Method Article

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

DOI:

10.3791/63116

⸱

November 8th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są ważne w patofizjologii wielu chorób neurodegeneracyjnych. Zmiany objętości mitochondriów, potencjału błony mitochondrialnej (MMP), mitochondrialnej produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) i liczby kopii mitochondrialnego DNA (mtDNA) są często cechami tych procesów. Raport ten szczegółowo opisuje nowatorskie podejście oparte na cytometrii przepływowej do pomiaru wielu parametrów mitochondrialnych w różnych typach komórek, w tym ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) oraz komórek nerwowych i glejowych pochodzących z iPSC. Ta strategia oparta na przepływie wykorzystuje żywe komórki do pomiaru objętości mitochondriów, poziomów MMP i ROS, a także stałe komórki do oszacowania składników mitochondrialnego łańcucha oddechowego (MRC) i białek związanych z mtDNA, takich jak mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A (TFAM).

Poprzez współbarwienie z fluorescencyjnymi reporterami, w tym MitoTracker Green (MTG), estru etylowym tetramethylrodamine (TMRE) i MitoSox Red, zmiany w objętości mitochondriów, MMP i mitochondrialnym ROS mogą być określone ilościowo i powiązane z zawartością mitochondriów. Podwójne barwienie przeciwciałami przeciwko podjednostkom kompleksu MRC i translokazie zewnętrznej błony mitochondrialnej 20 (TOMM20) pozwala na ocenę ekspresji podjednostki MRC. Ponieważ ilość TFAM jest proporcjonalna do liczby kopii mtDNA, pomiar TFAM na TOMM20 daje pośredni pomiar mtDNA na objętość mitochondriów. Cały protokół można przeprowadzić w ciągu 2-3 godzin. Co ważne, protokoły te pozwalają na pomiar parametrów mitochondrialnych, zarówno na poziomie całkowitym, jak i określonym na objętość mitochondriów, za pomocą cytometrii przepływowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są niezbędnymi organellami obecnymi w prawie wszystkich komórkach eukariotycznych. Mitochondria są odpowiedzialne za dostarczanie energii poprzez wytwarzanie trifosforanu adenozyny (ATP) poprzez fosforylację oksydacyjną i działają jako pośrednicy metaboliczni w biosyntezie i metabolizmie. Mitochondria są głęboko zaangażowane w wiele innych ważnych procesów komórkowych, takich jak wytwarzanie ROS, śmierć komórki i wewnątrzkomórkowa regulacja Ca2 +. Dysfunkcja mitochondriów jest związana z różnymi chorobami neurodegeneracyjnymi, w tym chorobą Parkinsona (PD), chorobą Alzheimera (AD), chorobą Huntingtona (HD), ataksją Friedreicha (FRDA) i stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS)1. Uważa się również, że zwiększona dysfunkcja mitochondriów i nieprawidłowości mtDNA przyczyniają się do starzenia się człowieka2,3.

W chorobach neurodegeneracyjnych występują różne rodzaje dysfunkcji mitochondriów, a zmiany w objętości mitochondriów, depolaryzacja MMP, produkcja ROS i zmiany w liczbie kopii mtDNA są powszechne4,5,6,7. Dlatego możliwość pomiaru tych i innych funkcji mitochondriów ma ogromne znaczenie przy badaniu mechanizmów chorobowych i testowaniu potencjalnych środków terapeutycznych. Ponadto, ze względu na brak modeli zwierzęcych, które wiernie odwzorowują ludzkie choroby neurodegeneracyjne, ustanowienie odpowiednich systemów modelowych in vitro, które rekapitulują ludzką chorobę w komórkach mózgowych, jest ważnym krokiem w kierunku lepszego zrozumienia tych chorób i opracowania nowych terapii2,3,8,9.

Ludzkie iPSC mogą być używane do generowania różnych komórek mózgowych, w tym komórek neuronalnych i nieneuronalnych (tj. komórek glejowych), a uszkodzenia mitochondriów związane z chorobą neurodegeneracyjną stwierdzono w obu typach komórek3,10,11,12,13. Dostępne są odpowiednie metody różnicowania iPSC na linie neuronalne i glejowe14,15,16. Komórki te stanowią unikalną platformę dla ludzi/pacjentów do modelowania chorób in vitro i badań przesiewowych leków. Co więcej, ponieważ pochodzą one od pacjentów, neurony i komórki glejowe pochodzące z iPSC dostarczają modeli choroby, które dokładniej odzwierciedlają to, co dzieje się u ludzi.

