Method Article

Kolumny chromatograficzne powinowactwa błony komórkowej do identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z unieruchomionym receptorem kinazy tropomiozynowej B

DOI:

10.3791/63118

⸱

January 19th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, The University of Alabama, 2Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy, Hacettepe University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje przygotowanie kolumn chromatografii powinowactwa błony komórkowej (CMAC) z unieruchomionymi fragmentami błony komórkowej zawierającymi funkcjonalne białka transbłonowego receptora B kinazy tropomiozyny. Wyjaśniono również zastosowanie kolumn CMAC w identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z tymi receptorami i obecnych w złożonych mieszaninach naturalnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemikalia syntetyzowane przez rośliny, grzyby, bakterie i bezkręgowce morskie były bogatym źródłem nowych trafień i tropów narkotykowych. Leki takie jak statyny, penicylina, paklitaksel, rapamycyna lub artemizynina, powszechnie stosowane w praktyce medycznej, zostały po raz pierwszy zidentyfikowane i wyizolowane z produktów naturalnych. Jednak identyfikacja i izolacja biologicznie aktywnych wyspecjalizowanych metabolitów ze źródeł naturalnych jest trudnym i czasochłonnym procesem. Tradycyjnie, po ekstrakcji biomasy, poszczególne metabolity są izolowane i oczyszczane ze złożonych mieszanin. Następnie wyizolowane cząsteczki są testowane w testach funkcjonalnych w celu zweryfikowania ich aktywności biologicznej. W artykule przedstawiono zastosowanie kolumn chromatografii powinowactwa błony komórkowej (CMAC) do identyfikacji związków biologicznie czynnych bezpośrednio z mieszanin złożonych. Kolumny CMAC pozwalają na identyfikację związków oddziałujących z unieruchomionymi funkcjonalnymi białkami transbłonowymi (TMP) osadzonymi w ich natywnym środowisku dwuwarstwowym fosfolipidowym. Jest to podejście celowane, które wymaga znajomości TMP, którego aktywność zamierza się modulować za pomocą nowo zidentyfikowanego kandydata na lek małocząsteczkowy. W niniejszym protokole przedstawiamy podejście do przygotowania kolumn CMAC z unieruchomionym receptorem B kinazy tropomiozyny (TrkB), który stał się realnym celem do odkrycia leku na wiele zaburzeń układu nerwowego. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół montażu kolumny CMAC z unieruchomionymi receptorami TrkB przy użyciu linii komórkowych nerwiaka zarodkowego z nadekspresją receptorów TrkB. Dalej przedstawiamy podejście do badania funkcjonalności kolumny i jej wykorzystania w identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z receptorami TrkB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mieszanki botaniczne są bogate w farmakologicznie aktywne związki1, służąc jako dobre źródło do identyfikacji nowych trafień i potencjalnych leków2,3,4,5. Odkrycie nowych leków z produktów naturalnych było owocnym podejściem i wiele obecnie zatwierdzonych leków pochodzi ze związków zidentyfikowanych po raz pierwszy w przyroda. Różnorodność chemiczna naturalnych związków jest trudna do dopasowania przez stworzone przez człowieka biblioteki chemicznie syntetyzowanych cząsteczek. Wiele naturalnych związków oddziałuje i moduluje ludzkie cele białkowe i można je uznać za ewolucyjnie zoptymalizowane cząsteczki podobne do leków6. Te naturalne związki szczególnie dobrze nadają się do identyfikacji ołowiu leku do stosowania w zaburzeniach neurologicznych6. Dwa z obecnie zatwierdzonych przez FDA leków stosowanych w leczeniu choroby Alzheimera (AD) pochodzą z naturalnych alkaloidów, a mianowicie: galantaminy i rywastygminy (pochodna fizostygminy)6. L-DOPA, obecnie najczęściej przepisywany lek na chorobę Parkinsona, został po raz pierwszy zidentyfikowany z bobu (Vicia faba L.)7. Pergolid i lizuryd, agoniści receptorów dopaminergicznych są pochodnymi naturalnych alkaloidów sporyszu pasożytniczego grzyba Claviceps purpurea8. Rezerpina, alkaloid wyizolowany z węża indyjskiego (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) był jednym z pierwszych leków przeciwpsychotycznych9. Ostatnio rozregulowana odpowiedź immunologiczna i ogólnoustrojowe stany zapalne zostały powiązane z rozwojem licznych dolegliwości neurologicznych, takich jak duże zaburzenie depresyjne lub choroby neurodegeneracyjne10. Stwierdzono, że dieta roślinna wraz z innymi interwencjami związanymi ze stylem życia poprawia zdolności poznawcze i funkcjonalne u osób starszych11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Stwierdzono, że niektóre cząsteczki elektrofilowe należące do triterpenów i polifenoli modulują reakcje zapalne zarówno w modelach in vitro, jak i in vivo12. Na przykład naturalne związki zawierające α,β-nienasycony karbonyl (np. kurkumina, aldehyd cynamonowy) lub grupę izotiocyjanianów (np. sulforafan) zakłócają dimeryzację receptora Toll-like 4 (TLR4), hamując dalszą syntezę cytokin pro-zapalnych w mysiej linii komórkowej pro-B zależnej od interleukiny-312,22. Dowody epidemiologiczne wskazują jednoznacznie, że fitochemikalia dietetyczne, obecne w złożonych matrycach żywnościowych, mogą również stanowić realne źródło nowych leków leads6.

