Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Summary

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Abstract

Mikroskopia siły pociągowej (TFM) jest główną metodą używaną w mechanobiologii do pomiaru sił komórkowych. Zwykle jest to używane do komórek przylegających do płaskich miękkich podłoży, które odkształcają się pod wpływem trakcji komórkowej (2D-TFM). TFM opiera się na zastosowaniu liniowych materiałów elastycznych, takich jak polidimetylosiloksan (PDMS) lub poliakryloamid (PA). W przypadku 2D-TFM na PA trudność w osiągnięciu wysokiej przepustowości wynika głównie z dużej zmienności kształtów komórek i trakcji, co wymaga standaryzacji. Przedstawiamy protokół szybkiego i wydajnego wytwarzania mikrowzorcowych hydrożeli PA do badań 2D-TFM. Mikrowzory są najpierw tworzone przez fotolitografię bez maski przy użyciu światła bliskiego UV, gdzie białka macierzy zewnątrzkomórkowej wiążą się tylko z obszarami mikrowzorów, podczas gdy reszta powierzchni pozostaje nieadhezyjna dla komórek. Mikrowzorzec białek macierzy zewnątrzkomórkowej wynika z obecności aktywnych grup aldehydowych, w wyniku czego powstają obszary adhezyjne o różnych kształtach, aby pomieścić pojedyncze komórki lub grupy komórek. Do pomiarów TFM używamy hydrożeli PA o różnej elastyczności poprzez zmianę ilości akrylamidu i bis-akrylamidu oraz śledzenie przemieszczenia osadzonych kulek fluorescencyjnych w celu rekonstrukcji pól trakcyjnych komórek za pomocą regularnej cytometrii trakcyjnej z transformacją Fouriera (FTTC).

Aby jeszcze bardziej osiągnąć precyzyjny zapis sił komórkowych, opisujemy użycie kontrolowanej dawki światła wzorcowego do uwalniania trakcji komórek w określonych regionach dla pojedynczych komórek lub grup komórek. Metodę tę nazywamy mikroskopią sił trakcyjnych z lokalnym oświetleniem UV (LUVI-TFM). W przypadku obróbki enzymatycznej wszystkie komórki są odłączane od próbki jednocześnie, podczas gdy w przypadku LUVI-TFM siły trakcyjne komórek w różnych regionach próbki mogą być rejestrowane sekwencyjnie. Wykazujemy możliwość zastosowania tego protokołu (i) do badania sił trakcyjnych komórek w funkcji kontrolowanej adhezji do podłoża oraz (ii) do uzyskania większej liczby obserwacji eksperymentalnych z tej samej próbki.

Introduction

Podczas interakcji ze swoim środowiskiem zewnątrzkomórkowym, przylegające komórki wywierają siły, które są głównie pośredniczone przez ogniskowe zrosty oparte na integrynie, łączące macierz zewnątrzkomórkową (ECM) z cytoszkieletem aktyny. Adhezje ogniskowe to zespoły wielobiałkowe, które koncentrują się wokół wiązania integryn z białkami ECM, takimi jak fibronektyna i kolagen. Grupowanie integryn i wzrost zrostów ogniskowych ma kluczowe znaczenie nie tylko dla ustanowienia stabilnego mechanicznie połączenia, ale także dla rekrutacji innych ogniskowych białek adhezyjnych, w tym tych, które aktywują szlak RhoA do regulacji kurczliwości komórkowej¹. Zależna od RhoA kurczliwość cytoszkieletu aktynowego pozwala komórkom rozprzestrzeniać się i migrować na leżącym pod spodem ECM, a także wyczuwać jego sztywność². Rozkład sił trakcyjnych silnie zależy od obszaru rozprzestrzeniania się i kształtu komórek, z których oba zależą od właściwości matrycy, a zatem wpływają na organizację cytoszkieletu, ostatecznie tworząc zamkniętą pętlę sprzężenia zwrotnego między mechaniką macierzy a organizacją cytoszkieletu^3,4.

Techniki mikrowzorcowania powierzchni pozwalają na zdefiniowaną kontrolę kształtu komórki poprzez tworzenie mikronowych obszarów prezentujących białka adhezyjne ECM; w zależności od wielkości tych regionów, pojedynczych komórek lub grup komórek, które przylegają do mikrowzorca⁵. Białka ECM mogą być wzorowane na podłożach szklanych za pomocą różnych metod, takich jak druk mikrokontaktowy, foto-patterning lub laserowe modelowanie⁶. Zastosowanie światła UV (λ = 185 lub 375 nm) w połączeniu ze strategiami przeciwporostowymi powierzchni zapewnia elastyczność w projektowaniu różnych kształtów i rozmiarów oraz immobilizacji wielu typów białek z dużą precyzją przy krawędziach powierzchni^7,8. Obszary pokryte substancjami chemicznymi odstraszającymi białka, takimi jak glikol polietylenowy (PEG), są chronione za pomocą chromowej fotomaski lub bezmaskowego systemu litograficznego opartego na cyfrowym urządzeniu lustrzanym (DMD). Wzory w maskach pozwalają na ekspozycję na światło UV obszarów, które następnie zostaną wymodelowane za pomocą białek ECM. Modelowanie powierzchni hydrożelowych za pomocą białek ECM wymaga etapu transferu w celu usunięcia białek z powierzchni szkła i usieciowania ich z wzorami. Alternatywnie, wzór na miękkich materiałach można uzyskać, najpierw pokrywając fotomaskę białkiem odstraszającym, a następnie spalając niezamaskowane obszary za pomocą głębokiego oświetlenia UV. Ponieważ głębokie promieniowanie UV generuje ozon i sprawia, że powierzchnia jest reaktywna w celu wiązania białek, niezamaskowane regiony są powlekane białkami ECM, a na koniec żel jest polimeryzowany bezpośrednio na niezamaskowanych regionach^9,10.

Wzorzyste hydrożele mogą być używane do wykonywania TFM, techniki, która mierzy siły komórkowe na granicy komórka-materiał¹¹. W 2D-TFM wykorzystuje się płaską powierzchnię grubej folii polimerowej, w której osadzono koraliki znacznika w celu śledzenia deformacji^12,13,14,15. Aby wyodrębnić wektory przemieszczenia, konieczne jest połączenie dwóch obrazów, jednego obrazu w stanie zdeformowanym i jednego obrazu odniesienia bez deformacji. Dwa obrazy są następnie odwzorowywane na siebie za pomocą przetwarzania obrazu. Przy dużej gęstości znaczników odbywa się to zwykle za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV), która jest dobrze znaną metodą rekonstrukcji przepływu hydrodynamicznego. Przy niskiej gęstości znaczników i w 3D-TFM odbywa się to zwykle za pomocą prędkości śledzenia cząstek (PTV), która obejmuje specyficzne cechy zestawu danych eksperymentalnych. Przykładem tańszej obliczeniowo alternatywy jest przepływ optyczny, taki jak algorytm Kanade-Lucas-Tomasi (KLT)¹⁶. W przypadku podłoży hydrożelowych kulki fluorescencyjne są zwykle zatapiane w dużej gęstości podczas polimeryzacji materiału, a obrazy są rejestrowane przed i po uwolnieniu komórek po oderwaniu enzymatycznym. Enzymatyczne odrywanie przylegających komórek, np. przez trypsynizację, prowadzi do jednoczesnego uwolnienia trakcji komórkowych ze wszystkich komórek na hydrożelach, co utrudnia uzyskanie szczegółowej analizy z dużej liczby komórek.

