Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

DOI:

10.3791/63103

⸱

7 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Department of Biomedical Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey, 2The Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne innowacje terapeutyczne, takie jak terapia komórkowa CAR-T, są w dużym stopniu uzależnione od dostarczania genów za pośrednictwem wirusa. Technika ta, choć wydajna, wiąże się z wysokimi kosztami produkcji, co spowodowało zainteresowanie stosowaniem alternatywnych metod dostarczania genów. Elektroporacja to elektrofizyczne, niewirusowe podejście do wewnątrzkomórkowego dostarczania genów i innych materiałów egzogennych. Po zastosowaniu pola elektrycznego błona komórkowa tymczasowo umożliwia dostarczanie molekularne do komórki. Zazwyczaj elektroporacja jest wykonywana w makroskali w celu przetworzenia dużej liczby komórek. Podejście to wymaga jednak szeroko zakrojonego opracowania protokołu empirycznego, co jest kosztowne w przypadku pracy z pierwotnymi i trudnymi do transfekcji typami komórek. Długotrwały rozwój protokołu, w połączeniu z wymogiem dużych napięć w celu osiągnięcia wystarczających natężeń pola elektrycznego do przenikania ogniw, doprowadził do opracowania urządzeń do elektroporacji w mikroskali. Te urządzenia do mikroelektroporacji są produkowane przy użyciu popularnych technik mikrowytwarzania i pozwalają na większą kontrolę eksperymentalną z potencjałem utrzymania wysokiej przepustowości. Prace te opierają się na technologii elektroporacji mikroprzepływowej, która jest w stanie wykryć poziom przenikania błony komórkowej na poziomie pojedynczej komórki przy ciągłym przepływie. Technologia ta została jednak ograniczona do 4 komórek przetwarzanych na sekundę, a co za tym idzie, zaproponowano i przedstawiono tutaj nowe podejście do zwiększania przepustowości systemu. Ta nowa technika, oznaczona jako kontrola sprzężenia zwrotnego oparta na populacji komórek, uwzględnia reakcję przepuszczalności komórek na różne warunki pulsacji elektroporacji i określa najlepiej dopasowane warunki impulsu elektroporacyjnego dla badanego typu ogniwa. Następnie stosuje się tryb o wyższej przepustowości, w którym ten "optymalny" impuls jest podawany do zawiesiny ogniw podczas transportu. Szczegółowo przedstawiono etapy wytwarzania urządzenia, konfiguracji i przeprowadzania eksperymentów mikroprzepływowych oraz analizy wyników. Wreszcie, ta technologia mikroelektroporacji została zademonstrowana poprzez dostarczenie plazmidu DNA kodującego białko zielonej fluorescencji (GFP) do komórek HEK293.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne innowacje terapeutyczne w badaniach biomedycznych, takie jak terapia komórkami CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) i edycja genetyczna za pomocą CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat DNAs)/Cas9, w dużym stopniu polegają na zdolności do dostarczania materiału egzogennego zarówno skutecznie, jak i efektywnie do przestrzeni wewnątrzkomórkowej1. W terapii CAR-T złotym standardem w przeprowadzaniu etapu dostarczania genów w produkcji terapii komórkowej jest użycie wektorów wirusowych2. Chociaż dostarczanie genów za pośrednictwem wirusa jest skuteczną metodą dostarczania, ma również kilka wad. Obejmują one koszty produkcji, cytotoksyczność, immunogenność, potencjał mutagenezy/nowotworzenia oraz ograniczenia rozmiaru genu(ów), które mają być dostarczone3. Ograniczenia te doprowadziły do badań i rozwoju alternatywnych, niewirusowych technologii dostarczania.

Elektroporacja, alternatywa dla dostarczania genów za pośrednictwem wirusa, polega na zastosowaniu optymalnego kształtu fali impulsu elektrycznego do przeprowadzenia transfekcji DNA, RNA i białek komórek. Po zastosowaniu zewnętrznego pola elektrycznego błona komórkowa zostaje na krótko naruszona, co sprawia, że komórka jest podatna na wewnątrzkomórkowe dostarczanie nieprzepuszczalnych w inny sposób materiałów egzogennych4. W porównaniu z dostarczaniem za pośrednictwem wirusów, elektroporacja jest korzystna, ponieważ jest ogólnie bezpieczna, łatwa w obsłudze i ma niskie koszty operacyjne. Elektroporacja może dostarczać zarówno mały, jak i duży ładunek molekularny i może być skuteczna w transfekcji komórek niezależnie od linii5. Aby osiągnąć pożądane wyniki po elektroporacji, tj. dobrą żywotność i dobrą wydajność elektrotransfekcji, należy zoptymalizować różne parametry eksperymentalne. Należą do nich: typ ogniwa6, gęstość komórki, stężenie cząsteczki7, właściwości bufora elektroporacyjnego (np. skład molekularny, przewodność i osmolarność)8, rozmiar elektrody/geometria9, oraz przebieg impulsu elektrycznego (kształt, polaryzacja, liczba impulsów)10 (patrz Rysunek 1 dla ilustracji). Chociaż każdy z tych parametrów może mieć znaczący wpływ na wyniki eksperymentów z elektroporacją, przebieg impulsu został szczególnie szczegółowo zbadany, ponieważ energia elektryczna zastosowanego impulsu (impulsów) jest podstawą wewnętrznego kompromisu między wynikającą żywotnością ogniwa a wydajnością elektrotransfekcji8.

Zazwyczaj, eksperymenty z elektroporacją są przeprowadzane na makroskalę, gdzie komórki są zawieszone w 100 mikrolitrach buforu pomiędzy zestawem dużych, równoległych elektrod w kuwecie do elektroporacji. Elektrody są zwykle wykonane z aluminium o rozstawie elektrod 1-4 mm. Po ręcznym załadowaniu komórek za pomocą pipety, kuweta jest elektrycznie podłączona do nieporęcznego, elektrycznego generatora impulsów, w którym użytkownik może ustawić i zastosować parametry fali impulsowej do elektroporacji zawiesiny ogniwa. Chociaż elektroporacja w skali makro lub masowa może przetwarzać gęstości komórek >106 komórek/ml, ta funkcja może być marnotrawstwem podczas optymalizacji ustawień przebiegu impulsu elektrycznego. Jest to szczególnie niepokojące w przypadku elektroportowania pierwotnych typów komórek, w których liczba populacji komórek może być ograniczona. Dodatkowo, ze względu na dużą odległość między elektrodami, generator impulsów musi być w stanie dostarczyć duże napięcia, aby osiągnąć natężenie pola elektrycznego >1kV/cm11. Te wysokie napięcia powodują rezystancyjne rozpraszanie mocy przez bufor elektrolitu, co powoduje nagrzewanie się Joule'a, co może być szkodliwe dla wynikowej żywotności ogniwa12. Wreszcie, wykonywanie elektroporacji na gęstej zawiesinie komórek będzie konsekwentnie obarczone wrodzoną zmiennością wynikającej z tego wydajności elektrotransfekcji i żywotności komórek. Każda komórka w zawieszeniu może doświadczać innego natężenia pola elektrycznego ze względu na otaczające komórki. W zależności od tego, czy doświadczane natężenie pola elektrycznego jest zwiększane czy zmniejszane, wynikowa żywotność ogniwa lub wydajność elektrotransfekcji mogą być negatywnie naruszone11. Te wady elektroporacji w skali makro doprowadziły do poszukiwania i rozwoju alternatywnych technologii, które działają w skali mikro i pozwalają na lepszą kontrolę na poziomie pojedynczych ogniw.

