Artykuł metodologiczny

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63121

⸱

29 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular Biophysics, Max Planck Institute for Medical Research, 2Institute for Theoretical Physics and BioQuant, Heidelberg University, 3Institute for Molecular Systems Engineering (IMSE), Heidelberg University

W tym artykule

Podsumowanie

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Streszczenie

Mikroskopia siły pociągowej (TFM) jest główną metodą używaną w mechanobiologii do pomiaru sił komórkowych. Zwykle jest to używane do komórek przylegających do płaskich miękkich podłoży, które odkształcają się pod wpływem trakcji komórkowej (2D-TFM). TFM opiera się na zastosowaniu liniowych materiałów elastycznych, takich jak polidimetylosiloksan (PDMS) lub poliakryloamid (PA). W przypadku 2D-TFM na PA trudność w osiągnięciu wysokiej przepustowości wynika głównie z dużej zmienności kształtów komórek i trakcji, co wymaga standaryzacji. Przedstawiamy protokół szybkiego i wydajnego wytwarzania mikrowzorcowych hydrożeli PA do badań 2D-TFM. Mikrowzory są najpierw tworzone przez fotolitografię bez maski przy użyciu światła bliskiego UV, gdzie białka macierzy zewnątrzkomórkowej wiążą się tylko z obszarami mikrowzorów, podczas gdy reszta powierzchni pozostaje nieadhezyjna dla komórek. Mikrowzorzec białek macierzy zewnątrzkomórkowej wynika z obecności aktywnych grup aldehydowych, w wyniku czego powstają obszary adhezyjne o różnych kształtach, aby pomieścić pojedyncze komórki lub grupy komórek. Do pomiarów TFM używamy hydrożeli PA o różnej elastyczności poprzez zmianę ilości akrylamidu i bis-akrylamidu oraz śledzenie przemieszczenia osadzonych kulek fluorescencyjnych w celu rekonstrukcji pól trakcyjnych komórek za pomocą regularnej cytometrii trakcyjnej z transformacją Fouriera (FTTC).

Aby jeszcze bardziej osiągnąć precyzyjny zapis sił komórkowych, opisujemy użycie kontrolowanej dawki światła wzorcowego do uwalniania trakcji komórek w określonych regionach dla pojedynczych komórek lub grup komórek. Metodę tę nazywamy mikroskopią sił trakcyjnych z lokalnym oświetleniem UV (LUVI-TFM). W przypadku obróbki enzymatycznej wszystkie komórki są odłączane od próbki jednocześnie, podczas gdy w przypadku LUVI-TFM siły trakcyjne komórek w różnych regionach próbki mogą być rejestrowane sekwencyjnie. Wykazujemy możliwość zastosowania tego protokołu (i) do badania sił trakcyjnych komórek w funkcji kontrolowanej adhezji do podłoża oraz (ii) do uzyskania większej liczby obserwacji eksperymentalnych z tej samej próbki.

Wprowadzenie

Podczas interakcji ze swoim środowiskiem zewnątrzkomórkowym, przylegające komórki wywierają siły, które są głównie pośredniczone przez ogniskowe zrosty oparte na integrynie, łączące macierz zewnątrzkomórkową (ECM) z cytoszkieletem aktyny. Adhezje ogniskowe to zespoły wielobiałkowe, które koncentrują się wokół wiązania integryn z białkami ECM, takimi jak fibronektyna i kolagen. Grupowanie integryn i wzrost zrostów ogniskowych ma kluczowe znaczenie nie tylko dla ustanowienia stabilnego mechanicznie połączenia, ale także dla rekrutacji innych ogniskowych białek adhezyjnych, w tym tych, które aktywują szlak RhoA do regulacji kurczliwości komórkowej1. Zależna od RhoA kurczliwość cytoszkieletu aktynowego pozwala komórkom rozprzestrzeniać się i migrować na leżącym pod spodem ECM, a także wyczuwać jego sztywność2. Rozkład sił trakcyjnych silnie zależy od obszaru rozprzestrzeniania się i kształtu komórek, z których oba zależą od właściwości matrycy, a zatem wpływają na organizację cytoszkieletu, ostatecznie tworząc zamkniętą pętlę sprzężenia zwrotnego między mechaniką macierzy a organizacją cytoszkieletu3,4.

Techniki mikrowzorcowania powierzchni pozwalają na zdefiniowaną kontrolę kształtu komórki poprzez tworzenie mikronowych obszarów prezentujących białka adhezyjne ECM; w zależności od wielkości tych regionów, pojedynczych komórek lub grup komórek, które przylegają do mikrowzorca5. Białka ECM mogą być wzorowane na podłożach szklanych za pomocą różnych metod, takich jak druk mikrokontaktowy, foto-patterning lub laserowe modelowanie6. Zastosowanie światła UV (λ = 185 lub 375 nm) w połączeniu ze strategiami przeciwporostowymi powierzchni zapewnia elastyczność w projektowaniu różnych kształtów i rozmiarów oraz immobilizacji wielu typów białek z dużą precyzją przy krawędziach powierzchni7,8. Obszary pokryte substancjami chemicznymi odstraszającymi białka, takimi jak glikol polietylenowy (PEG), są chronione za pomocą chromowej fotomaski lub bezmaskowego systemu litograficznego opartego na cyfrowym urządzeniu lustrzanym (DMD). Wzory w maskach pozwalają na ekspozycję na światło UV obszarów, które następnie zostaną wymodelowane za pomocą białek ECM. Modelowanie powierzchni hydrożelowych za pomocą białek ECM wymaga etapu transferu w celu usunięcia białek z powierzchni szkła i usieciowania ich z wzorami. Alternatywnie, wzór na miękkich materiałach można uzyskać, najpierw pokrywając fotomaskę białkiem odstraszającym, a następnie spalając niezamaskowane obszary za pomocą głębokiego oświetlenia UV. Ponieważ głębokie promieniowanie UV generuje ozon i sprawia, że powierzchnia jest reaktywna w celu wiązania białek, niezamaskowane regiony są powlekane białkami ECM, a na koniec żel jest polimeryzowany bezpośrednio na niezamaskowanych regionach9,10.

Wzorzyste hydrożele mogą być używane do wykonywania TFM, techniki, która mierzy siły komórkowe na granicy komórka-materiał11. W 2D-TFM wykorzystuje się płaską powierzchnię grubej folii polimerowej, w której osadzono koraliki znacznika w celu śledzenia deformacji12,13,14,15. Aby wyodrębnić wektory przemieszczenia, konieczne jest połączenie dwóch obrazów, jednego obrazu w stanie zdeformowanym i jednego obrazu odniesienia bez deformacji. Dwa obrazy są następnie odwzorowywane na siebie za pomocą przetwarzania obrazu. Przy dużej gęstości znaczników odbywa się to zwykle za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV), która jest dobrze znaną metodą rekonstrukcji przepływu hydrodynamicznego. Przy niskiej gęstości znaczników i w 3D-TFM odbywa się to zwykle za pomocą prędkości śledzenia cząstek (PTV), która obejmuje specyficzne cechy zestawu danych eksperymentalnych. Przykładem tańszej obliczeniowo alternatywy jest przepływ optyczny, taki jak algorytm Kanade-Lucas-Tomasi (KLT)16. W przypadku podłoży hydrożelowych kulki fluorescencyjne są zwykle zatapiane w dużej gęstości podczas polimeryzacji materiału, a obrazy są rejestrowane przed i po uwolnieniu komórek po oderwaniu enzymatycznym. Enzymatyczne odrywanie przylegających komórek, np. przez trypsynizację, prowadzi do jednoczesnego uwolnienia trakcji komórkowych ze wszystkich komórek na hydrożelach, co utrudnia uzyskanie szczegółowej analizy z dużej liczby komórek.