Jedną z głównych przeszkód w identyfikacji biologicznie aktywnych cząsteczek obecnych w ekstraktach roślinnych, w tym w żywności pochodzenia roślinnego, jest złożoność badanych próbek. Tradycyjnie, poszczególne związki są izolowane, oczyszczane, a następnie badane pod kątem aktywności biologicznej. Takie podejście zwykle prowadzi do identyfikacji najobficiej występujących i najlepiej scharakteryzowanych związków. Podejścia do odkrywania leków fenotypowych bez zdefiniowanego celu molekularnego opierają się na biokierowanym frakcjonowaniu złożonych mieszanin23. W tym podejściu ekstrakt jest frakcjonowany na mniej złożone podfrakcje, które są następnie testowane w testach fenotypowych. Izolacja i oczyszczanie związków aktywnych odbywa się w oparciu o zweryfikowaną w teście aktywność biologiczną. Wiedza o tożsamości określonego celu działania leku może znacząco przyspieszyć identyfikację związków farmakologicznie czynnych obecnych w złożonych mieszaninach. Podejścia te zwykle opierają się na unieruchomieniu celu molekularnego, na przykład enzymu, na stałej powierzchni, takiej jak kulki magnetyczne23. Unieruchomione cele są następnie wykorzystywane w eksperymentach przesiewowych, w wyniku których dochodzi do wyizolowania związków oddziałujących z celem. Chociaż podejście to było szeroko stosowane w identyfikacji związków ukierunkowanych na białka cytozolowe, rzadziej było stosowane w identyfikacji substancji chemicznych oddziałujących z białkami transbłonowymi (TMPs)23. Dodatkowym wyzwaniem w immobilizacji TMP jest fakt, że aktywność białka zależy od jego interakcji z fosfolipidami błony komórkowej i innymi cząsteczkami w dwuwarstwie, takimi jak cholesterol23,24. Ważne jest, aby zachować te subtelne interakcje między białkami a ich natywnym środowiskiem dwuwarstwowym fosfolipidowym podczas próby unieruchomienia celu transbłonowego.

W chromatografii powinowactwa błony komórkowej (CMAC) fragmenty błony komórkowej, a nie oczyszczone białka, są unieruchomione na cząstkach fazy stacjonarnej sztucznej błony (IAM)23. Fazy stacjonarne IAM są przygotowywane przez kowalencyjne wiązanie analogów fosfatydylocholiny z krzemionką. Ostatnio opracowano nowe klasy stacjonarnych faz IAM, w których grupy wolnych amin i silanoli są zakończone (IAM. Komputer osobisty. Cząstki DD2). Podczas przygotowania kolumn CMAC fragmenty błony komórkowej są unieruchamiane na powierzchni cząstek IAM poprzez adsorpcję.

Kolumny CMAC były do tej pory używane do unieruchamiania różnych klas TMP, w tym kanałów jonowych (np. receptorów nikotynowych), GPCR (np. receptorów opioidowych), transporterów białek (np. p-glikoproteiny), itd.24. Unieruchomione cele białkowe znalazły zastosowanie w charakterystyce farmakodynamiki (np. stałej dysocjacji, Kd) lub wyznaczaniu kinetyki wiązania (kon ik off) ligandów drobnocząsteczkowych oddziałujących z celem, a także w procesie identyfikacji potencjalnych nowych odprowadzeń leków obecnych w złożonych matrycach24. W artykule przedstawiono przygotowanie kolumn CMAC z unieruchomionym receptorem kinazy tropomiozynowej B (TrkB), który stał się realnym celem do odkrycia leków na liczne zaburzenia układu nerwowego.

Poprzednie badania wykazały, że aktywacja szlaku czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF)/TrkB wiąże się z poprawą niektórych dolegliwości neurologicznych, takich jak AD lub duże zaburzenie depresyjne25,26,27,28. Doniesiono, że poziom BDNF i ekspresja jego receptora TrkB zmniejszają się w AD, a podobne redukcje upośledzają funkcję hipokampa w modelach zwierzęcych AD29. Obniżone poziomy BDNF odnotowano w surowicy i mózgu pacjentów z AD30,31,32. Stwierdzono, że nadekspresja tau lub hiperfosforylacja obniżają ekspresję BDNF w pierwotnych neuronach i modelach zwierzęcych AD33,34,35. Ponadto donoszono, że BDNF ma działanie ochronne na neurotoksyczność wywołaną β-amyloidem in vitro i in vivo36. Wykazano, że bezpośrednie podawanie BDNF do mózgu szczura zwiększa uczenie się i pamięć u zwierząt z zaburzeniami poznawczymi37. BDNF/TrkB okazał się ważnym celem dla poprawy zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych, w tym AD28,38. Ukierunkowanie na szlak sygnałowy BDNF/TrkB w celu opracowania terapii w chorobie Alzheimera potencjalnie poszerzy naszą wiedzę na temat choroby39. Niestety, sam BDNF nie może być stosowany w leczeniu ze względu na jego słabe właściwości farmakokinetyczne i niepożądane skutki uboczne40. Aktywatory małych cząsteczek szlaków TrkB/BDNF zostały zbadane jako potencjalne ligandy TrkB41,42,43. Wśród badanych agonistów małocząsteczkowych wykazano, że 7,8-dihydroksyflawon (7,8-DHF) aktywuje szlak BDNF/TrkB41,44,45,46. Pochodna 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenylo-4H-chromeno-7,8-diyl bis(metylokarbaminian)) jest obecnie rozważana jako możliwy lek dla AD47. Niedawno wykazano, że kilka leków przeciwdepresyjnych działa poprzez bezpośrednie wiązanie się z TrkB i promowanie sygnalizacji BDNF, co dodatkowo podkreśla znaczenie dążenia do TrkB jako ważnego celu w leczeniu różnych zaburzeń neurologicznych48.

Protokół opisuje proces składania funkcjonalnej kolumny TrkB i kolumny kontroli negatywnej TrkB-NULL. Kolumny scharakteryzowano przy użyciu znanego naturalnego produktu małocząsteczkowego liganda: 7,8-DHF. Dodatkowo opisujemy proces przesiewowych złożonych matryc, na przykładzie ekstraktu roślinnego, w celu identyfikacji związków oddziałujących z TrkB.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y (linie komórkowe TrkB i TrkB-NULL (rodzicielskie))

UWAGA: Linie komórkowe (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) i SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 zostały zakupione od Kerafast. Hodowane komórki są wykorzystywane jako źródło receptorów transbłonowych, które mają zostać unieruchomione w celu przygotowania kolumn CMAC. Poniższe kroki opisują, jak uzyskać fragmenty błony komórkowej i złożyć funkcjonalne kolumny CMAC.

