodność tego pomiaru elektrycznego. Jednak w tej pracy rozważano jedynie dostarczanie małej cząsteczki jodku propidyny, co ma niewielkie lub żadne znaczenie translacyjne.

W niniejszej pracy przedstawiono nowe zastosowanie tej technologii w celu zwiększenia przepustowości systemu przy jednoczesnym dostarczaniu biologicznie aktywnego wektora plazmidowego DNA (pDNA) oraz ocenie wydajności elektrotransfekcji komórek przesianych i hodowanych po elektroporacji. Chociaż poprzednie prace wykazały wyższą skuteczność niż istniejące technologie mikro-elektroporacji zdolne do elektrycznego pomiaru zdarzenia elektroporacji, obecny stan urządzenia wciąż wymaga długiego czasu przejścia komórek między zestawem elektrod (~250 ms) w celu wykrycia komórki, przyłożenia impulsu i pomiaru permeabilizacji błony komórkowej. W przypadku pojedynczego kanału ogranicza to przepustowość do 4 komórek/s. Aby wyeliminować to ograniczenie, wprowadzono nową koncepcję elektroporacji sterowanej sprzężeniem zwrotnym w oparciu o populację komórek w celu przeprowadzenia elektrotransfekcji pDNA. Dzięki zastosowaniu buforu do elektroporacji o przewodnictwie hipofizjologicznym system ten umożliwia elektryczną analizę pojedynczych komórek podczas wielu aplikacji impulsów elektroporacyjnych. Na podstawie odpowiedzi elektrycznej wyznaczany jest następnie „optymalny” impuls elektroporacyjny. Następnie wdrożono tryb „wysokiej przepustowości”, w którym pomiar permeabilizacji błony komórkowej zostaje pominięty, zwiększono szybkość przepływu, a cykl pracy impulsu elektroporacyjnego dostosowano do czasu przejścia komórek, aby zapewnić jeden impuls na komórkę przemieszczającą się między elektrodami. Praca ta dostarczy szczegółowych informacji na temat etapów mikrofabrykacji urządzenia, materiałów i sprzętu oraz ich konfiguracji niezbędnej do przeprowadzenia eksperymentów, a także obsługi i analizy urządzenia oraz jego wydajności elektrotransfekcji (eTE).

Schemat procesu elektroporacji z przebiegiem impulsu, wpływem buforu i etapami regeneracji komórek.
Rycina 1: Czynniki eksperymentalne wpływające na wyniki elektroporacji. (Lewo) Zawiesina komórkowa – istotne czynniki do rozważenia przed rozpoczęciem elektroporacji obejmują: ładunek (w tym przypadku pDNA), stężenie, gęstość komórek oraz właściwości buforu do elektroporacji. Właściwości buforu do elektroporacji, które należy uwzględnić, to przewodność, osmolarność oraz dokładny skład cząsteczkowy wpływający na te wartości. (Środek) Aplikacja impulsu – dokładny typ impulsu (fala prostokątna vs. spadek wykładniczy) oraz przebieg impulsu (impuls pojedynczy vs. seria impulsów) muszą zostać zoptymalizowane, aby zmaksymalizować zarówno przeżywalność komórek, jak i wydajność elektrotransfekcji. Powszechnie stosowane serie impulsów w procesach elektroporacji zazwyczaj składają się z ciągu impulsów wysokiego napięcia (HV) lub serii impulsów przeplatanych wysokim (HV) i niskim (LV) napięciem. (Prawo) Regeneracja komórek – należy zoptymalizować etapy przetwarzania końcowego, w szczególności podłoże do hodowli komórek, do którego przenoszone są komórki w celu regeneracji. Nie przedstawiono (skrajna lewa), dodatkowe etapy wstępnego przetwarzania komórek, które można wdrożyć w celu ogólnej optymalizacji procesu elektroporacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Użytkownicy powinni zapoznać się ze wszystkimi kartami charakterystyki (MSDS) materiałów i odczynników użytych w tym protokole. Na każdym etapie należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), a podczas eksperymentów zachowywać zasady sterylności. W sekcjach 1-7 omówiono proces wytwarzania urządzenia.

1. Wytwarzanie urządzenia - Projekt maski

UWAGA: Ilustracja procesu mikrotworzywnictwa znajduje się na Rysunku 2. Etapy mikrotworzywnictwa należy przeprowadzić w środowisku typu cleanroom. Wymagane są dodatkowe środki ochrony indywidualnej (siatka na włosy, osłona na zarost, maska, kombinezon do czystego pomieszczenia, ochraniacze na obuwie).

  1. Zainstaluj wybrany program CAD, zaprojektuj dwuwymiarową „maskę” kanału mikroprzepływowego oraz elektrod, a następnie zapisz projekt w odpowiednim formacie pliku (np. .dxf, .dwg).
    UWAGA: Przykładowy schemat dwuwymiarowej maski znajduje się na Rysunku uzupełniającym 1.
  2. Prześlij projekt do wybranego dostawcy w celu wydruku. Upewnij się, że wymiary projektów mieszczą się w zakresie rozdzielczości oferowanej przez dostawcę.

2. Wytwarzanie urządzenia – fotolitografia

UWAGA: Przedstawione receptury mikrotwórcze zostały przyjęte z zaleceń producentów fotorezystów i powinny służyć jedynie jako punkt wyjścia34. Dokładne wartości czasów wypalania, czasów naświetlania itp. muszą zostać zoptymalizowane dla każdego protokołu wytwarzania. Do manipulowania zarówno podłożami krzemowymi, jak i szkiełkami przedmiotu zaleca się stosowanie pincet do wafli.