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania mikrowzorcowych hydrożeli do kontroli kształtu i lokalizacji komórek oraz metodę efektywnego pomiaru sił trakcyjnych w sekwencji za pomocą UV do oddzielania pojedynczych komórek od podłoża. Do pomiarów siły pociągowej przedstawiamy technikę wytwarzania dwuwarstwowych hydrożeli PA, gdzie kulki fluorescencyjne zatopione są tylko w wierzchniej warstwie, co zwiększa ich gęstość i zmniejsza ich pionowe rozpiętość. Połączenie uwalniania komórkowych sił trakcyjnych za pośrednictwem promieniowania UV z mikrowzorcami umożliwia uzyskanie kontroli przestrzennej nad oderwaniem komórek (np. pojedynczych komórek bez wpływu na adhezję innych komórek w obszarze zainteresowania), pod warunkiem, że istnieje wystarczająca odległość między komórkami wzorzystymi. Trakcja komórkowa jest następnie rekonstruowana przy użyciu najbardziej wydajnej i niezawodnej metody dla 2D-TFM, a mianowicie cytometrii trakcyjnej z transformacją Fouriera (FTTC) z regularyzacją17,18.

Protokół

1. Przygotowanie metakrylowanych szkiełek podstawowych

UWAGA: Szklane szkiełka podstawowe są metakrylowane w celu kowalencyjnego powiązania hydrożeli PA, co zapobiega ich odklejaniu się podczas inkubacji z komórkami. Szkiełka podstawowe do mikroskopu są stosowane w celu uzyskania wysokiej jakości obrazu.

  1. Aby przygotować 300 mL roztworu, należy wziąć czysty zlew szklany o pojemności 400 mL i umieścić go w dygestorium.
  2. Do zlewka dodać 10 mL wody dwukrotnie destylowanej (ddH2O). Za pomocą pipety serologicznej dodać 18,75 mL kwasu octowego (≥99,8% cz.d.a., p.a.), 18,75 mL metacrylanu 3-(trimetoksysilylo)propylu oraz 252,5 mL etanolu (≥99,8% p.a.). Roztwór przelać do naczynia krystalizacyjnego.
  3. Oczyścić okrągłe szklane szkiełka podstawowe o średnicy 24 mm za pomocą chusteczek precyzyjnych. Umieścić szkiełka w specjalnie wykonanym statywie z politetrafluoroetylenu.
  4. Zanurzyć statyw w roztworze i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Wyjąć statyw i opłukać wszystkie szkiełka etanolem (99,8% p.a.). Osuszyć szkiełka strumieniem powietrza.
    UWAGA: Metakrylowane szkiełka można przechowywać do 1 miesiąca w temperaturze RT.

2. Mikrowzorcowanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej na szkiełkach podstawkowych

UWAGA: Szklane szkiełka nakrywkowe są najpierw powlekane warstwą cząsteczek, składającą się z substancji odpychającej białka i komórki. Warstwa ta jest następnie usuwana za pomocą techniki fotolitografii, aby umożliwić późniejsze osadzanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach mikrowzorowanych.

  1. Należy wziąć okrągłą szkiełko nakrywkowe o średnicy 15 mm i umieścić je na szalce Petriego. Za pomocą rylca diamentowego należy zaznaczyć górną stronę szkiełka. Następnie należy przeprowadzić czyszczenie via obróbka plazmą tlenową przy ciśnieniu 0,4 mbar i mocy 200 W przez 2 min.
  2. Na powierzchnię każdego szkiełka należy nanieść pipetą 100 µL 0,01% roztworu poli-L-lizyny. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT). Szkiełka należy przemyć 10 mM kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) o pH 8,5. Należy usunąć nadmiar cieczy, pozostawiając powierzchnię wilgotną.
  3. Na powierzchnię każdego szkiełka należy nanieść pipetą 100 µL 50 mg/mL poli(glikolu etylenowego) metylu eteru kwasu succinimidylowo-walerynowego (mPEG-SVA) w 10 mM HEPES pH 8,5. Inkubować przez 1 h w RT. Szkiełka należy opłukać 10 mM HEPES pH 8,5 i osuszyć strumieniem powietrza.
  4. Na powierzchnię należy dodać 2 µL światłoczułego fotoinicjatora (np. PLPP-gel), a następnie 40 µL etanolu (≥99,8% p.a.). Aby uzyskać jednorodne rozłożenie żelu i etanolu na powierzchni, należy delikatnie przechylać szalkę Petriego w przód i w tył. Odczekać 5 min do spolimeryzowania roztworu.
  5. Pojedyncze szkiełko należy umieścić w szalce Petriego o średnicy 35 mm z otworem o średnicy 20 mm w dnie. Pozwala to wiązce lasera padającej od dołu na bezpośrednie dotarcie do szklanej powierzchni.
  6. Należy włączyć mikroskop oraz moduł wzorowania świetlnego (praca z tym urządzeniem jest dozwolona wyłącznie po przejściu szkolenia z zakresu bezpieczeństwa przeprowadzonego przez inspektorów ochrony przed laserami). Należy skalibrować laser UV-A na obiektywie powietrznym 20x. Próbkę z fotoinicjatorem należy umieścić na stoliku. Należy ustawić ostrość na powierzchni szkła i włączyć kontrolę ostrości. Należy wczytać i zablokować wcześniej przygotowany wzór.
    1. Wzór należy przygotować w oprogramowaniu graficznym, takim jak Inkscape. Należy upewnić się, że plik wzoru nie przekracza wymiarów DMD (1824 x 1140 px, co odpowiada 552 x 325 µm przy soczewce 20x (0,28 µm/px)).
      UWAGA: Zaleca się stosowanie rozmiaru DMD (1824 x 1140 pikseli) jako rozmiaru pliku wzoru, co zapobiegnie błędom podczas wzorowania. Na przykład nie należy tworzyć pliku wzoru o wymiarach 1830 x 1130 pikseli.
    2. W celu przeniesienia wzoru na poliakrylamid należy upewnić się, że wzorowanie odbywa się tylko do 60%-70% promienia, licząc od środka szkła do krawędzi.
    3. W przypadku wzorowania dla pojedynczej komórki należy zastosować średnicę 50-100 µm z odległością 100 µm między wzorami, a dla grupy komórek średnicę 150-300 µm. Odpowiedni rozmiar wzoru zależy w znacznym stopniu od typowego rozmiaru komórki i musi być wystarczająco duży, aby umożliwić adhezję komórek.
  7. Wzorowanie należy rozpocząć przy dawce UV wynoszącej 30 mJ/mm2. Czas trwania wzorowania zależy od liczby wzorów. Utworzenie pojedynczego wzoru zajmuje około 1 s.
  8. Po zakończeniu etapu wzorowania powierzchnię należy trzykrotnie opłukać fosforanem soli fizjologicznej (PBS). Próbkę należy inkubować przez 1 h w RT z 100 µL 25 µg/mL fibronektyny rozpuszczonej w 1x PBS oraz 25 µg/mL koniugatu fibrynogenu z Alexa488 w PBS. W przypadku innych białek ECM należy dobrać optymalne stężenia zapewniające całkowite pokrycie obszarów wzorowanych.
  9. Powierzchnię należy trzykrotnie opłukać 1x PBS. Należy upewnić się, że wzorowane szkło zostanie niezwłocznie użyte do transferu szkło-PA. Wzorowane szkło należy przechowywać w PBS w RT podczas przygotowywania hydrożelu.