Dziedzina BioMEMS, czyli biomedycznych systemów mikro-elektromechanicznych, wywodzi się z postępu technologicznego dokonanego w przemyśle mikroelektronicznym. W szczególności wykorzystanie procesów mikroprodukcji do opracowania mikrourządzeń w celu rozwoju badań biomedycznych. Postępy te obejmują opracowanie układów mikroelektrod do monitorowania elektrycznego in vivo13, pojemnościowe mikroelektrody do elektroporacji in situ14, zminiaturyzowane urządzenia organ-on-a-chip15, mikroprzepływowa diagnostyka przyłóżkowa16, biosensors17, oraz systemy dostarczania leków18, w tym nano- i Urządzenia do mikroelektroporacji19,20,21. Ze względu na możliwość projektowania i wytwarzania urządzeń w tej samej skali wielkości co ogniwa biologiczne, technologie nano- i mikroelektroporacji są korzystne w porównaniu z ich odpowiednikami w skali makro22,23. Te urządzenia do elektroporacji eliminują wymóg stosowania impulsów wysokiego napięcia, ponieważ zestawy elektrod o odstępach od 10 s do 100 s mikrometrów są zwykle zintegrowane. Ta cecha drastycznie zmniejsza prąd przepływający przez elektrolit, co z kolei zmniejsza gromadzenie się toksycznych produktów elektrolizy i skutki ogrzewania Joule'a w tych układach. Kanały w skali mikro zapewniają również, że znacznie bardziej jednorodne pole elektryczne jest niezawodnie doprowadzane do ogniw podczas aplikacji impulsów, co skutkuje bardziej spójnymi wynikami24. Ponadto powszechne jest również integrowanie urządzeń do mikroelektroporacji z platformą mikroprzepływową, która nadaje się do przyszłej integracji z w pełni zautomatyzowaną technologią, co jest bardzo pożądaną zdolnością w produkcji terapii komórkowej25. Wreszcie, elektroporacja w skali mikro pozwala na elektryczne badanie zdarzeń elektroporacji. Na przykład stopień przepuszczalności błony komórkowej może być monitorowany w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej komórki26,27. Celem tej metody jest opisanie mikrowytwarzania, działania systemu i analizy mikroprzepływowego, jednokomórkowego urządzenia do mikroelektroporacji, zdolnego do pomiaru stopnia przenikania błony komórkowej w celu optymalizacji protokołów elektroporacji, przy jednoczesnym zwiększeniu przepustowości w stosunku do poprzedniego stanu techniki.

Wykonywanie elektroporacji na poziomie pojedynczej komórki nie jest już nową techniką, jak to po raz pierwszy zademonstrowali Rubinsky et al. w 2001 roku wraz z rozwojem technologii elektroporacji komórek statycznych28. Opracowane przez nich mikrourządzenie było innowacyjne, ponieważ jako pierwsze zademonstrowano zdolność do elektrycznego monitorowania zdarzenia elektroporacji. Doprowadziło to do opracowania statycznych, jednoogniwowych technologii elektroporacji, zdolnych do elektrycznego wykrywania stopnia przenikania błony komórkowej w sposób równoległy w celu zwiększenia przepustowości urządzeń. Jednak nawet przy zrównoleglaniu i przetwarzaniu wsadowym urządzeniom tym bardzo brakuje całkowitej liczby komórek, które mogą przetworzyć w jednostce czasu29,30. To ograniczenie doprowadziło do opracowania urządzeń przepływowych zdolnych do wykonywania mikroelektroporacji na poziomie pojedynczego ogniwa przy znacznie większej przepustowości31. To przejście urządzenia, ze środowiska statycznego do przepływowego, ogranicza możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej po zastosowaniu impulsu elektroporacyjnego. Metoda opisana w tej pracy wypełnia lukę między tymi dwiema technologiami, technologią mikroelektroporacji zdolną do elektrycznego wykrywania, pulsowania i monitorowania stopnia przenikania błony komórkowej poszczególnych komórek w sposób ciągły, szeregowy.

Ta technologia została niedawno opisana w Zheng et al. W tej pracy możliwości tej technologii zostały przedstawione wraz z zakończeniem badania parametrycznego, w którym zarówno amplituda, jak i czas trwania impulsu elektroporacyjnego były zróżnicowane, a wynikający z tego sygnał elektryczny, wskazujący na przepuszczalność błony komórkowej, został zbadany32. Wyniki wykazały, że wzrost intensywności impulsu elektroporacyjnego (tj. wzrost przyłożonego pola elektrycznego lub wydłużenie czasu trwania impulsu) spowodował wzrost mierzonej przepuszczalności błony komórkowej. Aby dokładniej zweryfikować system, do zawiesiny ogniwa dodano powszechny fluorescencyjny wskaźnik udanej elektroporacji, jodek propidyny33, a obraz fluorescencyjny został zarejestrowany natychmiast po zastosowaniu impulsu elektrycznego. Sygnał optyczny, czyli intensywność fluorescencji jodku propidyny wewnątrz komórki, był silnie skorelowany z pomiarem elektrycznym stopnia przepuszczalności błony komórkowej, weryfikując wiarygodność tego pomiaru elektrycznego. Jednak praca ta dotyczyła tylko dostarczania małocząsteczkowego jodku propidyny, który ma niewielkie lub żadne znaczenie przekładalne.

W tej pracy wprowadzono nowe zastosowanie tej technologii w celu poprawy przepustowości systemu, dostarczając jednocześnie biologicznie aktywny wektor plazmidowego DNA (pDNA) i oceniając efektywność elektrotransfekcji komórek platerowanych i hodowanych po elektroporacji. Chociaż poprzednie prace przewyższają istniejące technologie mikroelektroporacji, które są w stanie elektrycznie mierzyć zdarzenie elektroporacji, obecny stan urządzenia nadal wymaga długich czasów przejścia ogniwa między zestawem elektrod (~250 ms) w celu wykrycia komórki, zastosowania impulsu i pomiaru przepuszczalności błony komórkowej. W przypadku pojedynczego kanału ogranicza to przepustowość do 4 komórek/s. Aby zwalczyć to ograniczenie, wprowadzono nową koncepcję elektroporacji sterowanej sprzężeniem zwrotnym w oparciu o populację komórek w celu przeprowadzenia elektrotransfekcji pDNA. Dzięki zastosowaniu hipofizjologicznego bufora elektroporacyjnego przewodności, system ten pozwala na elektryczne badanie pojedynczych komórek w wielu zastosowaniach impulsów elektroporacyjnych. Na podstawie odpowiedzi elektrycznej określa się następnie "optymalny" impuls elektroporacyjny. Następnie wdrażany jest tryb "wysokiej przepustowości", w którym oznaczanie przepuszczalności błony komórkowej jest neutralizowane, natężenie przepływu jest zwiększone, a cykl pracy impulsu elektroporacyjnego jest dopasowywany do czasu przejścia ogniwa, aby zapewnić jeden impuls na ogniwo w tranzycie między elektrodami. Prace te dostarczą obszernych informacji na temat etapów mikrofabrykacji do produkcji mikrourządzenia, materiału/sprzętu i ich konfiguracji wymaganej do przeprowadzenia eksperymentów, a także działania/analizy urządzenia i jego wydajności elektrotransfekcji (eTE).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Czynniki eksperymentalne wpływające na wyniki elektroporacji. (Po lewej) Zawieszenie komórek - Ważne czynniki, które należy wziąć pod uwagę przed rozpoczęciem elektroporacji, to: ładunek (w tym przypadku pDNA), stężenie, gęstość komórki i właściwości bufora elektroporacji. Właściwości bufora elektroporacyjnego, które należy wziąć pod uwagę, to przewodność, osmolarność i dokładny skład molekularny przyczyniający się do tych wartości. (Środek) Zastosowanie impulsu - Dokładny typ impulsu (fala prostokątna vs. rozpad wykładniczy) i kształt fali impulsowej (pojedynczy impuls vs. ciąg impulsów) muszą być zoptymalizowane, aby zmaksymalizować zarówno wynikową żywotność ogniwa, jak i wydajność elektrotransfekcji. Typowe ciągi impulsów stosowane w procesach elektroporacji składają się zwykle z serii impulsów wysokiego napięcia (HV) lub serii impulsów obracających się między wielkościami impulsów wysokiego napięcia i niskiego napięcia (LV). (Po prawej) Etapy przetwarzania Cell Recovery-Downstream, w szczególności pożywki do hodowli komórek, do których przenoszone są komórki, powinny być zoptymalizowane. Niewyróżnione (skrajnie po lewej), dodatkowe etapy przetwarzania ogniw przed elektroporacją mogą być zaimplementowane w celu ogólnej optymalizacji procesu elektroporacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Użytkownicy powinni przejrzeć wszystkie karty charakterystyki pod kątem materiałów i materiałów użytych w tym protokole. Na każdym etapie należy nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej, a podczas eksperymentów stosować sterylną technikę. Sekcje 1-7 omawiają produkcję urządzenia.