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania mikrowzorcowych hydrożeli do kontroli kształtu i lokalizacji komórek oraz metodę efektywnego pomiaru sił trakcyjnych w sekwencji za pomocą UV do oddzielania pojedynczych komórek od podłoża. Do pomiarów siły pociągowej przedstawiamy technikę wytwarzania dwuwarstwowych hydrożeli PA, gdzie kulki fluorescencyjne zatopione są tylko w wierzchniej warstwie, co zwiększa ich gęstość i zmniejsza ich pionowe rozpiętość. Połączenie uwalniania komórkowych sił trakcyjnych za pośrednictwem promieniowania UV z mikrowzorcami umożliwia uzyskanie kontroli przestrzennej nad oderwaniem komórek (np. pojedynczych komórek bez wpływu na adhezję innych komórek w obszarze zainteresowania), pod warunkiem, że istnieje wystarczająca odległość między komórkami wzorzystymi. Trakcja komórkowa jest następnie rekonstruowana przy użyciu najbardziej wydajnej i niezawodnej metody dla 2D-TFM, a mianowicie cytometrii trakcyjnej z transformacją Fouriera (FTTC) z regularyzacją^17,18.

Protocol

1. Przygotowanie metakrylowanych szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Szkiełka nakrywkowe są metakrylowane, aby kowalencyjnie łączyć hydrożele PA i tym samym zapobiegać ich odklejaniu się podczas inkubacji z komórkami. Szkiełka nakrywkowe mikroskopowe służą do uzyskania wysokiej jakości obrazu.

1. Aby przygotować roztwór o objętości 300 ml, weź czystą szklaną zlewkę o pojemności 400 ml i umieść ją w dygestorium.
2. Dodać 10 ml podwójnie destylowanej wody (ddH₂O) do zlewki. Dodać 18,75 ml kwasu octowego (≥99,8% pro analysis, p.a.), 18,75 ml 3-(trimetoksysililo)propylu metakrylanu i 252,5 ml etanolu (≥99,8% rocznie) za pomocą pipety serologicznej. Wlej roztwór do krystalizującego się naczynia.
3. Szkiełka nakrywkowe z okrągłego szkła o średnicy 24 mm należy czyścić precyzyjnymi chusteczkami. Umieść szkiełka nakrywkowe w wykonanym na zamówienie stojaku z politetrafluoroetylenu.
4. Zanurz stojak w roztworze i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
5. Weź ruszt i spłucz wszystkie szkiełka nakrywkowe etanolem (99,8% rocznie). Wysuszyć szkiełka nakrywkowe pod strumieniem powietrza.
   UWAGA: Szkiełka nakrywkowe z metakrylem można przechowywać do 1 miesiąca w temperaturze pokojowej.

2. Mikrowzorzec białek macierzy zewnątrzkomórkowej na szklanych szkiełkach nakrywkowych

UWAGA: Szklane szkiełka nakrywkowe są najpierw pokrywane warstwą molekuł, składającą się z białka i środka odstraszającego komórki. Warstwa ta jest następnie usuwana za pomocą techniki fotowzorcowania, aby umożliwić późniejsze osadzanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach o mikrowzorach.

1. Weź okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 15 mm i umieść je na szalce Petriego. Użyj pisaka diamentowego, aby zaznaczyć górną stronę szkiełka nakrywkowego. Następnie przejdź do czyszczenia za pomocą plazmy tlenowej o ciśnieniu 0,4 mbar i mocy 200 W przez 2 minuty.
2. Odpipetować 100 μl 0,01% roztworu poli-L-lizyny na powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Przemyć szkiełka nakrywkowe 10 mM kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) o pH 8,5. Usuń nadmiar płynu, ale utrzymuj powierzchnię mokrą.
3. Odmierzyć pipetą 100 μl 50 mg/ml eteru metylowego poli(glikolu etylenowego) sukcynimidylo-walerianowego kwasu (mPEG-SVA) w 10 mM HEPES pH 8,5 na powierzchni każdego szkiełka nakrywkowego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przepłukać szkiełka nakrywkowe 10 mM HEPES pH 8,5 i wysuszyć pod strumieniem powietrza.
4. Dodać 2 μl wrażliwego na promieniowanie UV fotoinicjatora (np. żelu PLPP), a następnie 40 μl etanolu (≥99,8% rocznie) na powierzchnię. Aby uzyskać jednorodny rozkład żelu i etanolu na powierzchni, delikatnie przechyl szalkę Petriego do przodu i do tyłu. Odczekaj 5 minut, aż roztwór spolimeryzuje.
5. Umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe na szalce Petriego o średnicy 35 mm z otworem o średnicy 20 mm na dnie. Dzięki temu wiązka laserowa pochodząca od spodu dociera bezpośrednio do powierzchni szkła.
6. Włącz mikroskop i moduł do rysowania wzorów świetlnych (praca z tym urządzeniem jest dozwolona tylko po wprowadzeniu bezpieczeństwa przez specjalistów ds. bezpieczeństwa laserowego). Skalibruj laser UV-A na obiektywie pneumatycznym 20x. Umieść próbkę z fotoinicjatorem na stoliku. Dostosuj ostrość na powierzchni szkła i włącz regulator ostrości. Załaduj i zablokuj wstępnie narysowany wzór.
   1. Przygotuj wzór za pomocą oprogramowania graficznego, takiego jak Inkscape. Upewnij się, że plik wzoru nie przekracza wymiarów DMD (1824 x 1140 px, co odpowiada 552 x 325 μm na obiektywie 20x (0,28 μm/px)).
      UWAGA: Zaleca się używanie rozmiaru DMD (1824 x 1140 pikseli) jako rozmiaru pliku wzoru, ponieważ zapewni to brak błędów podczas tworzenia wzoru. Na przykład nie należy tworzyć pliku wzorca o wymiarach 1830 x 1130 pikseli.
   2. W celu przeniesienia wzoru na poliakrylamid należy upewnić się, że wzór jest wykonywany tylko do 60%-70% promienia od środka szkła do krawędzi.
   3. Do tworzenia wzoru pojedynczej komórki należy użyć średnicy 50-100 μm z odległością 100 μm między wzorami i średnicy 150-300 μm dla grupy komórek. Odpowiedni rozmiar wzoru w dużym stopniu zależy od typowego rozmiaru komórki i musi być wystarczająco duży, aby umożliwić komórkom przyleganie.
7. Rozpocznij modelowanie od dawki UV 30 mJ/mm². Czas trwania wzoru zależy od liczby wzorów. Wykonanie pojedynczego wzoru zajmuje około 1 s.
8. Po zakończeniu etapu modelowania spłucz powierzchnię trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Inkubować próbkę ze 100 μl 25 μg/ml fibronektyny rozpuszczonej w 1x PBS i 25 μg/ml koniugatu fibrynogenu Alexa488 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W przypadku innych białek ECM znajdź optymalne stężenia całkowicie pokrywające wzorzyste obszary.
9. Spłucz powierzchnię trzykrotnie 1x PBS. Upewnij się, że wzorzyste szkło jest natychmiast używane do transferu szkła-PA. Przechowywać wzorzyste szkło w PBS w temperaturze pokojowej podczas przygotowywania hydrożelu.