Do tej pory dostępnych jest kilka wygodnych i niezawodnych metod pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów w iPSC, szczególnie żywych neuronów i komórek glejowych. Zastosowanie cytometrii przepływowej dostarcza naukowcowi potężnego narzędzia do pomiaru parametrów biologicznych, w tym funkcji mitochondriów, w pojedynczych komórkach. Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat generowania różnych typów komórek mózgowych, w tym nerwowych komórek macierzystych (NSC), neuronów i astrocytów glejowych z iPSC, a także nowatorskie podejścia oparte na cytometrii przepływowej do pomiaru wielu parametrów mitochondrialnych w różnych typach komórek, w tym iPSC oraz komórek nerwowych i glejowych pochodzących z iPSC. Protokół zapewnia również strategię współbarwienia przy użyciu cytometrii przepływowej do pomiaru objętości mitochondriów, MMP, mitochondrialnego poziomu ROS, kompleksów MRC i TFAM. Włączając pomiary objętości lub masy mitochondriów, protokoły te umożliwiają również pomiar zarówno poziomu całkowitego, jak i określonego poziomu na jednostkę mitochondrialną.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów i Tabelę Uzupełniającą S1, aby zapoznać się z przepisami wszystkich mediów i roztworów używanych w tym protokole.

1. Różnicowanie ludzkich iPSC na NCS, neurony dopaminergiczne (DA) i astrocyty

  1. Przygotuj płyty pokryte matrycą.
    1. Rozmrozić fiolkę z 5 ml matrycy na lodzie przez noc. Rozcieńczyć 1 ml matrycy 99 ml zimnego Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (1% stężenie końcowe). Przygotować 1 ml porcji i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
    2. Rozmrozić roztwór matrycy w temperaturze 4 °C (utrzymywać w niskiej temperaturze) i pokryć 6 dołków (1 ml na studzienkę na płytce 6-dołkowej).
    3. Umieść płytkę pokrytą matrycą w nawilżonym inkubatorze z powietrzem o stężeniu 5% CO2/95% w temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Wyjąć płytkę z inkubatora i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej (RT).
      UWAGA: Zaleca się zużyć płytkę w ciągu 3 dni od nałożenia powłoki. Powlekana płytka może być przechowywana do 2 tygodni w temperaturze 4 °C. Pamiętaj tylko, aby go wyjąć i pozwolić mu rozgrzać się do RT przed użyciem. W przypadku długotrwałego przechowywania należy dodać 1 ml pożywki hodowlanej iPSC do powlekanej płytki, aby uniknąć wysuszenia matrycy.
  2. Rozmrażanie iPSC
    1. Ogrzać płytki pokryte matrycą w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 20–30 minut. Ogrzać wymaganą ilość pożywki iPSC w temperaturze pokojowej.
    2. Zmieszać 6 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej iPSC z 12 μl inhibitora Y-27632 ROCK, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM.
    3. Częściowo rozmrozić zamrożoną fiolkę z iPSC w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej do momentu, aż pozostanie mały kawałek lodu.
    4. Powoli dodawać kroplami 1 ml podgrzanej pożywki hodowlanej iPSC z 12 μl inhibitora ROCK. Przenieść płynną zawartość fiolki z iPSC kroplami do jednego dołka na 6-dołkowej wstępnie powlekanej płytce za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
    5. Przesunąć płytkę w kierunku prostopadłym, aby wymieszać zawartość studzienki i włożyć płytkę z powrotem do inkubatora. Zmienić pożywkę hodowlaną iPSC po 24 godzinach od umycia solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco (1x) (bez Ca2+/Mg2+) (4 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej).
      UWAGA: Nie należy dodawać inhibitora ROCK do kolejnych karmień. Codziennie zmieniaj pożywkę hodowlaną iPSC.
  3. Subkulturacja iPSC
    1. Ogrzać płytki pokryte matrycą w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 20–30 minut. Ogrzać wymaganą ilość pożywki iPSC w temperaturze pokojowej.
    2. Odessać pożywkę hodowlaną z płytek zawierających komórki. Przepłukać iPSC za pomocą DPBS (1x) (bez Ca2+/Mg2+) (4 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej).
    3. Dodaj EDTA (0,5 mM) (1 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C do momentu, gdy krawędzie kolonii zaczną się podnosić ze studzienki (zwykle 3-5 minut). Odessać EDTA.
    4. Dodać wstępnie podgrzaną pożywkę hodowlaną iPSC (4 ml na studzienkę na płytce 6-dołkowej) i na siłę odłączyć kolonie iPSC za pomocą sterylnej pipety o pojemności 10 ml. Nie należy pipetować w górę i w dół, ponieważ może to spowodować rozpad zbrylonych komórek na pojedyncze komórki.
    5. Przenieść zawartość każdej studzienki do dwóch oddzielnych studzienek na pokrytej matrycą płytce 6-dołkowej (2 ml na studzienkę na płytce 6-dołkowej) i inkubować w temperaturze 37 °C. Nie wytwarzać pęcherzyków powietrza w zawiesinie podczas pipetowania.
      UWAGA: Delikatnie wstrząśnij płytką przed umieszczeniem jej w inkubatorze. Stosunek podziału może wynosić od 1:2 (jeden odwiert do 2 nowych studni) do 1:4 (jeden odwiert do 4 nowych studni).
    6. Wymieniaj pożywkę codziennie, aż kolonie osiągną 60% zbiegu o dobrej wielkości i połączeniach.
  4. Indukcja neuronalna i generowanie neuronalnych progenitorów
    1. Przygotuj 500 ml pożywki zdefiniowanej chemicznie (CDM), 500 ml pożywki do indukcji neuronalnej (NIM) i 500 ml pożywki wolnej od surowicy nerwowych komórek macierzystych (NSC SF).
    2. Przepłukać komórki DPBS (1x) (bez Ca2+/Mg2+) (4 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej) i dodać NIM (3 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej). Ustaw jako Dzień 0.
    3. Wymień NIM (3 ml na studzienkę w 6-dołkowej płytce) w dniu 1, dniu 3 i dniu 4 i codziennie obserwuj pod mikroskopem.
    4. W dniu 5 odłącz rozety nerwowe do kultury zawiesiny, jak opisano poniżej.
      1. Raz delikatnie przemyć DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 ml na dołek w płytce 6-dołkowej). Dodaj kolagenazę dożylną (1 ml na studzienkę na płytce 6-dołkowej) i trzymaj w inkubatorze przez 1 minutę. Odessać kolagenazę dożylnie i delikatnie przemyć raz DPBS (1x) (4 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej).