1. Produkcja urządzenia- Projekt maski

UWAGA: Patrz Rysunek 2 dla ilustracji procesu mikrofabrykacji. Etapy mikroprodukcji należy przeprowadzić w środowisku pomieszczenia czystego. Konieczne są dodatkowe środki ochrony osobistej (siatka na włosy, siatka na zarost, maska, kombinezon do pomieszczeń czystych, ochraniacze na buty).

  1. Zainstaluj wybrane oprogramowanie CAD, zaprojektuj dwuwymiarową "maskę" zarówno kanału mikroprzepływowego, jak i elektrod, a następnie zapisz projekt w żądanym formacie pliku (np. .dxf, .dwg).
    UWAGA: Patrz Rysunek Uzupełniający 1, aby zapoznać się z przykładem schematu maski 2-wymiarowej.
  2. Wyślij do wybranego dostawcy w celu wydrukowania. Upewnij się, że wymiary projektów mieszczą się w możliwościach rozdzielczości dostawcy.

2. Produkcja urządzeń- Fotolitografia

UWAGA: Dostarczone receptury mikrofabrykacji są zaczerpnięte z zaleceń producenta fotorezystorów i powinny być używane tylko jako punkt wyjścia34. Dokładne wartości czasów pieczenia, czasów ekspozycji itp. muszą być zoptymalizowane dla każdego protokołu produkcyjnego. Zaleca się używanie pęsety do płytek waflowych do przenoszenia zarówno wafli krzemowych, jak i szkiełek szkiełkowych.

  1. Wytwarzanie kanałów mikroprzepływowych
    1. Czyszczenie wafli krzemowych i szkiełek sodowo-wapniowych: Wykonaj kroki 2.1.2-2.1.3, aby wykonać czyszczenie wafli krzemowych i szkiełek sodowo-wapiennych 1" × 3" (oba określane jako "podłoże").
    2. Zanurzyć podłoża w kąpieli acetonowej, kąpieli izopropanolowej (IPA) i łaźni wodnej dejonizowanej na 10 minut każde. Wykonuj to 3-etapowe pranie szeregowo w temperaturze pokojowej.
    3. Usuń i osusz powierzchnię za pomocą źródła azotu pod ciśnieniem lub przefiltrowanego powietrza gazowego. Umieść podłoża w piekarniku o temperaturze 150 °C na co najmniej 30 minut, aby umożliwić odparowanie pozostałej wilgoci.
    4. Fotolitografia SU-8 na płytce krzemowej: Wykonaj fotolitografię na płytce krzemowej, wykonując czynności 2.1.5-2.1.14.
      UWAGA: Aby osiągnąć wysokość kanału mikroprzepływowego 20 μm, zastosowano fotorezystor ujemny serii SU-8 2000. Dokładne prędkości wirowania będą się różnić w zależności od składu SU-8 (tj. 2010, 2015 itd.); jednak następujące warunki dotyczą formuły SU-8 201035.
    5. Wyjmij wafel silikonowy z piekarnika o temperaturze 150 °C i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej (RT).
    6. Przymocuj wafel do uchwytu wirówki wafli za pomocą systemu próżniowego wirówki do powlekania. Zaprogramuj pokrętło. Stopień 1 - 500 obr/min przez 10 s przy przyspieszeniu 100 obr/s, Stopień 2 - 1000 obr/min przez 30 s przy przyspieszeniu 300 obr/s.
    7. Dozuj 4 ml fotorezystu SU-8 2010 na środek płytki krzemowej. Uruchom program. Gdy system się zatrzyma, wyłącz próżnię.
    8. Za pomocą pęsety przenieś wafel silikonowy pokryty SU-8 na płytę grzejną w temperaturze 95 °C na 4-5 minut, aby upiec go na miękko. Następnie wyjmij wafel z płyty grzejnej i pozwól mu ostygnąć do RT.
      UWAGA: Postępuj zgodnie z odpowiednią procedurą uruchamiania dla specyficznego dla laboratorium nakładki maski fotolitograficznej.
    9. Przymocuj fotomaskę za pomocą kanałów mikroprzepływowych 2D do uchwytu maski. Włóż płytkę silikonową z powłoką SU-8 skierowaną do góry na uchwyt wafla
      10. .
    10. Ustaw ekspozycję na 150 mJ/cm2 i uruchom urządzenie.
      UWAGA: Nie patrz bezpośrednio na źródło światła UV, aby uniknąć potencjalnego uszkodzenia oczu.
    11. Umieść wafel silikonowy pokryty SU-8 na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C na 4-5 minut w celu pieczenia po ekspozycji.
    12. Zanurz płytkę krzemową w roztworze wywoływacza SU-8 (patrz tabela materiałów) na 3-4 minuty. Zastosuj delikatne mieszanie. Wyjmij wafel z roztworu i spłucz powierzchnię alkoholem izopropylowym.
    13. Osusz powierzchnię za pomocą źródła azotu pod ciśnieniem lub przefiltrowanego powietrza gazowego. Sprawdź cechy pod mikroskopem za pomocą filtra UV i upewnij się, że nie ma widocznych wad w kanałach mikroprzepływowych.
    14. Umieść wafel silikonowy w piekarniku o temperaturze 150 °C na co najmniej 30 minut, aby upiec go na twardo.
    15. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury RT i użyć profilometrii rysika, aby zmierzyć dokładną wysokość i nachylenie ścianek bocznych kanału.
  2. Fotolitografia na szkiełkach szkiełkowych
    UWAGA: Heksametylodilazan (HMDS) jest używany jako promotor adhezji dla dodatniego fotorezystu S1818 klasy 36.
    1. Wyjmij szklane szkiełko z piekarnika o temperaturze 150 °C i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.
    2. Przymocuj szklaną szkiełko do uchwytu kołpaka za pomocą podciśnienia i zaprogramuj kołpak. Stopień 1 - 500 obr./min przez 10 s przy przyspieszeniu 100 obr./min/s. Krok 2 - 3000 obr./min dla 30 sat przyspieszenie 300 obr./min/s.
    3. Dozuj 3-4 kropelki HMDS na powierzchnię szkiełka podstawowego. Uruchom program.
      UWAGA: Aby uzyskać powłokę powierzchniową o grubości ~3 μm, należy zastosować dodatnie fotorezystu serii S1800. Dokładne prędkości wirowania będą się różnić w zależności od formuły; Poniższe zalecenia dotyczą formuły S181834.
    4. Naniec 1 ml fotorezystu na powierzchnię szkiełka podstawowego. Upewnij się, że wystarczająco, aby pokryć powierzchnię.
    5. Uruchom program. Gdy system się zatrzyma, wyłącz podciśnienie i wyjmij szklane szkiełko.
    6. Umieść szkiełko ze szkła powlekanego S1818 na płycie grzejnej w temperaturze 120 °C na 4 minuty, aby uzyskać miękkie pieczenie. Usuń i pozwól przyjść do RT.
    7. Przymocuj fotomaskę za pomocą wzorów elektrod 2D do uchwytu maski.
    8. Włóż i wyrównaj szkiełko szklane, z powłoką S1818 skierowaną do góry, do uchwytu waflowego. Ustaw ustawienia ekspozycji na 250 mJ/cm2 i uruchom urządzenie.
      UWAGA: Różne modele nakładek kontaktowych mogą być mniej lub bardziej przystosowane do nieokrągłych podłoży o różnej grubości.
    9. Zanurz szkiełko w roztworze wywoływacza MF-319 na 2 minuty. Delikatnie zamieszaj. Spłucz powierzchnię szkiełka szkiełkowego wodą dejonizowaną.
    10. Osusz powierzchnię za pomocą sprężonego źródła azotu lub przefiltrowanego powietrza gazowego i obserwuj cechy pod mikroskopem za pomocą filtra UV. Upewnij się, że we wzorach litograficznych nie ma widocznych wad.
    11. Umieść szklane szkiełko w piekarniku o temperaturze 150 °C, upewniając się, że powierzchnia podłoża jest skierowana do góry, na co najmniej 30 minut, aby piec na twardo. Wyjąć z piekarnika i chronić przed światłem.