3. Wytwarzanie wzorowanych hydrożeli poliakryloamidowych

UWAGA: Przygotowano hydrożele poliakrylamidowe zawierające utleniony N-hydroksyetylakrylamid (HEA), aby wprowadzić reaktywne grupy aldehydowe umożliwiające kowalencyjne wiązanie białek macierzy na powierzchni. Dodatkowo zastosowano podejście dwuwarstwowe, aby osadzić koraliki fluorescencyjne wyłącznie w górnej warstwie hydrożelu, co ma na celu poprawę rejestracji przemieszczenia koralików podczas eksperymentów z mikroskopii sił trakcyjnych.

  1. Umieść zmetyloakrylowane szkiełka podstawowe w szalce Petriego.
  2. Aby przygotować świeży roztwór utlenionego HEA, dodaj 9,55 mL wody podwójnie destylowanej do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL. Następnie dodaj 0,5 mL HEA oraz 42 mg nadwęglanu sodu, aby otrzymać 10 mL roztworu. Mieszaj roztwór w sposób ciągły w ciemności przez 4 h.
  3. Wymieszaj akrylamid, bis-akrylamid i wodę podwójnie destylowaną zgodnie z Tabelą 1, aby otrzymać 10 mL roztworu zapasowego hydrożelu (czynność tę należy przeprowadzić pod wyciągiem, ponieważ monomery są neurotoksyczne). Odgazuj roztwór i szczelnie zamknij pokrywkę.
    UWAGA: Roztwór zapasowy można przechowywać w alikwotach do 1 roku w temperaturze 4 °C. Przed użyciem zawsze należy wyznaczyć moduł Younga hydrożelu.
  4. Przygotuj dwuwarstwowy hydrożel PA (czynność tę należy przeprowadzić pod wyciągiem, ponieważ monomery są neurotoksyczne).
    1. Zacznij od warstwy dolnej, ostrożnie mieszając 99,3 µL roztworu zapasowego, 0,5 µL 1% persiarczanu amonu (APS) oraz 0,2 µL tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) w probówce 1,5 mL. Pobierz 10 µL roztworu i nanieś go kroplowo na środek zmetyloakrylowanego szkiełka podstawowego.
    2. Ostrożnie połóż okrągłe szkiełko podstawowe o średnicy 15 mm na kropli i odczekaj 45 min do polimeryzacji. Ostrożnie oddziel górne szkiełko za pomocą skalpela.
    3. W przypadku warstwy górnej, ostrożnie wymieszaj w probówce 1,5 mL 93,3 µL roztworu zapasowego z 1 µL świeżego roztworu utlenionego HEA, 5 µL kuleczek fluorescencyjnych (odpowiadających trzem kuleczkom na mikrometr kwadratowy dla kuleczek o rozmiarze 200 nm), 0,5 µL 1% APS oraz 0,2 µL TEMED. Pobierz 5 µL roztworu i nanieś go kroplowo na środek uprzednio spolimeryzowanej warstwy dolnej.
    4. Ostrożnie połóż szkiełko podstawowe z mikrowzorami na kropli. Odczekaj 45 min w temperaturze pokojowej (RT) do spolimeryzowania kropli. Upewnij się, że strona z wzorem dotyka kropli. Ostrożnie oddziel szkiełko za pomocą skalpela.
  5. Przyklej szkiełka podstawowe o średnicy 24 mm do dna specjalnie wywierconych płytek 6-dołkowych, używając dwuskładnikowego kleju silikonowego. Po 5 min dodaj PBS do dołków.
  6. Wyznacz moduł Younga próbek hydrożelu poliakryloamidowego za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM).
    1. Zamocuj wspornik ze sferyczną końcówką w uchwycie AFM.
    2. Zkalibruj każdy wspornik poprzez zarejestrowanie krzywej siła-odległość (setpoint 3-4 V) na twardym podłożu (np. szkle lub miką), wyznacz czułość wspornika, wycofaj go z powierzchni i przeprowadź strojenie termiczne w celu wyznaczenia stałej sprężystości.
    3. Umieść skalibrowane wsporniki nad próbką hydrożelu i zarejestruj krzywe siły w buforze PBS, stosując następujące parametry: setpoint siły 20-30 nN, prędkość zbliżania i wycofywania 5 lub 10 µm/s, zakres rampy 5 µm.
      UWAGA: Do wizualizacji i celowania w obszary z mikrowzorami ECM w próbkach hydrożelu PA użyto odwróconego mikroskopu optycznego wyposażonego w obiektyw 40x oraz filtr białka fluorescencyjnego (GFP).
    4. Wykreśl zarejestrowane krzywe siły w funkcji odległości przy użyciu oprogramowania analitycznego AFM.
    5. Wyznacz punkt kontaktu i przekształć krzywe siły w funkcji odległości w krzywe siły w funkcji wgłębienia.
    6. Dopasuj część krzywej odpowiadającą wgłębieniu do modelu Hertza (lub odpowiedniego modelu mechanicznego w zależności od geometrii końcówki), przyjmując współczynnik Poissona od 0,2 do 0,5.

4. Lokalny rozładunek sił trakcyjnych komórek za pomocą naświetlania laserem UV-A (LUVI-TFM)

UWAGA: Laser UV-A jest stosowany do uwalniania sił trakcyjnych w komórkach zlokalizowanych w określonych obszarach hydrożeli. Laser UV-A (tj. laser ciało stałe o długości fali λ = 375 nm, <15 mW) jest laserem klasy 3B. Nieosłonięta wiązka laserowa jest niebezpieczna dla oczu, a często również dla skóry. Odbite i rozproszone światło oraz promieniowanie mogą być niebezpieczne. Ponadto promieniowanie UV może powodować raka skóry. Praca z urządzeniami jest dozwolona wyłącznie po przejściu szkolenia z zakresu bezpieczeństwa prowadzonego przez inspektorów ochrony przed promieniowaniem laserowym.

  1. Odssać PBS z dołków.
  2. Zasiać 3 x 106 komórek na płytkę 6-dołkową w pożywce wzrostowej. W przypadku fibroblastów należy zastosować wysokoglukozowe pożywkę DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) zawierającą L-glutaminę i uzupełnioną o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny/streptomycyny. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO2Przed rozpoczęciem badania mikroskopowego należy wypłukać próbki w celu usunięcia komórek pływających.
  3. Włącz komorę inkubacyjną mikroskopu oraz dopływ gazu, aby uzyskać temperaturę wynoszącą 37 °C i 5% CO22 atmosfera
  4. Włącz mikroskop oraz moduł do wzorowania laserowego. W razie potrzeby skalibruj ponownie laser UV-A na obiektywie powietrznym 20x za pomocą oprogramowania Leonardo. Umieść na stoliku specjalnie wykonaną płytkę 6-dołkową z próbkami. Ustaw ostrość na powierzchni PA.
  5. Ustaw wzór oświetlenia i zaznacz interesujące komórki. Ponownie ustaw ostrość na powierzchni hydrożelu. Pozyskaj obraz komórek w kanale pola jasnego. Przełącz na kanał Cy5 (filtr dalekiej czerwieni, wzbudzenie 650 nm, emisja 670 nm) i wykonaj obraz kulek w stanie odkształcenia.
  6. Przełącz na kanał laserowy. Włącz laser na 3 min. W naszej konkretnej konfiguracji odpowiadało to dawce światła wynoszącej 6 000 mJ/mm²2.
  7. Przełącz na kanał Cy5 i wykonaj obrazowanie kulek w stanie nedeformowanym.
    UWAGA: W przypadku eksperymentu z użyciem embrionalnych fibroblastów mysich należy odczekać 15 min po ekspozycji przed zarejestrowaniem obrazu referencyjnego/niedeformowanego (patrz) Reprezentatywne wyniki sekcji). W przypadku innych typów komórek może być to inne. Powtórz kroki 4.5–4.7 dla kolejnych interesujących komórek.
  8. Aby zmierzyć zwiększony stres oksydacyjny po naświetlaniu UV-A, należy użyć dostępnego komercyjnie odczynnika (CellRox). CellRox w stanie zredukowanym nie wykazuje fluorescencji, natomiast po utlenieniu przez reaktywne formy tlenu fluorescuje z maksimum emisji przy ~665 nm.
  9. Zgodnie z dostarczonym protokołem, dodać 5 µM odczynnik do medium obrazującego i inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C/5% CO2Następnie komórki należy przemyć trzykrotnie ciepłym 1x PBS i wymienić medium do obrazowania. Sygnał Cy5 należy zarejestrować za pomocą obrazowania fluorescencyjnego przed i po naświetlaniu promieniami UV-A, stosując podobny czas ekspozycji na światło.