      2. Dodaj 2 ml pożywki NSC SF na dołek do płytki 6-dołkowej. Odłącz komórki, zeskrobując dno studzienek, rysując siatki za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
      3. Zebrać zawiesinę komórek z płytki 6-dołkowej do 10 cm nieprzywierającego naczynia. Uzupełnić objętość do 12 ml za pomocą pożywki NSC SF.
      4. Potrząśnij nieprzylegającą naczyniem z prędkością 65-85 obr./min na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze, aby zapobiec agregacji.
  5. Różnicowanie neuronów DA
    1. W dniu 7 dodaj 12 ml CDM uzupełnionego 100 ng / ml czynnika wzrostu fibroblastów-8b (FGF-8b) i umieść naczynie na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze.
    2. W dniach 8-13 zmieniaj pożywkę co 2 dni i obserwuj pod mikroskopem codziennie.
    3. W dniu 14 dodaj 12 ml CDM uzupełnionego 100 ng / ml FGF-8b i 1 μM purmorfaminy (PM). Umieść naczynie na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze.
    4. W dniach 15-20 zmieniaj pożywkę co 2 dni i codziennie obserwuj komórki pod mikroskopem.
    5. Mechaniczne przejście kulek za pomocą końcówek o pojemności 1000 μl do rozdrobnienia większych kul.
      UWAGA: Proporcje mogą wynosić 1:2 (jedno danie na 2 nowe dania).
  6. Zakończenie różnicowania
    1. Pokryj 6-dołkową płytkę lub szkiełka nakrywkowe poli-L-ornityną (PLO) i lamininą, jak opisano poniżej.
      1. Pokryć 6-dołkową płytkę 1 ml PLO na studzienkę i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Odessać roztwór PLO.
      2. Sterylizuj płytkę w promieniowaniu UV przez 20 minut. Przepłucz studzienki dwukrotnie DPBS (1x) (4 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej).
      3. Dodać 5 μg/ml roztworu lamininy (1 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej) do dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Odessać lamininę i krótko przemyć studzienki DPBS (1x) (4 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej) raz przed posiewem.
    2. Zebrać wszystkie kulki (z kroku 1.5.5) w probówkach o pojemności 50 ml i uzupełnić DPBS (1x). Wirować z prędkością 300 × g przez 5 minut. Odessać supernatant.
    3. Inkubować z 2 ml odczynnika do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, a następnie delikatnie rozcierać pipetą o pojemności 200 μl (20-50 razy w zależności od wielkości kulek, unikając tworzenia się pęcherzyków).
    4. Zneutralizować odczynnik do dysocjacji komórek za pomocą 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i odwirować stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą komórki o stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.
    5. Dodać 1 ml CDM uzupełnionego 10 ng / ml czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) i 10 ng / ml czynnika neurotroficznego pochodzącego z linii komórek glejowych (GDNF), aby ponownie zawiesić granulki komórkowe poprzez delikatne pipetowanie w górę iw dół w celu uzyskania zawiesin jednokomórkowych.
    6. Odessać roztwór lamininy z płytki (etap 1.6.1.3), przemyć krótko DPBS (1x) (4 ml na studzienkę na płytce 6-dołkowej) i zasiać komórki (od kroku 1.6.5) na wstępnie powlekanych płytkach lub szkiełkach nakrywkowych w 3 ml CDM uzupełnionym 10 ng/ml BDNF i 10 ng/ml GDNF. Karmić komórki co 4 dni.
      UWAGA: Zróżnicowane kultury mogą być utrzymywane przez wiele tygodni do 3 miesięcy. Morfologia neuronalna pojawia się zwykle po 2 tygodniach od zakończenia i od tego momentu może być wykorzystywana do dalszych analiz. BDNF i GDNF nie są konieczne do hodowli w celu dłuższego utrzymania (do 2 miesięcy).
  7. Generowanie NSC
    1. Płyty matrycy płaszcza.
    2. Zbierz wszystkie kule neuronowe (wygenerowane z kroku 1.4) w probówkach o pojemności 50 ml i uzupełnij DPBS (1x) (wolne od Ca2+/Mg2+). Wirować z prędkością 300 × g przez 5 minut. Odessać supernatanty.
    3. Inkubować granulki z 2 ml odczynnika do dysocjacji komórek przez 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, a następnie delikatnie rozcierać pipetą o pojemności 200 μl (20-50 razy w zależności od wielkości kulek, unikając tworzenia się pęcherzyków).
    4. Zneutralizować 2 ml DMEM z 10% FBS i odwirować stożkowe probówki o pojemności 50 ml zawierające komórki o stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatanty. Ponownie zawiesić granulki komórek, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby uzyskać zawiesiny jednokomórkowe.
    5. Odessać roztwór matrycy z wstępnie powlekanej płytki i zasiać komórki na wstępnie powlekanych płytkach w podłożu NSC SF (3 ml na dołek w płytce 6-dołkowej). Karm komórki co 2-3 dni i dziel komórki, gdy się zlewają.
      UWAGA: Począwszy od tego etapu, NSC mogą być rozszerzane i zamrażane.
  8. Różnicowanie astrocytów glejowych
    1. Różnicowanie astrocytów od NSC
      1. Przygotuj 500 ml pożywki do różnicowania astrocytów.
      2. Wysiewanie NSC na płytkach/szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną (PDL) za pomocą NSC SF Medium.
      3. Następnego dnia przepłucz komórki DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 ml na dołek w 6-dołkowej płytce) i dodaj pożywkę do różnicowania astrocytów (3 ml na dołek w 6-dołkowej płytce). Ustaw jako Dzień 0.
      4. Obserwuj NSC pod mikroskopem codziennie i wymieniaj pożywkę do różnicowania astrocytów (3 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej) co 2 dni od 1 do 27 dni.
    2. Dojrzewanie astrocytów
      1. Przygotuj pożywkę do dojrzewania astrocytów.
      2. W dniu 28 przepłucz komórki DPBS (1x) (4 ml na dołek w płytce 6-dołkowej) i dodaj pożywkę do dojrzewania astrocytów (3 ml na studzienkę na płytce 6-dołkowej).
      3. W dniu 29 i później codziennie obserwuj komórki pod mikroskopem i wymieniaj pożywkę do dojrzewania astrocytów (3 ml na dołek w płytce 6-dołkowej) co 2 dni.
      4. Po miesiącu dojrzewania roznów, roznkruj komórki i kriozarezerwuj je od tego etapu.
        UWAGA: W tej fazie liczba komórek wzrośnie. Podczas dzielenia komórek szkiełka nakrywkowe pokryte PDL nie są konieczne do hodowli.