3. Produkcja urządzenia: Wytrawianie kwasem fluorowodorowym (HF)

UWAGA: Ten krok obejmuje obchodzenie się i usuwanie kwasu fluorowodorowego (HF), który może spowodować głębokie, bolesne oparzenia chemiczne. W celu ochrony osoby prowadzącej należy stosować dodatkowe środki ochrony indywidualnej (osłona twarzy, rękawice chemoodporne do łokci, chemoodporny fartuch z rękawami). Neutralizator glukonianu wapnia i żel do skóry należy przechowywać w pobliżu stołu laboratoryjnego. Ten krok nie powinien być wykonywany samodzielnie. HF nigdy nie powinien być przechowywany ani dozowany do szklanych pojemników, ponieważ pojemnik zostanie wytrawiony przez kwas.

UWAGA: HF równomiernie wytrawia odsłonięte szkło (tj. konstrukcję elektrody), tworząc wgłębienie w szkle, co pozwala na lepszą rozdzielczość krawędzi wzoru elektrody po osadzeniu metalu (sekcja 4).

  1. Zanurz szkiełko w buforowanym roztworze HF w proporcji 10:1 na 1 minutę w pojemniku z politetrafluoroetylenu. Przenieś i umyj szkiełka w wodzie dejonizowanej. Powtórz krok prania 3 razy.
  2. Osusz powierzchnię za pomocą źródła azotu pod ciśnieniem lub przefiltrowanego powietrza gazowego. Umieść szklane podłoża w piekarniku o temperaturze 65 °C na noc, aby usunąć pozostałą wilgoć. Przykryj podłoża przed światłem.

4. Produkcja urządzenia: Fizyczne osadzanie z fazy gazowej

UWAGA: Ten krok polega na osadzaniu metalu na szklanych podłożach w celu zdefiniowania wzorów elektrod. Powszechnie stosowanymi elektrodami metalowymi są chrom/złoto i tytan/platyna. Złoto i platyna nie przylegają do podłoża szklanego, więc do zwiększenia przyczepności wymagana jest warstwa adhezyjna odpowiednio chromu lub tytanu, aby zwiększyć przyczepność37.

  1. Postępuj zgodnie z protokołem specyficznym dla pomieszczenia czystego, aby obsługiwać wewnętrzny system PVD. W tej pracy wykorzystuje się system napylania prądem stałym i napylanie gazem argonowym 100 SCCM pod ciśnieniem ~8 mTorr i mocą 200 W.
  2. Napylanie tytanu przez 8 minut z prędkością ~100 A/min. Napylanie platyny przez 10 minut z prędkością ~200 A/min. Usunąć podłoża z komory PVD.

5. Produkcja urządzenia: Fotoreflektor

UWAGA: Ten krok polega na rozpuszczeniu warstwy fotorezystu w kąpieli acetonowej, pozostawiając przylegające platynowe elektrody wzorowane na szkiełkach

podstawowych.
  1. Zanurz szkiełka szklane pokryte metalem w kąpieli acetonowej na ~10 min.
  2. Zanurz kąpiel w sonikacji, aby wprowadzić mieszanie w celu rozbicia nieprzylegającego filmu metalowego. W razie potrzeby użyj chusteczki nasączonej acetonem, aby usunąć wszelkie pozostałości.
  3. Po usunięciu całego fotorezystu/metalu umyj wzory elektrod wodą dejonizowaną i umieść je na noc w piekarniku o temperaturze 65 °C, aby usunąć pozostałą wilgoć z powierzchni.
  4. Użyj profilometrii trzpienia pomiarowego, aby zmierzyć profil elektrod z wzorem.

6. Produkcja urządzenia: Miękka litografia

UWAGA: Ten krok polega na uformowaniu repliki kanału mikroprzepływowego na głównej strukturze reliefowej SU-8 za pomocą elastomeru, polidimetylosiloksanu (PDMS).

  1. Silanizacja wafli krzemowych
    UWAGA: Jest to krok opcjonalny; Wydłuży to jednak żywotność konstrukcji odciążającej SU-8, która została wyprodukowana w podsekcji 2.1. Ten krok należy wykonać w dygestoriach chemicznych.
    1. Przymocuj wafel do dna szalki Petriego i umieść szalkę Petriego w eksykatorze.
    2. Otocz obwód płytki krzemowej około 50 μl trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanu. Podłącz próżnię (pompę próżniową lub domowy przewód próżniowy) i pracuj przez 20 minut.
  2. Formowanie replik PDMS
    1. W jednorazowym pojemniku (np. łódce wagowej, plastikowym kubku) wymieszaj bazę elastomerową PDMS z utwardzaczem w stosunku wagowym 10:1 na wadze elektronicznej. Wlej roztwór PDMS na płytkę krzemową i umieść mieszaninę w próżni, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
    2. Utwardzać w temperaturze 65 °C przez co najmniej 4 godziny, pozwalając PDMS na zestalenie się. Za pomocą końcówki żyletki wytnij uformowany PDMS i oderwij go od płytki silikonowej.
    3. Za pomocą zaostrzonego stempla do biopsji usuń PDMS z wlotu/wylotu urządzenia. W przypadku tego urządzenia zastosowano stemple biopsyjne 0,75 mm i 3 mm odpowiednio dla wlotów i wylotów.
      UWAGA: Zastosowany stempel do biopsji powinien mieć nieco mniejszą średnicę niż zewnętrzna średnica rurki łączącej, aby zapewnić szczelne uszczelnienie przewodów w zbiornikach.
  3. Czyszczenie sonikacyjne PDMS
    1. Zanurz urządzenia PDMS w IPA i umieść je w sonikatorze na 30-45 minut, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia PDMS z wlotu/wylotu. PDMS może pęcznieć w roztworze IPA.
    2. Spłucz wodą dejonizowaną i wstaw na noc do piekarnika o temperaturze 65 °C, aby PDMS opadł z powrotem do normalnego rozmiaru.
      UWAGA: Wszelkie resztki zanieczyszczeń mogą zatkać urządzenie podczas eksperymentowania. Duże kawałki zanieczyszczeń można usunąć z powierzchni PDMS za pomocą kawałka taśmy klejącej przed sonikacją.

