Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja potencjalnego wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63109

⸱

10 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biodiversity Unit, University of Turku, 2Department of Biology, University of Turku, 3Nutrition and Health Unit, Eurecat Technology Centre of Catalonia, 4Department of Biochemistry and Biotechnology, Rovira i Virgili University

W tym artykule

Podsumowanie

Produkty na bazie glifosatu (GBP) są najpopularniejszymi herbicydami o szerokim spektrum działania na świecie. W tym artykule przedstawiamy ogólne wytyczne dotyczące ilościowego określania wpływu GBP na mikrobiomy, od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne

.

Streszczenie

Produkty na bazie glifosatu (GBP) są najpopularniejszymi herbicydami o szerokim spektrum działania na świecie. Celem glifosatu jest enzym syntaza 5-enolopiruzyloszikimo-3-fosforanu (EPSPS) w szlaku szikimowym, który jest praktycznie uniwersalny u roślin. Hamowanie enzymu zatrzymuje produkcję trzech niezbędnych aminokwasów: fenyloalaniny, tyrozyny i tryptofanu. EPSPS jest również obecny w grzybach i prokariotach, takich jak archeony i bakterie; w związku z tym stosowanie GBP może mieć wpływ na skład mikrobiomu gleb, roślin, roślinożerców i konsumentów wtórnych. Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie ogólnych wytycznych do oceny wpływu GBP na mikrobiomy od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne oraz przedstawienie kilku możliwych do przetestowania hipotez. Przedstawiono dwa doświadczenia terenowe w celu przetestowania GBP na organizmach niebędących przedmiotem zwalczania. W pierwszej kolejności pobiera się i analizuje próbki drobnoustrojów związanych z roślinami z 10 powtórzonych powierzchni kontrolnych i traktowanych przez GBP symulujących uprawę bezorkową. W drugim doświadczeniu uzyskano próbki z poletek doświadczalnych nawożonych obornikiem drobiowym zawierającym pozostałości glifosatu lub nieprzetworzonym obornikiem kontrolnym. Analiza bioinformatyczna sekwencji białek EPSPS jest wykorzystywana do określenia potencjalnej wrażliwości drobnoustrojów na glifosat. Pierwszym krokiem w oszacowaniu wpływu GBP na mikrobiomy jest określenie ich potencjalnej wrażliwości na enzym docelowy (EPSPS). Sekwencje mikrobiologiczne można uzyskać albo z publicznych repozytoriów, albo za pomocą amplifikacji PCR. Jednak w większości badań terenowych skład mikrobiomu został określony na podstawie uniwersalnych markerów DNA, takich jak 16S rRNA i wewnętrzny transkrybowany dystans (ITS). W takich przypadkach wrażliwość na glifosat można oszacować jedynie poprzez probabilistyczną analizę sekwencji EPSPS z wykorzystaniem blisko spokrewnionych gatunków. Kwantyfikacja potencjalnej wrażliwości organizmów na glifosat, w oparciu o enzym EPSPS, stanowi solidne podejście do dalszych eksperymentów mających na celu zbadanie mechanizmów oporności na glifosat.

Wprowadzenie

Intensywne stosowanie pestycydów w nowoczesnym rolnictwie jest niewątpliwie głównym czynnikiem przyczyniającym się do spadku różnorodności biologicznej1. Niniejszy artykuł koncentruje się na glifosacie, ponieważ produkty na bazie glifosatu (GBP) stały się najczęściej stosowanymi pestycydami na świecie ze względu na ich skuteczność i przystępną cenę2,3. Oprócz zabijania chwastów na polach uprawnych, GBP są powszechnie stosowane w gospodarce leśnej, środowiskach miejskich i ogrodach przydomowych; Ponadto zostały uznane za nietoksyczne dla organizmów niebędących przedmiotem zwalczania, jeśli są stosowane zgodnie z instrukcjami producenta. Jednak coraz więcej ostatnich badań wykazało, że pozostałości glifosatu i produktów jego degradacji mogą być zatrzymywane i transportowane w glebie, wywołując w ten sposób efekt kaskadowy na organizmy niebędące przedmiotem zwalczania4,5,6,7,8 . Działanie glifosatu nie ogranicza się tylko do roślin - szlak szikimowy jest również obecny u wielu grzybów i prokariontów. Glifosat jest ukierunkowany na enzym syntazę 5-enolopiruzyloszikimo-3-fosforanu (EPSPS) w szlaku szikimowym, znanym również jako aroA9. Enzym ten znajduje się w centrum szlaku szikimowego w syntezie trzech niezbędnych aminokwasów aromatycznych (fenyloalaniny, tyrozyny i tryptofanu) i jest obecny w większości prokariontów, roślin i grzybów10,11. Niektóre gatunki drobnoustrojów rozwinęły częściową lub całkowitą oporność na glifosat za pomocą kilku mechanizmów, w tym mutacji w sekwencjach EPSPS. W związku z tym zasugerowano, że stosowanie GBP może mieć bezpośredni wpływ na mikrobiomy roślinne i zwierzęce, w tym na mikrobiom jelitowy człowieka12,13,14. Niemniej jednak stosowanie GBP może mieć niekorzystny wpływ na praktycznie każdą funkcję i usługę ekosystemu opartą na mikroorganizmach i procesach wspomaganych przez drobnoustroje. Wynikające z tego zagrożenia mogą dotyczyć biochemicznych procesów glebowych, biologii zapylania oraz dobrostanu zwierząt i ludzi. Wymaga to bardziej wszechstronnego zrozumienia, w jaki sposób glifosat wpływa na szlaki szikimowe oraz metod oceny wrażliwości drobnoustrojów na glifosat.

W tym protokole prezentujemy proces testowania wpływu glifosatu i GBP na mikrobiom, od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne. Szczegółowo opisujemy niedawno opublikowaną metodę bioinformatyczną, która może być wykorzystana do określenia potencjalnej wrażliwości organizmów na glifosat12. Zgodnie z wiedzą naukowców jest to pierwsze i jak dotąd jedyne narzędzie bioinformatyczne do oceny wewnętrznej wrażliwości enzymu EPSPS na aktywny składnik GBP. Ta metoda bioinformatyczna opiera się na wykrywaniu znanych markerów aminokwasowych w docelowym enzymie glifosatu (EPSPS)12. Rurociąg jest podzielony na pięć głównych faz roboczych (Rysunek 1): 1) krótkie wprowadzenie do dwóch eksperymentów terenowych w celu przetestowania wpływu GBPs, 2) krótkie podsumowanie analiz mikrobiomu (16S rRNA, ITS i gen EPSPS), 3) zbieranie sekwencji EPSPS z repozytoriów publicznych, 4) określanie potencjalnej wrażliwości organizmów na glifosat oraz 5) ocena klasy EPSPS na podstawie uniwersalnych markerów mikrobiologicznych (16S rRNA i ITS).

Protokół

1. Dwa eksperymenty terenowe w celu sprawdzenia wpływu GBP

UWAGA: Ten protokół przedstawia dwa przykłady eksperymentów terenowych w celu przetestowania wpływu GBP na mikroorganizmy związane z roślinami. Oba eksperymenty przeprowadzono na odłogowanych polach, na których nie było wcześniej stosowanych herbicydów ani zastosowań rolniczych, w Ogrodzie Botanicznym Ruissalo Uniwersytetu w Turku w Finlandii (60º26'N, 22º10'E). Gleba jest piaszczysto-gliniasta z dużą zawartością materii organicznej.