  1. Wytwarzanie kanałów mikroprzepływowych
    1. Czyszczenie wafla krzemowego i szkiełka z szkła sodowo-wapniowego: Należy wykonać kroki 2.1.2-2.1.3, aby przeprowadzić czyszczenie wafla krzemowego oraz szkiełka z szkła sodowo-wapniowego o wymiarach 1" × 3" (oba określane jako „podłoże”).
    2. Zanurzyć podłoża kolejno w kąpieli z acetonem, kąpieli z izopropanolu (IPA) i kąpieli z wodą dejonizowaną na 10 min każde. To 3-stopniowe mycie należy przeprowadzić sekwencyjnie w temperaturze pokojowej.
    3. Wyjąć i osuszyć powierzchnię za pomocą strumienia sprężonego azotu lub filtrowanego powietrza. Umieścić podłoża w piekarniku w temperaturze 150 °C na minimum 30 min, aby umożliwić odparowanie pozostałej wilgoci.
    4. Fotolitografia SU-8 na waflu krzemowym: Przeprowadzić fotolitografię na waflu krzemowym zgodnie z krokami 2.1.5-2.1.14.
      UWAGA: Aby uzyskać wysokość kanału mikroprzepływowego wynoszącą 20 µm, zastosowano negatywny fotorezist z serii SU-8 2000. Dokładne prędkości wirowania będą się różnić w zależności od formulacji SU-8 (np. 2010, 2015 itd.); poniższe warunki dotyczą formulacji SU-8 201035.
    5. Wyjąć wafel krzemowy z piekarnika (150 °C) i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej (RT).
    6. Zamocować wafel do uchwytu wirówki (spin coater) za pomocą systemu próżniowego urządzenia. Zaprogramować wirówkę: Krok 1 – 500 rpm przez 10 s przy przyspieszeniu 100 rpm/s, Krok 2 – 1000 rpm przez 30 s przy przyspieszeniu 300 rpm/s.
    7. Nanieść 4 mL fotorezistu SU-8 2010 na środek wafla krzemowego. Uruchomić program. Po zatrzymaniu systemu wyłączyć próżnię.
    8. Używając pincety, przenieść pokryty SU-8 wafel krzemowy na płytkę grzewczą w temperaturze 95 °C na 4-5 min w celu wstępnego wygrzewania (soft bake). Następnie zdjąć wafel z płytki grzewczej i pozostawić do ostygnięcia do RT.
      UWAGA: Należy postępować zgodnie z odpowiednią procedurą uruchamiania laboratoryjnego urządzenia do wyrównywania masek fotolitograficznych.
    9. Zamocować maskę fotolitograficzną z projektami 2D kanałów mikroprzepływowych w uchwycie maski. Włożyć wafel krzemowy warstwą SU-8 skierowaną do góry na uchwyt wafla.
    10. Ustawić parametry naświetlania na 150 mJ/cm2 i uruchomić urządzenie.
      OSTRZEŻENIE: Nie patrzeć bezpośrednio na źródło światła UV, aby uniknąć potencjalnego uszkodzenia wzroku.
    11. Umieścić wafel krzemowy pokryty SU-8 na płytce grzewczej w temperaturze 95 °C na 4-5 min w celu wygrzewania po naświetlaniu (post-exposure bake).
    12. Zanurzyć wafel krzemowy w roztworze wywoływacza SU-8 (patrz Tabela materiałów) na 3-4 min. Zastosować delikatne mieszanie. Wyjąć wafel z roztworu i opłukać powierzchnię IPA.
    13. Osuszyć powierzchnię za pomocą strumienia sprężonego azotu lub filtrowanego powietrza. Sprawdzić strukturę pod mikroskopem z użyciem filtra UV, upewniając się, że w kanałach mikroprzepływowych nie ma widocznych wad.
    14. Umieścić wafel krzemowy w piekarniku w temperaturze 150 °C na minimum 30 min w celu końcowego wygrzewania (hard bake).
    15. Pozostawić do ostygnięcia do RT i użyć profilometrii stykowej do pomiaru dokładnej wysokości i nachylenia ścian bocznych kanału.
  2. Fotolitografia na szkiełkach
    UWAGA: Heksametylodisilazan (HMDS) jest stosowany jako promotor adhezji dla pozytywnego fotorezistu S181836.
    1. Wyjąć szkiełko z piekarnika (150 °C) i pozostawić do ostygnięcia do RT.
    2. Zamocować szkiełko do uchwytu wirówki za pomocą próżni i zaprogramować urządzenie: Krok 1 – 500 rpm przez 10 s przy przyspieszeniu 100 rpm/s. Krok 2 – 3000 rpm przez 30 s przy przyspieszeniu 300 rpm/s.
    3. Nanieść 3-4 krople HMDS na powierzchnię szkiełka. Uruchomić program.
      UWAGA: Aby uzyskać powłokę powierzchniową o grubości ~3 µm, należy użyć pozytywnego fotorezistu z serii S1800. Dokładne prędkości wirowania będą się różnić w zależności od formulacji; poniższe zalecenia dotyczą formulacji S181834.
    4. Nanieść 1 mL fotorezistu na powierzchnię szkiełka. Upewnić się, że ilość jest wystarczająca do pokrycia całej powierzchni.
    5. Uruchomić program. Po zatrzymaniu systemu wyłączyć próżnię i wyjąć szkiełko.
    6. Umieścić szkiełko pokryte S1818 na płytce grzewczej w temperaturze 120 °C na 4 min w celu wstępnego wygrzewania (soft bake). Zdjąć i pozostawić do ostygnięcia do RT.
    7. Zamocować maskę fotolitograficzną z projektami 2D elektrod w uchwycie maski.
    8. Włożyć i wyrównać szkiełko z warstwą S1818 skierowaną do góry na uchwycie wafla. Ustawić parametry naświetlania na 250 mJ/cm2 i uruchomić urządzenie.
      UWAGA: Różne modele urządzeń do wyrównywania kontaktowego mogą w różnym stopniu obsługiwać podłoża nieokrągłe o zmiennej grubości.
    9. Zanurzyć szkiełko w roztworze wywoływacza MF-319 na 2 min. Zastosować delikatne mieszanie. Opłukać powierzchnię szkiełka wodą dejonizowaną.
    10. Osuszyć powierzchnię za pomocą strumienia sprężonego azotu lub filtrowanego powietrza i obejrzeć struktury pod mikroskopem z użyciem filtra UV. Upewnić się, że w wzorach litograficznych nie ma widocznych wad.
    11. Umieścić szkiełko w piekarniku w temperaturze 150 °C, upewniając się, że interesująca powierzchnia podłoża jest skierowana do góry, na minimum 30 min w celu końcowego wygrzewania (hard bake). Wyjąć z piekarnika i przechowywać w ciemności.