7. Produkcja urządzenia: klejenie PDMS/mocowanie drutu

UWAGA: Ten krok polega na potraktowaniu powierzchni PDMS i szklanego podłoża plazmą tlenową w celu wytworzenia nieodwracalnego wiązania między PDMS a glass38. Dostarczona receptura może wymagać dostosowania do dokładnego systemu stosowanego w laboratorium.

  1. Przytnij urządzenia na wymiar i upewnij się, że powierzchnia urządzenia PDMS jest czysta. Jeśli nie zostanie ponownie wyczyszczony, wykonaj czynności opisane w podrozdziale 6.3.
  2. Zaprogramuj generator plazmy. Ustaw moc na 70 W, czas na 35 s, ciśnienie na 325 mTorr, natężenie przepływu tlenu gazowego na 60 SCCM. Umieść PDMS i szklaną elektrodę w systemie z funkcjami skierowanymi do góry i uruchom program.
  3. Usuń urządzenia i szybko dopasuj cechy kanałów do elektrod za pomocą stereoskopu. Mocno dociśnij od środka PDMS w kierunku boków, aby usunąć wszelkie niechciane pęcherzyki powietrza na styku.
  4. Umieścić w gorącym miejscu w temperaturze 95 °C na co najmniej 2 minuty, aby zakończyć procedurę klejenia i pozostawić urządzenie do ostygnięcia w temperaturze pokojowej.
  5. Wytnij 2 kawałki drutu litego 22-G o długości ~6 cali i zdejmij izolator z obu końców.
  6. Połącz przewody z elektrodami za pomocą przewodzącej żywicy epoksydowej ze srebra. Gotowe urządzenia należy umieścić na noc w piekarniku o temperaturze 65 °C.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Produkcja mikrourządzeń. (A) Wytwarzanie kanałów mikroprzepływowych - kluczowe kroki: czyszczenie wafli krzemowych (kroki 2.1.1-2.1.3), powlekanie fotorezystem i miękkie wypalanie (kroki 2.1.7-2.1.8), ekspozycja na promieniowanie UV (krok 2.1.10), rozwój (krok 2.1.12) i nalewanie PDMS (podsekcja 6.2). (B) Produkcja elektrod - kluczowe kroki: czyszczenie szkiełek szklanych (kroki 2.1.1-2.1.3), powlekanie HMDS i powlekanie fotorezystem (kroki 2.2.3-2.2.4), ekspozycja na promieniowanie UV (kroki 2.2.8), rozwój (krok 2.2.9), trawienie HF (sekcja 3), fizyczne osadzanie z fazy gazowej (sekcja 4) i usuwanie fotorezystu (sekcja 5). (C) Finalizacja urządzenia - kluczowe kroki: dostęp do wlotu/wylotu i sonikacja (krok 6.2.3 i sekcja 6.3), klejenie PDMS i mocowanie drutu (sekcja 7). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Hodowla komórkowa i zbiór

UWAGA: Należy stosować standardowe procedury hodowli komórkowych i sterylnego obchodzenia się. Postępuj zgodnie z protokołem specyficznym dla typu komórki dla hodowli komórkowej.

  1. Hodowla komórkowa
    1. Pasaż komórkowy: Hodowla i pasaż komórek zgodnie z krokami 8.1.2-8.1.5.
    2. Hodowla komórek HEK293 w kompletnym roztworze DMEM (88% DMEM, 10% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca, 1% L-glutamina, 1% penicylina-streptomycyna) w kolbie T25 w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 95% O2, 5% CO2. Komórki pasażowe zgodnie z harmonogramem po osiągnięciu ~80% konfluencji.
    3. Odessać pożywkę za pomocą pipety lub systemu próżniowego i inkubować komórki w 0,25% trypsyny-EDTA (kolba 2 ml-T25) przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Zneutralizować trypsynę dwukrotnie większą objętością pożywki hodowlanej.
    4. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować komórki HEK293 przy 770 x g przez 2 minuty. Odessać supernatant za pomocą pipety lub systemu próżniowego
    5. Ponownie zawieś komórki HEK293 w 1 ml wstępnie podgrzanego DMEM.
    6. Posiewanie komórek: Pokryj komórki płytkami, wykonując czynności 8.1.7-8.1.8
    7. Umieścić komórki w rozcieńczeniu 10:1 do 20:1 w kolbie T25 (5 ml DMEM) w celu kontynuowania hodowli.
    8. Umieść komórki w rozcieńczeniu 5:1 do 20:1 na płytce 6-dołkowej (2 ml DMEM na studzienkę), które zostaną zebrane do eksperymentów elektroporacyjnych.
      UWAGA: Ogniwa HEK293 platerowane 24 godziny przed eksperymentami elektroporacji, aby osiągnąć ~70% konfluencji podczas zbierania komórek (podsekcja 8.3). Niespójny harmonogram zbiorów może prowadzić do zmienności wyników elektroporacji.
  2. Bufor do elektroporacji
    1. Przygotować bufor do elektroporacji
      UWAGA: Zapoznaj się z Sherba et al., aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania buforu do elektroporacji8. Skład buforowy wynosił 285 mM sacharozy, 0,7 mM MgCl2, 1 mM KCl, 10 mM HEPES, 3 mM NaOH (pH: 7,4; osmolalność: 310 mOsm, przewodność: 500 μS/cm). Bufor do elektroporacji powinien być sporządzony w sterylny sposób i przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres przydatności do spożycia ~1 miesiąc. Formuła buforu do elektroporacji powinna być zoptymalizowana dla każdego typu ogniwa.
  3. Pobieranie komórek i dodawanie pDNA
    1. Wykonaj te same czynności, co przejście komórki (8.1.2-8.1.4).
    2. Umyj komórki w sterylnym 1x PBS, zawiesinie komórek transferowych do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj komórki przy 770 x g przez 2 min.
    3. Przemyć osad komórek HEK293 w buforze do elektroporacji i odwirować przy 770 x g przez 2 min. Ponownie zawiesić komórki w buforze do elektroporacji przy ~5 milionach komórek/ml.
      UWAGA: Gęstość komórek powinna być zoptymalizowana dla każdego typu komórki.
    4. Dodać kodowanie pDNA dla białka zielonej fluorescencji (GFP) do końcowego stężenia 20 μg/ml. Delikatnie wymieszaj zawiesinę pDNA/komórki i przenieś zawiesinę do strzykawki o pojemności 1 cm3 w celu eksperymentowania.

9. Sprzęt/konfiguracja eksperymentalna

UWAGA: Przed pobraniem komórek do eksperymentów, upewnij się, że konfiguracja eksperymentalna została zakończona, aby zminimalizować ilość czasu zawieszenia komórek w buforze elektroporacyjnym. Włącz elektronikę 20-30 minut przed eksperymentami, aby się rozgrzać. Zapoznaj się z Rysunek 3, aby zapoznać się ze schematem eksperymentalnej konfiguracji działania modułu wykrywania pojedynczej komórki.

UWAGA: Specjalnie zbudowany obwód wzmacniacza operacyjnego PA90 został opracowany, aby dostosować zarówno czułość wymaganą do wykrywania poziomu pojedynczej komórki za pomocą wzmacniacza lock-in, jak i wysokie napięcia wymagane do zastosowania wystarczająco silnych impulsów elektroporacyjnych. Zapoznaj się z arkuszem danych PA90, aby zapoznać się ze specyfikacjami zalecanych obwodów39.

