Artykuł metodologiczny

Obrazowanie 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63106

⸱

25 lutego 2022

 ,  ,  , 
1Gastroenterology and Hepatology, Stanford University

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół optymalizuje metody perfuzji/decelularyzacji wątroby in situ i mikroskopii dwufotonowej w celu stworzenia niezawodnej platformy do wizualizacji dynamiki przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) podczas niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH).

Streszczenie

Niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH) jest najczęstszą przewlekłą chorobą wątroby w Stanach Zjednoczonych, dotykającą ponad 70 milionów Amerykanów. NASH może prowadzić do zwłóknienia, a ostatecznie do marskości wątroby, istotnego czynnika ryzyka raka wątrobowokomórkowego. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) zapewnia wsparcie strukturalne i utrzymuje homeostazę wątroby poprzez sygnały matrikomórkowe. Zwłóknienie wątroby wynika z braku równowagi w dynamicznym procesie przebudowy ECM i charakteryzuje się nadmiernym nagromadzeniem elementów strukturalnych i związanymi z tym zmianami w glikozaminoglikanach. Typowy wzór zwłóknienia NASH nazywa się "drutem kurzym", który zwykle składa się ze zwłóknienia okołosinusoidalnego/okołokomórkowego strefy 3, w oparciu o cechy obserwowane przez plamę trichromową Massona i plamy Picrosirius Red. Jednak te tradycyjne, cienkie, dwuwymiarowe (2D) techniki obrazowania tkanek oparte na szkiełkach nie mogą wykazać szczegółowych trójwymiarowych (3D) zmian strukturalnych ECM, co ogranicza zrozumienie dynamicznej przebudowy ECM w zwłóknieniu wątroby.

Obecne prace optymalizują szybki i wydajny protokół do obrazowania natywnej struktury ECM w wątrobie poprzez decelularyzację, aby sprostać powyższym wyzwaniom. Myszy były karmione dietą karmową lub fast-food przez 14 tygodni. Decelularyzację przeprowadzono po perfuzji żyły wrotnej in situ, a techniki mikroskopii dwufotonowej zastosowano do obrazowania i analizy zmian w natywnym ECM. Obrazy 3D prawidłowej wątroby i NASH zostały odtworzone i przeanalizowane. Przeprowadzenie decelularyzacji perfuzyjnej in situ i analiza rusztowania za pomocą mikroskopii dwufotonowej zapewniły praktyczną i niezawodną platformę do wizualizacji dynamicznej przebudowy ECM w wątrobie.

Wprowadzenie

Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) jest najczęstszą chorobą wątroby, dotykającą 20%-25% dorosłej populacji. 25% pacjentów z NAFLD przechodzi w niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH), gdzie wzrasta ryzyko marskości wątroby, niewydolności wątroby i raka wątrobowokomórkowego1. Szacuje się, że w ciągu najbliższych 20 lat NASH będzie odpowiadać za 2 miliony zgonów związanych z wątrobą w U.S2. Ponieważ nie ma zatwierdzonych metod leczenia, istnieje pilna potrzeba rozszyfrowania mechanizmów, które powodują zwłóknienie wątroby u pacjentów z NASH i opracowania ukierunkowanego leczenia3.

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) to dynamiczne, złożone mikrośrodowisko, które wywiera dwukierunkową komunikację z komórkami w celu regulacji homeostazy tkanek4. ECM wątroby składa się z elementów strukturalnych, takich jak proteoglikany, kolageny, fibronektyna, elastyna i inne białka niestrukturalne (np. olfaktomedyna i trombospondyna), aby zapewnić fizyczne i strukturalne wsparcie4.

Zwłóknienie wątroby to przewlekła reakcja gojenia ran na uszkodzenie wątroby o różnej etiologii, w tym NASH3. Wynika to z braku równowagi w dynamicznym procesie przebudowy macierzy ECM i charakteryzuje się nadmiarem białek strukturalnych w uszkodzonej wątrobie4. Fibrogeneza zależy od dynamicznej komunikacji komórka-komórka między różnymi typami komórek wątroby. Komórki gwiaździste wątroby (HSC), po aktywacji, różnicują się w komórki podobne do miofibroblastów alfa 2 alfa 2 mięśni gładkich i syntetyzują białka ECM jako działanie zamykające rany. Aktywowane HSC są centralnymi komórkami produkującymi kolagen w klasie liver1.