2. Charakterystyka komórek za pomocą immunocytochemii i barwienia immunofluorescencyjnego

  1. Pod koniec okresu hodowli przenieść szkiełka nakrywkowe z komórkami na płytkę 12-dołkową.
    Przepłukać komórki roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) (1x) dwa razy i inkubować przez 10 minut w 4% paraformaldehydzie (PFA) (0,5 ml na studzienkę na płytce 12-dołkowej) w temperaturze RT.
    UWAGA: Utrwaloną próbkę można przykryć 2 ml PBS (1x) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie to konieczne do barwienia immunologicznego. PFA jest toksyczny i podejrzewa się, że powoduje raka. Zapobiegaj ekspozycji skóry i oczu oraz pracuj pod wyciągiem chemicznym.
  2. Blokować i przenikać komórki i inkubować z buforem blokującym zawierającym PBS (1x), 0,3% Triton X-100 i 10% normalnej surowicy koziej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C: wybarwić iPSC czynnikiem transkrypcyjnym wiążącym antyoktamery 4 (Oct4) i anty-specyficznym antygenem embrionalnym 4 (SSEA4), NSC z regionem Y box-2 anty-determinującym płeć (Sox2) i anty-Nestin, sfery nerwowe z anty-sparowanym box-6 (Pax6) i anty-Nestin, astrocyty z anty-glejowym fibrylarnym białkiem kwaśnym (GFAP) i białkiem wiążącym anty-S100 wapń β (S100β), i neurony DA z hydroksylazą anty-tyrozynową (TH), anty-β III tubuliną (Tuj 1), anty-synaptofizyną i anty-PSD-95 (0,5 ml pierwszorzędowego roztworu przeciwciała na studzienkę w 12-dołkowej płytce; szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów).
  4. Przemyć próbki PBS (1x) trzy razy przez 10 minut, z których każdy delikatnie kołysząc.
  5. Inkubować z roztworem przeciwciał drugorzędowych (1:800 w buforze blokującym, 0,5 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych Alexa Fluor na dołek na płytce 12-dołkowej) przez 1 godzinę w temperaturze RT z delikatnym kołysaniem.
  6. Inkubować komórki za pomocą Hoechst 33342 (1:5 000, 0,5 ml na studzienkę na 12-dołkowej płytce) w PBS (1x) przez 15 minut w RT w celu znakowania jąder.
  7. Zamontuj ogniwa za pomocą pożywki montażowej i wysusz przez noc w temperaturze pokojowej w celu obrazowania pod mikroskopem fluorescencyjnym w ciemności. Patrz rysunek uzupełniający S1, aby zapoznać się z ustawieniami i parametrami mikroskopu.