  1. Zainicjuj wzmacniacz lock-in z aktualnymi ustawieniami przedwzmacniacza i ustaw za pomocą algorytmu. Zapoznaj się z Zheng et al., aby uzyskać szczegółowe informacje na temat ustawień blokady32.
  2. Zasilacze, generator funkcyjny i wzmacniacz
    1. Zasilanie 1: Ustaw na -15 V, aby zasilić ujemny koniec obwodu.
    2. Zasilanie 2 (generator funkcyjny): Ustaw na wyjście sygnału DC i ustaw amplitudę na 2 V. Podłącz do 50x amplifier wejście wejściowe.
    3. Zaprogramuj generator impulsów elektroporacyjnych dla fali prostokątnej: Ustaw żądaną szerokość impulsu (cykl pracy) i żądaną amplitudę impulsu (wolty).
    4. Ustaw wyjście w tryb wyzwalania (1 impuls). Podłącz wyjście do wejścia 50x amplifier.
      UWAGA: Pamiętaj o 50-krotnym wzmocnieniu podczas programowania amplitudy impulsu. Oznacza to, że aby osiągnąć natężenie pola elektrycznego 1 kV/cm, wymagane jest łącznie 30 V, 30 V/300 μm (odległość między elektrodami), dlatego wyjście generatora funkcyjnego powinno być ustawione na 30/50 lub 600 mV.
    5. Sprawdź wyjścia 50x Amplifier za pomocą oscyloskopu. Wyjście 1-100 V z zasilacza 2 (9.2.2). Wyjście 2 - Zmienna amplituda dla impulsu elektroporacyjnego (9.2.4).
    6. Podłącz sondę 10x do kanału oscyloskopu i do gotowego mikrourządzenia (testowanego urządzenia, DUT) w kroku 7.6, w którym ma zostać zastosowany impuls elektroporacyjny. Monitoruj system podczas eksperymentowania, aby upewnić się, że stosowane są impulsy.
    7. Upewnij się, że USB typu lock-in jest podłączony i zarejestrowany. Dokładnie sprawdź wszystkie ustawienia blokady w kodzie algorytmu (przede wszystkim, częstotliwość wyjściowa blokady).
  3. Mikroskop/kamera CCD
    1. Umieść mikrourządzenie na stoliku mikroskopu za pomocą uchwytu na szkiełko. Włącz kamerę CCD i ustaw ostrość na kanale mikroprzepływowym. Użyj obiektywu 4x lub 10x.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Schemat konfiguracji eksperymentalnej - Wykrywanie pojedynczej komórki. Wzmacniacz operacyjny dużej mocy (PA-90) pozwala na superpozycję impulsu elektroporacyjnego wysokiego napięcia na sygnał wyjściowy AC z blokadą, który jest wymagany do detekcji pojedynczej komórki. Ten sygnał wzbudzenia przechodzi przez urządzenie do mikroelektroporacji (Device Under Test, DUT), gdzie prąd jest następnie wzmacniany przez przedwzmacniacz prądowy i wprowadzany do algorytmu. System w sposób ciągły monitoruje zdarzenie wykrycia komórki. Po wejściu do ogniwa wzmacniacz typu lock-in generuje sygnał cyfrowy, który wyzwala zastosowanie impulsu elektroporacyjnego do ogniwa (ogniw) w tranzycie. Legenda: PA-90 (wzmacniacz operacyjny dużej mocy), DUT (urządzenie w trakcie testowania), DIO (wejście/wyjście cyfrowe), FG-EP (generator funkcyjny / impuls elektroporacyjny), 50X (wzmacniacz 50X), PS-V- (zasilacz / napięcie ujemne dla PA 90), FG-V+ (generator funkcyjny, napięcie dodatnie dla PA 90). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

10. Operacja eksperymentalna

  1. Gruntowanie kanałów mikroprzepływowych
    1. Usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki z komórką. Podłączyć igłę 30 G do strzykawki z komórkami.
    2. Za pomocą pęsety przesuń rurkę tygon wzdłuż igły. Wstępnie napełnij zbiornik wylotowy pożywką regeneracyjną (tak samo jak w kroku 8.1.2 bez antybiotyków), ~40-50 μL.
    3. Za pomocą kciuka delikatnie dociśnij tłok tak, aby płyn powoli dotarł do końca przewodu rurowego.
    4. Przymocować strzykawkę do pompy strzykawkowej. Włączyć pompę strzykawkową i upewnić się, że jest ustawiona na perfuzję do przodu.
    5. Zaprogramuj pompę na odpowiednią średnicę strzykawki, aby zapewnić dokładne natężenie przepływu. Szczegółowe informacje na temat średnic strzykawek można znaleźć w instrukcji obsługi pompy.
      UWAGA: Aby zapobiec osadzaniu się komórek w strzykawce, należy zabezpieczyć pompę strzykawkową na clamp stojak tak, aby mogła pracować w pozycji pionowej z końcem strzykawki skierowanym w dół.
    6. Ustaw natężenie przepływu pompy strzykawki, ~10-20 μL/min i pozwól pompie pracować, aż płyn dotrze do końca przewodu rurowego. Przymocuj rurkę do urządzenia mikroprzepływowego.
    7. Zmniejsz natężenie przepływu pompy strzykawki, ~5-10 μL/min i pozwól pompie pracować, aż całe powietrze zostanie usunięte z urządzenia mikroprzepływowego, a komórki będą przechodzić do wylotu urządzenia.
    8. Usuń komórki z wylotu za pomocą aspiracji pipetą. Ponownie napełnij zbiornik wylotowy pożywką regeneracyjną (tak samo jak w kroku 8.1.2 bez antybiotyków), ~40-50 μL.
  2. Mapowanie przenikania przez membranę komórkową do elektroporacji pojedynczej komórki
    UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 4 i Rysunek 5, aby lepiej zrozumieć dane elektryczne wskazujące odpowiednio na przenikanie błony komórkowej i mapowanie przenikania błony komórkowej.
    1. Ustaw natężenie przepływu pompy strzykawkowej na ~0,1-0,3 μL/min, aby zapewnić przepływ pojedynczych ogniw przez zestaw elektrod. Czas przejścia ogniwa między elektrodami powinien wynosić ~250 ms.
    2. Uruchom program komputerowy, klikając Uruchom. Upewnij się, że system zapisuje dane elektryczne.
    3. Upewnij się, że system niezawodnie wykrywa komórki, aby uruchomić sterowane komputerowo aplikacje impulsowe. Dostosuj odpowiednio próg wykrywania.
    4. Ustaw parametry impulsu dla początkowego, najniższego impulsu elektroporacyjnego o najniższej energii elektrycznej. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z parametrami pulsacji elektroporacji w tym badaniu.
    5. Włącz kanał wyjściowy generatora impulsów elektroporacyjnych (krok 9.2.3.).
    6. Postępuj zgodnie z wcześniej ustaloną liczbą aplikacji detekcji/impulsów komórek (n = 100). Pod koniec każdego badanego stanu odessać komórki z wylotu mikrourządzenia i uzupełnić wylot pożywką regeneracyjną.
    7. Iteruj do następnego warunku impulsu elektroporacji. Powtarzaj, aż wszystkie warunki impulsu elektroporacyjnego zostaną przetestowane.
    8. Określ stopień przepuszczalności błony komórkowej dla każdej testowanej aplikacji impulsowej. (Walidacja po zakończeniu procesu jest opisana w podsekcji 11.1). Wygeneruj mapę przepuszczalności błony komórkowej ( Rysunek 5).
    9. Określ parametry impulsu elektroporacyjnego dla wysokoprzepustowego, populacyjnego sprzężenia zwrotnego.
    10. Wyłączyć pompę strzykawkową, usunąć ogniwa ze zbiornika wylotowego i uzupełnić wylot środkiem odzyskiwania.
  3. Elektroporacja sterowana populacyjnie ze sprzężeniem zwrotnym o wysokiej przepustowości
    UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 6, aby zapoznać się ze schematem ilustrującym proces informacji zwrotnej opartej na populacji.
    1. Ustaw natężenie przepływu pompy strzykawkowej na ~1-3 μL/min, aby zapewnić przepływ pojedynczych ogniw przez zestaw elektrod. Czas przejścia ogniwa między elektrodami powinien wynosić ~25 ms.
    2. Ustaw amplitudę impulsu na stan "zoptymalizowany" (10.2.9), wyłącz tryb wyzwalania i ustaw szerokość impulsu tak, aby odpowiadała czasowi przejścia komórki.
    3. Ustaw cykl pracy tak, aby czas włączenia impulsu odpowiadał warunkom "zoptymalizowanym". Patrz Tabela 1.
    4. Ustaw generator funkcyjny kanału wyjściowego na ON, włącz pompę strzykawkową i pozwól systemowi działać, aż żądana liczba ogniw zostanie elektroporowana.
    5. Po zakończeniu wyłącz zarówno pompę strzykawkową, jak i generator funkcyjny.
    6. Przenieść komórki ze zbiornika wylotowego do kolby/płytki do hodowli komórkowych o odpowiedniej wielkości, wypełnionej wstępnie podgrzaną pożywką do odzysku i przenieść kolbę/płytkę do hodowli do inkubatora.