  1. Hodować komórki w pożywce do hodowli komórkowych przygotowanej przez zmieszanie 450 ml pożywki RPMI, 50 ml FBS, 5 ml roztworu penicyliny/streptomycyny i 0,3 mg/ml genetycyny (G418) w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 150 mm w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 .

2. Zbieranie komórek

  1. Potwierdź konfluencję komórek (80%-90%) za pomocą mikroskopu, osiągniętą po 3-4 dniach od pasażowania komórek.
  2. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych znad komórek i dwukrotnie przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, 1x, pH 7,4). Usuń PBS i dodaj 2 ml trypsyny o niskim stężeniu (0,25%), aby odłączyć komórki.
  3. Delikatnie zamieszać płytkę, aby równomiernie pokryć wszystkie komórki roztworem trypsyny i inkubować komórki przez około 2 minuty w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 . Dodać 8 ml pożywki do hodowli komórkowych do oddzielających się komórek i przenieść oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i umieścić na lodzie.
  4. Użyj hemocytometru, aby oszacować liczbę komórek (około 3 x 107 komórek). Wymieszać zawiesinę komórkową, pipetując w górę i w dół, aby uzyskać równomierną gęstość komórek w mieszaninie. Umieść 10 μl zawiesiny komórek pod szkiełkiem nakrywkowym i policz komórki pod mikroskopem za pomocą obiektywu 40x.

3. Homogenizacja komórek

  1. Przygotować roztwory podstawowe następujących inhibitorów proteazy: benzamidyny (200 mM), fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF, 10 mM) oraz dostępnego w handlu koktajlu inhibitorów proteazy (stężenie 100x) zawierającego chlorowodorek fluorku 4-(2-aminoetylo)benzenesulfonylu (AEBSF), aprotyninę, bestatynę i leupeptynę.
    UWAGA: PMSF należy obsługiwać wyłącznie wewnątrz dygestorium.
    1. Przygotować roztwór podstawowy benzamidyny (200 mM), rozpuszczając 120 mg benzamidyny w 5 ml ultraczystej wody dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu jednego dnia. Świeżo przygotowany roztwór przed każdym użyciem (zalecane).
    2. Przygotować roztwór podstawowy PMSF (10 mM), rozpuszczając 0,017 g PMSF w 10 ml etanolu. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Przygotuj koktajl inhibitorów proteazy (100x), rozpuszczając dostępną w handlu mieszaninę inhibitorów proteazy w 1 ml ultraczystej wody dejonizowanej. Dokładnie wymieszać i podać 200-300 μl koktajlu i przechowywać w temperaturze -20 °C przed użyciem.
  2. Przygotować roztwór podstawowy ATP (100 mM) rozpuszczając 55,114 mg hydratu soli disodowej ATP w 1 ml dejonizowanej ultraczystej wody. Dokładnie wymieszać i podać 100 μl mieszaniny i przechowywać w temperaturze -20 °C przed użyciem.
  3. Przygotować bufor, rozpuszczając 3,03 g chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl, 50 mM), 2,9 g chlorku sodu (NaCl, 100 mM), 0,22 g bezwodnego chlorku wapnia (CaCl2,3 mM), 0,2 g sześciowodnego chlorku magnezu (MgCl2,2 mM) i 0,19 chlorku potasu (KCl, 5 mM) w 500 ml ultraczystej wody dejonizowanej.
  4. Przygotować bufor homogenizacyjny, mieszając 17,3 ml buforu przygotowanego w kroku 3.3 z 0,3 ml (3 mM) roztworu podstawowego benzamidyny, 0,2 ml (0,1 mM) roztworu podstawowego PMSF, 0,2 ml mieszaniny koktajlowej inhibitorów proteazy, 20 ml (100 μM) roztworu podstawowego ATP, 2 ml (10%) glicerolu i 0,029 g (5 mM) EDTA (Tabela 1). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą roztworu kwasu solnego.
  5. Odwirować komórki zebrane w kroku 2.3 w temperaturze 4 °C przez 5 minut w temperaturze 400 x g. Usunąć supernatant i przemyć pozostały osad komórkowy 10 ml lodowatego PBS (1x, pH 7,4). Ponownie odwirować komórki w temperaturze 4 °C przez 5 minut w temperaturze 400 x g.
  6. Odrzucić supernatant i zastąpić go 20 ml buforu homogenizacyjnego przygotowanego w kroku 3.4. Umieść stożkową rurkę na lodzie.
  7. Przenieś zawiesinę komórek do 40 ml homogenizatora Dounce i umieść ją na lodzie. Homogenizuj zawieszenie ręcznie, na lodzie, używając 40 ruchów tłuczka góra-dół. Przenieść homogenizowaną zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  8. Odwirować homogenat w temperaturze 4 °C przez 7 minut przy 400 x g. Odrzucić osad i przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki i odwirować go w temperaturze 4 °C przez 30 minut przy 47900 x g. Zachowaj osad błony komórkowej i wyrzuć supernatant.

4. Solubilizacja błony komórkowej

  1. Przygotować bufor do solubilizacji, mieszając 8,7 ml roztworu buforowego sporządzonego w kroku 3.3 z 0,1 ml (0,1 mM) roztworu podstawowego PMSF, 0,15 ml (3 mM) roztworu podstawowego benzamidyny, 0,1 ml koktajlu inhibitorów proteazy, 10 ml (100 μM) roztworu podstawowego ATP, 1 ml (10%) glicerolu i 0,2 g (2%) cholanu sodu (Tabela 2).
  2. Przenieść bufor do solubilizacji do stożkowej probówki z fragmentami błony komórkowej otrzymanymi w kroku 3.8 i ponownie zawiesić osad. Obracać powstałą mieszaninę z prędkością 150 obr./min w temperaturze 4 °C przez 18 h.
    UWAGA: W tym momencie eksperyment można wstrzymać w celu rozeznania osadu błony komórkowej przez noc.