  1. Eksperyment 1
    UWAGA: Ten eksperyment został zaprojektowany w celu symulacji ogólnych praktyk rolniczych uprawy bezorkowej z aplikacjami GBP przed i po sezonie wegetacyjnym w celu zwalczania chwastów.
    1. Podziel pole doświadczalne na 10 powtórzonych powierzchni kontrolnych i zabiegowych GBP (23 m x 1,5 m) z buforowymi pasami roślinności między powierzchniami ( w tym badaniu wiosną 2014 r. 15) (Rysunek 2).
    2. Upewnij się, że działki są uprawiane glebogryzarką rotacyjną na głębokość 5 cm i poddawane obróbce dwa razy w roku. Tutaj działki były traktowane na początku (maj) i pod koniec (październik) sezonu wegetacyjnego.
    3. Poletka kontrolne należy potraktować wodą z kranu (5 l/poletkę), a poletka GBP handlowym GBP (stężenie glifosatu 450 g·L-1, dawka 6,4 l·ha-1 w 5 litrach wody z kranu na poletko), aby naśladować maksymalną dozwoloną dawkę glifosatu w praktykach rolniczych (3 kg·ha-1).
    4. Zabiegi należy wykonywać za pomocą ręcznego zbiornika ciśnieniowego z ręcznym opryskiwaczem. Dwa tygodnie po zastosowaniu GBP na poletkach wysiewa się owies (Avena sativa), bób (Vicia faba), rzepak (Brassica rapa subsp. oleifera) i ziemniaki roślinne (Solanum tuberosum) na poletkach zgodnie z praktykami rolniczymi.
    5. W okresie wegetacji należy ręcznie odchwaszczać poletka, aby konkurencja roślin i struktura gleby były jak najbardziej zbliżone na poletkach kontrolnych i traktowanych GBP.
    6. Pobranie próbki mikrobioty z roślin doświadczalnych. W tym badaniu próbki mikrobioty pobierano kolejno od 2017 do 2020 r. zarówno na poletkach poddanych działaniu GBP, jak i kontrolnych, raz na sezon wegetacyjny w trakcie trwania badania.
    7. Pobrać dziesięć powtórzeń próbek roślin (korzenia i liścia) z pola, natychmiast umieścić je na lodzie i przynieść do laboratorium w celu dalszego przetwarzania, jak opisano w sekcji 2.1.
  2. Eksperyment 2
    UWAGA: Ten eksperyment został zaprojektowany w celu zbadania zagrożeń związanych z gospodarką żywnościową o obiegu zamkniętym; dokładniej, został zaprojektowany w celu zbadania konsekwencji pozostałości GBP w oborniku stosowanym jako nawóz dla roślin uprawnych2 (Rysunek 3).
    1. Zbieraj ściółkę, w tym wióry drzewne, kał i trochę rozlanej paszy, od przepiórek karmionych paszami skażonymi GBP lub kontrolnymi w 12-miesięcznym eksperymencie wolierowym16,17.
      UWAGA: Pasza skażona GBP składała się z ekologicznej paszy dla kurcząt niosek w połączeniu z ekwiwalentem 160 mg glifosatu/kg, co odpowiada dziennemu spożyciu 12-20 mg glifosatu na kilogram masy ciała u dorosłych przepiórek japońskich16,17.
    2. W celu walidacji wyślij próbki do akredytowanego laboratorium w celu pomiarów stężenia glifosatu w sześciu partiach paszy.
    3. Ponadto należy zmierzyć pozostałości glifosatu w próbkach odchodów przepiórczych po 12 miesiącach ekspozycji. Grupa kontrolna była karmiona tą samą paszą ekologiczną bez dodatku GBP16,17.
    4. Podczas eksperymentu wolierowego zmieniaj pościel co dwa tygodnie. Regularnie zbieraj zużytą ściółkę od 8-12 miesięcy ekspozycji na leczenie i kontrole GBP, zbieraj na zabieg i przechowuj w zamkniętych pojemnikach w suchym, ciemnym pomieszczeniu do przechowywania w temperaturze 6 °C przed użyciem jako nawóz.
    5. Rozłóż 12 L ściółki ręcznie na każdej z 18 GBP i 18 poletek kontrolnych (o wymiarach 1 m x 1 m) na siatce szachownicy 6 x 6 na polu doświadczalnym w dwóch punktach czasowych. W tym badaniu pościel została rozłożona w sierpniu 2018 r. i w maju 2019 r.
    6. Wyślij próbki ściółki do akredytowanego laboratorium w celu zmierzenia stężenia glifosatu bezpośrednio po jego rozprowadzeniu (w tym badaniu w maju 2019 r.).
    7. Posadź wieloletnie trawy i truskawki na każdej działce, aby zbadać ich mikrobiotę korzeni i liści.
      UWAGA: W tym badaniu na każdej działce posadzono cztery wieloletnie rośliny trawiaste (Festuca pratensis) i dwie rośliny truskawki (Fragaria x vescana) i zbadano ich mikrobiotę korzeni i liści.

2. Analizy mikrobiomu (16S rRNA, gen ITS i EPSPS)

UWAGA: Większość badań mikrobiomu opiera się na analizie genu 16S rRNA dla regionów bakteryjnych i wewnętrznych transkrybowanych (ITS) dla społeczności grzybów przy użyciu technologii sekwencjonowania nowej generacji. W związku z tym w artykule nie ma informacji na temat rodzaju EPSPS. Sekwencje EPSPS z tysięcy gatunków są dostępne w publicznych repozytoriach (sekcja 3 Protokołu) (Rysunek 4).