3. Wytwarzanie wzorzystych hydrożeli poliakrylamidowych

UWAGA: Hydrożele poliakrylamidowe, w tym utleniony N-hydroksyetyloakryloamid (HEA), są przygotowywane do prezentacji reaktywnych grup aldehydowych do kowalencyjnego wiązania białek macierzy na powierzchni. Dodatkowo, dwuwarstwowe podejście polegające na osadzaniu koralików fluorescencyjnych tylko na górnej warstwie hydrożelu jest stosowane w celu poprawy rejestracji przemieszczenia kulki podczas eksperymentów z mikroskopią siły pociągowej.

1. Szkiełka nakrywkowe ze szkła metakrylowanego umieścić na szalce Petriego.
2. Aby przygotować świeży utleniony roztwór HEA, dodaj 9,55 ml podwójnie destylowanej wody do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Następnie dodaj 0,5 ml HEA i 42 mg (meta)periodianu sodu, aby uzyskać 10 ml roztworu. Ciągle mieszać roztwór w ciemności przez 4 godziny.
3. Zmieszaj akrylamid, bis-akryloamid i podwójnie destylowaną wodę zgodnie z tabelą 1, aby uzyskać 10 ml hydrożelu w roztworze podstawowym (zrób to pod wyciągiem, monomery są neurotoksyczne). Odgazuj i zamknij pokrywę do hermetycznego zamknięcia.
   UWAGA: Roztwór podstawowy można przechowywać w porcjach przez okres do 1 roku w temperaturze 4 °C. Przed użyciem należy zawsze scharakteryzować moduł Younga hydrożelu.
4. Przygotuj dwuwarstwowy hydrożel PA (zrób to pod wyciągiem, monomery są neurotoksyczne).
   1. Zacznij od dolnej warstwy, delikatnie mieszając 99,3 μl roztworu podstawowego, 0,5 μl 1% nadsiarczanu amonu (APS) i 0,2 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) w probówce o pojemności 1,5 ml. Pobrać 10 μl z roztworu i odpipetować kroplami na środek metakrylonego szkiełka nakrywkowego.
   2. Ostrożnie umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 15 mm na kropli i poczekaj 45 minut na polimeryzację. Delikatnie odczep górne szkiełko nakrywkowe skalpelem.
   3. W przypadku warstwy wierzchniej delikatnie wymieszaj 93,3 μl roztworu podstawowego z 1 μl świeżego utlenionego roztworu HEA, 5 μl kulek fluorescencyjnych (co odpowiada trzem kulkom na mikron kwadratowy w przypadku kulek o wielkości 200 nm), 0,5 μl 1% APS i 0,2 μl TEMED w probówce o pojemności 1,5 ml. Pobrać 5 μl z roztworu i pipetować kroplami na środek już spolimeryzowanej warstwy dolnej.
   4. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem na kropli. Odczekać 45 minut w temperaturze pokojowej do polimeryzacji kropli. Upewnij się, że wzorzysta strona dotyka kropli. Delikatnie odczep szkiełko nakrywkowe skalpelem.
5. Przyklej szkiełka nakrywkowe o średnicy 24 mm do dna specjalnie nawierconych płytek 6-dołkowych za pomocą dwuskładnikowego kleju silikonowego. Po 5 minutach dodaj PBS do studzienek.
6. Scharakteryzować moduł Younga próbek hydrożelu poliakryloamidowego za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM).
   1. Zamontuj wspornik z kulistą końcówką na uchwycie AFM.
   2. Skalibruj każdy wspornik, uzyskując krzywą siła-odległość (nastawa 3-4 V) na twardym podłożu (np. szkle lub mice), ekstrapoluj czułość wspornika, wycofaj się z powierzchni i wykonaj dostrojenie termiczne, aby uzyskać stałą sprężystości.
   3. Umieścić skalibrowane wsporniki na próbce hydrożelu i uzyskać krzywe siły w buforze PBS, używając następujących parametrów: nastawa siły 20-30 nN, prędkość zbliżania i cofania 5 lub 10 μm/s, rozmiar rampy 5 μm.
      UWAGA: Odwrócony mikroskop optyczny, wyposażony w obiektyw powietrzny 40x i filtr białka zielonej fluorescencji (GFP), został użyty do wizualizacji i ukierunkowania obszarów mikrowzorcowych ECM w próbkach hydrożelu PA.
   4. Wykreśl uzyskane krzywe siły w funkcji odległości za pomocą oprogramowania do analizy AFM.
   5. Znajdź punkt kontaktowy i zamień krzywe siły w funkcji odległości na krzywe siły i wcięcia.
   6. Dopasuj część krzywej z wcięciem do modelu Hertza (lub odpowiedniego modelu mechaniki w funkcji geometrii końcówki), używając współczynnika Poissona z zakresu od 0,2 do 0,5.

4. Lokalne uwalnianie sił trakcyjnych komórek przez oświetlenie laserowe UV-A (LUVI-TFM)

UWAGA: Laser UV-A jest stosowany do uwalniania sił trakcyjnych w komórkach zlokalizowanych w określonych regionach hydrożeli. Laser UV-A (tj. λ = laser na ciele stałym 375 nm, <15 mW) jest laserem klasy 3B. Nieosłonięta wiązka lasera jest niebezpieczna dla oczu, a często także dla skóry. Odbite i rozproszone światło oraz promieniowanie mogą być niebezpieczne. Ponadto promieniowanie UV może powodować raka skóry. Praca z urządzeniami jest dozwolona tylko po wprowadzeniu zasad bezpieczeństwa przez inspektorów ds. bezpieczeństwa laserowego.