5. Przetwarzanie obrazów, wideo-welocymetria cząstek (PIV) i obliczanie sił trakcyjnych

UWAGA: Siły trakcyjne komórek są rejestrowane poprzez analizę przemieszczenia fluorescencyjnych kuleczek i obliczane przy użyciu narzędzi do analizy obrazu opartych na welocymetrii obrazowej cząstek.

  1. Otwórz w programie Fiji obrazy fluorescencyjnych kuleczek przed (tj. zdeformowanych) i po naświetleniu laserem (tj. niezdeformowanych). Połącz oba obrazy w jeden stos (Obraz | Stosy | Obrazy do stosowania).
  2. Skoryguj przesunięcie boczne między dwoma obrazami przy użyciu wtyczki StackReg (P. Thévenaz, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne). Zmień obrazy na 8-bitowe (Obraz | Typ | 8 bitów) i przeskalować do rozmiaru 1024 x 1024 px (Obraz | Skala). Zapisz jako sekwencję obrazów (format TIFF), przy czym obraz referencyjny musi zawsze znajdować się na początku.
  3. Wyznaczenie wektorowego pola przemieszczeń przy użyciu techniki korelacji wzajemnej19 z pola PIV zaimplementowanego w projekcie OpenPIV.
    1. Należy upewnić się, że obraz w stanie rozluźnionym (niedeformowanym) oraz obraz zdeformowany są pokryte oknami przeszukiwania o rozmiarze wR i WD w pikselach. Dla każdego okna wyszukiwania zdefiniuj funkcję korelacji wzajemnej, korzystając z następującego wzoru:
      Równanie korelacji statycznej, ΣΣ(R(i,j)-R̄)(D(i+r,j+s)-D̄), wzór matematyczny do analizy badawczej.
      Tutaj R(i,j) oraz D(i,j) opisują pola intensywności dwóch obrazów uciętych do wybranego okna wyszukiwania, a następnie uzupełnionych poprzez lustrzane odbicie krawędzi (mirror padding). Wzór na średni promień \( \overline{R} \) w równaniu fizycznym do analizy równowagi statycznej. i Symbol wartości uśrednionej, \(\overline{D}\), w obliczeniach statystycznych. opisz ich wartość średnią. Rozmiary okien zostały dobrane tak, aby wR = 32 oraz wD = 32, a pomiędzy sąsiednimi oknami wyszukiwania zastosowano 70% zakładki.
    2. Dla każdego okna wyszukiwania wyznacz wektor przesunięcia Notacja wektorowa, równanie \(\vec{u}=(r,s)^T\), schemat matematyczny, pojęcie z zakresu algebry liniowej. która optymalizuje funkcję korelacji wzajemnej i przypisuje ją do środkowej pozycji okna wyszukiwania. Dokładność podpikselową uzyskuje się za pomocą dopasowania gaussowskiego w obszarze maksimów, zgodnie z opisem20.
    3. Znajdź i usuń niejednoznaczne wektory przesunięcia. Wektory przesunięcia odpowiadające oknom wyszukiwania, w których stosunek dwóch najwyższych lokalnych maksimów funkcji korelacji wzajemnej jest niższy niż próg 1,5, uznaje się za niejednoznaczne.21.
    4. Odrzuć wektory przemieszczenia, które nie przeszły znormalizowanego testu mediany przy progu reszt wynoszącym 1,522.
    5. (Opcjonalnie) Skoryguj pozostały dryft boczny poprzez odjęcie stałego wektora Zmienna ze strzałką, \( \vec{u_0} \), symbolizująca prędkość początkową w równaniu fizycznym. ze wszystkich przesunięć. Wynika to z faktu, że przesunięcie w wybranym obszarze oddalonym od komórki zanika.
    6. Interpoluj wynikowe pole wektorów przesunięcia do regularnej siatki o odstępach 4 px obrazów wejściowych, stosując interpolację wielomianem trzeciego stopnia. Brakujące punkty danych uzupełnia się za pomocą gładkiej dwuwymiarowej ekstrapolacji sklejanej. Wektor przesunięcia wyrażony w pikselach jest powiązany z lokalną deformacją poprzez stosunek pikseli obrazu (0.33 µm/px (dla obiektywu powietrznego 20x).
    7. (Opcjonalnie) Zastosuj lustrzane dopełnienie obrazu (mirror padding), aby zredukować artefakty dzwonienia w dalszej analizie.
    8. Pomnóż pole deformacji przez funkcję okna Tukeya, aby wyeliminować efekt brzegowy wynikający z korekcji dryftu, stosując parametr 0,2-0,3. W tym eksperymencie obszarem zainteresowania jest obszar mikrowzorowany znajdujący się w centrum pola widzenia (FOV).
  4. Rekonstrukcja sił trakcyjnych z wykorzystaniem zregularizowanej cytometrii trakcyjnej opartej na transformacie Fouriera (FTTC)18Jako regularyzację stosujemy najprostszy rozsądny wybór, mianowicie 0th regularyzacja Tichonowa (L2) rzędu23,24,25Optymalny parametr regularyzacji λ jest dobierany w taki sposób, aby minimalizował on funkcję uogólnionej walidacji krzyżowej (Generalized Cross Validation, GCV), zdefiniowaną jako26:
    Równanie uogólnionej walidacji krzyżowej (GCV) do oceny modelu statystycznego.
    Tutaj τλ jest wektorem skumulowanym zawierającym składowe x i y zrekonstruowanego pola naprężeń dla danej wartości λ dla wszystkich trybów próbkowania Fouriera, a G jest operatorem liniowym odwzorowującym pola naprężeń na odpowiadające im pole przemieszczeń, zdefiniowanym dla FTTC. Sumowanie odbywa się po składowych wektorowych. ui stanowią składowe x i y pola przemieszczeń dla wszystkich trybów próbkowania Fouriera. GCV jest powszechnie stosowane w dziedzinie źle postawionych problemów odwrotnych i stanowi dobrą alternatywę dla kryterium krzywej L często wykorzystywanego w TFM. Do redukcji artefaktów wprowadzonych przez ograniczoną przestrzeń częstotliwości oraz nadpróbkowanie pola przemieszczeń stosowany jest filtr Lanczosa. Obliczenie naprężeń zależy od modułu Younga PA (np. 11,3 kPa) oraz współczynnika Poissona (np. dla PA w zakresie od 0,2 do 0,5, w zależności od stężenia sieciującego).