3. Wytwarzanie urządzenia: Trawienie kwasem fluorowodorowym (HF)

OSTRZEŻENIE: Ten etap obejmuje obchodzenie się z kwasem fluorowodorowym (HF) oraz jego utylizację, co może spowodować głębokie i bolesne oparzenia chemiczne. Należy stosować dodatkowe środki ochrony osobistej (PPE), aby chronić osobę wykonującą czynność (przyłbica, chemoodporne rękawice do łokcia, chemoodporny fartuch z rękawami). Neutralizator kwasu w postaci gluconianu wapnia oraz żel do skóry powinny znajdować się w pobliżu blatu laboratoryjnego. Ten etap nie powinien być wykonywany w samotności. Kwasu HF nigdy nie należy przechowywać ani przelewać do szklanych pojemników, ponieważ kwas wytrawi naczynie.

UWAGA: HF jednorodnie trawi odsłonięte szkło (tzn. wzór elektrody), tworząc w szkle wgłębienie, co pozwala na uzyskanie lepszej rozdzielczości krawędzi wzoru elektrody po osadzaniu metalu (sekcja 4).

  1. Zanurz szkiełko w buforowanym roztworze HF w proporcji 10:1 na 1 min w pojemniku z politetrafluoroetylenu. Przenieś i przemyj szkiełka wodą dejonizowaną. Powtórz etap płukania 3 razy.
  2. Osusz powierzchnię za pomocą strumienia sprężonego azotu lub filtrowanego powietrza. Umieść podłoża szklane w suszarce w temperaturze 65 °C na noc, aby usunąć pozostałą wilgoć. Zabezpiecz podłoża przed światłem.

4. Wytwarzanie urządzenia: Fizyczne osadzanie z fazy gazowej

UWAGA: Ten krok obejmuje osadzanie metalu na szklanych podłożach w celu zdefiniowania wzorów elektrod. Powszechnie stosowanymi elektrodami metalowymi są chrom/złoto oraz tytan/platyna. Złoto i platyna nie przylegają do szklanego podłoża, dlatego wymagana jest warstwa adhezyjna z chromu lub tytanu, odpowiednio, aby zapewnić przyczepność37.

  1. Postępuj zgodnie z protokołem właściwym dla pomieszczenia czystego w celu obsługi wewnętrznego systemu PVD. W tej procedurze zastosowano system rozpylania prądem stałym (DC sputtering) z przepływem gazu argonowego 100 SCCM przy ciśnieniu ~8 mTorr i mocy 200 W.
  2. Rozpyl tytan przez 8 min z szybkością ~100 Å/min. Następnie rozpyl platynę przez 10 min z szybkością ~200 Å/min. Wyjmij podłoża z komory PVD.

5. Wytwarzanie urządzenia: Usuwanie fotorezystu (lift-off)

UWAGA: Ten krok polega na rozpuszczeniu warstwy fotorezystu w kąpieli z acetonu, w wyniku czego na szkiełkach przedmiotowych pozostają przylepione, wzorowane elektrody platynowe.

  1. Zanurz szkiełka przedmiotowe pokryte metalem w kąpieli z acetonem na ok. 10 min.
  2. Poddaj kąpiel sonicacji, aby wprowadzić drgania rozbijające nieprzylegającą warstwę metalu. W razie potrzeby użyj przenasiączonej acetonem chusteczki, aby usunąć wszelkie pozostałości.
  3. Po usunięciu całego fotorezystu/metalu przemyj wzory elektrod wodą dejonizowaną, a następnie umieść je w piecu w temperaturze 65 °C na noc, aby usunąć pozostałą wilgoć z powierzchni.
  4. Użyj profilometrii stykowej do pomiaru profilu wytrawionych elektrod.

6. Wytwarzanie urządzenia: Miękka litografia

UWAGA: Ten krok polega na odtwórczym formowaniu kanału mikroprzepływowego na strukturze reliefowej matrycy SU-8 przy użyciu elastomeru, polidimetylosiloksanu (PDMS).

  1. Silanizacja wafla krzemowego
    UWAGA: Jest to krok opcjonalny; zwiększy on jednak trwałość struktury wypukłej z SU-8, która została wykonana w podrozdziale 2.1. Krok ten należy przeprowadzić w dygestorium chemicznym.
    1. Przymocuj wafel do dna szalki Petriego i umieść szalkę w eksyكاتهrze.
    2. Wokół obwodu wafla krzemowego nanieś około 50 µL Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silanu. Podłącz próżnię (pompę próżniową lub instalację próżniową) i pozostaw na 20 min.
  2. Odlewanie repliki z PDMS
    1. W jednorazowym pojemniku (np. łódce wagowej, plastikowym kubku), zmieszaj bazę elastomeru PDMS z utwardzaczem w stosunku wagowym 10:1 na wadze elektronicznej. Wlej roztwór PDMS na wafel krzemowy i umieść mieszaninę w próżni, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
    2. Utwardzaj w temperaturze 65 °C przez minimum 4 h, aż PDMS stężeje. Używając czubka żyletki, wytnij odlew z PDMS i odklej go od wafla krzemowego.
    3. Używając naostrzonego wycinaka do biopsji, usuń PDMS z wlotów/wylotów urządzenia. W przypadku tego urządzenia do wlotów i wylotów zastosowano odpowiednio wycinaki o średnicy 0,75 mm i 3 mm.
      UWAGA: Stosowany wycinak do biopsji powinien mieć nieco mniejszą średnicę niż średnica zewnętrzna łączących przewodów, aby zapewnić szczelne połączenie przewodów w zbiornikach.
  3. Czyszczenie PDMS w myjce ultradźwiękowej
    1. Zanurz urządzenia z PDMS w IPA i umieść je w myjce ultradźwiękowej na 30-45 min, aby usunąć wszelkie resztki PDMS z wlotów/wylotów. PDMS może spuchnąć w roztworze IPA.
    2. Przepłucz wodą dejonizowaną i umieść w piekarniku w temperaturze 65 °C na noc, aby PDMS mógł powrócić do swojego normalnego rozmiaru.
      UWAGA: Wszelkie pozostałe resztki mogą zapchać urządzenie podczas eksperymentu. Duże fragmenty zanieczyszczeń można usunąć z powierzchni PDMS za pomocą kawałka taśmy klejącej przed sonikacją.

7. Wytwarzanie urządzenia: łączenie PDMS/mocowanie przewodów

UWAGA: Ten krok polega na poddaniu powierzchni PDMS i podłoża szklanego działaniu plazmy tlenowej w celu utworzenia nieodwracalnego wiązania między PDMS a szkłem38. Podana procedura może wymagać dostosowania do konkretnego systemu wykorzystywanego w laboratorium.