3. Pomiar objętości mitochondriów, MMP i mitochondriów za pomocą cytometrii przepływowej w żywych komórkach

  1. Zasiej komórki osobno w 4 dołkach na 6-dołkowej płytce, aż komórki osiągną 50%-60% zbieżności. Oznacz te cztery dołki jako #1, #2, #3 i #4.
  2. Pod koniec okresu hodowli przygotować 5 indywidualnych roztworów barwiących (500 μl na studzienkę na płytce 6-dołkowej) w następujący sposób: #1 tylko pożywka hodowlana (do studzienki #1 zawierającej tylko komórki do kontroli); #2-1 zawierająca FCCP (100 μM); #2-2 zawierająca FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) w pożywce hodowlanej; #3 zawierająca TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) w pożywce hodowlanej; #4 zawierająca MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) w PBS (1x) z 10% FBS. Zobacz Rysunek 1A, Tabela uzupełniająca S2 i Tabela materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tych związków i konfiguracji cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Użyj pożywki hodowlanej, aby przygotować roztwór barwiący. Rozgrzej podłoże i PBS (1x) w temperaturze pokojowej przed użyciem. FCCP jest toksyczny; Zapobiegaj narażeniu skóry i oczu oraz pracuj pod wyciągiem chemicznym.
  3. Odessać pożywkę z dołka #2 i dodać roztwór #2-1 (tylko FCCP). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  4. Odessać pożywkę z dołków #2 i #3 i dodać roztwór #2-2 (FCCP + TMRE + MTG) do dołka #2 i roztwór #3 (TMRE + MTG) do dołka #3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
  5. Odessać pożywkę z dołka #4 i dodać roztwór #4 (MitoSox Red + MTG). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  6. Odessać pożywkę ze wszystkich studzienek. Przemyć PBS (1x) (4 ml na dołek w płytce 6-dołkowej). Odłączyć komórki za pomocą 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek (1 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej) w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zneutralizuj odczynnik do dysocjacji komórek w 1 ml DMEM za pomocą 10% FBS (2 ml na dołek w 6-dołkowej płytce).
  7. Zebrać zawartość wszystkich studzienek do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować probówki o masie 300 × g przez 5 minut. Umyj granulki PBS (1x) raz lub dwa razy.
  8. Odessać supernatanty, ale pozostawić około 100 μl w probówkach. Zawiesić osady komórkowe w 300 μl PBS (1x). Przenieś komórki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Trzymaj lampy w ciemności przy RT.
  9. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego (z konfiguracją 3 niebieskich i 1 czerwonego lasera). Wykryj MTG w filtrze 1 (FL1) za pomocą filtra pasmowoprzepustowego 530/30, TMRE w filtrze 2 (FL2) za pomocą filtra pasmowoprzepustowego 585/40 i MitoSox Red w filtrze 3 (FL3) za pomocą filtra pasmowoprzepustowego 510/580.

4. Pomiar cytometrią przepływową podjednostek kompleksu MRC i TFAM w stałych komórkach

  1. Pod koniec okresu hodowli odłącz komórki (~106) przez dodanie odczynnika do dysocjacji komórek; następnie osadzaj i zbieraj komórki w probówce o pojemności 15 ml. Przemyć komórki przez odwirowanie z PBS (1x) dwukrotnie, odwirowując przy 300 × g przez 5 minut.
  2. Utrwalić komórki w 1,6% PFA (1 ml 1,6% PFA w probówce o pojemności 15 ml) w temperaturze pokojowej przez 10 min. Przemyć komórki przez odwirowanie z PBS (1x) dwukrotnie, odwirowując przy 300 × g przez 5 min.
  3. Przepuszczaj komórki lodowatym 90% metanolem (1 ml 90% metanolu w probówce o pojemności 15 ml) w temperaturze -20 °C przez 20 minut.
  4. Zablokować próbki w buforze blokującym zawierającym 0,3 M glicyny, 5% surowicy koziej i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) - frakcja V w PBS (1x) (1 ml buforu blokującego w probówce o pojemności 15 ml). Przemyć komórki przez odwirowanie z PBS (1x) dwukrotnie (jak w kroku 3.7).
  5. Inkubować komórki z następującymi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 30 min: anty-NDUFB10 (1:1,000) do pomiaru podjednostki kompleksu I, podjednostki flawoproteinowej kompleksu dehydrogenazy antybursztynianowej A (SDHA, 1:1,000) do pomiaru podjednostki kompleksu II i anty-COX IV (1:1,000) do pomiaru podjednostki kompleksu IV oraz przeciwciała anty-TFAM sprzężonego z Alexa Fluor 488 (1:400). Wybarwić tę samą liczbę komórek oddzielnie przeciwciałem anty-TOMM20 sprzężonym z Alexa Fluor 488 (1:400) przez 30 minut (1 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w probówce o pojemności 15 ml; szczegółowe informacje na temat przeciwciał znajdują się w Tabeli materiałów).
  6. Przemyć komórki PBS (1x) raz z odwirowaniem w ilości 300 × g przez 5 minut. Dodać przeciwciało drugorzędowe (1:400) do probówek z NDUFB10, SDHA i COX IV i inkubować komórki z tymi roztworami przez 30 minut.
  7. Przemyć komórki PBS (1x) jeden raz, odwirowując przy 300 × g przez 5 minut. Odessać supernatanty, pozostawiając około 100 μl w probówkach. Zawiesić osady komórkowe w 300 μl PBS (1x). Przenieść komórki do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml trzymanych w ciemności na lodzie.
  8. Przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym (z konfiguracją 3 niebieskich i 1 czerwonego lasera). Wykrywanie sygnałów w filtrze 1 (FL1) za pomocą filtra pasmowoprzepustowego 530/30. Patrz rysunek uzupełniający S2, aby zapoznać się z ustawieniami i parametrami mikroskopu.