5. Unieruchomienie błony komórkowej na IAM. Komputer osobisty. Cząstki DD2

  1. Po 18 godzinach odwirować mieszaninę solubilizacyjną w temperaturze 4 °C przez 30 minut przy 47900 x g.
  2. Zachować supernatant i wyrzucić osad. Dodać 100 mg IAM. Komputer osobisty. Cząstki DD2 do supernatantu wirują i obracają powstałą mieszaninę zawiesiny z prędkością 150 obr./min w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
  3. Aby ułatwić unieruchomienie fragmentów błony komórkowej na IAM. Komputer osobisty. Cząsteczki DD2 przechodzą do etapu dializy, jak opisano poniżej.
    1. Przygotować bufor do dializy w 4 litrach ultraczystej wody dejonizowanej, dodając 24 g tris-HCl (50 mM), 23,4 g NaCl (100 mM), 0,06 g CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g EDTA (5 mM) i 0,07 g PMSF (0,1 mM; Tabela 3).
      UWAGA: PMSF nie rozpuszcza się w wodzie, dlatego należy go najpierw rozpuścić w małej objętości etanolu, a następnie powoli dodawać do zlewki z buforem.
    2. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą roztworu kwasu solnego. Umieścić bufor w temperaturze 4 °C na co najmniej 1 godzinę przed przejściem do etapu dializy.
    3. Przygotować rurkę dializacyjną, przecinając 10 cm rurki do dializy z membraną celulozową (10 K MWCO, 35 mm) i przenieść zawiesinę zawierającą IAM. Komputer osobisty. Cząsteczki DD2 i fragmenty błony komórkowej do rurki dializowej. Użyj zacisków do rurki dializowej, aby zamknąć oba końce rurki dializowej.
    4. Umieścić rurkę dializacyjną zawierającą IAM. Komputer osobisty. DD2 w buforze do dializy i dializować w temperaturze 4 °C przez 24 godziny, delikatnie mieszając.
    5. Po upływie 24 godzin umieścić rurkę do dializy w świeżo przygotowanym buforze do dializy i kontynuować dializę przez kolejne 24 godziny.

6. Pakowanie kolumn CMAC

  1. Przygotować bufor octanu amonu (10 mM, pH 7,4), który zostanie użyty do przepłukania IAM. Komputer osobisty. Cząstki DD2 i eksperymenty z charakterystyką kolumnową przez rozpuszczenie 0,7708 g octanu amonu w 1 litrze ultraczystej wody dejonizowanej. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą roztworu kwasu solnego.
  2. Po 48 godzinach dializy wyjąć rurkę dializacyjną z buforu dializacyjnego i przenieść zawartość rurki dializacyjnej do stożkowej rurki o pojemności 15 ml.
  3. Odwirować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 400 x g. Odrzucić sklarowany osad i przemyć pozostały osad trzykrotnie 10 ml buforu octanu amonu, odwirowując mieszaninę w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 400 x g, po każdym przemyciu.
  4. Po trzecim przemyciu ponownie zawiesić pozostały osad w 1 ml buforu octanu amonu. Dokładnie wymieszaj i użyj powstałej zawiesiny do wypełnienia szklanej kolumny 5/20, aby uzyskać kolumnę chromatograficzną CMAC.
  5. Aby upakować kolumnę, najpierw umieść dolny filtr uprzednio nasączony buforem octanu amonu w uchwycie filtra. Zamontuj uchwyt filtra w szklanej kolumnie i przykręć nasadkę kolumny, aby zabezpieczyć pozycję uchwytu. Umieść kolumnę pionowo w zacisku palcowym i zabezpiecz ją w stojaku laboratoryjnym. Umieść zlewkę pod kolumną.
  6. Za pomocą pipety jednokanałowej przenieść niewielką objętość zawiesiny otrzymanej w kroku 6.4 do szklanej kolumny. Wlewaj materiał powoli, przytrzymując końcówkę pipety przy ściance szklanej kolumny. Poczekaj, aż materiał opakowaniowy osiądzie przed wlaniem kolejnej objętości gnojowicy.
  7. Aby przyspieszyć proces pakowania, należy usunąć bufor znad nieruchomego łoża za pomocą mikropipety między każdym etapem. Powtarzaj te kroki, aż 1 ml gnojowicy zostanie zapakowany.
  8. Umieść górny filtr i przykręć adapter tak, aby nad fazą stacjonarną nie pozostał bufor, jak pokazano na Rysunek 1. Zabezpiecz pozycję adaptera za pomocą blokady adaptera.
  9. Podłączyć kolumnę do pompy do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), ustawić natężenie przepływu na 0,2 ml/min i przepłukać kolumnę przez noc buforem octanu amonu. Kolumna jest teraz gotowa do etapu charakteryzacji. Przechowywać kolumnę w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    UWAGA: W przypadku dłuższego przechowywania (kolumna nie jest używana dłużej niż tydzień) uruchomić kolumnę z 0,05% roztworem azydku sodu w buforze octanu amonu i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Azydek sodu jest wysoce toksyczny po spożyciu doustnym lub wchłonięciu przez skórę; Należy go obsługiwać tylko pod wyciągiem. Upewnij się, że nosisz fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice (preferowany nitryl) podczas pracy z azydkiem sodu.