  1. Dotnij urządzenia do odpowiedniego rozmiaru i upewnij się, że powierzchnia urządzenia PDMS jest czysta. W przeciwnym razie wyczyść ją ponownie, postępując zgodnie z krokami opisanymi w podrozdziale 6.3.
  2. Zaprogramuj generator plazmy. Ustaw Moc (Power) na 70 W, Czas (Time) na 35 s, Ciśnienie (Pressure) na 325 mTorr oraz Przepływ (Flow Rate) tlenu na 60 SCCM. Umieść PDMS i szklaną płytkę z elektrodami w systemie stroną z elementami do góry i uruchom program.
  3. Wyjmij urządzenia i szybko dopasuj kanały do elektrod za pomocą stereomikroskopu. Mocno dociśnij PDMS, przesuwając nacisk od środka w stronę krawędzi, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z powierzchni styku.
  4. Umieść zestaw na płytce grzejnej w temperaturze 95 °C na co najmniej 2 min, aby sfinalizować procedurę wiązania, a następnie pozostaw urządzenie do ostygnięcia w RT.
  5. Odetnij 2 kawałki litego drutu 22-G o długości ok. 6" i zdejmij izolację z obu końców.
  6. Przylutuj druty do elektrod, używając przewodzącego srebrem epoksydu. Umieść gotowe urządzenia w piecu w temperaturze 65 °C na całą noc.

Przepływ procesu kanału mikrofluidycznego, schemat przedstawiający montaż urządzenia z etapami integracji elektrod.
Rysunek 2: Wytwarzanie mikrourządzenia. (A) Wytwarzanie kanału mikrofluidycznego – kluczowe etapy: czyszczenie wafla krzemowego (kroki 2.1.1-2.1.3), nakładanie fotorezystu i wstępne wygrzewanie (kroki 2.1.7-2.1.8), naświetlanie UV (krok 2.1.10), wywoływanie (krok 2.1.12) oraz wlewanie PDMS (podrozdział 6.2). (B) Wytwarzanie elektrod – kluczowe etapy: czyszczenie szkiełka przedmiotowego (kroki 2.1.1-2.1.3), nakładanie HMDS i fotorezystu (kroki 2.2.3-2.2.4), naświetlanie UV (krok 2.2.8), wywoływanie (krok 2.2.9), trawienie HF (sekcja 3), fizyczne osadzanie z fazy gazowej (sekcja 4) oraz usuwanie fotorezystu metodą lift-off (sekcja 5). (C) Finalizacja urządzenia – kluczowe etapy: wykonanie dostępów do wlotu/wylotu i sonikacja (krok 6.2.3 i sekcja 6.3), wiązanie PDMS oraz mocowanie przewodów (sekcja 7). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

8. Hodowla i zbiór komórek

UWAGA: Należy stosować standardowe procedury hodowli komórkowej i zasady pracy w warunkach sterylnych. Postępuj zgodnie z protokołem hodowli komórkowej specyficznym dla danego typu komórek.

  1. Hodowla komórek
    1. Pasażowanie komórek: Hodować i pasażować komórki zgodnie z krokami 8.1.2-8.1.5.
    2. Hodować komórki HEK293 w pełnej pożywce DMEM (88% DMEM, 10% dezaktywowanego cieplnie płodowej surowicy bydlęcej, 1% L-glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny) w kolbie T25 w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 95% O2, 5% CO2. Pasażować komórki zgodnie z harmonogramem po osiągnięciu ok. 80% konfluencji.
    3. Odssać pożywkę za pomocą pipety lub systemu próżniowego i inkubować komórki w 0,25% trypsynie-EDTA (2 mL do kolby T25) przez 2 min w temperaturze 37 °C. Zneutralizować trypsynę dwukrotną objętością pożywki hodowlanej.
    4. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowatej probówki 15 mL i odwirować komórki HEK293 przy 770 x g przez 2 min. Odssać nadsącz za pomocą pipety lub systemu próżniowego.
    5. Resuspendować komórki HEK293 w 1 mL uprzednio ogrzanej pożywki DMEM.
    6. Wysiewanie komórek: Wysiać komórki zgodnie z krokami 8.1.7-8.1.8.
    7. Wysiać komórki w rozcieńczeniu od 10:1 do 20:1 w kolbie T25 (5 mL DMEM) w celu kontynuowania hodowli.
    8. Wysiać komórki w rozcieńczeniu od 5:1 do 20:1 w płytce 6-dołkowej (2 mL DMEM na dołek) do późniejszego zbioru na potrzeby eksperymentów z elektroporacją.
      UWAGA: Komórki HEK293 należy wysiać 24 h przed eksperymentami z elektroporacją, aby uzyskać ok. 70% konfluencji podczas zbioru komórek (podrozdział 8.3). Niespójny harmonogram zbioru może prowadzić do zmienności wyników elektroporacji.
  2. Bufor do elektroporacji
    1. Przygotować bufor do elektroporacji
      UWAGA: Szczegóły dotyczące przygotowania buforu do elektroporacji znajdują się w pracy Sherba et al.8. Skład buforu to: 285 mM sacharozy, 0,7 mM MgCl2, 1 mM KCl, 10 mM HEPES, 3 mM NaOH (pH: 7,4; osmolalność: 310 mOsm, przewodność: 500 µS/cm). Bufor do elektroporacji powinien być przygotowany w warunkach sterylnych i przechowywany w temperaturze 4 °C przez ok. 1 miesiąc. Skład buforu do elektroporacji powinien zostać zoptymalizowany dla każdego typu komórek.
  3. Zbiór komórek i dodawanie pDNA
    1. Postępować zgodnie z krokami opisanymi dla pasażowania komórek (8.1.2-8.1.4).
    2. Przemyć komórki sterylnym 1x PBS, przenieść zawiesinę komórkową do stożkowatej probówki 15 mL i odwirować komórki przy 770 x g przez 2 min.
    3. Przemyć osad z komórek HEK293 buforem do elektroporacji i odwirować przy 770 x g przez 2 min. Resuspendować komórki w buforze do elektroporacji do stężenia ok. 5 milionów komórek/mL.
      UWAGA: Gęstość komórek powinna być zoptymalizowana dla każdego typu komórek.
    4. Dodać pDNA kodujące zielone białko fluorescencyjne (GFP) do stężenia końcowego 20 µg/mL. Delikatnie wymieszać zawiesinę pDNA/komórki i przenieść zawiesinę do strzykawki 1 cc do przeprowadzenia eksperymentu.

