Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodę opartą na hodowli eksplantatów do izolacji i hodowli pierwotnych, specyficznych dla pacjenta ludzkich komórek mięśni gładkich aorty i fibroblastów skóry. Ponadto przedstawiono nowatorską metodę pomiaru skurczu komórek i późniejszej analizy, która może być wykorzystana do badania specyficznych dla pacjenta różnic w tych komórkach.

Streszczenie

Komórki mięśni gładkich (SMC) są dominującym typem komórek w aortach. Ich mechanizm skurczowy jest ważny dla przenoszenia siły w aorcie i reguluje zwężenie i rozszerzenie naczyń krwionośnych. Mutacje w genach kodujących białka aparatu skurczowego SMC są związane z chorobami aorty, takimi jak tętniaki aorty piersiowej. Pomiar skurczu SMC in vitro jest wyzwaniem, zwłaszcza w sposób wysokoprzepustowy, który jest niezbędny do badań przesiewowych materiału pacjenta. Obecnie dostępne metody nie są odpowiednie do tego celu. W artykule przedstawiono nowatorską metodę opartą na wykrywaniu impedancji ogniwa elektrycznego i podłoża (ECIS). Po pierwsze, opisano protokół eksplantacji w celu wyizolowania specyficznych dla pacjenta ludzkich pierwotnych SMC z biopsji aorty i specyficznych dla pacjenta ludzkich pierwotnych fibroblastów skóry do badania tętniaków aorty. Następnie podano szczegółowy opis nowej metody skurczu w celu zmierzenia odpowiedzi skurczowej tych komórek, w tym późniejszą analizę i sugestię porównania różnych grup. Metoda ta może być stosowana do badania skurczu przylegających komórek w kontekście badań translacyjnych (sercowo-naczyniowych) oraz badań przesiewowych pacjentów i leków.

Wprowadzenie

Komórki mięśni gładkich (SMC) są dominującym typem komórek w przyśrodkowej warstwie aorty, najgrubszej warstwie aorty. W obrębie ściany są one zorientowane promieniowo i biorą udział między innymi w zwężeniu naczyń krwionośnych i rozszerzeniu naczyń krwionośnych¹. Maszyneria kurczliwa SMC bierze udział w przenoszeniu siły w aorcie poprzez funkcjonalne połączenie z macierzą zewnątrzkomórkową². Mutacje w genach kodujących białka aparatu skurczowego SMC, takie jak łańcuch ciężki miozyny mięśni gładkich (MYH11) i aktyna mięśni gładkich (ACTA2), zostały powiązane z przypadkami rodzinnych tętniaków aorty piersiowej, podkreślając znaczenie skurczu SMC w utrzymaniu strukturalnej i funkcjonalnej integralności aorty^1,2. Co więcej, mutacje w szlaku sygnałowym TGFβ są również związane z tętniakami aorty, a ich wpływ na patofizjologię tętniaka aorty można również badać w fibroblastach skóry³.

Wysokoprzepustowy pomiar skurczu SMC in vitro jest wyzwaniem. Ponieważ kurczliwości SMC nie można zmierzyć in vivo u ludzi, testy in vitro na komórkach ludzkich stanowią realną alternatywę. Co więcej, rozwój tętniaka aorty brzusznej (AAA) w modelach zwierzęcych jest albo indukowany chemicznie, na przykład przez perfuzję elastazy, albo spowodowany określoną mutacją. W związku z tym dane na zwierzętach nie są porównywalne z rozwojem AAA u ludzi, który w większości przypadków ma przyczynę wieloczynnikową, taką jak palenie tytoniu, wiek i/lub miażdżyca. Metody in vitro Kurczliwość SMC była do tej pory mierzona głównie za pomocą mikroskopii siły pociągowej^4,5, oznaczanie ilościowe wewnątrzkomórkowych strumieni wapnia fluorescencji Fura-2⁶ oraz testy marszczenia kolagenu⁷. Chociaż mikroskopia sił trakcyjnych dostarcza nieocenionych danych numerycznych na temat sił generowanych przez pojedynczą komórkę, nie nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych ze względu na złożone przetwarzanie danych matematycznych i analizę jednej komórki na raz, co oznacza, że pomiar reprezentatywnej liczby komórek na dawcę jest bardzo czasochłonny. Testy barwienia barwnika Fura-2 i kolagenu pozwalają na powierzchowne określenie skurczu i nie dają precyzyjnych danych liczbowych, co czyni je mniej odpowiednimi do rozróżniania różnic specyficznych dla pacjenta. Upośledzony skurcz SMC w komórkach pochodzących z aorty pacjentów z tętniakiem aorty brzusznej wykazano po raz pierwszy poprzez optymalizację nowatorskiej metody pomiaru skurczu SMC in vitro⁸. Dokonano tego poprzez zmianę przeznaczenia metody wykrywania impedancji podłoża elektrycznego (ECIS). ECIS to średnioprzepustowy test w czasie rzeczywistym do ilościowego określania zachowania i kurczenia się przylegających komórek^9,10,11 takich jak wzrost i zachowanie SMC w testach gojenia się ran i migracji^12,13,14. Dokładna metoda jest opisana w sekcji protokołu. W ten zoptymalizowany sposób ECIS może być również wykorzystywany do badania skurczu fibroblastów ze względu na ich podobny rozmiar i morfologię.

Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowego opisu metody pomiaru skurczu SMC in vitro za pomocą ECIS⁸ i porównania skurczu między kontrolnymi i pacjentskimi SMC. Po pierwsze, wyjaśniono izolację i hodowlę pierwotnych SMC z kontrolnych i biopsji aorty pacjenta, które można wykorzystać do pomiaru skurczu. Po drugie, opisano pomiary i analizę skurczu, wraz z weryfikacją ekspresji markera SMC. Ponadto w artykule opisano metodę izolacji specyficznych dla pacjenta fibroblastów skóry, których skurcz można zmierzyć przy użyciu tej samej metodologii. Komórki te mogą być wykorzystywane w badaniach specyficznych dla pacjenta skoncentrowanych na tętniaku aorty lub innych patologiach sercowo-naczyniowych¹⁵ lub badaniach prognostycznych wykorzystujących protokół transdyferencjacji, który umożliwia pomiar skurczu przed operacją tętniaka¹⁶.

Protokół

UWAGA: Biopsje aorty zostały wykonane podczas otwartej naprawy tętniaka w Centrach Medycznych Uniwersytetu w Amsterdamie, Centrum Medycznym Uniwersytetu VU w Amsterdamie, Zaans Medisch Centrum, Zaandam i szpitalu Dijklander, Hoorn, Holandia. Kontrolną tkankę aorty uzyskano z fragmentu aorty przyczepionej do tętnicy nerkowej pobranej do przeszczepu nerki. Do badania włączono wyłącznie pacjentów w wieku powyżej 18 lat, a wszyscy pacjenci wyrazili świadomą zgodę na udział w badaniu. Cały materiał został zebrany zgodnie z przepisami Deklaracji Helsińskiej WMA oraz wytycznymi instytucjonalnymi Komisji Etyki Medycznej Centrum Medycznego VU. Wszystkie eksperymenty i protokoły eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Komisję Etyki Medycznej Centrum Medycznego VU. Aby uzyskać pełne informacje na temat używanych linii komórkowych kontrolnych i pacjentów, zapoznaj się z ⁸.

1. Izolowanie pierwotnych ludzkich SMC z biopsji aorty

UWAGA: Wykonaj następujące kroki pod sterylnym kapturem do hodowli tkanek z przepływem laminarnym. Nosić rękawice i stosować standardowe techniki aseptyczne podczas pracy z próbkami krwi ludzkiej i tkanek ludzkich. SMC są hodowane w 231 ludzkich komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych Podłoże podstawowe uzupełnione 100 U / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny i suplementem wzrostu mięśni gładkich określanym jako podłoże SMC.