7. Charakterystyka kolumny CMAC

  1. Mikroskopia konfokalna i wiązanie BDNF
    1. Przygotuj IAM. PCC. Cząstki fazy stacjonarnej DD2 z unieruchomionymi fragmentami błony komórkowej uzyskanymi oddzielnie z komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y z nadekspresją komórek TrkB i SH-SY5Y TrkB-NULL, postępując zgodnie z instrukcjami od kroku 1 do kroku 6.4.
    2. W przypadku próbek, które będą inkubowane z BDNF przed barwieniem przeciwciałami, należy przygotować roztwór podstawowy BDNF, rozpuszczając 10 μg BDNF w 100 μl ultraczystej wody dejonizowanej. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
      1. Przenieść w oddzielnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, 100 μl podwielokrotności IAM. Komputer osobisty. Materiał wypełniający kolumnę DD2 z unieruchomionymi komórkami nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y z nadekspresją TrkB i 100 μL podwielokrotności IAM. Komputer osobisty. Materiał wypełniający kolumnę DD2 z unieruchomionymi komórkami SH-SY5Y TrkB-NULL zawieszonymi w buforze octanu amonu.
      2. Dodać 390 μl buforu octanu amonu, 10 μl roztworu podstawowego BDNF i 0,5 μl roztworu podstawowego ATP (przygotowanego w kroku 3.2) do każdej probówki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z kołysaniem.
    3. W przypadku próbek, które nie będą inkubowane z BDNF przed barwieniem przeciwciałami, należy przenieść 100 μl podwielokrotności IAM. Komputer osobisty. Materiał wypełniający kolumnę DD2 z unieruchomionymi komórkami nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y z nadekspresją TrkB zawieszonymi w octanie amonu w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    4. Dodać 400 μl buforu octanu amonu i 0,5 μl roztworu podstawowego ATP (przygotowanego w kroku 3.2) do każdej probówki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z kołysaniem.
    5. Próbki przygotowane w krokach 7.1.2 i 7.1.4 należy wirować w temperaturze 4 °C przez 1 minutę w temperaturze 10 000 x g i odrzucić sklarowany nad osadem.
    6. Przemyć powstałe granulki 500 μl buforu octanu amonu przez 10 minut i ponownie wirować w temperaturze 4 °C przez 1 minutę przy 10 000 x g i odrzucić supernatant.
    7. Do każdej z pastylek dodać 220 μl buforu octanu amonu, 25 μl 10% normalnej surowicy koziej i 5 μl pierwszorzędowego przeciwciała anty-BDNF. Inkubować w chłodnym pomieszczeniu (4 °C) przez noc z bujaniem.
    8. Po zakończeniu etapu inkubacji wirować mieszaninę przez 1 minutę w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    9. Otrzymany osad przepłukać 3 razy buforem octanu amonu zawierającym 1% łagodnego detergentu (np. cholanu sodu) przez 10 minut i wirować mieszaniny przez 1 minutę w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatant.
    10. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, mieszając 900 μl buforu octanu amonu, 100 μl 10% normalnej surowicy koziej i 1 μl przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem (rozcieńczenie 1:1,000). Dodać 300 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej z osadek otrzymanych w kroku 7.1.9. i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z bujaniem.
    11. Wirować mieszaninę w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    12. Przemyć otrzymany osad 3 razy buforem octanu amonu zawierającym 1% łagodnego detergentu (np. cholanu sodu) przez 10 minut i wirować mieszaninę przez 1 minutę przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatant.
    13. Zawiesić powstałe granulki w 50 μl buforu octanu amonu. Umieścić 20 μl każdej z mieszanin na szkiełku podstawowym i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
    14. Obraz IAM. Komputer osobisty. Cząstki DD2 z unieruchomionymi fragmentami błony komórkowej za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego ze wzbudzeniem przy długości fali 488 nm i emisją przy długości fali 520 nm wygenerowane za pomocą systemu laserowego na ciele stałym. Użyj obiektywu 20x o współczynniku NA 0,75 mm i WD 0,35 mm.
  2. Chromatografia powinowactwa czołowego z użyciem 7,8-DHF jako liganda markerowego
    1. Podłączyć kolumnę CMAC do systemu HPLC z detektorem diodowym i/lub spektrometrem masowym.
    2. Przygotować 500 ml 1 ml 1 mM roztworu 7,8-DHF w buforze octanu amonu zawierającym 5% metanolu.
    3. Przepompować stałe stężenie liganda znacznikowego (1 mM) przez kolumnę CMAC przy natężeniu przepływu 0,4 ml/min w temperaturze pokojowej. Monitorować profil elucji za pomocą detektora detekcji matrycy diodowej (DAD) (długość fali 254 nm) lub spektrometru mas (użyć trybu monitorowania pojedynczych jonów; m/z 253 w trybie jonizacji ujemnej).
    4. Po zakończeniu cyklu należy przeprowadzić płukanie przez noc, przepuszczając bufor octanu amonu przez kolumnę.
    5. Powtórzyć kroki 7.2.2-7.2.4, stosując różne stężenia liganda znacznikowego (750 nM, 500 nM, 300 nM), przemując kolumny przez noc po każdym przebiegu. Użyj chromatografii powinowactwa czołowego, aby obliczyć ligand Kd, zgodnie ze szczegółowym przeglądem, w innym miejscu. 24,51
  3. Badania przemieszczenia z Centella asiatica (L.) Urb. Ekstrakt z (gotu kola)
    1. Przygotować 500 ml 500 nM roztworu 7,8-DHF o stężeniu 500 nM w buforze octanu amonu zawierającym 5% metanolu i 0,2% wodnego ekstraktu gotu kola (10 mg/ml).
    2. Przepompować stałe stężenie liganda znacznikowego (500 nM) z ekstraktem przez kolumnę przy natężeniu przepływu 0,4 ml/min w temperaturze pokojowej. Monitorować profil elucji za pomocą detektora DAD (długość fali 254 nm) lub spektrometru masowego (użyć trybu monitorowania pojedynczych jonów; m/z 253 w trybie jonizacji ujemnej).
    3. Po zakończeniu cyklu należy przeprowadzić płukanie przez noc, przepuszczając bufor octanu amonu przez kolumnę.
    4. Wykreślić profile elucji dla 500 nM 7,8-DHF i profile otrzymane po uruchomieniu roztworu z ekstraktem gotu kola w celu sprawdzenia przemieszczenia liganda markerowego.