9. Sprzęt/układ eksperymentalny

UWAGA: Przed pobraniem komórek do eksperymentu należy upewnić się, że układ doświadczalny jest w pełni przygotowany, aby zminimalizować czas przebywania komórek w buforze do elektroporacji. Urządzenia elektroniczne należy włączyć na 20-30 min przed rozpoczęciem eksperymentów w celu ich rozgrzania. Schemat układu doświadczalnego dla modułu detekcji pojedynczych komórek przedstawiono na Rysunku 3.

UWAGA: Opracowano specjalnie zaprojektowany układ wzmacniacza operacyjnego PA90, aby zapewnić zarówno czułość wymaganą do detekcji na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu wzmacniacza lock-in, jak i wysokie napięcia niezbędne do przyłożenia wystarczająco silnych impulsów elektroporacyjnych. Specyfikacje dotyczące zalecanych układów znajdują się w arkuszu danych PA9039.

  1. Inicjalizuj wzmacniacz lock-in z aktualnymi ustawieniami przedwzmacniacza i skonfiguruj go za pomocą algorytmu. Szczegółowe informacje na temat ustawień lock-in znajdują się w pracy Zheng et al.32.
  2. Zasilacze, generator funkcji i wzmacniacz
    1. Zasilacz 1: Ustaw na -15 V, aby zasilić ujemny koniec obwodu.
    2. Zasilacz 2 (Generator funkcji): Ustaw na wyjście sygnału DC i ustaw amplitudę na 2 V. Podłącz do wejścia wzmacniacza 50x.
    3. Zaprogramuj generator impulsów do elektroporacji dla fali prostokątnej: Ustaw żądaną szerokość impulsu (cykl pracy) i żądaną amplitudę impulsu (Wolty).
    4. Ustaw wyjście w trybie wyzwalania (1 impuls). Podłącz wyjście do wejścia wzmacniacza 50x.
      UWAGA: Pamiętaj o wzmocnieniu 50x podczas programowania amplitudy impulsu. Np. aby uzyskać natężenie pola elektrycznego 1 kV/cm, wymagane jest łącznie 30 V, 30 V/300 µm (odległość między elektrodami), zatem wyjście generatora funkcji powinno zostać ustawione na 30/50, czyli 600 mV.
    5. Zweryfikuj wyjścia wzmacniacza 50x za pomocą oscyloskopu. Wyjście 1-100 V z Zasilacza 2 (9.2.2). Wyjście 2-zmienna amplituda dla impulsu elektroporacyjnego (9.2.4).
    6. Podłącz sondę 10x do kanału oscyloskopu i do gotowego mikrourządzenia (badane urządzenie, DUT) w kroku 7.6, gdzie zostanie przyłożony impuls elektroporacyjny. Monitoruj system podczas eksperymentu, aby upewnić się, że impulsy są przyłożone.
    7. Upewnij się, że USB lock-in jest podłączone i zarejestrowane. Ponownie sprawdź wszystkie ustawienia lock-in w kodzie algorytmu (najważniejsza jest częstotliwość wyjściowa lock-in).
  3. Mikroskop/Kamera CCD
    1. Umieść mikrourządzenie na stoliku mikroskopu za pomocą uchwytu na preparat. Włącz kamerę CCD i ustaw ostrość na kanał mikrofluidyczny. Użyj obiektywu 4x lub 10x.

Schemat równowagi statycznej; obwód wzmacniacza PA 90; konfiguracja impulsu elektroporacyjnego; monitorowanie systemu.
Rysunek 3: Schemat układu eksperymentalnego – detekcja pojedynczych komórek. Wzmacniacz operacyjny o wysokiej mocy (PA-90) umożliwia nałożenie wysokonapięciowego impulsu elektroporacyjnego na sygnał AC z wyjścia wzmacniacza lock-in, który jest niezbędny do detekcji pojedynczych komórek. Ten sygnał wzbudzenia przechodzi przez urządzenie do mikroelektroporacji (badane urządzenie, DUT), gdzie prąd jest następnie wzmacniany przez przedwzmacniacz prądowy i przekazywany do algorytmu. System stale monitoruje zdarzenia detekcji komórek. W momencie wejścia komórki, wzmacniacz lock-in generuje sygnał cyfrowy, aby wyzwolić aplikację impulsu elektroporacyjnego do komórki(ek) znajdującej się w przejściu. Legenda: PA-90 (wzmacniacz operacyjny o wysokiej mocy), DUT (badane urządzenie), DIO (cyfrowe wejście/wyjście), FG-EP (generator funkcji / impuls elektroporacyjny), 50X (wzmacniacz 50X), PS-V- (zasilacz / napięcie ujemne dla PA 90), FG-V+ (generator funkcji, napięcie dodatnie dla PA 90). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