1. Odessać PBS ze studzienek.
2. Wysiew: 3 x 10⁶ komórek na płytkę 6-dołkową w pożywce wzrostowej. W przypadku fibroblastów należy stosować zmodyfikowany środek Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy, zawierający L-glutaminę i uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO₂ . Umyj próbki, aby usunąć pływające komórki przed rozpoczęciem mikroskopii.
3. Włączyć komorę inkubacyjną mikroskopu i dopływ gazu, aby uzyskać temperaturę 37 °C i 5% atmosfery CO_{2 .}
4. Włącz mikroskop i moduł do tworzenia wzorów laserowych. W razie potrzeby ponownie skalibruj laser UV-A na obiektywie pneumatycznym 20x za pomocą oprogramowania Leonardo. Umieść na stoliku wykonaną na zamówienie płytkę 6-dołkową z próbkami. Dostosuj ostrość na powierzchni PA.
5. Ustaw wzór oświetlenia i zaznacz interesujące Cię komórki. Ponownie skup się na powierzchni hydrożelu. Uzyskaj obraz komórek w kanale jasnego pola. Przełącz się na kanał Cy5 (filtr dalekiej czerwieni, wzbudzenie 650 nm, emisja 670 nm) i zrób zdjęcie koralików w stanie zdeformowanym.
6. Przełącz się na kanał laserowy. Włącz laser na 3 minuty. W naszej konkretnej konfiguracji odpowiadało to dawce światła wynoszącej 6 000 mJ/^mm2.
7. Przełącz się na kanał Cy5 i uzyskaj obraz koralików w stanie niezdeformowanym.
   UWAGA: W przypadku eksperymentu z użyciem mysich fibroblastów embrionalnych, odczekaj 15 minut po ekspozycji, aby zarejestrować obraz referencyjny/niezdeformowany (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki). Może być inaczej w przypadku innych typów komórek. Powtórz kroki 4.5-4.7 ponownie dla innej interesującej Cię komórki.
8. Aby zmierzyć podwyższony stres oksydacyjny po naświetleniu UV-A, należy użyć dostępnego na rynku odczynnika (CellRox). CellRox jest niefluorescencyjny w stanie zredukowanym, a po utlenieniu przez reaktywne formy tlenu fluoryzuje z maksymalną emisją ~665 nm.
9. Zgodnie z dostarczonym protokołem dodać odczynnik 5 μM do pożywki obrazowej i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C/5% CO₂ . Następnie umyj ogniwa 3x ciepłym 1x PBS i wymień nośnik obrazowania. Zarejestruj sygnał Cy5 za pomocą obrazowania fluorescencyjnego przed i po oświetleniu UV-A przy użyciu podobnej ekspozycji na światło.

5. Przetwarzanie obrazu, prędkość obrazu cząstek i obliczanie sił trakcyjnych

UWAGA: Siły trakcyjne komórek są rejestrowane poprzez analizę przemieszczenia koralików fluorescencyjnych i obliczane za pomocą narzędzi do analizy obrazu na podstawie prędkości obrazu cząstek.

1. Otwarte obrazy koralików fluorescencyjnych, przed (tj. zdeformowane) i po laserze (tj. niezdeformowane) przy użyciu Fidżi. Scalanie dwóch obrazów w jeden stos (punkt menu Obraz | Stosy | Obrazy do stosu).
2. Popraw dryf boczny między dwoma obrazami za pomocą wtyczki StackReg (P. Thévenaz, Szwajcarski Federalny Instytut Technologii w Lozannie). Zmień obrazy na 8-bitowe (Obraz | Rodzaj | 8 bitów) i ponownie przeskaluj do 1024 x 1024 pikseli (Obraz | Skala). Zapisz jako sekwencję obrazów (format TIFF) z obrazem referencyjnym zawsze na początku.
3. Pozyskaj pole wektora przemieszczenia za pomocą techniki korelacji krzyżowej¹⁹ z pola PIV, jak zaimplementowano w projekcie OpenPIV.
   1. Upewnij się, że zrelaksowany (niezdeformowany) obraz i zdeformowany obraz są pokryte oknami wyszukiwania o rozmiarach w_R i _{w D} w pikselach. Dla każdego okna wyszukiwania zdefiniuj funkcję korelacji krzyżowej przy użyciu następującej formuły:
      
      W tym miejscu R(i,j) i D(i,j) opisują pola intensywności dwóch obrazów obciętych do wybranego okna wyszukiwania, a następnie wypełnionych lustrzanym odbiciem. i opisują swoją średnią wartość. Rozmiary okien są wybierane tak, aby w_R = 32 i w_D = 32, a sąsiednie okna wyszukiwania nakładają się na siebie w 70%.
   2. Dla każdego okna wyszukiwania wyznacz wektor przemieszczenia , który optymalizuje funkcję korelacji krzyżowej i przypisz do środkowej pozycji okna wyszukiwania. Dokładność subpikseli uzyskuje się przy użyciu dopasowania gaussowskiego wokół obszaru maksimów, zgodnie z opisem²⁰.
   3. Znajdowanie i usuwanie niejednoznacznych wektorów przemieszczenia. Wektory przemieszczenia odpowiadające oknom wyszukiwania, w których stosunek między dwoma najwyższymi maksimami lokalnymi funkcji korelacji krzyżowej poniżej progu 1,5 są uważane za niejednoznaczne²¹.
   4. Odrzuć wektory przemieszczenia, które nie przejdą znormalizowanego testu mediany, dla progu resztkowego 1,5²².
   5. (Opcjonalnie) Skoryguj pozostały dryf boczny, odejmując stały wektor od wszystkich przemieszczeń. Dzieje się tak, ponieważ przemieszczenie w wybranym obszarze oddalonym od komórki znika.
   6. Interpoluj wynikowe pole wektora przemieszczenia do regularnej siatki z odstępem 4 px obrazów wejściowych przy użyciu interpolacji wielomianu sześciennego. Brakujące punkty danych są wypełniane przy użyciu gładkiej ekstrapolacji splajnu dwóch zmiennych. Wektor przemieszczenia w pikselach jest związany z lokalnym odkształceniem przez stosunek pikseli obrazu (0,33 μm/px dla soczewki powietrznej 20x).
   7. (Opcjonalnie) Odbicie lustrzane obrazu w celu zmniejszenia artefaktów dzwonienia w późniejszej analizie.
   8. Pomnóż pole deformacji przez funkcję okna Tukeya, aby wyeliminować efekt krawędzi spowodowany korekcją dryftu, z parametrem 0,2-0,3. W tym eksperymencie interesujący jest obszar z mikrowzorem, który znajduje się w centrum pola widzenia.
4. Zrekonstruuj trakcję za pomocą regularnej cytometrii trakcyjnej z transformacją Fouriera (FTTC)¹⁸. Jako regularyzację używamy najprostszego rozsądnego wyboru, a mianowicie regularyzacji Tichonowa (L2) 0 rzędu^23,24,25. Optymalny parametr regularyzacji λ jest wybierany w taki sposób, aby minimalizował funkcję uogólnionej walidacji krzyżowej (GCV) zdefiniowaną przez²⁶:
   
   Tutaj τ_λ jest wektorem skumulowanym zawierającym składowe x i y zrekonstruowanego pola trakcyjnego dla danej wartości λ dla wszystkich trybów próbkowania Fouriera, a G jest operatorem liniowym odwzorowującym pola trakcyjne na odpowiadające im pole przemieszczenia, zgodnie z definicją dla FTTC. Suma przebiega przez składowe wektorowe. u_{i są} składowymi x i y pola przemieszczenia dla wszystkich trybów próbkowania Fouriera. GCV jest szeroko stosowany w dziedzinie źle postawionych problemów odwrotnych i stanowi dobrą alternatywę dla kryterium krzywej L często stosowanego w TFM. Filtr Lanzcos służy do redukcji artefaktów wprowadzanych ze względu na ograniczoną przestrzeń częstotliwości i upsamplingowanie pola przemieszczenia. Obliczenia trakcji zależą od modułu Younga PA (np. 11,3 kPa) i współczynnika Poissona (np. dla PA w zakresie od 0,2 do 0,5 w zależności od stężenia środka sieciującego).