Wyniki

Hydrożele PA polimeryzowano na metakrylowanych szkiełkach przedmiotowych, które posiadają grupy reaktywne umożliwiające kowalencyjne wiązanie PA. W ten sposób zapobieżono odrywaniu się hydrożeli od podłoża podczas ich umieszczania w roztworze wodnym (Rysunek 1A-D). Aby uzyskać wysoką gęstość markerów referencyjnych w pobliżu powierzchni hydrożelu, opracowaliśmy metodę przygotowania dwuwarstwowego hydrożelu PA. Dolną warstwę, pozbawioną kuleczek fluorescencyjnych, polimeryzowano na metakrylowanym szkiełku. Następnie na górze dolnej warstwy polimeryzowano kolejną warstwę zawierającą kuleczki (Rysunek 1E-H), co wyeliminowało konieczność sedymentacji, często stosowanej w celu uzyskania rozkładu kuleczek w jednej płaszczyźnie ogniskowania i zwiększenia ich gęstości. Aby uzyskać kontrolę nad kształtem komórek podczas pomiarów TFM, wytworzono mikrowzorowane hydrożele PA via bezpośredni transfer mikrostruktur z wzorem z fibronektyny ze szkiełka przedmiotowego na uprzednio spolimeryzowany PA (Rysunek 1F-F'). Dodatek 1% niekonwencjonalnego sieciowania (utlenionego HEA) w roztworze górnej warstwy hydrożelu dostarcza grup aldehydowych, które wiążą się kowalencyjnie z grupami aminowymi fibronektyny.

Przygotowaliśmy hydrożele PA o grubości około 60 µm, w których w górnej warstwie, blisko powierzchni hydrożelu, uwięziono fluorescencyjne kuleczki. Ten rodzaj hydrożelu stanowi odpowiedni podłoże do obrazowania trakcji komórkowych za pomocą mikroskopów odwróconych i jest wystarczająco gruby (minimalna grubość do przeprowadzenia TFM została określona na 20-30 µm)18, aby zapobiec wpływowi szklanego podłoża. Lokalizację fluorescencyjnych kuleczek obrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej (Ryc. 1I). Aby zwizualizować transfer białek na hydrożelu, wykorzystano białka ECM znakowane fluorescencyjnie, które obrazowano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (Ryc. 1J). Przygotowano mikrowzory koliste z fibronektyny o średnicach 100 µm (lewa strona) i 50 µm (prawa strona), aby umożliwić adhezję grup komórek lub pojedynczych komórek, co przedstawiono na nałożonych na siebie obrazach w polu jasnym przylegających komórek, fluorescencyjnie znakowanych kuleczek referencyjnych oraz mikrowzorów z fibronektyny. Na innym preparacie odpowiedź adhezyjną pojedynczych komórek na mikrowzory z fibronektyny zweryfikowano za pomocą pośredniej mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu obrazowania lokalizacji białek adhezji ogniskowej, takich jak paxillin (Ryc. 1K).

Zarówno powlekanie białkami ECM, jak i sztywność hydrożelu są kluczowymi parametrami dla adhezji komórek26. Aby scharakteryzować właściwości mechaniczne naszych hydrożeli PA, przeprowadziliśmy eksperymenty nanoindentacji za pomocą AFM27, sprzężonego z mikroskopem epifluorescencyjnym. Przygotowano i przetestowano w naszej konfiguracji podłoża hydrożelowe o trzech różnych stopniach sztywności (Rysunek 2 i Tabela 1). Sferyczne końcówki AFM były cyklicznie zbliżane i oddalane od nieukształtowanych hydrożeli PA oraz od obszarów z mikrowzorami koniugatu fibrynogenu z Alexa488, przy jednoczesnym rejestrowaniu krzywych siła-odległość. Następnie ocena punktu kontaktu i zastosowanie modelu Hertza pozwoliły nam oszacować moduł Younga (E) każdej próbki. Mikrowzorowanie ECM nie zmieniło modułu Younga, który pozostał porównywalny do każdego z nieukształtowanych hydrożeli PA.

Aby zmierzyć siły trakcyjne wywierane przez komórki adherentne na podłoże, opracowaliśmy układ eksperymentalny do TFM opartego na referencji, przeprowadzanego na mikroskopie epifluorescencyjnym w polu szerokim, wyposażonym w moduł lasera bliskiego UV (UV-A 6000 mJ/mm2) w celu zniesienia trakcji komórkowych (Rycina 3A). Ponieważ oświetlenie wiązką lasera może być kontrolowane czasowo i przestrzennie, możliwe jest nie tylko selektywne naświetlanie pojedynczej komórki lub skupiska komórek wysoką dawką lasera, ale co ważniejsze, nie jest już wymagany inwazyjny etap pośredni usuwania komórek z całej próbki przy użyciu enzymu trawiennego, takiego jak trypsyna. Naświetlanie komórek tak wysoką dawką lasera indukuje zwiększony stres oksydacyjny prowadzący do śmierci komórek (Rycina 3B). Śmierć komórek skutkuje zniesieniem trakcji z podłoża, co jest wskazane przez przesunięcie kulek (zilustrowane na Rycynie 3A). Połączyliśmy naświetlanie UV-A z modułem wzorcowania światłem, aby selektywnie naświetlać obszary hydrożeli PA o rozmiarach mikrometrycznych (Rycina 3B-C). W ten sposób możliwe jest zniesienie trakcji w mikrowzorowanych skupiskach komórek (Rycina 3C,F) lub pojedynczych komórek (Rycina 3B). Co istotne, w naszych skalach czasowych właściwości mechaniczne wzorowanych hydrożeli ECM nie uległy znacznemu pogorszeniu pod wpływem ekspozycji na UV (Rycina 2C). Wzrost stresu oksydacyjnego przedstawiono na Rycynie 3D,E. Siły trakcyjne zrekonstruowano przy użyciu zregularizowanej FTTC z parametrem regularyzacji wybranym metodą Generalized Cross Validation (Rycina 3B,F). Zniesienie sił dla pojedynczych komórek nastąpiło w ciągu 15 min, a wynik LUVI-TFM jest porównywalny z TFM opartym na trypsynie (Rycina 3G-H).