10. Procedura eksperymentalna

  1. Przygotowanie kanałów mikrofluidycznych (priming)
    1. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza z strzykawki z zawiesiną komórek. Do strzykawki z zawiesiną komórek przymocuj igłę 30 G.
    2. Za pomocą pęsety nasuń rurkę Tygon wzdłuż igły. Wstępnie napełnij zbiornik wylotowy medium regeneracyjnym (takim samym jak w kroku 8.1.2, ale bez antybiotyków), ok. 40-50 µL.
    3. Kciukiem delikatnie naciśnij tłok tak, aby ciecz powoli dotarła do końca linii rurki.
    4. Zabeziecz strzykawkę w pompie strzykawkowej. Włącz pompę strzykawkową i upewnij się, że ustawiono w niej perfuzję w przód.
    5. Zaprogramuj pompę, wybierając odpowiednią średnicę strzykawki, aby zapewnić dokładność przepływu. Szczegółowe informacje dotyczące średnic strzykawek znajdują się w instrukcji obsługi pompy.
      UWAGA: Aby zapobiec osadzaniu się komórek w strzykawce, należy zamocować pompę strzykawkową na statywie z zaciskiem w taki sposób, aby mogła ona pracować w pozycji pionowej, z końcem strzykawki skierowanym w dół.
    6. Ustaw prędkość przepływu pompy strzykawkowej na ok. 10-20 µL/mini poczekaj, aż pompa przepompuje ciecz do końca linii przewodów. Przymocuj przewody do urządzenia mikroprzepływowego.
    7. Zmniejsz szybkość przepływu pompy strzykawkowej do ok. 5-10 µL/mini należy pozwolić pompie na pracę do momentu usunięcia całego powietrza z urządzenia mikrofluidycznego i przemieszczenia się komórek w kierunku wylotu urządzenia.
    8. Usunąć komórki z odpływu za pomocą aspiracji pipetą. Ponownie napełnić zbiornik odpływowy medium regeneracyjnym (takim samym jak w kroku 8.1.2, ale bez antybiotyków), ~40-50 µL.
  2. Mapowanie permeabilizacji błony komórkowej podczas elektroporacji pojedynczych komórek
    UWAGA: Należy odnieść się do Rysunek 4 i Rycina 5 w celu lepszego zrozumienia danych elektrycznych wskazujących na permeabilizację błony komórkowej oraz mapowania permeabilizacji błony komórkowej, odpowiednio.
    1. Ustawić szybkość przepływu pompy strzykawkowej na ok. 0,1-0.3 µL/min aby zapewnić przepływ pojedynczych komórek przez zestaw elektrod. Czas przejścia komórki między elektrodami powinien wynosić ok. 250 ms.
    2. Uruchom program komputerowy, klikając w UruchomNależy upewnić się, że system zapisuje dane elektryczne.
    3. Upewnij się, że system niezawodnie wykrywa komórki w celu wyzwolenia sterowanych komputerowo aplikacji impulsów. Dostosuj Próg detekcji odpowiednio.
    4. Ustaw parametry impulsu dla początkowego impulsu elektroporacyjnego o najniższej energii elektrycznej. Odwołaj się do Tabela 1 parametrów impulsów do elektroporacji w niniejszym badaniu.
    5. Włącz kanał wyjściowy (Output) generatora impulsów do elektroporacji (krok 9.2.3.).
    6. Wykonaj określoną liczbę detekcji komórek/aplikacji impulsów (n = 100). Po zakończeniu każdego testowanego warunku odessij komórki z wylotu mikrourządzenia i uzupełnij wylot pożywką regeneracyjną.
    7. Przejdź do następnych parametrów impulsu elektroporacji. Powtarzaj czynność do czasu przetestowania wszystkich parametrów impulsów elektroporacji.
    8. Określ stopień permeabilizacji błony komórkowej dla każdego przetestowanego zastosowania impulsu. (Walidacja po procesie została opisana w podrozdziale 11.1). Wygeneruj mapę permeabilizacji błony komórkowej (Rycina 5).
    9. Wyznacz parametry impulsu elektroporacji dla wysokoprzepustowego sprzężenia zwrotnego opartego na populacji.
    10. Wyłączyć pompę strzykawkową, usunąć komórki z rezerwuaru wylotowego i uzupełnić go pożywką regeneracyjną.
  3. Elektroporacja z kontrolą sprzężenia zwrotnego w oparciu o populację – wysokoprzepustowa
    UWAGA: Należy odnieść się do Rycina 6 do schematu ilustrującego proces sprzężenia zwrotnego opartego na populacji.
    1. Ustaw prędkość przepływu pompy strzykawkowej na ok. 1-3 µL/min aby zapewnić przepływ pojedynczych komórek przez zestaw elektrod. Czas przejścia komórki między elektrodami powinien wynosić ok. 25 ms.
    2. Ustaw amplitudę impulsu na wartość dla stanu „zoptymalizowanego” (10.2.9), wyłącz tryb wyzwalania i ustaw szerokość impulsu tak, aby odpowiadała czasowi przejścia komórek.
    3. Ustaw cykl pracy w taki sposób, aby czas trwania impulsu (czas włączenia) odpowiadał warunkowi „zoptymalizowanemu”. Należy odnieść się do Tabela 1.
    4. Ustaw generator funkcji kanału wyjściowego na WŁ.następnie włącz pompę strzykawkową i pozwól systemowi pracować do momentu elektroporacji pożądanej liczby komórek.
    5. Po zakończeniu wyłączyć pompę strzykawkową oraz generator funkcji.
    6. Przenieś komórki z zbiornika wylotowego do odpowiednio dobranego rozmiarem kolby lub płytki do hodowli komórkowych wypełnionej uprzednio ogrzanym medium regeneracyjnym, a następnie umieść kolbę lub płytkę w inkubatorze.