  1. Gen 16S rRNA
    1. Na podstawie oderwanych próbek liści i korzeni pobranych w opisanych powyżej eksperymentach zidentyfikuj drobnoustroje endofityczne (tj. drobnoustroje żyjące w tkankach roślinnych).
    2. Umyj próbki roślin wodą z kranu, a następnie wysterylizuj je w celu usunięcia drobnoustrojów epifitycznych (tj. drobnoustrojów na powierzchni tkanek roślinnych). Sterylizuj przy użyciu 3% wybielacza przez 3 minuty, a następnie 70% roztworu etanolu przez 1 minutę i myj trzy razy autoklawowaną ultraczystą wodą przez 1 minutę każdy.
    3. Zamrażać próbki w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji genomowego DNA.
    4. Wykonaj ekstrakcję genomowego DNA przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA roślinnego zgodnie z protokołem producenta.
    5. Celuj w zmienne regiony V6-V8 genu 16S rRNA z wyekstrahowanych próbek DNA przy użyciu podejścia zagnieżdżonego z dyskryminującymi starterami, które wiążą się specyficznie z bakteryjnym DNA18, minimalizując w ten sposób amplifikację z DNA rośliny gospodarza.
    6. Po trzech rundach reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oznacz docelowy gen kodem kreskowym i sekwencjami adaptera, aby przygotować go jako matrycę do sekwencjonowania. Wykonaj kroki 2.1.7-2.1.11, aby uzyskać amplifikację PCR
    7. Przygotować główną mieszaninę PCR dla wymaganej liczby próbek, tak aby każda reakcja miała 30 μl całkowitej objętości i składała się z 30 ng DNA, 1x buforu PCR, 0,2 mM dNTP, 0,3 μM każdego startera i 2000 U/ml polimerazy DNA. Wykonaj ten sam krok dla drugiej i trzeciej rundy PCR.
    8. W pierwszej rundzie PCR użyj starterów 799F19 i 1492R (zmodyfikowane z20) (Tabela 1). Ustaw profil amplifikacji w termocyklerze (3-minutowa początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C, następnie 35 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 45 s, wyżarzanie w temperaturze 54 °C przez 45 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę). Ostatnie przedłużenie w temperaturze 72 °C przeprowadzić przez 5 minut.
    9. Jako matrycę do drugiej rundy PCR sprawdź amplifikację przez elektroforezę (5 μl produktów PCR na 1,5% żelu agarozowym), a następnie rozcieńczyć pozostałe 25 μl produktu PCR w autoklawowanej ultraczystej wodzie w stosunku 1:10.
    10. Powtórz PCR z rozcieńczonymi matrycami i starterami PCR uni-1062F21 i uni-1390R22 (Tabela 1). Zachować te same warunki reakcji PCR i profil amplifikacji (krok 2.1.8), z wyjątkiem zmniejszenia liczby cykli do 25.
    11. Rozcieńczyć powstałe produkty PCR w autoklawowanej ultraczystej wodzie w stosunku 1:1. Przeprowadź trzecią rundę PCR, aby oznaczyć produkty kodami kreskowymi i sekwencją adaptera P1 za pomocą 8 cykli tego samego profilu PCR, jak wspomniano w kroku 2.1.8.
  2. Przygotowanie biblioteki
    1. Sprawdzić stężenie i jakość produktów PCR na bioanalizatorze i zebrać objętości stanowiące 30 ng DNA każdej próbki w probówce o pojemności 1,5 ml w celu przygotowania biblioteki równomolowej.
    2. Wybierz amplikony o wielkości 350-550 pz przez frakcjonowanie za pomocą automatycznego systemu wyboru wielkości DNA na kasecie z żelem agarozowym. Należy pamiętać, że eliminuje to również niespecyficzne amplikony i odczynniki PCR z biblioteki. Zebrać elucję składającą się z amplikonów o określonej wielkości do fiolki w kasecie, w wyniku czego otrzymamy oczyszczoną bibliotekę genów 16S rRNA.
    3. Odpipetować elucję do probówki o pojemności 1,5 ml i sprawdzić czystość i stężenie na bioanalizatorze. Rozcieńczyć bibliotekę DNA za pomocą autoklalawowanej ultraczystej wody do końcowego stężenia 26 pM; Próbka jest gotowa do sekwencjonowania.
  3. ITS
    UWAGA: Region ITS jest amplifikowany przy użyciu starterów specyficznych dla ITS (Tabela 1), a otrzymany produkt PCR jest oznaczany kodami kreskowymi i sekwencją adaptera P1 do sekwencjonowania.
    1. Przygotować główną mieszankę PCR zgodnie z tym samym protokołem, jak wspomniano w sekcji 2.1, ze starterami ITS.
    2. Ustaw profil amplifikacji w termocyklerze jako 5-minutową początkową denaturację w temperaturze 95 °C, a następnie 35 cykli denaturacji, wyżarzania i przedłużania w temperaturze 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C odpowiednio przez 1 minutę i końcowe przedłużenie 72 °C przez 7 minut.
    3. Przeanalizować 5 μl produktu PCR na 1,5 % żelu agarozowym i rozcieńczyć pozostałe 25 μl do 1:10 przy użyciu autoklawowanej ultraczystej wody. Użyć rozcieńczonego produktu PCR jako matrycy do drugiej rundy PCR.
    4. Przygotować główną mieszankę PCR dla wymaganej liczby próbek (patrz krok 2.1.6) z oznaczonymi kodami kreskowymi starterami do przodu i starterami odwrotnymi oznaczonymi adapterem P1. Amplifikuj z tym samym profilem amplifikacji, co w kroku 2.3.2, z wyjątkiem użycia 8 cykli.
    5. Przygotować otrzymane produkty PCR do sekwencjonowania zgodnie z protokołami wymienionymi w sekcji 2.2.
  4. Gen EPSPS
    1. Sekwencjonowanie i analizowanie genów EPSPS drobnoustrojów.
      UWAGA: W celu ustalenia, czy narażenie na GBP zmieniło skład drobnoustrojów wrażliwych i opornych na glifosat w społeczności, geny EPSPS drobnoustrojów muszą zostać zsekwencjonowane i przeanalizowane. W ten sposób zebrano 353 sekwencje genów EPSPS z szerokiej kolekcji taksonów drobnoustrojów w bazie danych Alignable Tight Genomic Clusters (ATGC), a wszystkie sekwencje białek zostały dopasowane22. Te wyrównania są dostępne w bazie danych ATGC23 i mogą być wykorzystane do generowania starterów z konserwatywnych regionów. Łatwe w użyciu narzędzie bioinformatyczne zostało zaprojektowane do identyfikacji konserwatywnych regionów na podstawie wyrównania wielu sekwencji, a jest ono dostępne na stronie badawczej Pere Puigbo24. Jednakże, nie jest to objęte zakresem tej publikacji, aby przedstawić szczegółowy opis tego serwera WWW. Niemniej jednak, potencjalny protokół wykorzystania tych starterów do amplifikacji genu EPSPS w celu znalezienia wrażliwości mikrobiomu na glifosat jest podany w Rysunek 4.

3. Zbieranie sekwencji białek EPSPS z publicznych repozytoriów

  1. Sekwencje EPSPS do wykorzystania w badaniach makroewolucji
    1. Zgromadź białka EPSPS z publicznych repozytoriów, takich jak PFAM23 (baza danych rodzin białek25), GenBank24 (baza danych genów, genomów i białek26 ), COG25 (Klastry grup ortologicznych27; baza danych białek ortologicznych archeonów i bakterii); oraz PDB26 (Bank Danych o Białkach)28; Baza danych struktur białkowych).
      UWAGA: Niedawne badanie przeprowadzone przez naukowców wykazało, że białka te mogą być wykorzystane do przeprowadzania analiz mikroewolucyjnych i porównawczych potencjalnego wpływu glifosatu na organizmy posiadające szlak szikimów12. Autorzy stworzyli przyjazną dla użytkownika stronę internetową, która gromadzi informacje na temat dziesiątek tysięcy sekwencji białek EPSPS29, w tym ręcznie wyselekcjonowany zestaw danych białek z ludzkiego mikrobiomu jelitowego12. Informacje zawarte w tych wstępnie obliczonych zestawach danych obejmują aktualną klasyfikację EPSPS jako przypuszczalnie wrażliwe i odporne na glifosat, informacje taksonomiczne dotyczące gatunków, adnotacje dotyczące aktywnego miejsca EPSPS oraz linki do baz danych PDB i NCBI. Ponadto serwer WWW zawiera kody identyfikacyjne EPSPS oraz linki do kilku zewnętrznych baz danych (tabela 2).
  2. Sekwencje EPSPS do wykorzystania w badaniach mikroewolucji ATGC
    UWAGA: Ogólne repozytoria sekwencji białek są przydatne do prowadzenia badań porównawczych wśród stosunkowo odległych organizmów; Jednak potencjalny wpływ glifosatu jest stosunkowo nowy z ewolucyjnego punktu widzenia. W związku z tym w niektórych badaniach konieczne jest porównanie blisko spokrewnionych gatunków (np. różnych szczepów z tego samego gatunku bakterii) w celu określenia wpływu glifosatu14. W takich przypadkach bardziej odpowiednim zasobem jest baza danych Alignable Tight Genomic Clusters (ATGC)30, która zawiera obszerną listę blisko spokrewnionych genomów archeonów i bakterii. Baza danych ATGC zawiera informacje o kilku milionach białek z tysięcy genomów zorganizowanych w setki klastrów30. Każdy klaster genomu jest wyrównany (genomy mają wspólną syntenię na ponad ≥85% swojej długości) i ciasny (o współczynniku substytucji synonimicznej poniżej nasycenia). Naukowcy wykorzystali zestaw danych ATGC w niedawnym badaniu do analizy zmian mikroewolucyjnych w białkach EPSPS14. Do zidentyfikowania sekwencji białka EPSPS w ATGC potrzebne są następujące kroki:
    1. Pobierz całą bazę danych ATGC z link31 i wszystkie białka COG0128 (kod odpowiadający białkom EPSPS w bazie danych)32 do lokalnego projektu.
      UWAGA: Jeśli naukowcy/eksperymentatorzy mają siedzibę w Finlandii, CSC-IT Center for Science33 zapewnia pamięć masową i oprogramowanie. Ważne jest, aby zebrać wszystkie sekwencje w formacie FASTA.
    2. Zbudowano bazę danych blastów COG0128, które zawierają ortologi białka EPSPS w reprezentatywnym zestawie gatunków prokariontów. CSC ma preinstalowany program blast34, co pozwala na użycie polecenia makeblastdb -in COG0128.fa -dbtype prot w celu utworzenia referencyjnej bazy danych sekwencji EPSPS.
    3. Zmapuj bazę danych ATGC na COG0128.fa (białka EPSPS) za pomocą iteracyjnego wyszukiwania blast za pomocą polecenia blastp -query [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150.
    4. W rezultacie tworzy zestaw danych sekwencji białek EPSPS w każdym z nich. Dostępny jest wstępnie obliczony zestaw danych blisko powiązanych sekwencji białek EPSPS z bazy danych ATGC29.