Schemat polimeryzacji żelu poliakrylamidowego metodą APS, TEMED; wzór adhezyjny, mikroskopia.
Rycina 1: Schemat przygotowania podłoża z wzorowaną fibronektyną do TFM. (A) Roztwór na warstwę dolną jest pipetowany na powierzchnię metakrylowaną. (B) Mniejsze, czyste szkiełko nakrywką jest ostrożnie kładzione na kropli. (C) Czas żelowania wynosi 45 min. (D) Górne szkiełko nakrywkowe zostaje odczepione. Warstwa dolna jest gotowa. (E) Roztwór na warstwę górną jest pipetowany na hydrożel. (F) Wzorowane szkiełko nakrywkowe jest ostrożnie kładzione na kropli. (F') Mikrowzorowanie białek adhezyjnych na szkle jest wykonywane za pomocą bezmaskowej litografii bliskiego UV, a następnie przenoszone ze szkła na hydrożel PA. Wolne grupy aminowe białek adhezyjnych, np. fibronektyny, wiążą się kowalencyjnie z grupami aldehydowymi na powierzchni PA. (G) Czas żelowania wynosi 45 min. (H) Górne szkiełko nakrywkowe zostaje odczepione. Wzorowany hydrożel PA jest gotowy. (I) Reprezentacja 3D mikrografii konfokalnej xyz pokazująca wysoką gęstość kulek fiducjalnych w pobliżu powierzchni. (J) Mikrografia znakowanej fluorescencyjnie fibronektyny (magenta) na powierzchni PA z zatopionymi fluorescencyjnymi kuleczkami (zielony), nałożona na obraz komórek w świetle przechodzącym. (K) Obrazowanie mikroskopowe z pośrednią immunofluorescencją pojedynczej komórki przylegającej do kolistego mikrowzoru fibronektyny (100 µm). Jądro (niebieski), paksylina (czerwony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat układu AFM, krzywa siła-wgłębienie, wyniki modułu Younga dla hydrożelu PAA, wzory ECM.
Rycina 2: Charakterystyka właściwości mechanicznych próbki za pomocą AFM. (A) Układ eksperymentalny nanoindentacji AFM. Do badania mikrowzorów ECM przed lub po obróbce UV, a także niezwzorowanych obszarów dwuwarstwowego PA (5% akryloamidu, 0,3% bis-akryloamidu), wykorzystuje się wspornik o kształcie sferycznym. (B) Reprezentatywna krzywa zależności siły od wgłębienia dla mikrowzoru ECM (czarna). Dopasowanie wg modelu Hertza (czerwone) jest używane do obliczenia modułu Younga (E) próbki. (C) Pomiary mechaniczne dla niezwzorowanych obszarów dwuwarstwowego PA (bez ECM), mikrowzoru ECM oraz mikrowzoru ECM po ekspozycji na promieniowanie UV-A. Słupki przedstawiają średnią ± S.E.M. (test Brown-Forsythe i ANOVA Welcha). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Deformacja i regeneracja komórek indukowana promieniowaniem UV-A; wykresy naprężenie-odkształcenie, obrazy mikroskopowe, analiza danych.
Rycina 3Lokalna iluminacja UV-A w TFM (LUVI-TFM) umożliwia lokalne pomiary sił trakcyjnych w szerokim polu widzenia. (A) Schemat lokalnego oświetlania UV-A w TFM. Komórki są poddawane działaniu wysokiej dawki lasera UV-A w celu uzyskania obrazu niedeformowanego (referencyjnego). (B) Obraz w polu jasnym pojedynczej komórki przed naświetlaniem laserem UV-A. Środek: Obraz w polu jasnym pojedynczej komórki po naświetlaniu laserem UV-A. Prawo: Siła trakcyjna pojedynczego MEF przylegającego do powleczonego fibronektyną hydrożelu PA (E = 5,74 kPa) naświetlanego za pomocą 50 µm średnica wiązki światła UV (czerwona przerywana linia). (C) Po lewej: Rejestracja sił trakcyjnych klastra zarodkowych fibroblastów mysich (MEF) przylegających do mikrowzorca fibronektyny (koło, 100 µm średnica). Klastry oświetlano za pomocą 200 µm średnica wiązki światła UV (czerwona przerywana linia). Po prawej: Rejestracja sił trakcyjnych klastra embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) przylegających do mikrowzorca fibronektyny (koło, 300 µm średnica). Gromadę oświetlono za pomocą 300 µm średnica wiązki światła UV (czerwona przerywana linia). Pasek skali = 200 µm. (D,E) Zwiększenie stresu oksydacyjnego w komórkach, objawiające się wzrostem intensywności sygnału Cy5 po zastosowaniu wysokiej dawki lasera UV-A, jest wykrywane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Stres oksydacyjny prowadzi do śmierci komórek. Pasek skali = 200 µm. (F) Lewo: Mapa ciepła naprężeń klastra embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) przylegających do mikrowzorowanej fibronektyny (koło, 100 µm średnica). Po prawej: mapa ciepła naprężeń dla klastra embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) przylegających do mikrowzorowanej fibronektyny (koło, 300 µm średnica). (G) komórki MEF przylegające do 100 µm mikrowzory fibronektyny powoli uwalniają naprężenia po ekspozycji na promieniowanie UV-A. Pełne uwolnienie następuje po 15 min (obraz referencyjny wykonano wówczas 15 min po ekspozycji).H) Porównanie z konwencjonalną TFM opartą na trypsynozie dla komórek MEF przylegających do 300 µm średnicy wzorowanej fibronektyny. Wynik naświetlania UV-A (6 000 mJ/mm2) po 15-minutowym czasie oczekiwania nie wykazuje istotnej różnicy w porównaniu do konwencjonalnej inkubacji z trypsyną (tj. 0,05% przez 20 min). Słupki przedstawiają średnią ± S.E.M. (dwustronny test t Studenta) t-test, ****P < 0,0001, * P < 0,05, ns P ≤0,5). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Akrylamid (%)Bis-akrylamid (%)Akrylamid z 40% roztworu stokowego (ml)Bis-akrylamid z 2% roztworu stokowego (ml)Woda (ml)Moduł Younga (kPa)
40.110.58.55,74 ± 0,53
50.151.250.7589,69 ± 0,68
50.31.251.57.2511,33 ± 1,06

Tabela 1: Mieszaniny roztworów stokowych hydrożelu i wynikająca z nich elastyczność

Wszystkie dane zostały zdeponowane w otwartym repozytorium danych Towarzystwa Maxa Plancka (Edmond) i są dostępne pod następującym adresem: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

Dyskusja

W niniejszym protokole opisujemy przygotowanie mikrowzorzystych hydrożeli PA zawierających kulki fluorescencyjne, które są wykorzystywane jako markery referencyjne do badań TFM. Nasze podejście opiera się na trzech krokach: 1) przygotowaniu dwuwarstwowych hydrożeli PA; 2) mikromodelowanie białek ECM i ich transfer na powierzchnię hydrożelu; 3) zastosowanie wzorzystego światła bliskiego UV dla TFM. Eksperymentalna konfiguracja do analizy trakcji komórek do podłoża wymaga użycia liniowych materiałów sprężystych o znanych wartościach sztywności do obliczenia sił związanych z przemieszczeniem koralików fluorescencyjnych26. Hydrożele PA są łatwe w przygotowaniu, sztywność można łatwo dostroić i są powszechnie stosowane do wykrywania sztywności i TFM18,28. Jednak, aby uzyskać powtarzalne czasy polimeryzacji i jednorodną polimeryzację całego hydrożelu, należy zwrócić uwagę na warunki i czas przechowywania odczynników, np. APS powinien być przechowywany w eksykatorze, aby uniknąć utraty swojej aktywności; TEMED należy chronić przed bezpośrednim działaniem światła. Zastosowanie utlenionego HEA pozwala na kowalencyjne wiązanie białek macierzy na powierzchni hydrożelu, co może być korzystne dla uzyskania pełnej i stabilnej warstwy białka. Utleniony roztwór HEA należy przygotowywać na świeżo za każdym razem, gdy wytwarzane są hydrożele PA. Dwuwarstwowy hydrożel PA ma trzy główne zalety: 1) zapewnia alternatywny sposób na powtarzalne uzyskanie jednorodnego rozmieszczenia kulek fiducial w pobliżu powierzchni hydrożelu, bez konieczności nadawania żelowi niezwykle cienkiej (tj. <20 μm). Kontrola nad grubością hydrożelu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych pomiarów za pomocą TFM. Gdy elastyczny substrat jest zbyt cienki, silnie przylegające komórki, takie jak fibroblasty, mogą wyczuwać i mechanicznie reagować na leżące pod nim sztywne szklane podłoże29,30. Gęste hydrożele sprawiają, że akwizycja obrazu w celu rekonstrukcji siły jest trudniejsza. Co więcej, wiele mikroskopów nie będzie miało wystarczającej ilości miejsca, aby je pomieścić, biorąc pod uwagę dodatkową grubość szklanego podłoża używanego do mocowania hydrożelu, chyba że stosowane są ultracienkie szkiełka mikroskopowe. 2) W dwuwarstwowym hydrożelu PA jednorodny rozkład kulek fiducial w pobliżu powierzchni hydrożelu PA uzyskuje się bez użycia wirówki, ale raczej poprzez prostą inkubację precyzyjnych ilości roztworów hydrożelu i kulek fluorescencyjnych. Wysoka gęstość ściegów jest istotną zaletą podczas wykonywania analizy PIV, ponieważ zwiększa rozdzielczość sił trakcyjnych i stosunek sygnału do szumu bez konieczności stosowania mikroskopii konfokalnej. 3) Zamknięcie kulek w cienkiej warstwie blisko granicy faz komórka-materiał umożliwia obrazowanie sił trakcyjnych za pomocą mikroskopów epifluorescencyjnych, a także mikroskopów konfokalnych. Przygotowując hydrożel, użytkownik powinien upewnić się, że mocno przylega on do dolnej szyby przed przystąpieniem do kolejnych kroków protokołu. Zalecamy przestrzeganie czasu inkubacji wskazanego dla polimeryzacji warstw hydrożelu, ponieważ usunięcie szkła z powierzchni bez uszkodzenia powierzchni hydrożelu może być trudne.