11. Analiza

  1. Wykrywanie permeabilizacji błony na poziomie pojedynczych komórek
    UWAGA: Aby upewnić się, że podczas pracy modułu wysokoprzepustowego zastosowano „optymalny” impuls, należy przeprowadzić analizę poeksperymentalną w celu weryfikacji danych elektrycznych wyeksportowanych z podrozdziału 10.2. Przedstawienie graficzne sygnału elektrycznego reprezentującego permeabilizację błony w wyniku elektroporacji znajduje się na Rysunku 4.
    1. Wczytaj dane do oprogramowania analitycznego (MATLAB, Python itp.). Wygeneruj wykres zależności Natężenia od Czasu dla każdego warunku impulsowania.
    2. Ręcznie określ stopień permeabilizacji błony komórkowej (ΔIP/ΔIC). Patrz Rysunek 4. Wygeneruj mapę permeabilizacji błony komórkowej (ΔIP / ΔIC w funkcji Energii Elektrycznej, Rysunek 5) dla wszystkich przetestowanych warunków impulsowania. Zweryfikuj „optymalny” warunek impulsowania.
  2. Wydajność elektrotransfekcji (eTE)
    1. Po 24-godzinnym okresie inkubacji wyjmij elektroporowane komórki z inkubatora.
    2. Wykonaj barwienie żywych komórek. Rozcieńcz DRAQ5 w stosunku 1:1000 do końcowego stężenia 5 µM w naczyniu hodowlanym. Delikatnie wymieszaj komórki z roztworem barwiącym i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5–30 min.
      UWAGA: Na tym etapie można zastosować inny barwnik. Upewnij się, że właściwości fluorescencyjne nie nakładają się na marker fluorescencyjny wskazujący na udaną elektrotransfekcję (np. GFP znajduje się w zakresie fali zielonej, a DRAQ5 w zakresie głębokiej czerwieni).
    3. Włącz mikroskop epifluorescencyjny, lampę oraz kamery (patrz Tabela materiałów).
    4. Wyjmij komórki z inkubatora i ustaw ostrość w mikroskopie.
    5. Wykonaj obraz w kontraście fazowym (w polu jasnym) wybranego obszaru.
    6. Wykonaj obrazy epifluorescencyjne tego samego obszaru, używając filtrów FITC (GFP) oraz głębokiej czerwieni (DRAQ5). Przeanalizuj zestawy obrazów ręcznie lub za pomocą algorytmu.
      UWAGA: Reprezentatywne obrazy przedstawiono na Rysunku 7.
    7. Policz całkowitą liczbę komórek GFP-dodatnich na wszystkich obrazach. Policz całkowitą liczbę komórek zabarwionych DRAQ5 na wszystkich obrazach. Oblicz eTE (stosunek liczby komórek GFP-dodatnich do liczby komórek zabarwionych DRAQ5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 4 przedstawia zasady działania detekcji permeabilizacji błony na poziomie pojedynczych komórek dla pojedynczej amplitudy impulsu. Po rozpoczęciu eksperymentu z elektroporacji algorytm detekcji komórek określa optymalny próg wykrywania komórek za pomocą punktowej metody detekcji opartej na nachyleniu. Następnie system w sposób ciągły monitoruje: (1) wystąpienie znaczącej ujemnej zmiany zmierzonego prądu elektrycznego, co wskazuje na wniknięcie komórki. Wynika to z izolacyjnego charakt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metodologia przedstawiona w tym protokole koncentruje się przede wszystkim na mikrowytwarzaniu urządzenia mikroprzepływowego, które jest następnie integrowane ze specjalistycznym układem eksperymentalnym do elektroporacji. Termin "receptura", który jest często używany do opisywania specyfiki procesu mikrowytwarzania, wskazuje na znaczenie przestrzegania/optymalizacji każdego kroku w celu pomyślnego wytworzenia działającego urządzenia. Jednak niektóre krytyczne etapy procesu, jeśli nie są zoptymalizowane, takie jak czas/e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Fundacji Nauki (NSF, CBET 0967598, DBI, IDBR 1353918) oraz U.S. Department of Education's Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) za sfinansowanie stypendium dla doktoranta J.J.S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalki Petriego o średnicy 150 mmVWR25384-326krok 6.1.1 do zabezpieczania
24-dołkowych płytek do hodowli tkankowychwafli VWR10062-896krok 10.3.6 do płytki ogniw elektroporowanych
33220A Generator przebiegów/funkcjiAgilentkrok 9.2.3 generator impulsów elektroporacyjnych
4'' wafle krzemoweWafeluniwersyteckiPodsekcja 2.1 dotycząca wytwarzania kanałów mikroprzepływowych
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychVWR10062-892krok 8.1.8 do płytki komórek
AcetonFisher ScientificA18-4krok 2.1.2 do czyszczenia i  krok 5.1 Photoresist lift-off
Wirówka Allegra X-22RBeckman Coulterkroki 8.1.4 , 8.3.2. i 8.3.3. do obracania komórek
AutoCAD 2018Autodeskpodsekcja 1.1. do projektowania masek przezroczystości
Buforowany wytrawiacz tlenkowy 10:1VWR901621-1Lpodsekcja 3.1 do trawienia HF
CCD Monochromatyczna kamera mikroskopowaHamamatsuOrca 285 C4742-96-12G04krok 11.2.3. do obrazowania
kamery CMOS - Sensicam QE 1.4MPPCOpodsekcja 9.3 część konfiguracji eksperymentalnej
Przewodząca żywica epoksydowaCircuitWorksCW2400podrozdział 7.6. do mocowania
drutu Stożkowe probówki wirówkowe, 15 mlFisher Scientific14-959-70Ckrok 8.1.4. do wirowania komórek
Profilometr powierzchniowy Dektak 3STVeeco (Sloan/Dektak)krok 2.1.15 i 5.4 do profilometrii powierzchni
Jednorazowy dziurkacz do biopsji, 0,75 mmRobbins InstrumentsRBP075krok 6.2.3 dla dostępu do wlotu
Jednorazowy dziurkacz do biopsji, 3 mmRobbins InstrumentsRBP30Pkrok 6.2.3 dla dostępu do ujścia
DRAQ5abcamab108410krok 11.2.2. do barwienia żywych komórek
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s MediumThermoFisher Scientific 11885084krok 8.1.2. część składu mediów
E3631A Bipolarny zasilacz Triple DCAgilentkrok 9.2.1.-9.2.2.część zestawu eksperymentalnego
Eclipse TE2000-U Odwrócony  MikroskopNikon  podsekcja 9.3. część eksperymentalnej konfiguracji
EVG620 UV Lithium SystemEVG  Krok 2.1.9. oraz 2.2.7. do ekspozycji na promieniowanie UV
Płodowa surowica bydlęcaNeuromicsFBS001krok 8.1.2. część kompozycji pożywki
Myjka ultradźwiękowa FS20Fisher Scientificpodrozdział 5.1. do podnoszenia fotorezystu
Szklana butelka z nakrętką, 100 mlFisher ScientificFB800100krok 8.2.1. do przechowywania buforowego
Szklana butelka z nakrętką, 500 mlFisher ScientificFB800500kroku 8.1.2. do przechowywania nośników
Linia komórkowa HEK-293ATCCCRL-1573podsekcja 8.1 dla roztworu
buforowego HEPESSigma Aldrich83264-100ML-Fkrok 8.2.1 część kompozycji buforu elektroporacyjnego
HeksametyldisilazanSigma Aldrich379212-25MLkrok 2.2.3 promotor przyczepności
HF2LI Wzmacniacz blokującyZurych Przyrządypodrozdział 9.2 część konfiguracji eksperymentalnej
Wzmacniacz prądowy HF2TAZurich Instrumentspodsekcja 9.2 część zestawu eksperymentalnego
Alkohol izopropylowyFisher ScientificA459-1krok 2.1.2 do czyszczenia, krok 2.1.14 do płukania płytki po wywołaniu SU-8 i krok 6.3.1 do czyszczenia mikroskopu
fluorescencyjnego PDMS IX81Olympuskrok 11.2.3 do obrazowania
roztworu L-glutaminySigma AldrichG7513-20MLkrok 8.1.2. część składu pożywki
Drut o średnicy 22 M16878 / 1BFAAWCB22-1podsekcja 7.5 do produkcji urządzeń
Chlorek magnezuSigma Aldrich208337-100GKrok 8.1.2 część składu bufora do elektroporacji
MF 319 DeweloperKayaku Advanced Materials10018042kroku 2.2.9. wywoływacz fotorezystu
Microposit S1818 fotorezystorKayaku Advanced Materials1136925Krok 2.2.4 dodatni fotorezystor do modelowania elektrod
Szkiełka mikroskopowe, 75 x 25 mmVWR16004-422krok 2.2.1 elektroda podłoże ze szkła sodowo-wapiennego
Model 2350 Wzmacniacz wysokiego napięciaTEGAM2350krok 9.2.5. Część układu eksperymentalnego
National Instruments LabVIEWdo akwizycji danychNational Instruments
, 30G x 1 wBD Scientific305128Krok 10.1.1. Część systemu Zalewanie
PA90 IC OPAMP Obwód zasilaniaDigi-key598-1330-NDCzęść niestandardowego obwodu
Penicylina-StreptomycynaSigma AldrichP4458-20MLKrok 8.1.2. Część kompozycji podłoża
Plazmid pMAX-GFPLonzaVCA-1003krok 8.3.4. do dostarczania wewnątrzkomórkowego
Rurka plastikowa, 0,010'' x 0,030"VWR89404-300krok 10.1.2. do gruntowania systemu
Cele platynoweKurt J. Leskerpodrozdział 4.2. do fizycznego osadzania z fazy gazowej
Chlorek potasuSigma AldrichP9333-500Gkrok 8.2.1. część kompozycji buforowej do elektroporacji
Pompa 11 Mikroprzepływowa pompa strzykawkowa PicoPlusAparaturaHarvarda MA1 70-2213krok 10.1.4. do zalewania systemu
PVD75 System fizycznego osadzania z fazy gazowejKurt J. Leskerpodrozdział 4.1. do fizycznego osadzania z fazy gazowej
PWM32 Spinner SystemHeadway2.1.6 i 2.2.2. do powlekania podłoża fotorezystem
PX-250 System obróbki plazmowejMarch Instrumentspodrozdział 7.2 do klejenia PDMS i podłoża szklanego
SDG1025 Generator funkcji/przebiegówSiglentkrok 9.2.2. część układu doświadczalnego
Wodorotlenek soduSigma AldrichS8045-500GKrok 8.2.1. Część składu buforu elektroporacyjnego
SU-8 2010 ujemny fotorezystorKayaku Advanced MaterialsY111053kroku 2.1.7. do tworzenia wzorców kanałów mikroprzepływowych
SU-8 DeveloperMicrochemY010200kroku 2.1.12. do wywoływania fotorezystu
SacharozaSigma AldrichS7903-1KGkrok 8.2.1. część kompozycji buforu elektroporacyjnego
Zestaw elastomerów Sylgard 184Dow Corning3097358-1004krok 6.2.1  10 : 1 mieszanina polimeru PDMS i utwardzacza
Strzykawka, 1 ml Strzykawka309628 BD Scientifickrok 8.3.4. Część systemu zalewania
System stereomikroskopu SZ61Olympuspodrozdział 7.3. do wyrównania kanałów i elektrod
Kolby T25 poddane działaniu kultur tkankowychFalcon353108etap 8.1.2 dla hodowli komórek
Tarcze tytanoweKurt J. Leskerpodrozdział 4.2. do fizycznego osadzania z fazy gazowej
Maski przezroczystościCAD/ARTkroki 2.1.9. i 2.2.7. dla fotolitografii
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanSigma Aldrich448931-10Gkrok 6.1.2. do silanizacji wafli
Roztwór trypsyny-EDTASigma AldrichT4049-100MLkroki 8.1.3. i 8.3.1. do pobierania komórek
do hodowli komórkowych Igła Etapy badań Usługi