Results

Hydrożele PA zostały spolimeryzowane na szkiełkach nakrywkowych z metakrylanego szkła, które prezentują grupy reaktywne dla kowalencyjnego wiązania PA. W ten sposób, podczas umieszczania hydrożeli w roztworze wodnym, zapobiegano ich oderwaniu się od podłoża (Rysunek 1A-D). Aby uzyskać dużą gęstość markerów referencyjnych w pobliżu powierzchni hydrożelu, opracowaliśmy preparat dwuwarstwowego hydrożelu PA. Dolna warstwa, bez żadnych kulek fluorescencyjnych, została spolimeryzowana na metakrylonym szkiełku nakrywkowym. Następnie, kolejna warstwa zawierająca koraliki została spolimeryzowana na wierzchu dolnej warstwy (Rysunek 1E-H), zastępując potrzebę sedymentacji, która jest często stosowana w celu uzyskania rozkładu ściegów w jednej płaszczyźnie ogniskowej i zwiększenia gęstości ściegów. Aby uzyskać kontrolę nad kształtem komórki podczas pomiarów TFM, wyprodukowaliśmy mikrowzorzyste hydrożele PA poprzez bezpośredni transfer mikrostruktur o wzorze fibronektyny ze szklanego szkiełka nakrywkowego do wstępnie spolimeryzowanego PA (Rysunek 1F-F'). Dodanie 1% niekonwencjonalnego środka sieciującego (utlenionego HEA) w roztworze górnej warstwy hydrożelu zapewnia grupy aldehydowe, które kowalencyjnie wiążą się z grupami aminowymi fibronektyny.

Przygotowaliśmy hydrożele PA o grubości około 60 μm i zamknęliśmy fluorescencyjne kulki w górnej warstwie, blisko powierzchni hydrożelu. Ten rodzaj hydrożelu jest odpowiednim podłożem do obrazowania trakcji komórkowych za pomocą mikroskopów odwróconych i wystarczająco grubym (minimalna grubość do wykonania TFM wynosi 20-30 μm)^18, aby zapobiec wpływowi szklanego podłoża. Lokalizacja koralików fluorescencyjnych została zobrazowana za pomocą mikroskopii konfokalnej (Rysunek 1I). Aby zobrazować transfer białek na hydrożelu, użyliśmy znakowanych fluorescencyjnie białek ECM i zobrazowaliśmy je za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (Rysunek 1J). Przygotowaliśmy mikrowzorzyste okręgi fibronektyny o średnicy 100 μm (lewa strona) i 50 μm (prawa strona), aby umożliwić adhezję grup komórek lub pojedynczych komórek, jak pokazano na nakładce obrazów jasnego pola przylegających komórek oraz fluorescencyjnie znakowanych kulek fiducial i mikrowzorów fibronektyny. Na innej próbce odpowiedź adhezyjną pojedynczych komórek na fibronektynę z mikrowzorem zweryfikowano za pomocą pośredniej mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu zobrazowania lokalizacji ogniskowych białek adhezyjnych, takich jak paxillin (Figura 1K).

Zarówno powłoka białkowa ECM, jak i sztywność hydrożelu są kluczowymi parametrami dla adhezji komórek²⁶. Aby scharakteryzować właściwości mechaniczne naszych hydrożeli PA, przeprowadziliśmy eksperymenty z nanoindentacją za pomocą AFM²⁷, w połączeniu z mikroskopem epifluorescencyjnym. Podłoża hydrożelowe o trzech różnych sztywnościach zostały przygotowane i przetestowane za pomocą naszego zestawu (Rysunek 2 i Tabela 1). Wsporniki AFM w kształcie kuli były cyklicznie zbliżane i wycofywane z niewzorzystych hydrożeli PA i fibrynogenu sprzężonych z obszarami mikrowzorcowymi Alexa488, rejestrując jednocześnie krzywe siła-odległość. Następnie, ocena punktu kontaktowego i zastosowanie modelu Hertza pozwoliły nam oszacować moduł Younga (E) każdej próbki. Mikrowzorcowanie ECM nie zmieniło modułu Younga, który pozostał porównywalny z każdym z niewzorzystych hydrożeli PA.

Aby zmierzyć siły trakcyjne wywierane przez przylegające komórki do podłoża, opracowaliśmy eksperymentalny układ dla referencyjnego TFM przeprowadzonego na szerokokątnym mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w moduł laserowy bliskiego UV (UV-A 6000 mJ/mm²) w celu uwolnienia trakcji komórek (Rysunek 3A). Ponieważ oświetlenie wiązką laserową może być kontrolowane przestrzenno-czasowo, możliwe jest nie tylko selektywne naświetlanie pojedynczej komórki lub klastra komórek za pomocą wysokiej dawki lasera, ale także, co ważniejsze, nie jest już konieczny destrukcyjny etap pośredni usuwania komórek z całej próbki za pomocą enzymu trawiennego, takiego jak trypsyna. Oświetlanie komórek tak wysoką dawką lasera indukowało podwyższony stres oksydacyjny prowadzący do śmierci komórki (Rysunek 3B). Śmierć komórki spowodowała uwolnienie trakcji z podłoża, na co wskazuje przemieszczenie ściegu (zilustrowane na Rysunek 3A). Połączyliśmy oświetlenie UV-A z modułem do modelowania światła, aby selektywnie oświetlić mikronowe obszary hydrożeli PA ( Rysunek 3B-C). W ten sposób możliwe jest uwolnienie trakcji mikrowzorcowych klastrów komórkowych (Rysunek 3C,F) lub pojedynczych komórek (Rysunek 3B). Co ważne, w naszych skalach czasowych na właściwości mechaniczne hydrożeli z wzorem ECM nie miała znaczącego wpływu ekspozycja na promieniowanie UV (Rysunek 2C). Wzrost stresu oksydacyjnego pokazano w Rysunek 3D,E. Siły trakcyjne zostały zrekonstruowane przy użyciu regularyzowanego FTTC z parametrem regularyzacji wybranym przez Generalized Cross Validation (Rysunek 3B,F). Uwolnienie sił dla pojedynczych komórek nastąpiło w okresie 15 minut, a wynik LUVI-TFM jest porównywalny z TFM na bazie trypsyny (Rysunek 3G-H).