8. Brak metody chromatografii szczytowej w celu identyfikacji potencjalnych spoiw TrkB z ekstraktu gotu kola

  1. Frakcjonowanie ekstraktu z gotu kola na kolumnach CMAC
    1. Podłączyć oddzielnie kolumny CMAC TrkB i TrkB-NULL do systemu HPLC i wstrzyknąć 50 μl wodnego ekstraktu gotu kola (10 mg/ml) na każdą z kolumn. Przepompować bufor octanu amonu (10 mM, pH 7,4) zawierający 5% metanolu przez kolumnę z prędkością przepływu 0,4 ml/min w temperaturze pokojowej.
    2. Zbierz frakcje oddzielnie od kolumn CMAC TrkB i TrkB-NULL w następujący sposób: 0-5 min, 5-10 min, 10-15 min, 15-20 min, 20-25 min, 25-30 min, 30-35 min, 35-40 min, 40-45 min, 45-50 min, 50-55 min, 55-60 min.
    3. Otrzymane frakcje należy zamrozić i liofilizować. Ponownie zawiesić liofilizowane frakcje w 50 μl metanolu przed przystąpieniem do ultrasprawnej chromatografii cieczowej i analizy spektrometrii mas.
  2. Ultra-sprawna chromatografia cieczowa z kwadrupolową spektrometrią mas czasu przelotu (UPLC-QTOF-MS) analiza frakcji CMAC gotu kola
    1. Przeanalizować wszystkie frakcje otrzymane w pkt 8.1.3 przy użyciu spektrometru mas sprzężonego z systemem UPLC (tryb analizy UPLC-MSE). Analizuj frakcje za pomocą kolumny C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) z kolumną wstępną C18 VanGuard (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm).
    2. Eluować kolumnę przy użyciu następujących roztworów gradientowych przy natężeniu przepływu 0,3 ml/min z fazą ruchomą A (woda z 0,1% kwasem mrówkowym) i B (acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym): 0,0 min 99% A 1% B, 1,5 min 84% A 16% B, 5,0 min 80% A 20% B, 7,0 min 75% A 25% B, 10,0 min 65% A 35% B, 20,0-24,0 min 1% A 99% B, 25,0-29,0 min 99% A 1% B.
    3. Ustaw objętość iniekcji dla każdej próbki na 3 μl. Wykonaj MSE w trybach jonów dodatnich i ujemnych, z energią zderzenia na poziomie 4 V dla niskiej energii i 20-35 V dla wysokiej energii.
    4. W trybie jonizacji dodatniej należy stosować następujące warunki źródła ESI: napięcie kapilarne 1,5 kV, stożek próbkowania 40 V, przesunięcie źródła 80, temperatura źródła 100 °C, temperatura desolwatacji 350 °C, przepływ gazu w stożku 38,0 l/h, gaz do desolwatacji 400 l/h.
    5. W trybie jonizacji ujemnej należy stosować następujące warunki źródła ESI: napięcie kapilarne 1,45 kV, stożek próbkowania 40 V, przesunięcie źródła 80, temperatura źródła 110 °C, temperatura desolwatacji 300 °C, przepływ gazu w stożku 50,0 l/h, przepływ gazu w procesie desolwatacji 652 l/h.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem, zmontowano dwie kolumny chromatograficzne CMAC: jedną z unieruchomionymi fragmentami błony komórkowej nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y z nadekspresją TrkB i drugą z fragmentami błony komórkowej SH-SY5Y TrkB-NULL. Prawidłowo zmontowana kolumna CMAC jest przedstawiona w Rysunek 1, a etapy związane z unieruchomieniem fragmentu błony komórkowej są przedstawione w Rysunek 2.