4. Algorytm określający potencjalną wrażliwość organizmów na glifosat (serwer WWW EPSPSClass: wejścia, przetwarzanie i wyjścia)

UWAGA: Badacze zaimplementowali łatwy w użyciu serwer, który jest dostępny bezpłatnie pod adresem 29, aby określić klasę sekwencji białek EPSPS12,35. Serwer wymaga jedynie wprowadzenia sekwencji białka w formacie FASTA w celu określenia procentu tożsamości każdej z klas EPSPS i ich potencjalnej wrażliwości na glifosat. Co więcej, użytkownicy mogą korzystać z serwera internetowego do testowania własnych sekwencji referencyjnych i markerów aminokwasowych. Po pierwsze, algorytm (Rysunek 5) wyrównuje sekwencje zapytań i sekwencje referencyjne za pomocą programu do wyrównywania wielu sekwencji35 w celu określenia pozycji aminokwasów. Następnie wyszukuje obecność markerów aminokwasowych w celu zidentyfikowania klasy EPSPS (I, II, III lub IV) sekwencji zapytania.

  1. Wprowadź sekwencję białka EPSPS w formacie FASTA do wejściowego pola tekstowego, aby zidentyfikować klasę enzymu (Rysunek 6A) i naciśnij Wyślij.
  2. Oceń potencjalną wrażliwość sekwencji zapytań na glifosat (Rysunek 6B-E) z dostarczonych danych wyjściowych serwera:
    Wynik 1: Frakcja markerów aminokwasowych (tj. tożsamość) obecnych w sekwencjach zapytań (klasa I, II i IV) oraz liczba motywów (klasa III).
    Dane wyjściowe 2: Wyrównania sekwencji zapytania i odwołań na podstawie pozostałości znaczników.
    Dane wyjściowe 3: Pełne wyrównanie parami sekwencji zapytania i odwołań.
    Wynik 4: Sekwencje referencyjne EPSPS: Vibrio cholerae(vcEPSPS, klasa I), Coxiella burnetii(cbEPSPS, klasa II), Brevundimonas vesicularis(bvEPSPS, klasa III), Streptomyces davawensis(sdEPSPS, klasa IV).
  3. Na końcu strony wyjściowej znajdź łącza do zewnętrznych narzędzi, takich jak blastp i domeny konserwatywne, aby dokładniej przeanalizować sekwencję zapytania EPSPS (Rysunek 6F).

5. Ocena klasy EPSPS na podstawie uniwersalnych markerów mikrobiologicznych (16S rRNA i ITS)

UWAGA: Większość badań mikrobiomu opiera się na analizie 16S rRNA i/lub ITS36. W takich przypadkach nie jest możliwe przeprowadzenie bezpośredniej analizy sekwencji EPSPS. W związku z tym konieczne jest podejście probabilistyczne do oszacowania potencjalnej wrażliwości organizmów na glifosat. Analiza ta jest prosta i zapewnia rozsądne oszacowanie rodzaju sekwencji EPSPS w projekcie mikrobiomu. Proces jest podzielony na 3 etapy (Rysunek 7 i Rysunek 8):

  1. Zidentyfikuj sekwencje EPSPS z repozytoriów publicznych. Klasa EPSPS kompleksowego zestawu danych reprezentatywnych sekwencji została skompilowana i wstępnie obliczona na podstawie PFAM37, GenBank38, COG39, PDB40, ATGC30. Uzyskaj dostęp do tych zestawów danych ze strony głównej serwera EPSPSClass, zawierającej informacje taksonomiczne i klasę EPSPS obejmującą ponad 50 000 sekwencji (Rysunek 7).
  2. Mierz wysokość roślin doświadczalnych co dwa tygodnie w sezonie wegetacyjnym i waż nadziemną biomasę roślin pod koniec sezonu polowego, aby porównać wzrost roślin na poletkach GBP i kontrolnych.
    UWAGA: Analizy mikrobioty uzyskane w ramach doświadczeń terenowych nie zostały jeszcze w pełni przeanalizowane.
  3. Użyj arkusza kalkulacyjnego, aby zmapować bakteryjne OTU (na podstawie 16S rRNA lub ITS) z eksperymentów mikrobiomu do wstępnie obliczonych zestawów danych.
    UWAGA: Poprzednie badania wykazały, że klasa EPSPS (tj. wewnętrzna wrażliwość na glifosat) jest wysoce konserwatywna w obrębie grupy filogenetycznej14. W związku z tym stosunkowo bezpiecznie jest założyć, że blisko spokrewnione gatunki z wysoce konserwatywnych taksonów mogą mieć podobne reakcje EPSPS na glifosat (Rysunek 8).
  4. W tym samym arkuszu kalkulacyjnym oblicz wewnętrzną wrażliwość na glifosat na podstawie wyniku probabilistycznego (S = s / (s + r + u), gdzie S: ocena wrażliwości; s: liczba potencjalnie wrażliwych sekwencji; r: liczba potencjalnie opornych sekwencji; u: liczba niesklasyfikowanych sekwencji) obliczona na podstawie znanych sekwencji EPSPS w publicznych bazach danych.
    UWAGA: Wynik ten waha się od 0 (w taksonie nie znaleziono żadnych wrażliwych sekwencji EPSPS) do 1 (wszystkie sekwencje w taksonie są wrażliwe na glifosat) (Rysunek 8). Ponadto istnieją wartości pośrednie, tj. gatunki o szczepach wrażliwych, odpornych lub nieznanych.

Wyniki

Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie ogólnego schematu postępowania, od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne, który pozwala na określenie potencjalnej wrażliwości organizmów na herbicyd glifosat. W Eksperymentcie 2 średnie stężenie glifosatu w paszy dla przepiórek wynosiło 164 mg/kg, a średnie stężenie glifosatu w próbkach wydzielin (połączone próbki moczu i kału) wynosiło 199 mg/kg. Podściółki zebrane od przepiórek karmionych paszą zanieczyszczoną GBP zawierały średnio 158 mg/kg glifosatu, natomiast w podściółkach kontrolnych stężenie to wynosiło 0,17 mg/kg (Tabela 3). W eksperymentach terenowych gatunki roślin różnie reagowały na pozostałości glifosatu w glebach (sekcja 1). Biomasa owsa i rzepaki brukiewnego była większa w glebach kontrolnych w porównaniu do gleb traktowanych GBP. Jednakże boby i ziemniaki zdawały się odnieść korzyść z traktowania GBP pod koniec sezonu wegetacyjnego15. Glifosat w oborniku drobiowym ograniczył wzrost roślin trawy (Festuca pratensis) oraz truskawki (Fragaria x vescana) (sekcja 1). Analizy mikrobiomu z eksperymentów terenowych nie zostały jeszcze w pełni opracowane i nie są tutaj przedstawione (sekcja 2). Wyniki tego protokołu, interpretowane bezpośrednio (jak pokazano w sekcjach 3 i 4) lub pośrednio (sekcja 5), pozwalają określić proporcję organizmów potencjalnie wrażliwych i opornych na glifosat w zbiorze danych (Rysunek 9). Zastosowanie tej metody przetestowano na zbiorze sekwencji białka EPSPS z gatunków mikroorganizmów tworzących rdzeń ludzkiego mikrobiomu jelitowego, pozyskanych z publicznych repozytoriów12. W badaniu 890 szczepów z 101 najliczniejszych gatunków bakterii przeanalizowano metodą EPSPSClass w celu określenia proporcji bakterii wrażliwych i opornych. Wyniki wykazały, że 54% gatunków w rdzeniu ludzkiego mikrobiomu jelitowego jest potencjalnie wrażliwych na glifosat12. Tendencja ta jest obserwowana również w większości świata prokariontów; dodatkowo u eukariontów (głównie roślin i grzybów) proporcja gatunków potencjalnie wrażliwych jest jeszcze wyższa12. Ponadto wykorzystaliśmy tę metodę do określenia zmian wrażliwości białka EPSPS na poziomie mikroewolucyjnym (Rysunek 10)14. Zidentyfikowano zmiany statusu wrażliwości w 12 z 32 analizowanych, blisko spokrewnionych grup prokariontów (Tabela 4)14. Zatem ciągłe stosowanie GBP może prowadzić do dysbiozy mikrobiologicznej (tj. zaburzenia równowagi między wrażliwymi a opornymi gatunkami bakterii) w mikrobiomach roślin, zwierząt i gleby. Ponadto postawiono hipotezę, że wzrost liczby bakterii opornych na glifosat może sprzyjać powstawaniu mikrobiomów wielolekoopornych14,41,42. W związku z tym protokół ten rzuca światło na interpretację wszystkich tych scenariuszy, ponieważ metoda klasyfikacji EPSPS dostarcza bezpośredniego szacunku wrodzonej wrażliwości mikrobiomów na glifosat. Ponieważ wrodzona wrażliwość białka EPSPS na glifosat jest konserwatywna filogenetycznie14, możliwe jest ekstrapolowanie wyników z istniejących zbiorów danych na nieznane mikrobiomy (Rysunek 8).