Rysunek 1: Schemat przygotowania wzorzystego substratu fibronektyny dla TFM. (A) Roztwór dla dolnej warstwy jest pipetowany na powierzchnię pokrytą metakrylem. (B) Mniejsze, czyste szkiełko nakrywkowe ostrożnie umieszcza się na kropli. (C) Czas żelowania wynosi 45 minut. (D) Górne szkiełko nakrywkowe jest odczepiane. Dolna warstwa jest gotowa. (E) Roztwór dla warstwy wierzchniej pipetuje się na hydrożel. (F) Wzorzyste szkiełko nakrywkowe ostrożnie umieszcza się na kropli. (F') Mikrowzorzec białek adhezyjnych na szkle jest wytwarzany metodą bezmaskową w pobliżu litografii UV, a następnie przenoszony ze szkła do hydrożelu PA. Wolne grupy aminowe białek adhezyjnych, np. fibronektyny, wiążą się kowalencyjnie z grupami aldehydowymi na powierzchni PA. (G) Czas żelowania wynosi 45 minut. (H) Górne szkiełko nakrywkowe jest odczepiane. Wzorzysty hydrożel PA jest gotowy. (I) Reprezentacja 3D konfokalnego mikrogramu xyz pokazująca dużą gęstość kulek odniesienia w pobliżu powierzchni. (J) Mikrofotografia znakowanej fluorescencyjnie fibronektyny (magenta) na powierzchni PA z osadzonymi koralikami fluorescencyjnymi (zielonymi), pokryta obrazem komórek w jasnym polu. (K) Obrazowanie za pomocą pośredniej mikroskopii immunofluorescencyjnej pojedynczej komórki przylegającej do mikrowzoru fibronektyny w kształcie koła (100 μm). Jądro (niebieskie), paxillin (czerwone). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Charakterystyka właściwości mechanicznych próbki za pomocą AFM. (A) Konfiguracja eksperymentalna nanotwardości AFM. Wspornik w kształcie kuli służy do badania mikrowzorów ECM przed lub po zabiegu UV oraz niewzorzystych obszarów dwuwarstwowego PA (5% akrylamidu, 0,3% bis-akrylamidu). (B) Siła reprezentatywna w funkcji krzywej wgłębienia dla mikrowzoru ECM (). Dopasowanie hercowe (czerwone) służy do obliczenia modułu Younga (E) próbki. (C) Pomiary mechaniczne dla dwuwarstwowych obszarów PA bez wzoru (bez ECM), mikrowzoru ECM i mikrowzorca ECM po ekspozycji na promieniowanie UV-A. Słupki pokazują średnią ± S.E.M. (test ANOVA Browna-Forsythe'a i Welcha). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Lokalne oświetlenie UV-A TFM (LUVI-TFM) umożliwia lokalne pomiary siły pociągowej w dużym polu widzenia. (A) Schemat lokalnego oświetlenia UV-A TFM. Komórki są poddawane działaniu wysokiej dawki lasera UV-A w celu uzyskania niezdeformowanego (referencyjnego) obrazu. (B) Obraz w jasnym polu pojedynczej komórki przed oświetleniem laserowym UV-A. Środek: Obraz w jasnym polu pojedynczej komórki po oświetleniu laserem UV-A. Po prawej: Siła pociągowa pojedynczego MEF przylegającego do hydrożelu PA pokrytego fibronektyną (E = 5,74 kPa) oświetlonego wiązką światła UV o średnicy 50 μm (czerwona linia przerywana). (C) Po lewej: Zapis sił trakcyjnych grupy mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) przylegających do fibronektyny z mikrowzorem (okrąg, średnica 100 μm). Gromada została oświetlona wiązką światła UV o średnicy 200 μm (czerwona linia przerywana). Po prawej: Zapis sił trakcyjnych grupy mysich fibroblastów zarodkowych (MEF) przylegających do fibronektyny z mikrowzorem (okrąg, średnica 300 μm). Gromada została oświetlona wiązką światła UV o średnicy 300 μm (czerwona linia przerywana). Podziałka = 200 μm. (D,E) Wzrost stresu oksydacyjnego w komórkach, na który wskazuje zwiększona intensywność sygnału Cy5 po wysokiej dawce lasera UV-A, jest wykrywany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Stres oksydacyjny prowadzi do śmierci komórki. Podziałka = 200 μm. (F) Po lewej: Mapa ciepła stresu z grupy mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) przylegających do fibronektyny z mikrowzorem (okrąg, średnica 100 μm). Po prawej: Mapa cieplna stresu z grupy mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) przylegających do fibronektyny z mikrowzorem (okrąg, średnica 300 μm). (G) Komórki MEF przylegające do mikrowzorów fibronektyny 100 μm powoli uwalniają swoje trakcje po ekspozycji na promieniowanie UV-A. Pełne uwolnienie uzyskuje się po 15 minutach (zdjęcie referencyjne zostało wtedy wykonane 15 minut po naświetleniu). (H) Porównanie z konwencjonalnym TFM na bazie trypsyny dla komórek MEF przylegających do fibronektyny o średnicy 300 μm. Wynik oświetlenia UV-A (6000 mJ/^mm2), po którym następuje 15 minut oczekiwania, nie różni się znacząco od konwencjonalnego leczenia trypsyną (tj. 0,05% przez 20 minut). Słupki pokazują średnią S.E.M. (dwustronny test t-Studenta, ****P < 0,0001, * P < 0,05, ns P ≤0,5). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt.

Akrylamid (%)	Bis-akryloamid (%)	Akrylamid z 40 % roztworu podstawowego (ml)	Bi-akryloamid z 2 % roztworu podstawowego (ml)	Woda (ml)	Moduł Younga (kPa)
4	0,1	1	0,5	8,5	5,74 ± 0,53
5	0,15	Wydanie orzeczenia 1,25	0,75	8	9,69 ± 0,68
5	0,3	Wydanie orzeczenia 1,25	1,5	Godzina 7,25	11,33 ± 1,06

Tabela 1: Mieszaniny roztworów hydrożelowych i wynikająca z nich elastyczność

Wszystkie dane są zdeponowane w Repozytorium Danych Open Access Towarzystwa Maxa Plancka (Edmond) i można uzyskać do nich dostęp pod następującym adresem: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