Od momentu unieruchomienia receptorów TrkB na IAM. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja związków czynnych obecnych w złożonych mieszaninach wyspecjalizowanych metabolitów jest bardzo trudnym zadaniem23. Tradycyjnie izoluje się poszczególne związki, a ich aktywność bada się w różnych testach. Podejście to jest czasochłonne i kosztowne i często prowadzi do izolacji i identyfikacji najliczniejszych i najlepiej scharakteryzowanych związków23. Obecnie stosowane wysokoprzepustowe testy przesiewowe opierają się w dużej mierze na przesiewowych biblioteka...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łukasz Cieśla współpracuje z firmą Regis Technologies, dostawcą IAM. Komputer osobisty. Cząsteczki DD2.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z.C.A. był wspierany przez Naukową i Technologiczną Radę Badań Naukowych Turcji (TUBITAK) 2219- Międzynarodowy Program Stypendialny dla Doktorantów. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowe Centrum Medycyny Komplementarnej i Integracyjnej Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem nagrody 1R41AT011716-01. Praca ta była również częściowo wspierana przez American Society of Pharmacognostyy Research Starter Grant, grant Regis Technologies dla L.C. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
7-8 Hydrat dihydroksyflawonuSigma-AldrichD5446-10 mg≥ 98% (HPLC)
Adenozyno-5'-trifosforan (ATP) sól disodowa hydratSigma-AldrichA2383-1 g
Octan amonuVWR Chemicals BDHBDH9204-500 g
Przeciwciało BDNFInvitrogenPA5-15198-400 μ LPrzeciwciało pierwszorzędowe; Stężenie 2 mg/ml
Hydrat chlorowodorku benzamidynySigma-AldrichB6506-25 g
Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) ludzkiSigma-AldrichB3795-10 μ gRekombinant, wyrażony w E. coli, liofilizowany proszek, odpowiedni do hodowli komórkowych
Chlorek wapniaVWR AnalyticalBDH9224-1 kg
Sól sodowa kwasu cholowegoAlfa AesarJ62050-100 g
Homogenizator DounceVWR71000-51640 mL, 285 mm (długość całkowita), 32 x 140 mm (OD x H)
EtanolSigma-Aldrich493511
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)VWR AnalyticalBDH-9232-500 g
Surowica bydlęcapłodu Sigma-AldrichF2442-500 mlsterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowych
G418 roztwór soli dwusiarczanowejSigma-AldrichG8168-100 ml50 mg/ml w H2O, 0,1 μ m filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych
GlycerolVWR Life ScienceE520-100 mL
Unieruchomiona sztuczna membrana (IAM. Komputer osobisty. DD2)Regis Technologies, Inc.1-771050-500
Sześciowodny chlorek magnezuVWR AnalyticalBDH9244-500 ml
MetanoluSigma-Aldrich322425
Nikon C2 DUVbKonfokalny laserowy mikroskop skaningowyNikon
Normalna kozia surowica (10%)Life Technologies50197Z
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333-100 mL
Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)Thermo Scientific36978-5 g
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)VWR Life ScienceK812-500 ml1x
Chlorek potasuVWR Chemicals BDH0395-1 kg
Koktajl inhibitorów proteazyVWR Life Science AmbresoM221-1 mlStopień proteomiczny, zawierający 50 mM AEBSF, 30 &mikro; M aprotonina, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 i 1 mM leupeptyna
RPMI-1640 podłożeSigma-AldrichR8758-500 mLz L-glutaminą i wodorowęglanem sodu, płynne, sterylnie filtrowane, odpowiednie do hodowli komórkowych
Przeciwciało drugorzędowe koza anty-królicze IgG (H+L)Invitrogen Alexa Mąka Plus 488A32731
SH-SY5Y Linie komórkowe nerwiaka zarodkowego eksprymujące Trk-BKerafastECP007
Linia komórkowa SH-SY5Y Trk-NULLKerafastECP005
Rurka do dializy ze skóry wężaThermo Scientific8824510K MWCO, 35 mm sucha średnica wewnętrzna
Azydek soduSigma-AldrichS2002
Chlorek soduBDH VWR AnalitycznyBDH9286-2,5 kg
Kolumna Tricorn 5/20GE Healthcare24-4064-08
Tris-HClVWR Life Science0497-1 kg
Roztwór trypsyny-EDTASigma-AldrichT4049-500 ml0,25%, sterylnie filtrowane, odpowiednie do hodowli komórkowych, 2,5 g trypsyny wieprzowej i 0,2  g EDTA
firmy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578(2018).
  2. Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M. International Natural Product Sciences Taskforce, Supuran, C.T. Natural products in drug discovery: advances and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (3), 200-216 (2021).
  3. Altmann, K. H. Drugs from the Oceans: Marine Natural Products as Leads for Drug Discovery. Chimia. 71 (10), 646-652 (2017).
  4. Bernardini, S., Tiezzi, A., Laghezza Masci, V., Ovidi, E. Natural products for human health: an historical overview of the drug discovery approaches. Natural Product Research. 32 (16), 1926-1950 (2018).
  5. DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (20), 9295-9304 (2016).
  6. Lee, J., Jo, D. G., Park, D., Chung, H. Y., Mattson, M. P. Adaptive cellular stress pathways as therapeutic targets of dietary phytochemicals: focus on the nervous system. Pharmacological Reviews. 66 (3), 815-868 (2014).
  7. Hornykiewicz, O. L-DOPA: from a biologically inactive amino acid to a successful therapeutic agent. Amino Acids. 23 (1-3), 65-70 (2002).
  8. Hoyer, D. Targeting the 5-HT system: Potential side effects. Neuropharmacology. 179, 108233(2020).
  9. Nur, S., Adams, C. E. Chlorpromazine versus reserpine for schizophrenia. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4, (2016).
  10. Chung, H. Y., et al. Redefining Chronic Inflammation in Aging and Age-Related Diseases: Proposal of the Senoinflammation Concept. Aging and Disease. 10 (2), 367-382 (2019).
  11. Fitzgerald, K. N., et al. Potential reversal of epigenetic age using a diet and lifestyle intervention: a pilot randomized clinical trial. Aging. 13 (7), 9419-9432 (2021).
  12. Zhao, L., Lee, J. Y., Hwang, D. H. Inhibition of pattern recognition receptor-mediated inflammation by bioactive phytochemicals. Nutrition Reviews. 69 (6), 310-320 (2011).
  13. Corbi, G., et al. Dietary Phytochemicals in Neuroimmunoaging: A New Therapeutic Possibility for Humans? Frontiers in Pharmacology. 7, 364(2016).
  14. Davinelli, S., et al. Dietary phytochemicals and neuro-inflammaging: from mechanistic insights to translational challenges. Immunity & Ageing: I & A. 13, 16(2016).
  15. Ostan, R., et al. Inflammaging and cancer: a challenge for the Mediterranean diet. Nutrients. 7 (4), 2589-2621 (2015).
  16. Martucci, M., et al. Mediterranean diet and inflammaging within the hormesis paradigm. Nutrition Reviews. 75 (6), 442-455 (2017).
  17. Szarcvel Szic, K., Declerck, K., Vidakovic, M., Vanden Berghe, W. From inflammaging to healthy aging by dietary lifestyle choices: is epigenetics the key to personalized nutrition. Clinical Epigenetics. 7 (1), 33(2015).
  18. Dean, E., Gormsen Hansen, R. Prescribing optimal nutrition and physical activity as "first-line" interventions for best practice management of chronic low-grade inflammation associated with osteoarthritis: evidence synthesis. Arthritis. , 560634(2012).
  19. Ruiz-Núñez, B., Pruimboom, L., Dijck-Brouwer, D. A., Muskiet, F. A. Lifestyle and nutritional imbalances associated with Western diseases: causes and consequences of chronic systemic low-grade inflammation in an evolutionary context. TheJournal of Nutritional Biochemistry. 24 (7), 1183-1201 (2013).