5. Akwizycja i analiza cytometrii przepływowej

  1. Użyj niebarwionej rurki kontrolnej, aby ustawić wykresy punktowe obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) i obszaru rozproszenia bocznego (SSC-A) w oparciu o rozmiar i złożoność analizowanej populacji komórek. Patrz rysunek uzupełniający S2, aby zapoznać się z ustawieniami i parametrami mikroskopu.
    UWAGA: Skonfiguruj nieplamione formanty dla poszczególnych typów komórek.
  2. Użyj probówek kontrolnych bez plam, aby wybrać bramki dodatnie, i użyj jednokolorowych probówek kontrolnych, aby skompensować nakładanie się widma fluorescencji między MTG (fluorofor-1 [FL-1]) i TMRE (FL-2) w wielokolorowej cytometrii przepływowej. Użyj kontroli izotypu do kontroli ujemnej do monitorowania barwienia tła w próbkach MRC i TFAM. Użyj rurki FCCP jako kontroli depolaryzacji do barwienia TMRE.
  3. Odetnij obce szczątki, aby wybrać żywe komórki i główne bramkowanie z przodu i z boku wykresu punktowego (Rysunek 2A). Bramkuj dublety, używając wykresu wysokości rozproszenia do przodu (FSC-H) w porównaniu z (vs.) FSC-A, aby wykluczyć dublety, a także skonstruować wykres wysokości rozrzutu bocznego (SSC-H) w porównaniu z wykresem SSC-A (Rysunek 2A).
  4. Akwizycja danych (cytometr przepływowy)
    1. Używając próbek niebarwionych lub izotypowych jako kontroli negatywnej, utwórz bramkę powyżej głównej populacji zdarzeń jednokomórkowych, przeglądając SSC-A i różne filtry (FL1, FL2, FL3, FL4) (Rysunek 1B i Rysunek 2B).
  5. Analiza danych (oprogramowanie CFlow)
    1. Skopiuj położenie bramek na barwione próbki komórek i zapisz ilość dodatnio zabarwionych komórek do barwienia dodatniego.
    2. Dla każdej subpopulacji komórek wybierz wykres histogramu i przeanalizuj medianę intensywności fluorescencji (MFI) różnych kanałów filtrujących (FL1, FL2, FL3, FL4) (oś x).
      1. Oblicz poziomy TMRE, odejmując MFI FL2 komórek #2 poddanych działaniu FCCP od MFI FL2 od #3 próbek barwionych TMRE na histogramie, jak w równaniu (1) poniżej.
        Poziomy TMRE = MFI FL2 z próbek barwionych TMRE #3 - MFI FL2 komórek #2 poddanych działaniu FCCP (1)
      2. Oblicz konkretne wartości dla MMP i mitochondrialnego ROS według MFI w TMRE lub MitoSox Red, dzieląc wskaźnik objętości mitochondriów MTG.
      3. Obliczyć wartość właściwą dla podjednostki zespolonej i TFAM za pomocą MFI w wyrażeniu zespolonym lub TFAM, dzieląc wskaźnik objętości mitochondrialnej TOMM20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczny opis metody różnicowania i strategii cytometrii przepływowej jest pokazany w Rysunek 3. Ludzkie komórki iPS są różnicowane w rozety nerwowe, a następnie przenoszone do kultury zawiesinowej w celu różnicowania w sfery nerwowe. Sfery nerwowe są dalej różnicowane i dojrzewają do neuronów DA. Sfery nerwowe są dysocjowane na pojedyncze komórki w celu wytworzenia astrocytów glejowych, ponownie powlekanych w monowarstwach jako NSC, a następnie różnicowanych w astrocyty. Protokół ten za...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniżej znajdują się protokoły generowania neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC oraz oceny wielu aspektów funkcji mitochondriów za pomocą cytometrii przepływowej. Protokoły te umożliwiają efektywną konwersję ludzkich iPSC zarówno w neurony, jak i astrocyty glejowe oraz szczegółową charakterystykę funkcji mitochondriów, głównie w żywych komórkach. Protokoły zapewniają również strategię opartą na cytometrii przepływowej współbarwienia do pozyskiwania i analizowania wielu funkcji mitochondriów, w tym objętości, MMP i m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uprzejmie dziękujemy Centrum Obrazowania Molekularnego oraz Ośrodkowi Cytometrii Przepływowej na Uniwersytecie w Bergen w Norwegii. Prace te zostały sfinansowane przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych (numer grantu: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat oraz Chińską Radę Stypendialną (numer projektu: 201906220275).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anty-Oct4Abcamab19857, RRID:AB_445175Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 μ L w 1000 μ Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor ® 488 koza anty-królik IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne.
anty-SSEA4Abcamab16287, RRID:AB_778073Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 μ L w 1000 μ Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor ® 594 kozioł anty-mysi IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005) jako przeciwciało drugorzędowe.
anty-Sox2Abcamab97959, RRID:AB_2341193Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 μ L w 1000 μ Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor ® 488 koza anty-królik IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne.