11. Analiza

  1. Wykrywanie przenikania błony na poziomie pojedynczej komórki
    UWAGA: Aby upewnić się, że "optymalny" impuls został wykorzystany podczas modułu o wysokiej przepustowości, należy przeprowadzić analizę poeksperymentalną w celu zweryfikowania danych elektrycznych wyeksportowanych z podsekcji 10.2. Proszę zapoznać się z Rysunek 4 dla graficznej reprezentacji sygnału elektrycznego reprezentatywnego dla przepuszczalności membrany spowodowanej elektroporacją.
    1. Załaduj dane do oprogramowania analitycznego (MATLAB, Python itp.). Wygeneruj wykres prądu w funkcji czasu dla każdego stanu pulsacji.
    2. Ręcznie określ stopień przepuszczalności błony komórkowej (ΔIP/ΔIC). Zapoznaj się z Rysunek 4. Wygeneruj mapę przepuszczalności błony komórkowej (ΔIP / ΔIC w funkcji energii elektrycznej, rysunek 5) we wszystkich testowanych warunkach impulsu. Sprawdź "optymalne" warunki pulsacji.
  2. Sprawność elektrotransfekcji (eTE)
    1. Po 24-godzinnym okresie inkubacji należy wyjąć elektroporowane ogniwa z inkubatora.
    2. Wykonaj barwienie żywych komórek. Rozcieńczyć DRAQ5 w stosunku 1:1000 do końcowego stężenia 5 μM w naczyniu do hodowli komórkowej. Delikatnie wymieszać komórki/roztwór barwiący i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-30 min.
      UWAGA: Na tym etapie można zastosować inną plamę. Upewnij się, że właściwości fluorescencyjne nie pokrywają się ze znacznikiem fluorescencyjnym wskazującym na udaną elektrotransfekcję (tj. GFP jest w zielonej długości fali, a DRAQ5 jest daleko czerwony).
    3. Włącz mikroskop epifluorescencyjny, lampę i kamery (patrz Tabela materiałów).
    4. Wyjmij komórki z inkubatora i ustaw je ostrość pod mikroskopem.
    5. Przechwyć obraz z kontrastem fazowym (jasne pole) wybranego pola.
    6. Przechwytuj obrazy epifluorescencyjne tego samego pola za pomocą filtrów FITC (GFP) i Far-Red (DRAQ5). Analizuj zestawy obrazów ręcznie lub za pomocą algorytmu.
      UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 7, aby zapoznać się z reprezentatywnymi obrazami.
    7. Policz całkowitą liczbę komórek GFP-dodatnich na wszystkich obrazach. Policz całkowitą liczbę komórek barwionych DRAQ5 na wszystkich obrazach. Obliczać eTE (stosunek komórek dodatnich GFP do komórek barwionych DRAQ5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 4 przedstawia zasady działania stojące za wykrywaniem przepuszczalności błony na poziomie pojedynczej komórki dla pojedynczej amplitudy impulsu. Po rozpoczęciu eksperymentu z elektroporacją algorytm wykrywania komórek określa optymalny próg wykrywania komórek za pomocą metody wykrywania punkt po punkcie, opartej na nachyleniu. Następnie system w sposób ciągły monitoruje (1) pod kątem znaczącej ujemnej zmiany mierzonego prądu elektrycznego, która wskazuje na wejście ogniwa. Wynika to ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodologia przedstawiona w tym protokole koncentruje się przede wszystkim na mikrowytwarzaniu urządzenia mikroprzepływowego, które jest następnie integrowane ze specjalistycznym układem eksperymentalnym do elektroporacji. Termin "receptura", który jest często używany do opisywania specyfiki procesu mikrowytwarzania, wskazuje na znaczenie przestrzegania/optymalizacji każdego kroku w celu pomyślnego wytworzenia działającego urządzenia. Jednak niektóre krytyczne etapy procesu, jeśli nie są zoptymalizowane, takie jak czas/e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Fundacji Nauki (NSF, CBET 0967598, DBI, IDBR 1353918) oraz U.S. Department of Education's Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) za sfinansowanie stypendium dla doktoranta J.J.S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalki Petriego o średnicy 150 mmVWR25384-326krok 6.1.1 do zabezpieczania
24-dołkowych płytek do hodowli tkankowychwafli VWR10062-896krok 10.3.6 do płytki ogniw elektroporowanych
33220A Generator przebiegów/funkcjiAgilentkrok 9.2.3 generator impulsów elektroporacyjnych
4'' wafle krzemoweWafeluniwersyteckiPodsekcja 2.1 dotycząca wytwarzania kanałów mikroprzepływowych
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychVWR10062-892krok 8.1.8 do płytki komórek
AcetonFisher ScientificA18-4krok 2.1.2 do czyszczenia i  krok 5.1 Photoresist lift-off
Wirówka Allegra X-22RBeckman Coulterkroki 8.1.4 , 8.3.2. i 8.3.3. do obracania komórek
AutoCAD 2018Autodeskpodsekcja 1.1. do projektowania masek przezroczystości
Buforowany wytrawiacz tlenkowy 10:1VWR901621-1Lpodsekcja 3.1 do trawienia HF
CCD Monochromatyczna kamera mikroskopowaHamamatsuOrca 285 C4742-96-12G04krok 11.2.3. do obrazowania
kamery CMOS - Sensicam QE 1.4MPPCOpodsekcja 9.3 część konfiguracji eksperymentalnej
Przewodząca żywica epoksydowaCircuitWorksCW2400podrozdział 7.6. do mocowania
drutu Stożkowe probówki wirówkowe, 15 mlFisher Scientific14-959-70Ckrok 8.1.4. do wirowania komórek
Profilometr powierzchniowy Dektak 3STVeeco (Sloan/Dektak)krok 2.1.15 i 5.4 do profilometrii powierzchni
Jednorazowy dziurkacz do biopsji, 0,75 mmRobbins InstrumentsRBP075krok 6.2.3 dla dostępu do wlotu
Jednorazowy dziurkacz do biopsji, 3 mmRobbins InstrumentsRBP30Pkrok 6.2.3 dla dostępu do ujścia
DRAQ5abcamab108410krok 11.2.2. do barwienia żywych komórek
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s MediumThermoFisher Scientific 11885084krok 8.1.2. część składu mediów
E3631A Bipolarny zasilacz Triple DCAgilentkrok 9.2.1.-9.2.2.część zestawu eksperymentalnego
Eclipse TE2000-U Odwrócony  MikroskopNikon  podsekcja 9.3. część eksperymentalnej konfiguracji
EVG620 UV Lithium SystemEVG  Krok 2.1.9. oraz 2.2.7. do ekspozycji na promieniowanie UV
Płodowa surowica bydlęcaNeuromicsFBS001krok 8.1.2. część kompozycji pożywki
Myjka ultradźwiękowa FS20Fisher Scientificpodrozdział 5.1. do podnoszenia fotorezystu
Szklana butelka z nakrętką, 100 mlFisher ScientificFB800100krok 8.2.1. do przechowywania buforowego
Szklana butelka z nakrętką, 500 mlFisher ScientificFB800500kroku 8.1.2. do przechowywania nośników
Linia komórkowa HEK-293ATCCCRL-1573podsekcja 8.1 dla roztworu
buforowego HEPESSigma Aldrich83264-100ML-Fkrok 8.2.1 część kompozycji buforu elektroporacyjnego
HeksametyldisilazanSigma Aldrich379212-25MLkrok 2.2.3 promotor przyczepności
HF2LI Wzmacniacz blokującyZurych Przyrządypodrozdział 9.2 część konfiguracji eksperymentalnej
Wzmacniacz prądowy HF2TAZurich Instrumentspodsekcja 9.2 część zestawu eksperymentalnego
Alkohol izopropylowyFisher ScientificA459-1krok 2.1.2 do czyszczenia, krok 2.1.14 do płukania płytki po wywołaniu SU-8 i krok 6.3.1 do czyszczenia mikroskopu
fluorescencyjnego PDMS IX81Olympuskrok 11.2.3 do obrazowania
roztworu L-glutaminySigma AldrichG7513-20MLkrok 8.1.2. część składu pożywki
Drut o średnicy 22 M16878 / 1BFAAWCB22-1podsekcja 7.5 do produkcji urządzeń
Chlorek magnezuSigma Aldrich208337-100GKrok 8.1.2 część składu bufora do elektroporacji
MF 319 DeweloperKayaku Advanced Materials10018042kroku 2.2.9. wywoływacz fotorezystu
Microposit S1818 fotorezystorKayaku Advanced Materials1136925Krok 2.2.4 dodatni fotorezystor do modelowania elektrod
Szkiełka mikroskopowe, 75 x 25 mmVWR16004-422krok 2.2.1 elektroda podłoże ze szkła sodowo-wapiennego
Model 2350 Wzmacniacz wysokiego napięciaTEGAM2350krok 9.2.5. Część układu eksperymentalnego
National Instruments LabVIEWdo akwizycji danychNational Instruments
, 30G x 1 wBD Scientific305128Krok 10.1.1. Część systemu Zalewanie
PA90 IC OPAMP Obwód zasilaniaDigi-key598-1330-NDCzęść niestandardowego obwodu
Penicylina-StreptomycynaSigma AldrichP4458-20MLKrok 8.1.2. Część kompozycji podłoża
Plazmid pMAX-GFPLonzaVCA-1003krok 8.3.4. do dostarczania wewnątrzkomórkowego
Rurka plastikowa, 0,010'' x 0,030"VWR89404-300krok 10.1.2. do gruntowania systemu
Cele platynoweKurt J. Leskerpodrozdział 4.2. do fizycznego osadzania z fazy gazowej
Chlorek potasuSigma AldrichP9333-500Gkrok 8.2.1. część kompozycji buforowej do elektroporacji
Pompa 11 Mikroprzepływowa pompa strzykawkowa PicoPlusAparaturaHarvarda MA1 70-2213krok 10.1.4. do zalewania systemu
PVD75 System fizycznego osadzania z fazy gazowejKurt J. Leskerpodrozdział 4.1. do fizycznego osadzania z fazy gazowej
PWM32 Spinner SystemHeadway2.1.6 i 2.2.2. do powlekania podłoża fotorezystem
PX-250 System obróbki plazmowejMarch Instrumentspodrozdział 7.2 do klejenia PDMS i podłoża szklanego
SDG1025 Generator funkcji/przebiegówSiglentkrok 9.2.2. część układu doświadczalnego
Wodorotlenek soduSigma AldrichS8045-500GKrok 8.2.1. Część składu buforu elektroporacyjnego
SU-8 2010 ujemny fotorezystorKayaku Advanced MaterialsY111053kroku 2.1.7. do tworzenia wzorców kanałów mikroprzepływowych
SU-8 DeveloperMicrochemY010200kroku 2.1.12. do wywoływania fotorezystu
SacharozaSigma AldrichS7903-1KGkrok 8.2.1. część kompozycji buforu elektroporacyjnego
Zestaw elastomerów Sylgard 184Dow Corning3097358-1004krok 6.2.1  10 : 1 mieszanina polimeru PDMS i utwardzacza
Strzykawka, 1 ml Strzykawka309628 BD Scientifickrok 8.3.4. Część systemu zalewania
System stereomikroskopu SZ61Olympuspodrozdział 7.3. do wyrównania kanałów i elektrod
Kolby T25 poddane działaniu kultur tkankowychFalcon353108etap 8.1.2 dla hodowli komórek
Tarcze tytanoweKurt J. Leskerpodrozdział 4.2. do fizycznego osadzania z fazy gazowej
Maski przezroczystościCAD/ARTkroki 2.1.9. i 2.2.7. dla fotolitografii
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanSigma Aldrich448931-10Gkrok 6.1.2. do silanizacji wafli
Roztwór trypsyny-EDTASigma AldrichT4049-100MLkroki 8.1.3. i 8.3.1. do pobierania komórek
do hodowli komórkowych Igła Etapy badań Usługi