  20. Agarwal, P., et al. MIND Diet Associated with Reduced Incidence and Delayed Progression of Parkinsonism in Old Age. The Journal of Nutrition, Health & Aging. 22 (10), 1211-1215 (2018).
  21. Morris, M. C., et al. MIND diet associated with reduced incidence of Alzheimer's Disease. Alzheimer's & Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association. 11 (9), 1007-1014 (2015).
  22. Franceschi, C., Garagnani, P., Parini, P., Giuliani, C., Santoro, A. Inflammaging: a new immune-metabolic viewpoint for age-related diseases. Nature Reviews. Endocrinology. 14 (10), 576-590 (2018).
  23. Ciesla, L., Moaddel, R. Comparison of analytical techniques for the identification of bioactive compounds from natural products. Natural Product Reports. 33 (10), 1131-1145 (2016).
  24. Moaddel, R., Wainer, I. W. The preparation and development of cellular membrane affinity chromatography columns. Nature Protocols. 4 (2), 197-205 (2009).
  25. Ferrer, I., et al. BDNF and full-length and truncated TrkB expression in Alzheimer disease. Implications in therapeutic strategies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (7), 729-739 (1999).
  26. Numakawa, T., Odaka, H., Adachi, N. Actions of Brain-Derived Neurotrophin Factor in the Neurogenesis and Neuronal Function, and Its Involvement in the Pathophysiology of Brain Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3650(2018).
  27. Lima Giacobbo, B., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor in Brain Disorders: Focus on Neuroinflammation. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3295-3312 (2019).
  28. Wang, Z. H., et al. Deficiency in BDNF/TrkB Neurotrophic Activity Stimulates δ-Secretase by Upregulating C/EBPβ in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 28 (3), 655-669 (2019).
  29. Devi, L., Ohno, M. TrkB Reduction Exacerbates Alzheimer's Disease-like Signaling Aberrations and Memory Deficits without Affecting beta-Amyloidosis in 5XFAD Mice. Translational Psychiatry. 5 (5), 562(2015).
  30. Jiao, S. S., et al. Brain-derived Neurotrophic Factor Protects against Tau-related Neurodegeneration of Alzheimer's Disease. Translational Psychiatry. 6 (10), 907(2016).
  31. Ng, T., Ho, C., Tam, W., Kua, E., Ho, R. C. Decreased Serum Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Levels in Patients with Alzheimer's Disease (AD): A Systematic Review and Meta-Analysis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 257(2019).
  32. Amidfar, M., de Oliveira, J., Kucharska, E., Budni, J., Kim, Y. K. The Role of CREB and BDNF in Neurobiology and Treatment of Alzheimer's Disease. Life Sciences. 257, 118020(2020).
  33. Atasoy, I. L., et al. Both Secreted and the Cellular Levels of BDNF Attenuated due to Tau Hyperphosphorylation in Primary Cultures of Cortical Neurons. Journal of Chemical Neuroanatomy. 80, 19-26 (2017).
  34. Rosa, E., et al. Tau Downregulates BDNF Expression in Animal and Cellular Models of Alzheimer's Disease. Neurobiology of Aging. 48, 135-142 (2016).
  35. Xiang, J., et al. Delta-secretase-cleaved Tau Antagonizes TrkB Neurotrophic Signalings, Mediating Alzheimer's Disease Pathologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 9094-9102 (2019).
  36. Giuffrida, M. L., Copani, A., Rizzarelli, E. A Promising Connection between BDNF and Alzheimer's Disease. Aging. 10 (8), 1791-1792 (2018).
  37. Ando, S., et al. Animal Model of Dementia Induced by Entorhinal Synaptic Damage and Partial Restoration of Cognitive Deficits by BDNF and Carnitine. Journal of Neuroscience Research. 70 (3), 519-527 (2002).
  38. Fischer, D. L., Sortwell, C. E. BDNF Provides Many Routes Toward STN DBS-Mediated Disease Modification. Movement Disorders. Official Journal of the Movement Disorder Society. 34 (1), 22-34 (2019).
  39. Zhang, F., Kang, Z., Li, W., Xiao, Z., Zhou, X. Roles of Brain-derived Neurotrophic Factor/Tropomyosin-related Kinase B (BDNF/TrkB) Signalling in Alzheimer's Disease. Journal of Clinical Neuroscience: Official Journal of the Neurological Society of Australasia. 19 (7), 946-949 (2012).
  40. Pilakka-Kanthikeel, S., Atluri, V. S., Sagar, V., Saxena, S. K., Nair, M. Targeted Brain Derived Neurotropic Factors (BDNF) Delivery across the Blood-Brain Barrier for Neuro-protection using Magnetic Nano Carriers: An In-vitro Study. PLoS One. 8 (4), 62241(2013).
  41. Jang, S. W., et al. A Selective TrkB Agonist with Potent Neurotrophic Activities by 7,8-Dihydroxyflavone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (6), 2687-2692 (2010).
  42. Todd, D., et al. A Monoclonal Antibody TrkB Receptor Agonist as a Potential Therapeutic for Huntington's Disease. Plos One. 9 (2), 87923(2014).
  43. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-Related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  44. Liu, X., et al. Biochemical and Biophysical Investigation of the Brain-derived Neurotrophic Factor Mimetic 7,8-Dihydroxyflavone in the Binding and Activation of the TrkB Receptor. The Journal of Biological Chemistry. 289 (40), 27571-27584 (2014).
  45. Chen, L., Gao, X., Zhao, S., Hu, W., Chen, J. The Small-Molecule TrkB Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Decreases Hippocampal Newborn Neuron Death After Traumatic Brain Injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 74 (6), 557-567 (2015).
  46. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  47. Zhang, Z., et al. 7,8-Dihydroxyflavone Prevents Synaptic Loss and Memory Deficits in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 39 (3), 638-650 (2014).
  48. Casarotto, P. C., et al. Antidepressant Drugs Act by Directly Binding to TRKB Neurotrophin Receptors. Cell. 184 (5), 1299-1313 (2021).
  49. Iyer, R., et al. Entrectinib is a potent inhibitor of Trk-driven neuroblastomas in a xenograft mouse model. Cancer letters. 372 (2), 179-186 (2016).
  50. Iyer, R., et al. Nanoparticle delivery of an SN38 conjugate is more effective than irinotecan in a mouse model of neuroblastoma. Cancer letters. 360 (2), 205-212 (2015).
  51. Ng, E. S., Chan, N. W., Lewis, D. F., Hindsgaul, O., Schriemer, D. C. Frontal Affinity Chromatography-Mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (8), 1907-1917 (2007).
  52. Maciuk, A., Moaddel, R., Haginaka, J., Wainer, I. W. Screening of Tobacco Smoke Condensate for Nicotinic Acetylcholine Receptor Ligands using Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns and Missing Peak Chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (2), 238-246 (2008).
  53. Harvey, A. L., Edrada-Ebel, R., Quinn, R. J. The Re-emergence of Natural Products for Drug Discovery in the Genomics Era. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (2), 111-129 (2015).
  54. Ciesla, L., et al. Development and Characterization of the α3β4α5 Nicotinic Receptor Cellular Membrane Affinity Chromatography Column and Its Application for on line Screening of Plant Extracts. Journal of Chromatography A. 1431, 138-144 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cellular Membrane AffinityAffinity Chromatography ColumnsSpecialized Plant MetabolitesTropomyosin Kinase ReceptorTrkB ReceptorTransmembrane ProteinsNeuroblastoma Cell LinesNatural Product ScreeningLigand Binding AssayHigh Performance Liquid Chromatography

Related Articles