1. Wysterylizuj dwie pary kleszczy chirurgicznych i skalpel, zanurzając je w 70% etanolu, a następnie wycierając do sucha.
2. Odpipetować 2 ml pożywki SMC na szalce Petriego, na której zostanie przeprowadzona sekcja tkanek.
3. Odpipetować 2,5 ml pożywki SMC do dwóch kolb T25. Obracać kolby tak, aby mała objętość podłoża pokryła całą powierzchnię.
4. Pobraną biopsję ludzkiej ściany aorty należy przetransportować z sali operacyjnej do laboratorium na lodzie w sterylnej plastikowej probówce z zimnym, sterylnym roztworem do przenoszenia tkanek (patrz tabela materiałów) lub 0,9% NaCl.
5. Otwórz probówkę z tkanką znajdującą się w kapturze do hodowli tkankowej. Wyjmij biopsję z probówki za pomocą wysterylizowanych kleszczyków i umieść ją na szalce Petriego (Ryc. 1A).
6. Sprawdź wzrokowo biopsję, aby zidentyfikować trzy warstwy aorty, błonę wewnętrzną osłonki (wewnętrzna), pożywkę (środkowa) i przydankę (warstwa zewnętrzna). Poszukaj obecności blaszek miażdżycowych po stronie błony wewnętrznej i śluzowatej tkanki łącznej po stronie przybyszowej (Ryc. 1B), aby odróżnić warstwy.
7. Aby odizolować SMC od podłoża, usuń pozostałe dwie warstwy. Najpierw umieść tkankę płytką wewnętrzną do góry (Ryc. 1B). Usuń stałą płytkę nazębną, odciągając ją od tkanki za pomocą kleszczy, jednocześnie dociskając tkankę drugą parą kleszczy. Usuwaj kolejne warstwy płytki nazębnej, aż do momentu, gdy widoczna będzie różowa, jednolita warstwa przyśrodkowa.
8. Odwróć tkankę (Rysunek 1C). Powtórz tę samą procedurę, co w kroku 1.7, ściągając warstwę przybyszową (Rysunek 1D). Pamiętaj, aby usunąć wszystkie widoczne części w tylu próbach, ile to konieczne, ponieważ ta warstwa nie oderwie się łatwo od nośnika.
   UWAGA: Istotne jest, aby warstwy wewnętrzne i przybyszowe zostały prawidłowo usunięte, aby uzyskać jak najczystszą populację SMC.
9. Po wyizolowaniu warstwy przyśrodkowej pokrój tkankę w kostkę o wymiarach około 1 mm x 1 mm x 1 mm. Dociśnij podłoże kleszczami i przetnij tkankę w jednym kierunku za pomocą skalpela. Nie tnij tam iz powrotem; Wykonuj czyste, jednokierunkowe cięcia, aby zminimalizować uszkodzenia. Postaraj się zrobić jak najwięcej kostek, biorąc pod uwagę rozmiar biopsji (Ryc. 1E).
10. Umieścić kawałki tkanki w górnej ćwiartce kolby T25 za pomocą kleszczy. Umieść 10-20 kostek w kolbie, jeśli pozwala na to ilość materiału (Rysunek 1F).
    UWAGA: Użyj gładkich kleszczy, aby zminimalizować przyleganie tkanki do żeber kleszczy i łatwo odczepić tkankę od kolby.
11. Inkubować kostki tkanek w kolbach T25 przez około 10 dni w temperaturze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
    UWAGA: Mniej więcej w tym czasie spodziewany jest pierwszy wzrost komórek. Komórki, które początkowo migrują, mogą wyglądać na mniejsze niż normalne SMC.
12. Po zaobserwowaniu wzrostu komórek dodaj 2,5 ml pożywki do kolby, uważając, aby nie pipetować jej na kawałki tkanki, aby zapobiec ich oderwaniu.
13. Po około 5 kolejnych dniach, gdy zaobserwuje się skupiska komórek wokół fragmentów tkanki, zmień pożywkę hodowlaną. Jeśli kawałki tkanki oderwą się, usuń je, ponieważ nie przyczepią się ponownie.
14. Gdy komórki zlewają się w 80-90%, przenieś je do kolby T75 i kontynuuj hodowlę w tym formacie.
    UWAGA: Zalecany jest podział 1:2 lub 1:3. Zamroź kopię zapasową komórek we wczesnym pasażu. Komórki na ogół zachowują swoje właściwości do przejścia 10; Późniejsze fragmenty nie powinny być wykorzystywane do eksperymentów.

2. Izolowanie pierwotnych fibroblastów skóry z biopsji skóry

UWAGA: Wykonaj następujące kroki pod sterylnym kapturem do hodowli tkanek z przepływem laminarnym. Nosić rękawice i stosować standardowe techniki aseptyczne podczas pracy z próbkami krwi ludzkiej i tkanek ludzkich. Fibroblasty są hodowane w pożywce podstawowej uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, określanej jako podłoże fibroblastowe.