Schemat wrażliwości na narażenie na glifosat; eksperymenty polowe, przepływ danych EPSPS, analiza wrażliwości.
Rycina 1: Ogólny schemat postępowania Jest to ogólny schemat analizy wrażliwości na GBP, obejmujący etapy od eksperymentów polowych po analizy bioinformatyczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat planu płodozmianu, obejmujący kontrolę (C1-C10) i GBP (G1-G10), z rzepą, owsem, bobem i ziemniakiem.
Rycina 2: Eksperyment polowy 1 w celu zbadania wpływu pozostałości GBP na mikroby związane z roślinami uprawnymi. Pole doświadczalne składa się z naprzemiennych 10 działek kontrolnych i 10 działek traktowanych GBP (23 m x 1,5 m) z pasami buforowymi o szerokości 1,5 m pomiędzy działkami. Od 2014 roku, dwa razy w roku, działki GBP były traktowane komercyjnym preparatem GBP (stężenie glifosatu 450 g L-1, dawka aplikacyjna 6,4 L ha-1 w 5 L wody kranowej na działkę), a działki kontrolne taką samą ilością wody kranowej bez glifosatu. Preparaty aplikowano za pomocą ręcznego opryskiwacza ciśnieniowego z plastikową osłoną na końcówce dyszy, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się GBP poza działki traktowane. Po dwutygodniowym okresie bezpieczeństwa po aplikacji GBP w działkach wysiano owies (Avena sativa), bób (Vicia faba) i rzepę (Brassica rapa subsp. oleifera), a także posadzono ziemniaki (Solanum tuberosum). Próbki mikrobioty z badanych roślin uprawnych, z liści i korzeni, pobierano kilkakrotnie od rozpoczęcia eksperymentu w 2014 roku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat eksperymentu w wolierze: wpływ obornika z przepiórników na poletki roślinne; pobieranie próbek danych do analizy mikrobioty.
Rysunek 3Doświadczenie polowe 2 miało na celu zbadanie wpływu pozostałości GBP w nawozie z obornika na dwie uprawy wieloletnie oraz powiązaną z nimi mikrobiotę. Podłoża zebrane z 12-miesięcznego eksperymentu w wolierze z przepiórkami japońskimi karmionymi paszą kontrolną lub zanieczyszczoną GBP zostały wykorzystane jako nawóz organiczny w doświadczeniu polowym. Pole doświadczalne składało się z 18 działek kontrolnych i 18 działek GBP (1 m x 1 m), rozmieszczonych w układzie szachownicy 6 x 6. Podłoża rozprowadzano na polu doświadczalnym dwukrotnie, w sierpniu 2018 roku i maju 2019 roku (25 l / działkę). Działki kontrolne nawożono podłożami zebranymi od przepiórek karmionych paszą kontrolną, a działki GBP podłożami od przepiórek karmionych paszą zanieczyszczoną GBP. Pozostałości glifosatu w podłożach kontrolnych wynosiły 0,17 mg/kg glifosatu, natomiast w podłożach GBP ilość ta wynosiła 158 mg/kg glifosatu. Dwie linie z endofitami (E+) oraz dwie linie pozbawione endofitów (E-) Festuca pratensis, oraz dwa Fragaria x vescana posadzono na każdą pole và w wrześniu 2018 roku, w przybliżeniu miesiąc po wysianiu pierwszych grządek. Pomiary kondycji i przystosowania roślin, a także pobieranie próbek mikrobioty związanej z korzeniami i liśćmi, przeprowadzono podczas dwóch kolejnych sezonów wegetacyjnych (2019 & 2020). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu PCR dla sekwencjonowania genów; primery na drobnoustrojach; tworzenie biblioteki sekwencjonowania.
Rysunek 4: Analiza taksonów mikrobiologicznych z wykorzystaniem genu 16S rRNA/regionu ITS oraz wrażliwość mikrobiomów na glifosat z wykorzystaniem genu EPSPS. (A) Analiza sekwencji 16S rRNA lub ITS w celu identyfikacji taksonów mikrobiologicznych. (B) Analiza sekwencji EPSPS w celu określenia wrażliwości drobnoustrojów na glifosat (GS – wrażliwe na glifosat / GR – oporne na glifosat) Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat dopasowania sekwencji DNA przedstawiający klasy EPSPS oraz procenty markerów tożsamości.
Rysunek 5: Algorytm identyfikacji klasy sekwencji białek EPSPS. Danem wejściowym jest sekwencja białka EPSPS w formacie FASTA. Algorytm przeprowadza porównania z znanymi markerami aminokwasowymi w referencyjnych sekwencjach białkowych, które określają potencjalną wrażliwość na glifosat. Algorytm został zaimplementowany na ogólnodostępnym serwerze WWW EPSPSClass29. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Konfiguracja analizy sekwencji syntazy EPSP, wprowadzanie sekwencji, wyniki dopasowania, wykres tożsamości klas, analiza BLAST.
Rysunek 6: Podstawowe dane wejściowe i wyjściowe serwera internetowego EPSPSClass. (A) Dane wejściowe: sekwencja białka EPSPS w formacie FASTA. (B) Wynik 1 – tożsamość: frakcja markerów aminokwasowych obecnych w sekwencjach zapytania (Klasy I-IV) i motywach (Klasa III). (C) Wynik 2 – tożsamość: dopasowania sekwencji zapytania i referencyjnych. (D) Wynik 3 – dopasowania parowe sekwencji zapytania i referencyjnych. (E) Referencyjne sekwencje EPSPS: Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasa I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasa II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasa III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasa IV). (F) Linki do przeprowadzenia dodatkowych wyszukiwań blastp oraz identyfikacji domen konserwatywnych Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Klasyfikacja syntazy EPSPS, schemat; prekomputowane zestawy danych, dane taksonomiczne, przewidywanie gatunków.
Rysunek 7: Dostęp do prekomputowanych zestawów danych sekwencji EPSPS. Postępuj zgodnie ze wskazówkami na rysunku, aby uzyskać dostęp do prekomputowanego zestawu danych sekwencji EPSPS. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Wykres projektu mikrobiomu przedstawiający klasyfikację wrażliwości mikrobiologicznej; zestawy danych; od S. aureus do S. islandicus.
Rysunek 8: Przykład szacowania potencjalnej wrażliwości w projektach mikrobiomu bez sekwencji EPSPS. Przykład wykorzystuje wartości z bazy danych Alignable Tight Genomic Clusters30, która zawiera sekwencje gatunków prokariontów. Hipotetyczne gatunki z projektu mikrobiomu to Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci oraz Sulfolobus islandicus. Wynik wrażliwości na glifosat oblicza się jako Liczba_Sekwencji_Wrażliwych/Całkowita_Liczba_Sekwencji. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Reakcja mikrobiomu na glifosat; Wrażliwe, oporne, niezaklasyfikowane; Diagram, progresja czasowa.
Rycina 9: Schemat interpretacji wyników z niniejszego protokołu oraz hipotetyczne scenariusze ewolucyjne. (A) W mikrobiomie proporcja bakterii potencjalnie wrażliwych (na zielono) i opornych (na czerwono) wynosi około 50:50. Czarne kropki oznaczają gatunki drobnoustrojów niezaklasyfikowane; zatem ich wrażliwość na glifosat jest nieznana. W niektórych mikrobiomach proporcja bakterii wrażliwych jest nieco wyższa, jak w przypadku mikrobiomu jelitowego człowieka12. (B) Z biegiem czasu stosowanie glifosatu może prowadzić do dysbiozy mikrobiomu (tj. zachwiania proporcji bakterii wrażliwych i opornych), co prowadzi do różnych hipotetycznych scenariuszy. (C) Hipotetyczny przypadek 1 (brak selekcji): Stosowanie glifosatu nie wpływa na mikrobiom; zatem proporcja bakterii wrażliwych i opornych pozostaje stała. (D) Hipotetyczny przypadek 2: Stosowanie glifosatu eliminuje z populacji bakterie wrażliwe na glifosat. Przypuszczamy, że ten scenariusz może być zależny od dawki. (E) Hipotetyczny przypadek 3: Presja selekcyjna wynikająca ze stosowania glifosatu nasila mutacje w genie EPSPS, które zmieniają status wrażliwości bakterii. W konsekwencji cała populacja drobnoustrojów staje się oporna na glifosat. Co więcej, w tym scenariuszu może nastąpić wzrost liczby bakterii wielolekoopornych. (F) Hipotetyczny przypadek 4: Stosowanie glifosatu zmienia skład niektórych gatunków bakteryjnych, powodując zachwianie równowagi na korzyść bakterii opornych, podczas gdy niektóre gatunki bakterii pozostają niezmienione, prawdopodobnie ze względu na dodatkowe mechanizmy oporności, takie jak pompy efflux lub nadekspresja genu EPSPS13. Scenariusz ten może również prowadzić do wzrostu liczby bakterii opornych na glifosat, a także do wzrostu oporności bakteryjnej na dodatkowe antybiotyki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Diagram drzewa filogenetycznego odporności na glifosat; taksonomia, tryb życia, analiza zawartości GC.
Rycina 10: Rozkład przewidywanej wrażliwości na glifosat w obrębie drzewa gatunków. Wykresy kołowe wskazują proporcję gatunków uznanych za wrażliwe (zielony) lub odporne (czerwony) na glifosat, a także niezaklasyfikowane (czarny). Rycina została opracowana na podstawie publikacji Rainio i wsp.14 za zgodą autorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Interfejs wstawiania sekwencji do analizy białek; zawiera pola wprowadzania danych FASTA i markerów aminokwasowych.
Rycina 11: Wejścia i wyjścia serwera internetowego EPSPSClass służącego do testowania własnych sekwencji referencyjnych użytkownika. (A) Wejście 1: sekwencja zapytania. (B) Wejście 2: sekwencja referencyjna. (C) Wejście 3: markery aminokwasowe w sekwencjach referencyjnych. (D) Wyjście: identyczność: ułamek markerów aminokwasowych w sekwencjach zapytania (klasy I-IV oraz własne sekwencje referencyjne użytkownika). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Lista starterów do amplifikacji PCR genu 16S rRNA i regionu ITS w analizie mikrobiomu Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Kody enzymu syntazy 5-enolopirowyloszykimatu-3-fosforanu (EPSPS) w różnych bazach danych Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Średnie stężenie glifosatu Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Tabela podsumowująca procent gatunków wrażliwych/odpornych na glifosat. Tabela ta została opracowana za zgodą Rainio et al.14. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Pozycje markerów aminokwasowych w sekwencjach referencyjnych Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Protokół ten zawiera ogólne wytyczne dotyczące ilościowego określania wpływu GBP na mikrobiomy w oparciu o analizę białka EPSPS. Protokół składa się z trzech głównych kluczowych etapów: (i) Kwantyfikacja białka EPSPS na podstawie danych mikrobiomu. Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ EPSPS jest bezpośrednim enzymem docelowym herbicydu. W związku z tym stosowanie GBP może mieć wpływ na gatunki, które mają kopię genu EPSPS. Niemniej jednak, nawet gatunki, które nie mają kopii genu EPSPS, mogą być dotknięte przez herbicyd poprzez alternatywne mechanizmy niebędące celem43,44. (ii) Jeśli analiza genu EPSPS nie jest uwzględniona w projekcie badania, możliwe jest uzyskanie dobrego oszacowania poprzez analizę 16S rRNA (bakterie) lub ITS (grzyby). W takim przypadku konieczne jest oparcie się na wyczerpującej tabeli referencyjnej (np. baza danych ATGC zawiera sekwencje białka EPSPS z kilku blisko spokrewnionych gatunków). (iii) Białko EPSPS dzieli się na potencjalnie wrażliwe lub odporne na glifosat, w zależności od pewnych reszt aminokwasowych w miejscu aktywnym EPSPS. Jednak mutacje wpływające na pojedynczy aminokwas mogą zmienić tę klasyfikację45, a przejścia między klasami mogą wystąpić w stosunkowo krótkim czasie14.