anty-Pax6Abcamab5790, RRID:AB_305110Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 i mu; L w 1000 μ Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor ® 488 koza anty-królik IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne.
anty-NestinSanta Cruz Biotechnologysc-23927, RRID:AB_627994Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:50, 20 i mu; L w 1000 μ Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor ® 594 kozioł anty-mysi IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005) jako przeciwciało drugorzędowe.
anty-GFAPAbcamab4674, RRID:AB_304558Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 μ L w 1000 μ Roztwór do barwienia L;   korzystanie z Alexa Fluor ® 594 kozie przeciwciało anty-kurze IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11042) jako przeciwciało drugorzędowe.
anty-S100β   sprzężony z Alexa Fluor 488Abcamab196442, RRID:AB_2722596Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:400, 2,5 μ L w 1000 μ Roztwór do barwienia L;
anty-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 μ L w 1000 μ Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor ® 488 koza anty-królik IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne.
anty-Tuj 1Abcamab78078, RRID:AB_2256751Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:1000, 1 μ L w 1000 μ Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor ® 594 kozioł anty-mysi IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005) jako przeciwciało drugorzędowe.
anty-synaptofizynaAbcamab32127, RRID:AB_2286949Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 μ L w 1000 μ Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor ® 488 koza anty-królik IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne.
anty-PSD-95Abcamab2723, RRID:AB_303248Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 μ L w 1000 μ Roztwór do barwienia L;   korzystanie z Alexa Fluor ® 594 kozie przeciwciało anty-kurze IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11042) jako przeciwciało drugorzędowe.
anty-TFAM sprzężony z Alexa Fluor 488Abcamab198308Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:400, 2,5 i mu; L w 1000 μ Roztwór do barwienia L; stosować mysie monoklonalne IgG2b  Alexa Fluor® 488 jako kontrola izotypu.
anty-TOMM20 sprzężony z Alexa Fluor 488Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-17764 RRID:AB_628381Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:400, 2,5 i mu; L w 1000 μ Roztwór do barwienia L; stosować mysie monoklonalne IgG2a  Alexa Fluor® 488 jako kontrola izotypu.
anty-NDUFB10Abcamab196019Przeciwciało pierwotne; stosować jako 1:1000, 1 i mu; L w 1000 μ Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor ® 488 koza anty-królik IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało drugorzędowe; stosować królicze monoklonalne IgG jako kontrolę izotypu.
przeciwciało pierwszorzędowe anty-SDHAAbcamab137040; stosować jako 1:1000, 1 μ L w 1000 μ Roztwór do barwienia L;   korzystanie z Alexa Fluor ® 488 koza anty-królik IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało drugorzędowe; stosować królicze monoklonalne IgG jako kontrolę izotypu.
anty-COX IVAbcamab14744, RRID:AB_301443Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:1000, 1 μ L w 1000 μ Roztwór do barwienia L; posługiwać się  Alexa Fluor ® 488 kozie przeciwciała anty-mysie IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11001) jako przeciwciało drugorzędowe; używać mysiej monoklonalnej IgG jako kontroli izotypu.
Activin APeproTech120-14ESkładnik pożywki do różnicowania astrocytów
ABM Basal MediumLonzaCC-3187Podłoże bazowe do hodowli astrocytów
AGM SingleQuots Supplement PackLonzaCC-4123Suplement do hodowli astrocytów
Antybiotykowo-PrzeciwgrzybiczeThermo Fisher Scientific15240062Składnik CDM
Zaawansowany DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific 12634010Podłoże podstawowe do rozcieńczonego
albuminy surowicy bydlęcejGeltrex Europa BioproductsEQBAH62-1000Środek blokujący zapobiegający nieswoistemu wiązaniu przeciwciał w testach barwienia immunologicznego i składnik CDM
BDNFPeproTech450-02DA neurony średni składnik
B-27 SuplementThermo Fisher Scientific17504044Składnik pożywki do różnicowania astrocytów
Cytometr przepływowy BD Accuri C6 PlusBD Biosciences, USA
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowyThermo Fisher Scientific11905031Składnik CDM
Kolagenaza IVThermo Fisher Scientific17104019Odczynnik do delikatnej dysocjacji ludzkich iPSC
Kamera mikroskopowa CCD Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Niemcy
Corning Naczynia hodowlane bez obróbkiSigma-AldrichCLS430589Kultura zawiesinowa
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Używany do różnych mycia kultur komórkowych
DMEM/F-12, suplement GlutaMAXThermo Fisher Scientific10565018Różnicowanie astrocytów bazowe Medium
EDTAThermo Fisher Odczynnik do15575020 Scientific do delikatnej dysocjacji ludzkich iPSC
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher ScientificA1516901Podłoże bazowe do hodowli iPSC