Bibliografia

  1. Gao, Q. Q., et al. Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy. Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).
  2. Aijaz, A., et al. Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).
  3. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).
  4. Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41 (2), 135-160 (1996).
  5. Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models. Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).
  6. Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. Gene electrotransfer: A mechanistic perspective. Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).
  7. Clauss, J., et al. Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors. Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).
  8. Sherba, J. J., et al. The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency. Scientific Reports. 10 (1), 3053(2020).
  9. Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. A microfluidic electroporation device for cell lysis. Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).
  10. Kar, S., et al. Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects. Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).
  11. Shi, J. F., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  12. Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells. Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).
  13. Wei, W. J., et al. An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo. Microsystems & Nanoengineering. 1, (2015).
  14. Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
  15. Wu, Q. R., et al. Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects. Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).
  16. Pandey, C. M., et al. Microfluidics Based Point-of-Care Diagnostics. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
  17. Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).
  18. Nuxoll, E. BioMEMS in drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1611-1625 (2013).
  19. Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode. Scientific Reports. 5, (2015).
  20. Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).
  21. Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G. Nano-localized single-cell nano-electroporation. Lab on a Chip. 20 (22), 4194-4204 (2020).
  22. Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).
  23. Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation. Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).
  24. Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).
  25. Hsi, P., et al. Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing. Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).
  26. Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control. Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).
  27. Ye, Y. F., et al. Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip. 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).
  28. Huang, Y., Rubinsky, B. Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization. Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).
  29. Guo, X. L., Zhu, R. Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array. Scientific Reports. 6, (2016).
  30. Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation. Scientific Reports. 9, (2019).
  31. Wang, H. Y., Lu, C. Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply. Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).
  32. Zheng, M. D., et al. Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation. Technology. 5 (1), 31-41 (2017).
  33. Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. In vitro electroporation detection methods - An overview. Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).
  34. MICROPOSIT™ S1800® G2 Series Photoresists. KAYAKU. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf (2021).
  35. SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf (2001).
  36. Substrate Preparation. MicroChemicals. , Available from: https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf (2021).
  37. Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. 4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture. , Elsevier. 91-94 (2006).
  38. Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules. Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).
  39. PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX. , Available from: https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf (2021).
  40. Lissandrello, C. A., et al. High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing. Scientific Reports. 10 (1), 18045(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Elektroporacja w przep ywie ci g ympermeabilizacja b ony kom rkowejwytwarzanie urz dze mikrofluidycznychoptymalizacja impulsu elektroporacyjnegosprz enie zwrotne w oparciu o populacjelektroporacja pojedynczych kom reksystem dostarczania gen wkom rki HEK293dostarczanie plazmid w DNA
Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.