Potencjalną wrażliwość organizmów na glifosat można określić na podstawie genomów referencyjnych, markerów aminokwasowych i dopasowań sekwencji. (i) Genomy referencyjne: Enzym EPSPS można sklasyfikować jako potencjalnie wrażliwy (klasa I [alfa lub beta]46,47) lub oporny (klasy II48,49, III50 i IV51) na glifosat ze względu na obecność markerów i motywów aminokwasowych (w przypadku klasy III). Te markery i motywy aminokwasowe opierają się na lokalizacji reszt aminokwasowych w białku EPSPS Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasa I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasa II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasa III) i Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasa IV). (ii) Markery aminokwasowe: Glifosat oddziałuje z enzymem EPSPS i konkuruje z fosfoenolopirogronianem (PEP, drugi substrat enzymu EPSPS)52,53. U niektórych gatunków niewielkie zmiany aminokwasów w sekwencji EPSPS zapewniają większe powinowactwo do PEP i odporność na glifosat12, 14, 52, 54, 55. W innych sekwencjach glifosat wiąże sekwencję EPSPS w konformacji niehamującej 45. Chociaż opisano wiele opornych na glifosat sekwencji 12,14,48,49,52,52,54,55 i tolerancyjnych 56,57 EPSP, obecny system klasyfikacji EPSPS jest podzielony na cztery główne klasy (I-IV)12 (Tabela 5). (iii) Dopasowania sekwencji: Aby sklasyfikować enzym EPSPS, przeprowadziliśmy dopasowania parami, z programem do dopasowywania wielu sekwencji - domyślne parametry35-, sekwencji zapytania względem każdej z sekwencji referencyjnych (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS i sdEPSPS). Te wyrównania są niezbędne do zidentyfikowania pozycji markerów aminokwasów w sekwencji zapytania. W rezultacie enzym jest klasyfikowany jakoopisany 12-klasowy I, II i/lub IV na podstawie obecności markerów aminokwasowych i markerów motywów opartych na klasie III.