Molekularny mechanizm przebudowy ECM, wzorce zwłóknienia i ich związek ze zdarzeniami komórkowymi nie są jasne. Nadal potrzebne jest lepsze zrozumienie trójwymiarowej (3D) struktury ECM, mimo że techniki spektrometrii mas pomogły w analizie składu białek ECM4. Tradycyjnie, barwienie trichromowe Massona, barwienie czerwienią Picro Sirius i obrazowanie drugiej generacji harmonicznej (SHG) przeprowadzono na dwuwymiarowych (2D) cienkich skrawkach wątroby. Typowy wzorzec zwłóknienia NASH nazywa się "drutem z kurczaka", który rozciąga się do strefy 3 i jest zwłóknieniem okołosinusoidalnym/okołokomórkowym5,6. Brakowało jednak badań skupiających się na strukturze 3D natywnej wątroby, szczególnie tych, które nie obejmują sekcji tkanek. Solidne metody obrazowania w celu identyfikacji wzorców i cech zwłóknienia podczas dynamicznej przebudowy ECM w zwłóknieniu wątroby znacznie pogłębiłyby zrozumienie mechanizmów NASH i pozwoliłyby zidentyfikować nowe cele terapeutyczne.

Aby sprostać tym wyzwaniom, zoptymalizowano szybki i wydajny protokół do obrazowania natywnego ECM wątroby za pomocą decelularyzacji7. Decelularyzacja całej wątroby to podejście polegające na usunięciu zawartości komórkowej wątroby przy jednoczesnym zachowaniu natywnej sieci ECM 3D poprzez perfuzję detergentu. Myszy były karmione dietą karmową lub fast-food (FFD) przez 14 tygodni. Decelularyzacja przeprowadzono po perfuzji żyły wrotnej in situ łagodnym detergentem i niskimi prędkościami przepływu w celu zachowania struktur potrójnej helisy i natywnego kolagenu fibrylarnego. Mikroskopię dwufotonową zastosowano do analizy zmian w strukturach kolagenu w ECM. Obrazy 3D natywnej struktury ECM w prawidłowej wątrobie i NASH zostały odtworzone i przeanalizowane. Przeprowadzanie decelularyzacji perfuzyjnej in situ i analiza rusztowania za pomocą mikroskopii dwufotonowej stanowi praktyczną i niedrogą platformę do wizualizacji dynamicznej przebudowy ECM w wątrobie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z procedurami eksperymentalnymi zatwierdzonymi przez instytucjonalne komitety ds. opieki i użytkowania zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanforda oraz Szpitala Weteranów w Palo Alto. 6-8 tygodniowe samce myszy C57BL/6J były karmione karmą lub dietą typu fast-food uzupełnioną syropem kukurydzianym o wysokiej zawartości 4,2% (patrz Tabela Materiałów) w wodzie pitnej przez 14 tygodni5. Myszy trzymano w standardowych klatkach w 12-godzinnym cyklu ciemności/światła.

1. Chirurgiczne przygotowanie i procedury perfuzji wątroby

  1. Zważ mysz przed zabiegiem.
  2. Znieczulić mysz, podając ketaminę (90 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg) (patrz tabela materiałów) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona przez szczypanie palców u nóg przed przejściem do następnego kroku.
    UWAGA: Izofluran nie jest tutaj potrzebny, ponieważ jest to operacja niepozwalająca na przeżycie.
  3. Ogol okolicę brzuszną za pomocą maszynki do strzyżenia włosów i zdezynfekuj skórę 70% etanolem. Połóż mysz na plecach i unieruchom nogi na tablicy operacyjnej za pomocą taśmy.
  4. Po ponownym potwierdzeniu głębokości znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, za pomocą nożyczek Mayo i kleszczyków Adson (patrz Tabela materiałów) wykonaj 3 cm nacięcie boczne w dolnej części brzucha, a następnie 5 cm nacięcie pionowo od dolnej części brzucha do wyrostka mieczykowatego. Uważaj, aby nie otworzyć jamy klatki piersiowej.
  5. Po otwarciu otrzewnej delikatnie umieść jelita po lewej stronie zwierzęcia i podnieś prawy płat wątroby za pomocą aplikatora ze sztucznego jedwabiu (patrz tabela materiałów), aby odsłonić żyłę wrotną.
  6. Cewnikować żyłę wrotną za pomocą cewnika 24 G IV. Wprowadzić cewnik do dystalnego końca żyły wrotnej. Umieść końcówkę cewnika, zanim żyła wrotna rozgałęzi się do płatów wątroby.
  7. Wyjmij igłę natychmiast po wprowadzeniu cewnika do żyły. Sprawdź, czy cewnik jest prawidłowo umieszczony wewnątrz żyły, wykonując perfuzję wątroby za pomocą PBS za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml przez cewnik.
    UWAGA: Po perfuzji PBS wszystkie płaty powinny natychmiast zblednąć. Jeśli cewnik zostanie prawidłowo założony, krew żylna szybko przepłynie przez cewnik.
  8. Użyj mikrokleszczyków Dumont, uchwytu na mikroigły Castroviejo i szwu 4-0 (patrz Tabela materiałów), aby umieścić ścieg poniżej rozgałęzienia żyły wrotnej i drugi szew 1 cm poniżej, aby zabezpieczyć cewnik.