Najbardziej znanymi technikami pomiaru właściwości elastycznych są AFM, nanotwardość, próby rozciągania i reometria. Jednak nanotwardość indukuje bardzo duże naprężenia na materiałach, które mogą wpływać na określenie właściwości elastycznych. Z drugiej strony próby rozciągania i reometria są makroskopowymi technikami pomiarowymi, podczas gdy komórki oddziałują na siebie w skali mikroskopowej31,32. AFM umożliwia pomiary w mikroskali ze zredukowanymi odkształceniami w warunkach fizjologicznych. Wiarygodność pomiarów AFM może ulec pogorszeniu, jeśli brakuje szczegółów eksperymentalnych (np. siły wgłębienia i prędkości) lub rejestruje się niewystarczającą ilość danych27. Huth i in. opisują algorytm wyodrębniania modułów Younga z danych AFM, który kładzie nacisk na utrzymanie stałych szczegółów pomiaru27. Algorytm ten oferuje precyzyjne i wiarygodne określenie modułów Younga i został wykorzystany w naszych eksperymentach. Dodatkowo zmierzyliśmy wiele krzywych na próbkach wytworzonych w różnych dniach i uzyskaliśmy bardzo podobne wyniki (zmienność średnich wartości ok. 1-2 kPa). To pokazuje, że sztywność naszych żeli można wiarygodnie przewidzieć.

W tym protokole używamy modułu fotomodelingu do tworzenia mikrowzorów na szkle, które są następnie przenoszone na powierzchnie hydrożelowe. Mikrowzorzec pokazany w tym protokole opiera się na bezmaskowej litografii bliskiej UV opartej na DMD (λ = 375 nm)7. DMD składa się z dużej liczby mikroluster na chipie. Pojedynczy piksel odpowiada pojedynczemu mikrolustrze. Plik obrazu pikselowego wzoru z komputera jest rzutowany przez DMD i ogniskowany na powierzchni za pomocą soczewki obiektywu. Do mikromodelowania białek skupione światło laserowe służy do rozszczepiania odstraszających szczotek polimerowych za pomocą fotoinicjatora. Następnie odsłonięte obszary są wypełniane białkami ECM. Ta metoda ablacji bez maski oferuje dużą elastyczność w projektowaniu nowych wzorów, ponieważ nie polega na użyciu fotomaski. Zaprojektowanie i zastosowanie wzoru jest bardzo łatwe, ponieważ zajmuje tylko kilka minut przy użyciu darmowego oprogramowania, takiego jak Inkscape. Jednak liczba wzorów i próbek wytworzonych w krótkim czasie jest poważną wadą, ponieważ metoda ta może być stosowana tylko do modelowania tylko jednego podłoża za każdym razem. Moduł fotowzorcowy wykorzystuje źródło lasera na ciele stałym w bliskim UV, które emituje kilka miliwatów. Odsłonięta wiązka lasera jest niebezpieczna dla oczu i skóry. Odbite i rozproszone światło i promieniowanie mogą być również niebezpieczne. Do obsługi należy dołączyć instrukcję bezpieczeństwa od oficerów laserowych. Najważniejszym krokiem w protokole podczas korzystania z modułu fotomodelowania jest upewnienie się, że podczas mikromodelowania i ablacji laser jest odpowiednio skupiony na powierzchni. Stała dawka oświetlenia (intensywność pomnożona przez czas) światła UV podczas modelowania zależy od tego, w jaki sposób laser jest skupiony na powierzchni. Słaba intensywność na powierzchni spowodowana słabym skupieniem może spowodować niepowodzenie transferu ECM na powierzchnię hydrożelu, co spowoduje, że żadne komórki nie przyłączą się do hydrożelu.

W eksperymentach TFM, po wstępnym obrazowaniu przylegających komórek i markerów odniesienia, komórki są uwalniane z hydrożelu PA przez leczenie trypsyną, aby zarejestrować ich stan relaksu. Wadą w wykonywaniu tego kroku jest obchodzenie się z próbką na etapie mikroskopii. Bez komory perfuzyjnej otwieranie pokrywy naczynia, zasysanie pożywki, płukanie i pipetowanie roztworu trypsyny stanowią wyzwanie dla początkujących i doświadczonych użytkowników. W rzeczywistości procedury te są głównym źródłem dryfu w osiach xyz , co skutkuje utratą pozycji i ostrości. Nasz protokół lokalnego oświetlenia UV sprawia, że TFM jest bardziej dostępną techniką dla początkujących. Należy zauważyć, że użyliśmy dostępnego na rynku modułu fotowzorcowego bez maski opartego na mikroskopii, ale w zasadzie można było zastosować dowolny system oświetlenia UV-A, ostatecznie w połączeniu z maską w celu ochrony obszarów podłoży, w których siły trakcyjne komórek nie powinny być rejestrowane. Wystawienie komórek na działanie znacznej dawki światła widzialnego o niskiej długości fali (np. światła fioletowego, które wzbudza emisję DAPI) doprowadzi do wzrostu stresu oksydacyjnego, co może skutkować fototoksycznością i śmiercią komórki. Dlatego technika ta może być stosowana nawet w mikroskopie epifluorescencyjnym bez modułu lasera UV. Ponieważ jednak intensywność jest znacznie słabsza, w tym przypadku znacznie łatwiej będzie osiągnąć TFM za pomocą leczenia enzymatycznego.

Dzięki LUVI-TFM możliwe jest użycie tej samej próbki do kilku pomiarów ze względu na miejscowe oderwanie pojedynczych komórek lub małych grup komórek. Należy jednak zwrócić uwagę na wybór ogniw do odłączenia, aby uniknąć rejestrowania sił z sąsiednich komórek. W związku z tym w przypadku pomiarów pojedynczych komórek przy braku mikrowzorców należy unikać zatłoczonych regionów; W przypadku pomiarów na pojedynczych komórkach z mikrowzorami, wzory powinny być zaprojektowane w taki sposób, aby odległość między pojedynczymi strukturami była co najmniej dwukrotnie większa od średnicy obszaru z wzorem. Zalecamy również, aby nie używać komórek z sąsiednich wzorów w sekwencji, ale raczej pobierać próbki z odległych obszarów na podłożu. Nasz pomiar jest dobrze przeprowadzony na mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w funkcję kontroli ostrości i soczewkę 40 x NA = 0,9, gdzie odległość robocza soczewki jest wystarczająco duża, a szybki ruch od jednego dołka do drugiego jest wysoce przestrajalny. Ukierunkowane oddzielenie komórek do zastosowań TFM jest skuteczne w pomiarze siły komórkowej pojedynczej komórki lub całego klastra małych komórek (np. o średnicy do 300 μm). Korzystając z naszej konfiguracji, zaobserwowaliśmy zaokrąglanie i odwarstwianie komórek w przypadku obróbki UV pojedynczych komórek (ryc. 3A), podczas gdy odwarstwienie rzadko występowało w przypadku małych klastrów komórek. Może to prowadzić do niedoszacowania sił trakcyjnych komórek. W przypadku większych skupisk komórek zalecane jest odłączanie enzymatyczne, ponieważ użytkownicy powinni używać obiektywu pneumatycznego 20x do obrazowania całego klastra i potrzebna jest funkcja kontroli ostrości. Ponieważ głębia ostrości obiektywu pneumatycznego 20x jest znacznie większa, obsługa nie będzie tak krytyczna, jak w przypadku obiektywu o większym powiększeniu. Użytkownik powinien upewnić się, że ostrość jest prawidłowo ustawiona do ablacji komórek, ponieważ dawka oświetlenia zależy od skupienia lasera na powierzchni. Chociaż zdajemy sobie sprawę z możliwych ograniczeń w stosowaniu LUVI-TFM w kolektywach komórkowych ze względu na możliwe interakcje mechaniczne z sąsiednimi nieleczonymi komórkami, ten aspekt może okazać się przydatny w badaniach nad mechaniką celowanej ekstruzji komórek, np. z monowarstw nabłonka.