Protokół opiera się na czterech znanych typach EPSPS: jeden typ jest wrażliwy, pozostałe trzy są odporne). Jednak około 10% sekwencji EPSPS u prokariontów nie jest jeszcze sklasyfikowanych (16% u archeonów i 8% u bakterii)12. W związku z tym dalsze badania powinny przeanalizować te sekwencje w celu określenia wrażliwości na glifosat. Serwer EPSPSClass umożliwia testowanie nowych markerów genetycznych. Identyfikacja znanych klas EPSPS jest prosta, jak pokazano w sekcji 4.4. i rysunek 5. Ponadto w przypadkach, gdy użytkownicy chcą porównać własne białka zapytania i białka referencyjne, serwer zapewnia opcję ręcznego dołączenia sekwencji referencyjnej i zestawu markerów aminokwasowych (Figura 11). Opcja ta może być wykorzystana do identyfikacji nowych klas EPSPS, a także do testowania innych herbicydów i sekwencji docelowych.

Analizę klasy EPSPS określa się na podstawie analizy sekwencji i obecności/braku markerów aminokwasowych. Jest to wstępne oszacowanie, które można wykorzystać do testowania hipotez w terenie. Markery aminokwasowe zostały określone w literaturze na podstawie badań empirycznych i obserwacyjnych 46,47,48,49,50,51. Jednak referencyjne sekwencje białek w celu określenia klasy EPSPS zostały przetestowane tylko na ograniczonej liczbie gatunków i czasami mogą nie wyjaśniać oporności na glifosat. Wpływ mutacji kompensacyjnych i domen związanych z EPSPS (głównie u grzybów) może również wpływać na wrażliwość na glifosat58. Analiza w niniejszym artykule opiera się na czterech klasach EPSPS. Badanie bakterii w ludzkim mikrobiomie jelitowym wykazało, że około 30% z nich było niesklasyfikowanych (tj. białka EPSPS z tych gatunków nie należą do żadnej ze znanych klas) i potrzebne są dodatkowe badania w celu zidentyfikowania innych klas EPSPS. Należy również zauważyć, że sekwencja białka EPSPS u bakterii i roślin jest jednodomenowa, podczas gdy białka EPSPS grzybów zawierają kilka domen59. Tak więc fałdowanie białek u grzybów może prowadzić do innej odpowiedzi enzymu EPSPS na glifosat. Ponadto nie uwzględnia się dodatkowych mechanizmów oporności niezwiązanych z celem (np. pompy wypływowe i nadekspresja genu EPSPS 13) lub wrażliwości na glifosat (np. wpływ glifosatu na mitochondrialny łańcuch transportowy12).

Chociaż GBP istnieją jako herbicydy od 1974 roku i są szeroko stosowane od 1991 roku, jest to pierwsza metoda bioinformatyczna do określania potencjalnej wrażliwości organizmów na glifosat. Metoda opiera się na identyfikacji znanych reszt aminokwasowych w sekwencji docelowej. W związku z tym nasza metoda zapewnia podstawowe oszacowanie potencjalnego wpływu glifosatu na gatunek. W niedalekiej przyszłości nowatorskie metody bioinformatyczne powinny obejmować dodatkowe klasy białka EPSPS w celu określenia potencjalnej wrażliwości na glifosat niesklasyfikowanych sekwencji 12,54,55. Ponadto, biorąc pod uwagę, że dokładne zachowanie enzymu EPSPS może różnić się w zależności od zmian pojedynczych aminokwasów 12,14,52,54,55, dalsze eksperymenty in silico powinny uwzględniać niewielkie różnice w fałdowaniu białka EPSPS, a także wpływ domen związanych z EPSPS na strukturę białka u grzybów 58. Ponadto wykazano, że tolerancja na glifosat może być spowodowana nadekspresją białka EPSPS56,57; w związku z tym analizy bioinformatyczne oparte na poprawie użycia kodonów60 mogą być wykorzystane do identyfikacji nowych sekwencji EPSPS, które maksymalizują lub minimalizują ekspresję genów.

Rolnicy, politycy i decydenci pilnie potrzebują dogłębnego zrozumienia zagrożeń związanych z intensywnym stosowaniem pestycydów. W związku z tym niezbędne są zarówno narzędzia bioinformatyczne ujawniające potencjalną wrażliwość organizmów na pestycydy, jak i dobrze odtworzone, randomizowane i realistyczne w terenie badania eksperymentalne prowadzone w różnych środowiskach. Przedstawiona metoda bioinformatyczna przeznaczona do badania wrażliwości organizmów na glifosat może być modulowana dla innych pestycydów. Podobnie, metody ekologii eksperymentalnej mogą być stosowane do badania wszelkich powiązanych zagadnień ekologicznych. Razem metody te mogą być wykorzystane do wykazania liczby ofiar między obserwacjami terenowymi, danymi genomicznymi i stosowaniem pestycydów. Wszystkie przedstawione metody są nieocenione w ocenie ryzyka. Metody bioinformatyczne mogą być wykorzystywane na przykład do monitorowania adaptacji mikroorganizmów do agrochemikaliów oraz do zapewnienia ilościowej metody badania potencjalnych innych powiązanych zagrożeń, takich jak wzrost odporności patogenów na agrochemikalia, negatywny wpływ na drobnoustroje stosowane jako środki kontroli biologicznej w integrowanej ochronie roślin (IPM) oraz oporność bakterii na antybiotyki.

Oświadczenia

Konflikt interesów: brak.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Akademię Fińską (grant nr 311077 dla Marjo Helander).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2100 BioanalizatorAgilentG2939BDo sprawdzania stężenia i jakości produktów PCR
Mieszanka dNTP (10 mM każdy)ThermoFisher ScientificR0192Do reakcji PCR
GoTaq G2 Zestaw polimerazy DNA PromegaM7848Bufor PCR i polimeraza DNA do amplifikacji PCR
Invisorb Spin Plant Mini KitINVITEK Molecular1037100300Ekstrakcja genomowego DNA z tkanek roślinnych
Ion Chip MinifugeThermoFisher Scientific4479672Do celowanego sekwencjonowania mikrobiologicznych produktów PCR
Ion PGM SystemThermoFisher Scientific4462921Do celowanego sekwencjonowania mikrobiologicznych produktów PCR
Ion PGM Torrent ServerThermoFisher Scientific4483643Do ukierunkowanego sekwencjonowania mikrobiologicznych produktów PCR
PippinprepSageSciencePIP0001Do frakcjonowania wielkości amplikonów PCR
Zbiornik ciśnieniowyBerthoud102140Do rozpylania produktów na bazie glifosatu w terenie
PodkładySigma AldrichWykonane na zamówienieDo amplifikacji PCR
Glebogryzarka rotacyjnaGrillo984511Do uprawy gleby na poletkach doświadczalnych
S1000 ThermalCyclerBIO-RAD1852196Do amplifikacji PCR