2. Decelularyzacja tkanek

  1. Podłącz cewnik do silikonowej rurki (~1 m długości, 3 mm średnicy wewnętrznej i 4.1 mm średnicy zewnętrznej) ze złączem Luer. Podłącz silikonową rurkę do pompy perystaltycznej i zbiornika zawierającego wodę dejonizowaną (patrz Tabela materiałów).
  2. Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza z wnętrza rurki i unikaj tworzenia nowych pęcherzyków podczas perfuzji. Ustaw pompę perystaltyczną na wydatek 0,2 ml/min (tj. 288 ml/24 h).
  3. Najpierw utrwalaj się wodą dejonizowaną (~50 ml / mysz) przez 2 godziny. Kolor wątroby zmieni się z czerwonego na żółty podczas perfuzji.
    UWAGA: Zwierzę umrze po 10 minutach perfuzji.
  4. Zamień roztwór perfuzyjny na 0,5% (wag./obj.) deoksycholanu sodu (DOC, patrz tabela materiałów) i kontynuuj przez noc (18 godzin, ~250 ml / mysz). Wątroba stanie się biała pod koniec perfuzji (Rysunek 1).
  5. Zamień roztwór perfuzyjny na wodę dejonizowaną (~50 ml / mysz) i uzyskuj przez 2 godziny.
  6. Użyj mikrokleszczyków Dumont i nożyczek z mikrosprężynami (patrz Tabela materiałów), aby zebrać pozbawioną komórek wątrobę i dokładnie umyć ją na szalce Petriego z PBS.
  7. Pokrój pozbawioną komórek tkankę na małe kawałki w celu natychmiastowego obrazowania lub zamroź w temperaturze -80 °C w celu dalszej analizy biochemicznej, takiej jak tandemowa spektrometria mas, ELISA lub western blot.

3. Przygotowanie preparatu do obrazowania (za pomocą wielofotonowego/konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego)

  1. Przenieś mały kawałek pozbawionej komórek wątroby (<3 x 3 x 3 mm) na szkiełko mikroskopowe i umieść tkankę pośrodku.
  2. Dodać 10 μl podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu (patrz tabela materiałów) do chusteczki za pomocą pipety, aby uniknąć wysuszenia tkanki.
  3. Przykryj chusteczkę szkłem nakrywkowym i przyłóż niewielką siłę, aby spłaszczyć próbkę. Uszczelnij krawędzie szkła nakrywkowego bezbarwnym i przezroczystym lakierem do paznokci (Rysunek 2).
    UWAGA: Ze względu na ustawienie pionowego dwufotonu przez mikroskop, na próbce zastosowano szkło nakrywkowe. Jednak próbki mogą być umieszczane inaczej, jeśli używany jest mikroskop odwrócony.

4. Akwizycja obrazu

  1. Umieść kroplę olejku immersyjnego na wierzchu szkła nakrywkowego i umieść szkiełko na uchwycie szkiełka mikroskopowego. Opuść soczewkę obiektywu olejowego 20x, aż zetknie się z olejkiem immersyjnym.
  2. Przełącz się na kanał fioletowy (405 nm), włącz migawkę i skup się na próbce. Nawiguj i ustaw obszar zainteresowania do obrazowania. Wyłącz migawkę przed przejściem do akwizycji obrazu za pomocą światła laserowego.
  3. Przełącz się na sterowanie komputerowe i uruchom laser dwufotonowy. Najpierw włącz laser dwufotonowy (Rysunek 3A), a następnie włącz dwufotonowy kontroler laserowy (patrz Tabela materiałów) i migawkę (Rysunek 3B,C). Upewnij się, że moc wyjściowa jest wyższa niż 2.5 W.
    Zmniejsz moc lasera, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji. Wybierz i dostosuj detektory (zarówno fotopowielacze, jak i hybrydę) do wybranych fluoroforów.
    UWAGA: Obrazowanie dwufotonowe przeprowadzono przy długości fali wzbudzenia 860 nm. Wybrano dwa kanały odpowiednio dla obrazów kolagenu SHG i fluorescencji wzbudzonej dwufotonami (TPEF). Jeden kanał odpowiadający zakresowi długości fal 415-445 nm wykrył szczegółową strukturę kolagenu na podstawie sygnałów SHG. Kolejny kanał obejmował zakres 465-669 nm do zbierania sygnałów TPEF.
  4. Wybierz jednoczesną lub sekwencyjną akwizycję obrazu. Ustaw otwór na najwyższą wartość. Dostosuj długości fal lasera, wzmocnienie, moc i przesunięcie. Dostosuj czas przebywania piksela, rozmiar piksela, uśrednianie i powiększenie (Rysunek 4A).
  5. Przewiń kontroler z komputera i ustaw wymiary z, zdefiniuj początek i koniec oraz wybierz liczbę obrazów podanych w woluminie (z-stosie). Pobierz images.
    UWAGA: W tym przypadku wybrano objętość Z 20 μm i rozmiar kroku Z 1 μm (Rysunek 4B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Włókna kolagenowe wykryto za pomocą generacji drugiej harmonicznej oraz mikroskopii dwufotonowej. Sygnał pochodzi z kruchych struktur potrójnej helisy oraz natywnych struktur włóknistych kolagenu. Do analizy podtypów kolagenu nie użyto specyficznych przeciwciał; można jednak wprowadzić ten element do techniki obrazowania.