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, Q. Q., et al. Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy. Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).
  2. Aijaz, A., et al. Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).
  3. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).
  4. Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41 (2), 135-160 (1996).
  5. Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models. Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).
  6. Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. Gene electrotransfer: A mechanistic perspective. Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).
  7. Clauss, J., et al. Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors. Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).
  8. Sherba, J. J., et al. The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency. Scientific Reports. 10 (1), 3053(2020).
  9. Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. A microfluidic electroporation device for cell lysis. Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).
  10. Kar, S., et al. Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects. Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).
  11. Shi, J. F., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  12. Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells. Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).
  13. Wei, W. J., et al. An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo. Microsystems & Nanoengineering. 1, (2015).
  14. Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
  15. Wu, Q. R., et al. Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects. Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).
  16. Pandey, C. M., et al. Microfluidics Based Point-of-Care Diagnostics. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
  17. Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).
  18. Nuxoll, E. BioMEMS in drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1611-1625 (2013).
  19. Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode. Scientific Reports. 5, (2015).
  20. Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).
  21. Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G. Nano-localized single-cell nano-electroporation. Lab on a Chip. 20 (22), 4194-4204 (2020).
  22. Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).
  23. Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation. Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).
  24. Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).
  25. Hsi, P., et al. Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing. Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).
  26. Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control. Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).
  27. Ye, Y. F., et al. Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip. 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).
  28. Huang, Y., Rubinsky, B. Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization. Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).
  29. Guo, X. L., Zhu, R. Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array. Scientific Reports. 6, (2016).
  30. Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation. Scientific Reports. 9, (2019).
  31. Wang, H. Y., Lu, C. Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply. Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).
  32. Zheng, M. D., et al. Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation. Technology. 5 (1), 31-41 (2017).
  33. Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. In vitro electroporation detection methods - An overview. Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).
  34. MICROPOSIT™ S1800® G2 Series Photoresists. KAYAKU. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf (2021).
  35. SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf (2001).
  36. Substrate Preparation. MicroChemicals. , Available from: https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf (2021).
  37. Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. 4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture. , Elsevier. 91-94 (2006).
  38. Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules. Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).
  39. PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX. , Available from: https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf (2021).
  40. Lissandrello, C. A., et al. High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing. Scientific Reports. 10 (1), 18045(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Continuous Flow ElectroporationCell Membrane PermeabilizationMicrofluidic Device FabricationElectroporation Pulse OptimizationPopulation Based FeedbackSingle Cell ElectroporationGene Delivery SystemHEK293 CellsDNA Plasmid Delivery

Powiązane artykuły