Suplement Essential 8 (50X)Thermo Fisher ScientificA1517101Suplement do hodowli iPSC
EGF Rekombinowane białko ludzkieThermo Fisher ScientificPHG0314Suplement do hodowli NSC
FGF-podstawowy (AA 10– 155) Rekombinowane białko ludzkieThermo Fisher ScientificPHG0024Suplement do hodowli NSC
Surowica bydlęcapłodu Sigma-Aldrich12103CŚredni składnik
FGF-basicPeproTech100-18BPożywka do różnicowania astrocytów
FCCPAbcamab120081Eliminuje potencjał błony mitochondrialnej i barwienie
TMRESystem aspiracji płynów BVC controlVacuubrand, Niemcy
Formaldehyd (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Utrwalanie komórek
GeltrexThermo Fisher ScientificA1413302Służy do mocowania i konserwacji ludzkich iPSC
Suplement GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Suplement do hodowli NSC
GDNFPeprotech450-10DA neurony średni składnik
GlicynaSigma-AldrichG8898Służy do blokowania
buforu Mieszanka składników odżywczych F-12 szynkiThermo Fisher Scientific31765027Podłoże podstawowe dla CDM
Heregulina beta-1 ludzkaSigma-AldrichSRP3055Astrocyty różnicowanie
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Barwienie jąder do obrazu konfokalnego
Inkubatory CO2 Heracell 150iFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Podłoże podstawowe dla CDM
InsulinaRoche1376497składnik CDM
InSolution AMPK InhibitorSigma-Aldrich171261Składnik pożywki do indukcji neuronalnej
Insulinopodobny czynnik wzrostu-I ludzkiSigma-AldrichI3769Pożywka do różnicowania astrocytów
Składnik KnockOut DMEM/F-12 pożywkaThermo Fisher Scientific12660012Podłoże podstawowe do hodowli NSC
LamininSigma-AldrichL2020Wspomaga przyczepianie i wzrost komórek nerwowych in vitro
Mikroskop konfokalny Leica TCS SP8 STEDLeica Microsystems, Niemcy
MonotioglicerolSigma-AldrichM6145CDM składnik
MitoTracker Green FMThermo Fisher ScientificM7514Używany do wskaźnika objętości mitochondriów
MitoSox RedThermo Fisher ScientificM36008Używany do mitochondrialnego wskaźnika ROS
N-acetylo-L-cysteinaSigma-AldrichA7250Neural pożywka indukcyjna składnik
N-2 SuplementThermo Fisher Scientific17502048Składnik pożywki do różnicowania astrocytów
Normalna surowica koziaThermo Fisher ScientificPCN5000Służy do blokowania bufora
Wytrząsarki orbitalne - SSM1Stuart Equipment, Wielka Brytania
Roztwór poli-L-ornitynySigma-AldrichP4957Wspomaga przyczepianie i wzrost komórek nerwowych in vitro
Bromowodorek poli-D-lizynySigma-AldrichP7405Wspomaga przyczepianie i wzrost komórek nerwowych in vitro
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Wspomaga różnicowanie neuronów DA
ProLong Gold AntifadeMountant Thermo Fisher ScientificP36930Montaż szkiełka nakrywkowego do obrazu
konfokalnegoPBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Używany do różnych rodzajów prania
Rekombinowane białko ludzkie / mysie FGF-8b R& D Systems423-F8-025/CFWspomaga różnicowanie neuronów DA
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPIndukcja neuronalna Składnik
StemPro Neural SupplementThermo Fisher ScientificA10508-01Suplement do hodowli NSC
TrypLE Express EnzymeThermo Fisher Scientific12604013Odczynnik do dysocjacji komórek
TransferynaSkładnik Roche652202CDM
TRITON X-100VWR International9002-93-1Stosowany do przenikania komórek w testach barwienia immunologicznego
TMREAbcamab113852Używany do barwienia potencjału błony mitochondrialnej
Kąpiel wodna Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Instrumenty grantoweGrant Instruments, USA
składnika

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304(2021).
  3. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146(2020).
  4. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
  5. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  6. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583(2019).
  7. Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311(2019).
  8. Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
  9. Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449(2020).
  10. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337(2021).
  11. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  12. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  13. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
  15. Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400(2019).
  16. Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
  17. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  18. Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
  19. Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
  20. Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
  21. Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryMitochondrial ParametersInduced Pluripotent Stem CellsNeural DerivativesGlial DerivativesMitochondrial Membrane PotentialReactive Oxygen SpeciesMitochondrial VolumeMitochondrial DNA CopyMitochondrial Respiratory Chain

Related Articles