Podsumowując, dzięki naszemu podejściu TFM w połączeniu z indukowanym światłem uwalnianiem komórek z mikrowzorem, zapewniamy solidny i wysokoprzepustowy protokół do pomiaru sił adhezji komórek. Wszechstronność tej metody może być dalej wykorzystywana przy użyciu mikroskopii i konfiguracji obrazowania w celu poprawy rozdzielczości i czułości.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Pani Rebecce Alvarado za wsparcie w produkcji filmu z protokołem oraz Panu Stephenowi Casale za konstruktywną krytykę rękopisu. Dziękujemy kolegom z Zakładu Biofizyki Komórkowej Instytutu Badań Medycznych im. Maxa Plancka za pomocne dyskusje. Wsparcie finansowe ze strony Max-Planck-Gesellschaft dla E.A.C.-A. oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 do E.A.C.-A. i P4 do U.S.S.; DFG EXC 2082/1-390761711 do U.S.S.) jest również bardzo ceniony. J.B. dziękuje Fundacji Carla Zeissa za wsparcie finansowe. E.A.C.-A., C.S. i U.S.S. potwierdzają finansowanie za pośrednictwem Max Planck School Matter to Life wspieranego przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (BMBF). C.S. jest wspierany przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (Consolidator Grant PHOTOMECH, no.101001797).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Metakrylan 3-(trimetoksysililo)propylu#440159Sigma Aldrich
Kwas octowy#33209Akrylamid Honeywell
40 %#1610140Bio-RadUWAGA : toksyczny, praca pod wyciągiem
Wspornik AFM#CP-CONT-BSG-A-GNanoAndMore5 μ
m system AFM#NanoWizard3JPKSprzężony z mikroskopem optycznym wyposażonym w 40-krotny obiektyw powietrzny i filtr GFP
Nadsiarczan amonu#A3678Sigma
Bis-akryloamid 2 %#1610142Bio-RadUWAGA : toksyczny, praca pod wyciągiem
Kamera sCMOS#C11440-42U30Hamamatsu
Kamera sCMOS#ANDORZYLA4.2Oxford Instrument
CellRox#C10422Thermo Fisher
Niestandardowa komoraEMBLEM
Klej dentystyczny#1300 100Picodent
DMEM#41965Mikroskop
#Eclipse Ti2ENikon
Epifluorescencja mikroskop#Axiovert200Zeiss
Etanol#9065.3Carl Roth
FBS Ameryka Południowa#S181TThermo Fisher
Fibrynogen#F13191InvitrogenAlexa488 sprzężony
Fibronektyna#F1141Sigma
Koraliki fluorescencyjne 200 nm#F8805InvitrogenKarboksylowany ( 365/415)
Koraliki fluorescencyjne 200 nm#F8848InvitrogenKarboksylowane (505/515)
Koraliki fluorescencyjne 200 nm#F8810InvitrogenKarboksylowane (580/605)
Koraliki fluorescencyjne 200 nm#F8807InvitrogenKarboksylowane (660/680)
Szkiełko nakrywkowe szklane 15 mm okrągłe#41001115Szkiełko
Glass 24 mm okrągłe#41001124Obiektyw mikroskopu wspomagającego
#MRH08230Nikon20x air NA 0.45
Mysie fibroblasty embrionalne#CRL-2991ATCC
mPEG-SVA#MPEG-SVA-5000Laysan Bio
N-hydroksyetyloakrylamid#697931Środek
#100-ETePla
Żel PLPP#PLPPgelAlveole
Poly-L-lizyna#P4823Sigma Aldrich
Poly(L-lizyna)-graft-poli(glikol etylenowy)#PLL(20-g[3.5]-PEG(2)SuSoS
Periodynian sodu(meta)#S1878Sigma Aldrich
TEMED#17919Moduł
#PRIMOAlveole
UVO#342-220Jelight
z końcówką sferyczną inkubatora epifluorescencyjny Thermo Fisher nakrywkowe Assistent do czyszczenia plazmowego Aldrich do modelowania UV Thermo Scientific Środek czyszczący

Bibliografia

  1. Geiger, B., Bershadsky, A. Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors. Cell. 110 (2), 139-142 (2002).
  2. Beningo, K. A., Hamao, K., Dembo, M., Wang, Y. -l, Hosoya, H. Traction forces of fibroblasts are regulated by the Rho-dependent kinase but not by the myosin light chain kinase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 456 (2), 7(2006).
  3. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
  4. Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation. Biochimica Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516(2019).
  5. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  6. Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123, 4201-4213 (2010).
  7. Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
  8. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Microtubules: in vivo Methods in Cell Biology. , 133-146 (2010).
  9. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  10. Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. Polyacrylamide hydrogel micropatterning. Methods Cell Biology. 120, 93-116 (2014).
  11. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  12. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  13. Polacheck, W. J., Chen, C. S. Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools. Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).
  14. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica Biophysica Acta. 1853, 3095-3104 (2015).
  15. Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
  16. Hanke, J., Probst, D., Zemel, A., Schwarz, U. S., Koster, S. Dynamics of force generation by spreading platelets. Soft Matter. 14 (31), 6571-6581 (2018).
  17. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  18. Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
  19. Willert, C. E., Gharib, M. Digital particle image velocimetry. Experiments in Fluids. 10, 181-193 (1991).
  20. Lourenco, L., Krothapalli, A. On the accuracy of velocity and corticity measurements with PIV. Experiments in Fluids. 18, 421-428 (1995).
  21. Adrian, R. J., Westerweel, J. Particle Image Velocimetry. , Cambridge University Press. (2011).
  22. Westerweel, J., Scarano, F. Universal outlier detection for PIV data. Experiments in Fluids. 39 (6), 1096-1100 (2005).
  23. Dembo, M., Wang, Y. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  24. Schwarz, U. S., et al. Calculation of forces at focal adhesions from elastic substrate data: the effect of localized force and the need for regularization. Biophysical Journal. 83 (3), 1380-1394 (2002).
  25. Huang, Y., Gompper, G., Sabass, B. A Bayesian traction force microscopy method with automated denoising in a user-friendly software package. Computer Physics Communications. 256, 107313(2020).
  26. Vedadghavami, A., et al. Manufacturing of hydrogel biomaterials with controlled mechanical properties for tissue engineering applications. Acta Biomaterialia. 62, 42-63 (2017).
  27. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281(2019).
  28. Oria, R., et al. Force loading explains spatial sensing of ligands by cells. Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).
  29. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194116(2010).
  30. Sen, S., Engler, A. J., Discher, D. E. Matrix strains induced by cells: Computing how far cells can feel. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (1), 39-48 (2009).
  31. Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Letters. 8 (7), 2063-2069 (2008).
  32. Galluzzi, M., et al. Atomic force microscopy methodology and AFMech Suite software for nanomechanics on heterogeneous soft materials. Nat Communications. 9 (1), 3584(2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hydro ele poliakrylamidowekontrola adhezji kom rekhydro ele z mikrowzoramimikroskopia fluorescencyjnafotolitografia UVbia ka macierzy zewn trzkom rkowejcytometria trakcyjna z transformat Fourieramikroskopia si atomowych
Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.