Bibliografia

  1. Williams, G. M., Kroes, R., Munro, I. C. Safety evaluation and risk assessment of the herbicide Roundup and its active ingredient, glyphosate, for humans. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 31, 117-165 (2000).
  2. Muola, A., et al. Risk in the circular food economy: Glyphosate-based herbicide residues in manure fertilizers decrease crop yield. The Science of the Total Environment. 750, 141422(2021).
  3. Helander, M., Saloniemi, I., Saikkonen, K. Glyphosate in northern ecosystems. Trends in Plant Science. 17 (10), 569-574 (2012).
  4. Fuchs, B., Saikkonen, K., Helander, M. Glyphosate-Modulated Biosynthesis Driving Plant Defense and Species Interactions. Trends in Plant Science. 26 (4), 312-323 (2021).
  5. Helander, M., Saloniemi, I., Omacini, M., Druille, M., Salminen, J. -P., Saikkonen, K. Glyphosate decreases mycorrhizal colonization and affects plant-soil feedback. The Science of the Total Environment. 642, 285-291 (2018).
  6. Bai, S. H., Ogbourne, S. M. Glyphosate: environmental contamination, toxicity and potential risks to human health via food contamination. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (19), 18988-19001 (2016).
  7. Cuhra, M., Bøhn, T., Cuhra, P. Glyphosate: too much of a good thing. Frontiers in Environmental Science. 4, (2016).
  8. de Brito Rodrigues, L., et al. Impact of the glyphosate-based commercial herbicide, its components and its metabolite AMPA on non-target aquatic organisms. Mutation Research. 842, 94-101 (2019).
  9. Steinrücken, H. C., Amrhein, N. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate synthase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 94 (4), 1207-1212 (1980).
  10. Bentley, R. The shikimate pathway--a metabolic tree with many branches. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 25 (5), 307-384 (1990).
  11. Richards, T. A., et al. Evolutionary origins of the eukaryotic shikimate pathway: gene fusions, horizontal gene transfer, and endosymbiotic replacements. Eukaryotic Cell. 5 (9), 1517-1531 (2006).
  12. Leino, L., et al. Classification of the glyphosate target enzyme (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) for assessing sensitivity of organisms to the herbicide. Journal Of Hazardous Materials. 408, 124556(2021).
  13. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase. BioRxiv. , (2020).
  14. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase. Environmental Microbiology Reports. 13 (3), 309-316 (2021).
  15. Helander, M., Pauna, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I. Glyphosate residues in soil affect crop plant germination and growth. Scientific Reports. 9 (1), 19653(2019).
  16. Ruuskanen, S., Rainio, M. J., Uusitalo, M., Saikkonen, K., Helander, M. Effects of parental exposure to glyphosate-based herbicides on embryonic development and oxidative status: a long-term experiment in a bird model. Scientific Reports. 10 (1), 6349(2020).
  17. Ruuskanen, S., et al. female preference and adverse developmental effects of glyphosate-based herbicides on ecologically relevant traits in Japanese quails. Environmental Science & Technology. 54 (2), 1128-1135 (2020).
  18. Mäki, A., Rissanen, A. J., Tiirola, M. A practical method for barcoding and size-trimming PCR templates for amplicon sequencing. Biotechniques. 60 (2), 88-90 (2016).
  19. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of Zea mays L. Microbial Ecology. 41 (3), 252-263 (2001).
  20. Lane, D. J. 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. , John Wiley & Sons. New York. 115-175 (1991).
  21. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. Plos One. 8 (8), 71360(2013).
  22. Zheng, D., Alm, E. W., Stahl, D. A., Raskin, L. Characterization of universal small-subunit rRNA hybridization probes for quantitative molecular microbial ecology studies. Applied and Environmental Microbiology. 62 (12), 4504-4513 (1996).
  23. JoVE Supplementary Material. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass/JOVE_SM (2021).
  24. Alignments Conserved Positions. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/primers (2021).
  25. Protein Families. , Available from: http://pfam.xfam.org (2021).
  26. NCBI GenBank. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/genbank (2021).
  27. COG Database. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/research/cog (2021).
  28. Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org (2021).
  29. EPSPSClass. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass (2021).
  30. Kristensen, D. M., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. ATGC database and ATGC-COGs: an updated resource for micro- and macro-evolutionary studies of prokaryotic genomes and protein family annotation. Nucleic Acids Research. 45, 210-218 (2017).
  31. ATG_NCBI. , Available from: http://ftp.ncbi.nim.nih.gov/pub/kristensen/ATGC/atgc_home.html (2021).
  32. COG2020. , Available from: http://ftp.ncbi.nim.nih.gov/pub/COG/COG2020/data (2021).
  33. CSC - IT CENTER FOR SCIENCE LTD. , Available from: https://www.csc.fi (2021).
  34. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
  35. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  36. Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110(2018).
  37. El-Gebali, S., et al. The Pfam protein families database in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 427-432 (2019).
  38. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
  39. Galperin, M. Y., Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Expanded microbial genome coverage and improved protein family annotation in the COG database. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 261-269 (2015).
  40. Burley, S. K., Berman, H. M., Kleywegt, G. J., Markley, J. L., Nakamura, H., Velankar, S. Protein data bank (PDB): the single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  41. Raoult, D., Hadjadj, L., Baron, S. A., Rolain, J. -M. Role of glyphosate in the emergence of antimicrobial resistance in bacteria. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76 (7), 1655-1657 (2021).
  42. Liu, J., Gefen, O., Ronin, I., Bar-Meir, M., Balaban, N. Q. Effect of tolerance on the evolution of antibiotic resistance under drug combinations. Science. 367 (6474), 200-204 (2020).
  43. Peixoto, F. Comparative effects of the Roundup and glyphosate on mitochondrial oxidative phosphorylation. Chemosphere. 61 (8), 1115-1122 (2005).
  44. Peillex, C., Pelletier, M. The impact and toxicity of glyphosate and glyphosate-based herbicides on health and immunity. Journal of Immunotoxicology. 17 (1), 163-174 (2020).
  45. Funke, T., Han, H., Healy-Fried, M. L., Fischer, M., Schönbrunn, E. Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13010-13015 (2006).
  46. Light, S. H., Krishna, S. N., Minasov, G., Anderson, W. F. An unusual cation-binding site and distinct domain-domain interactions distinguish Class II Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. Biochemistry. 55 (8), 1239-1245 (2016).
  47. Firdous, S., Iqbal, S., Anwar, S., Jabeen, H. Identification and analysis of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) gene from glyphosate-resistant Ochrobactrum intermedium Sq20. Pest Management Science. 74 (5), 1184-1196 (2018).
  48. Barry, G. F., Kishore, G. M., Padgette, S. R., Stallings, W. C. Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. United States Patient. , US5627061A (1997).
  49. Priestman, M. A., Funke, T., Singh, I. M., Crupper, S. S., Schönbrunn, E. 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Staphylococcus aureus is insensitive to glyphosate. FEBS Letters. 579, 728-732 (2005).
  50. Carozzi, N., Carr, B., Hammer, P. E. Identification of a new class of EPSP synthases. World Intellectual Property Organization Publ.of the Int.Appl. without Int.search. , REP. WO2006US13161 (2006).
  51. Lira, J. M., Cicchillo, R. M., Nair, S. K. Novel class of glyphosate resistance genes. US Patent. , US20130217577A1 (2013).
  52. Funke, T., et al. Structural basis of glyphosate resistance resulting from the double mutation Thr97 -> Ile and Pro101 -> Ser in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 284 (15), 9854-9860 (2009).
  53. Schönbrunn, E., et al. Interaction of the herbicide glyphosate with its target enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase in atomic detail. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (4), 1376-1380 (2001).
  54. Stalker, D. M., Hiatt, W. R., Comai, L. A single amino acid substitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate. The Journal of Biological Chemistry. 260 (8), 4724-4728 (1985).
  55. Eschenburg, S., Healy, M. L., Priestman, M. A., Lushington, G. H., Schönbrunn, E. How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. Planta. 216 (1), 129-135 (2002).
  56. Achary, V. M. M., et al. Overexpression of improved EPSPS gene results in field level glyphosate tolerance and higher grain yield in rice. Plant Biotechnology Journal. 18 (12), 2504-2519 (2020).
  57. Huang, Z., Liu, Y., Zhang, C., Jiang, C., Huang, H., Wei, S. Molecular basis of natural tolerance to glyphosate in Convolvulus arvensis. Scientific Reports. 9 (1), 8133(2019).
  58. Tall, T. A census analysis of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase and EPSP-associated domains. , (2020).
  59. Tall, T., Puigbò, P. The glyphosate target enzyme 5-Enolpyruvyl Shikimate 3-Phosphate Synthase (EPSPS) contains several EPSPS-associated domains in fungi. ATLA Summary of Proceedings. 76 (1), 6(2020).
  60. Puigbò, P., Guzmán, E., Romeu, A., Garcia-Vallvé, S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Research. 35, Web server issue 126-131 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wpływ glifosatu na mikrobiomenzym EPSPSszlak shikimowyskład mikrobiomusekwencjonowanie 16S rRNAamplifikacja regionu ITSanaliza bioinformatycznamikrobiota roślinwrażliwość drobnoustrojów
Kwantyfikacja potencjalnego wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.