Podczas badania tkanki wątroby bez decelularyzacji uzyskanie obrazów sieci kolagenowej o wysokiej rozdzielczości jest utrudnione (Rycina 5A

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecny protokół pokazuje, że decelularyzacja poprzez perfuzję in situ DOC o niskim natężeniu przepływu zachowuje łamliwe struktury potrójnej helisy i natywnego kolagenu fibrylarnego, zapewniając niezawodną i opłacalną platformę do przechwytywania dynamicznej przebudowy ECM w zwłóknieniu wątroby NASH. Chociaż decelularyzacja została przeprowadzona w prawidłowych i zwłóknienionych wątrobach przed zidentyfikowaniem składników ECM lub wygenerowaniem biologicznych rusztowań do hodowli komórek, dynamika przebudowy ECM...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że w związku z tym artykułem nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Hyesuk Park za pomoc techniczną. Badania te były finansowane przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, do NJT), National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, do NJT). Serdecznie dziękujemy Jonowi Mulhollandowi i Kitty Lee z Cell Sciences Imaging Facility w Beckman Center za pomoc techniczną przy obrazowaniu za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-0 MONOCRYL NIEBARWIONY 1 x 18" P-3MONOCRYLY494G
4-0 szewfisher scientific10-000-649https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true
AnaSed Injection (ksylazyna)AnaSedNDC 59399-110-20ten lek do stosowania przez licencjonowanego lekarza weterynarii lub na jego zlecenie.
Cewnik dożylny BD INSYTE AUTOGUARD Z TECHNOLOGIĄ BCBD
Dieta ChowEnvigo# 2918Dieta kontrolna. Dieta o stałej formule, nieautoklawowalna, wyprodukowana z wysokiej jakości składników i zaprojektowana w celu wspierania ciąży, laktacji i wzrostu gryzoni.
Dieta fast-food (AIN76A Dieta Zachodnia)Test diety1810060https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf
Zestaw barwników hematoksyliny i eozynyvectorlabsH-3502https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html
Kent Scientific Zestaw chirurgiczny dla szczurówfisher scientific13-005-205https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit
CHLOROWODOREK KETAMINY DO WSTRZYKIWAŃVedcoNDC 50989-996-06 - 10 ml - fiolka.KetaVed był badany klinicznie na naczelnych innych niż ludzie, oprócz gatunków wymienionych w sekcji Administracja i dawkowanie.
Leica SP5 - pionowy koncentryczny, wielofotonowyLeicaSP5
Luer (zawór trójdrogowy z blokadą SPIN-LOCK®)bbraunD300https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html
Zestaw czerwonych plam PicrosiriusPolysciences, Inc.24901https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771
Aplikator z końcówką ze sztucznego jedwabiupurytan25-806 1PR
Deoksycholan sodusigmaaldrichD6750-100G
Syropwww.target.com24 uncjehttps://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801
Pompa perystaltyczna o zmiennej prędkościINTLLABBT100https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1
VECTASHIELD Antifade Mediummontażowe vectorlabsH-1000-10https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html
382612 łącznik

Bibliografia

  1. Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
  2. Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
  3. Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
  4. Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome - looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115(2020).
  5. Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
  6. Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
  7. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
  8. Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83(2019).
  9. Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398(2016).
  10. Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
  11. Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
  12. Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356(2020).
  13. Cox, T. R. The matrix in cancer. Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).
  14. Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
  15. Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079(2015).
  16. Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183(2020).
  17. Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Remodelowanie ECMw knienie w trobyprotok decelularyzacjimikroskopia dwufotonowaw kna kolagenoweobrazowanie w troby myszybarwienie czerwieni picrosiriusowperfuzja y y wrotnej

Powiązane artykuły