Discussion

W niniejszym protokole opisujemy przygotowanie mikrowzorzystych hydrożeli PA zawierających kulki fluorescencyjne, które są wykorzystywane jako markery referencyjne do badań TFM. Nasze podejście opiera się na trzech krokach: 1) przygotowaniu dwuwarstwowych hydrożeli PA; 2) mikromodelowanie białek ECM i ich transfer na powierzchnię hydrożelu; 3) zastosowanie wzorzystego światła bliskiego UV dla TFM. Eksperymentalna konfiguracja do analizy trakcji komórek do podłoża wymaga użycia liniowych materiałów sprężystych o znanych wartościach sztywności do obliczenia sił związanych z przemieszczeniem koralików fluorescencyjnych²⁶. Hydrożele PA są łatwe w przygotowaniu, sztywność można łatwo dostroić i są powszechnie stosowane do wykrywania sztywności i TFM^18,28. Jednak, aby uzyskać powtarzalne czasy polimeryzacji i jednorodną polimeryzację całego hydrożelu, należy zwrócić uwagę na warunki i czas przechowywania odczynników, np. APS powinien być przechowywany w eksykatorze, aby uniknąć utraty swojej aktywności; TEMED należy chronić przed bezpośrednim działaniem światła. Zastosowanie utlenionego HEA pozwala na kowalencyjne wiązanie białek macierzy na powierzchni hydrożelu, co może być korzystne dla uzyskania pełnej i stabilnej warstwy białka. Utleniony roztwór HEA należy przygotowywać na świeżo za każdym razem, gdy wytwarzane są hydrożele PA. Dwuwarstwowy hydrożel PA ma trzy główne zalety: 1) zapewnia alternatywny sposób na powtarzalne uzyskanie jednorodnego rozmieszczenia kulek fiducial w pobliżu powierzchni hydrożelu, bez konieczności nadawania żelowi niezwykle cienkiej (tj. <20 μm). Kontrola nad grubością hydrożelu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych pomiarów za pomocą TFM. Gdy elastyczny substrat jest zbyt cienki, silnie przylegające komórki, takie jak fibroblasty, mogą wyczuwać i mechanicznie reagować na leżące pod nim sztywne szklane podłoże^29,30. Gęste hydrożele sprawiają, że akwizycja obrazu w celu rekonstrukcji siły jest trudniejsza. Co więcej, wiele mikroskopów nie będzie miało wystarczającej ilości miejsca, aby je pomieścić, biorąc pod uwagę dodatkową grubość szklanego podłoża używanego do mocowania hydrożelu, chyba że stosowane są ultracienkie szkiełka mikroskopowe. 2) W dwuwarstwowym hydrożelu PA jednorodny rozkład kulek fiducial w pobliżu powierzchni hydrożelu PA uzyskuje się bez użycia wirówki, ale raczej poprzez prostą inkubację precyzyjnych ilości roztworów hydrożelu i kulek fluorescencyjnych. Wysoka gęstość ściegów jest istotną zaletą podczas wykonywania analizy PIV, ponieważ zwiększa rozdzielczość sił trakcyjnych i stosunek sygnału do szumu bez konieczności stosowania mikroskopii konfokalnej. 3) Zamknięcie kulek w cienkiej warstwie blisko granicy faz komórka-materiał umożliwia obrazowanie sił trakcyjnych za pomocą mikroskopów epifluorescencyjnych, a także mikroskopów konfokalnych. Przygotowując hydrożel, użytkownik powinien upewnić się, że mocno przylega on do dolnej szyby przed przystąpieniem do kolejnych kroków protokołu. Zalecamy przestrzeganie czasu inkubacji wskazanego dla polimeryzacji warstw hydrożelu, ponieważ usunięcie szkła z powierzchni bez uszkodzenia powierzchni hydrożelu może być trudne.

Najbardziej znanymi technikami pomiaru właściwości elastycznych są AFM, nanotwardość, próby rozciągania i reometria. Jednak nanotwardość indukuje bardzo duże naprężenia na materiałach, które mogą wpływać na określenie właściwości elastycznych. Z drugiej strony próby rozciągania i reometria są makroskopowymi technikami pomiarowymi, podczas gdy komórki oddziałują na siebie w skali mikroskopowej^31,32. AFM umożliwia pomiary w mikroskali ze zredukowanymi odkształceniami w warunkach fizjologicznych. Wiarygodność pomiarów AFM może ulec pogorszeniu, jeśli brakuje szczegółów eksperymentalnych (np. siły wgłębienia i prędkości) lub rejestruje się niewystarczającą ilość danych²⁷. Huth i in. opisują algorytm wyodrębniania modułów Younga z danych AFM, który kładzie nacisk na utrzymanie stałych szczegółów pomiaru²⁷. Algorytm ten oferuje precyzyjne i wiarygodne określenie modułów Younga i został wykorzystany w naszych eksperymentach. Dodatkowo zmierzyliśmy wiele krzywych na próbkach wytworzonych w różnych dniach i uzyskaliśmy bardzo podobne wyniki (zmienność średnich wartości ok. 1-2 kPa). To pokazuje, że sztywność naszych żeli można wiarygodnie przewidzieć.

W tym protokole używamy modułu fotomodelingu do tworzenia mikrowzorów na szkle, które są następnie przenoszone na powierzchnie hydrożelowe. Mikrowzorzec pokazany w tym protokole opiera się na bezmaskowej litografii bliskiej UV opartej na DMD (λ = 375 nm)⁷. DMD składa się z dużej liczby mikroluster na chipie. Pojedynczy piksel odpowiada pojedynczemu mikrolustrze. Plik obrazu pikselowego wzoru z komputera jest rzutowany przez DMD i ogniskowany na powierzchni za pomocą soczewki obiektywu. Do mikromodelowania białek skupione światło laserowe służy do rozszczepiania odstraszających szczotek polimerowych za pomocą fotoinicjatora. Następnie odsłonięte obszary są wypełniane białkami ECM. Ta metoda ablacji bez maski oferuje dużą elastyczność w projektowaniu nowych wzorów, ponieważ nie polega na użyciu fotomaski. Zaprojektowanie i zastosowanie wzoru jest bardzo łatwe, ponieważ zajmuje tylko kilka minut przy użyciu darmowego oprogramowania, takiego jak Inkscape. Jednak liczba wzorów i próbek wytworzonych w krótkim czasie jest poważną wadą, ponieważ metoda ta może być stosowana tylko do modelowania tylko jednego podłoża za każdym razem. Moduł fotowzorcowy wykorzystuje źródło lasera na ciele stałym w bliskim UV, które emituje kilka miliwatów. Odsłonięta wiązka lasera jest niebezpieczna dla oczu i skóry. Odbite i rozproszone światło i promieniowanie mogą być również niebezpieczne. Do obsługi należy dołączyć instrukcję bezpieczeństwa od oficerów laserowych. Najważniejszym krokiem w protokole podczas korzystania z modułu fotomodelowania jest upewnienie się, że podczas mikromodelowania i ablacji laser jest odpowiednio skupiony na powierzchni. Stała dawka oświetlenia (intensywność pomnożona przez czas) światła UV podczas modelowania zależy od tego, w jaki sposób laser jest skupiony na powierzchni. Słaba intensywność na powierzchni spowodowana słabym skupieniem może spowodować niepowodzenie transferu ECM na powierzchnię hydrożelu, co spowoduje, że żadne komórki nie przyłączą się do hydrożelu.

W eksperymentach TFM, po wstępnym obrazowaniu przylegających komórek i markerów odniesienia, komórki są uwalniane z hydrożelu PA przez leczenie trypsyną, aby zarejestrować ich stan relaksu. Wadą w wykonywaniu tego kroku jest obchodzenie się z próbką na etapie mikroskopii. Bez komory perfuzyjnej otwieranie pokrywy naczynia, zasysanie pożywki, płukanie i pipetowanie roztworu trypsyny stanowią wyzwanie dla początkujących i doświadczonych użytkowników. W rzeczywistości procedury te są głównym źródłem dryfu w osiach xyz , co skutkuje utratą pozycji i ostrości. Nasz protokół lokalnego oświetlenia UV sprawia, że TFM jest bardziej dostępną techniką dla początkujących. Należy zauważyć, że użyliśmy dostępnego na rynku modułu fotowzorcowego bez maski opartego na mikroskopii, ale w zasadzie można było zastosować dowolny system oświetlenia UV-A, ostatecznie w połączeniu z maską w celu ochrony obszarów podłoży, w których siły trakcyjne komórek nie powinny być rejestrowane. Wystawienie komórek na działanie znacznej dawki światła widzialnego o niskiej długości fali (np. światła fioletowego, które wzbudza emisję DAPI) doprowadzi do wzrostu stresu oksydacyjnego, co może skutkować fototoksycznością i śmiercią komórki. Dlatego technika ta może być stosowana nawet w mikroskopie epifluorescencyjnym bez modułu lasera UV. Ponieważ jednak intensywność jest znacznie słabsza, w tym przypadku znacznie łatwiej będzie osiągnąć TFM za pomocą leczenia enzymatycznego.

Dzięki LUVI-TFM możliwe jest użycie tej samej próbki do kilku pomiarów ze względu na miejscowe oderwanie pojedynczych komórek lub małych grup komórek. Należy jednak zwrócić uwagę na wybór ogniw do odłączenia, aby uniknąć rejestrowania sił z sąsiednich komórek. W związku z tym w przypadku pomiarów pojedynczych komórek przy braku mikrowzorców należy unikać zatłoczonych regionów; W przypadku pomiarów na pojedynczych komórkach z mikrowzorami, wzory powinny być zaprojektowane w taki sposób, aby odległość między pojedynczymi strukturami była co najmniej dwukrotnie większa od średnicy obszaru z wzorem. Zalecamy również, aby nie używać komórek z sąsiednich wzorów w sekwencji, ale raczej pobierać próbki z odległych obszarów na podłożu. Nasz pomiar jest dobrze przeprowadzony na mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w funkcję kontroli ostrości i soczewkę 40 x NA = 0,9, gdzie odległość robocza soczewki jest wystarczająco duża, a szybki ruch od jednego dołka do drugiego jest wysoce przestrajalny. Ukierunkowane oddzielenie komórek do zastosowań TFM jest skuteczne w pomiarze siły komórkowej pojedynczej komórki lub całego klastra małych komórek (np. o średnicy do 300 μm). Korzystając z naszej konfiguracji, zaobserwowaliśmy zaokrąglanie i odwarstwianie komórek w przypadku obróbki UV pojedynczych komórek (ryc. 3A), podczas gdy odwarstwienie rzadko występowało w przypadku małych klastrów komórek. Może to prowadzić do niedoszacowania sił trakcyjnych komórek. W przypadku większych skupisk komórek zalecane jest odłączanie enzymatyczne, ponieważ użytkownicy powinni używać obiektywu pneumatycznego 20x do obrazowania całego klastra i potrzebna jest funkcja kontroli ostrości. Ponieważ głębia ostrości obiektywu pneumatycznego 20x jest znacznie większa, obsługa nie będzie tak krytyczna, jak w przypadku obiektywu o większym powiększeniu. Użytkownik powinien upewnić się, że ostrość jest prawidłowo ustawiona do ablacji komórek, ponieważ dawka oświetlenia zależy od skupienia lasera na powierzchni. Chociaż zdajemy sobie sprawę z możliwych ograniczeń w stosowaniu LUVI-TFM w kolektywach komórkowych ze względu na możliwe interakcje mechaniczne z sąsiednimi nieleczonymi komórkami, ten aspekt może okazać się przydatny w badaniach nad mechaniką celowanej ekstruzji komórek, np. z monowarstw nabłonka.

Podsumowując, dzięki naszemu podejściu TFM w połączeniu z indukowanym światłem uwalnianiem komórek z mikrowzorem, zapewniamy solidny i wysokoprzepustowy protokół do pomiaru sił adhezji komórek. Wszechstronność tej metody może być dalej wykorzystywana przy użyciu mikroskopii i konfiguracji obrazowania w celu poprawy rozdzielczości i czułości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metakrylan 3-(trimetoksysililo)propylu	#440159	Sigma Aldrich
Kwas octowy	#33209	Akrylamid Honeywell
40 %	#1610140	Bio-Rad	UWAGA : toksyczny, praca pod wyciągiem
Wspornik AFM	#CP-CONT-BSG-A-G	NanoAndMore	5 μ
m system AFM	#NanoWizard3	JPK	Sprzężony z mikroskopem optycznym wyposażonym w 40-krotny obiektyw powietrzny i filtr GFP
Nadsiarczan amonu	#A3678	Sigma
Bis-akryloamid 2 %	#1610142	Bio-Rad	UWAGA : toksyczny, praca pod wyciągiem
Kamera sCMOS	#C11440-42U30	Hamamatsu
Kamera sCMOS	#ANDORZYLA4.2	Oxford Instrument
CellRox	#C10422	Thermo Fisher
Niestandardowa komora		EMBLEM
Klej dentystyczny	#1300 100	Picodent
DMEM	#41965	Mikroskop
	#Eclipse Ti2E	Nikon
Epifluorescencja mikroskop	#Axiovert200	Zeiss
Etanol	#9065.3	Carl Roth
FBS Ameryka Południowa	#S181T	Thermo Fisher
Fibrynogen	#F13191	Invitrogen	Alexa488 sprzężony
Fibronektyna	#F1141	Sigma
Koraliki fluorescencyjne 200 nm	#F8805	Invitrogen	Karboksylowany ( 365/415)
Koraliki fluorescencyjne 200 nm	#F8848	Invitrogen	Karboksylowane (505/515)
Koraliki fluorescencyjne 200 nm	#F8810	Invitrogen	Karboksylowane (580/605)
Koraliki fluorescencyjne 200 nm	#F8807	Invitrogen	Karboksylowane (660/680)
Szkiełko nakrywkowe szklane 15 mm okrągłe	#41001115	Szkiełko
Glass 24 mm okrągłe	#41001124	Obiektyw mikroskopu wspomagającego
	#MRH08230	Nikon	20x air NA 0.45
Mysie fibroblasty embrionalne	#CRL-2991	ATCC
mPEG-SVA	#MPEG-SVA-5000	Laysan Bio
N-hydroksyetyloakrylamid	#697931	Środek
	#100-E	TePla
Żel PLPP	#PLPPgel	Alveole
Poly-L-lizyna	#P4823	Sigma Aldrich
Poly(L-lizyna)-graft-poli(glikol etylenowy)	#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)	SuSoS
Periodynian sodu(meta)	#S1878	Sigma Aldrich
TEMED#	17919	Moduł
	#PRIMO	Alveole
UVO	#342-220	Jelight