1. Wysterylizuj dwie pary kleszczy chirurgicznych i skalpel, zanurzając je w 70% etanolu, a następnie wycierając do sucha.
2. Odpipetować 2 ml pożywki z fibroblastami na szalce Petriego, na której zostanie przeprowadzona sekcja tkanki.
3. Odpipetować 2,5 ml pożywki z fibroblastami do dwóch kolb T25. Obracać kolby tak, aby mała objętość podłoża pokryła całą powierzchnię.
4. Pobraną biopsję skóry należy przetransportować z sali operacyjnej do laboratorium na lodzie w zimnym, sterylnym roztworze do przenoszenia tkanek (patrz tabela materiałów) lub 0,9% NaCl w sterylnej plastikowej probówce.
5. Otwórz probówkę z tkanką znajdującą się w kapturze do hodowli tkankowej. Wyjmij biopsję z probówki za pomocą wysterylizowanych kleszczyków i umieść ją na szalce Petriego (Ryc. 2A).
6. Sprawdź wzrokowo biopsję, aby zidentyfikować trzy warstwy skóry: naskórek, skórę właściwą i podskórną tkankę tłuszczową. Poszukaj rozpoznawalnej powierzchni skóry, czasami z widocznymi włosami, aby zidentyfikować naskórek. Po przeciwnej stronie poszukaj podskórnej tkanki tłuszczowej, która często jest żółta i śluzowata. Zidentyfikuj warstwę między naskórkiem a podskórną tkanką tłuszczową jako skórę właściwą - źródło żywotnych fibroblastów (Rysunek 2B).
7. Aby wyizolować fibroblasty ze skóry właściwej, usuń pozostałe dwie warstwy i umieść tkankę na boku, tak aby wszystkie trzy warstwy były widoczne.
   UWAGA: W przeciwieństwie do tkanki aorty, warstwy skóry nie mogą być oddzielane od siebie; dlatego muszą zostać wycięte. Tkanka jest również bardziej gumowata, co utrudnia jej cięcie. Użyj ostrego skalpela.
8. Przytrzymaj tkankę kleszczami. Przeciąć równolegle do granicy między naskórkiem a skórą właściwą. Odetnij cały naskórek. Staraj się ciąć jedną czystą linią i nie poruszaj się tam iz powrotem, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.
9. Odwróć chusteczkę. Powtórz tę samą procedurę, co w kroku 2.8; Tym razem przeciąć w skórze właściwej równolegle do granicy z tłuszczem podskórnym.
10. Po wyizolowaniu skóry właściwej pokrój tkankę w kostkę o wymiarach około 1 x 1 x 1 mm³. Dociśnij tkankę kleszczami i przetnij tkankę w jednym kierunku za pomocą skalpela. Nie tnij tam iz powrotem; Wykonuj czyste, jednokierunkowe cięcia, aby zminimalizować uszkodzenia. Postaraj się zrobić jak najwięcej kostek, biorąc pod uwagę rozmiar biopsji (Rysunek 2C).
11. Umieścić kawałki tkanki w górnej ćwiartce kolby T25 za pomocą kleszczy. Umieść 10-20 kostek w kolbie, jeśli pozwala na to ilość materiału (Rysunek 2D).
    UWAGA: Użyj gładkich kleszczy, aby zminimalizować przyleganie tkanki do żeber kleszczy i łatwo odczepić tkankę od kolby.
12. Inkubować kostki tkanek w kolbach T25 przez około 10 dni w temperaturze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
    UWAGA: Mniej więcej w tym czasie spodziewany jest pierwszy wzrost komórek. Komórki, które początkowo migrują, mogą wyglądać na mniejsze niż normalne fibroblasty.
13. Po zaobserwowaniu wzrostu komórek dodaj 2,5 ml pożywki do kolby, uważając, aby nie pipetować jej na kawałki tkanki, aby zapobiec ich oderwaniu.
14. Po około 5 kolejnych dniach, gdy można zaobserwować skupiska komórek wokół fragmentów tkanki, zmień pożywkę hodowlaną. Jeśli kawałki tkanki oderwą się, usuń je, ponieważ nie przyczepią się ponownie.
15. Gdy komórki zlewają się w 80-90%, przenieś je do kolby T75 i kontynuuj hodowlę w tym formacie.
    UWAGA: Zalecany jest podział 1:2 lub 1:3. Zamroź kopię zapasową komórek we wczesnym pasażu. Komórki na ogół zachowują swoje właściwości do przejścia 10; Późniejsze fragmenty nie powinny być wykorzystywane do eksperymentów.

3. Pomiar skurczu (przykładowe SMC)

1. Przygotuj tablicę ECIS 96w10e (patrz Rysunek 3A dla reprezentatywnego obrazu tablicy z powiększonymi elektrodami i komórkami umieszczonymi na elektrodach).
   UWAGA: Wykonaj następujące czynności pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych.
   1. Pokryj sterylną tablicę 96w10e 200 μl 10 mM L-cysteiny na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Umyj płytkę dwukrotnie sterylną wodą. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na noc w kapturze do hodowli tkankowych z lekko uchyloną pokrywką.
      UWAGA: Pokrycie płytki L-cysteiną jest konieczne tylko przy pierwszym użyciu płytki.
   3. Następnego dnia sterylizuj płytkę i pokrywkę promieniami UV przez 30 minut. Obróć pokrywkę do góry, aby wnętrze było wysterylizowane. Po wysterylizowaniu płytki nie należy otwierać płytki na zewnątrz okapu przepływowego.
2. Inicjowanie komórek w tablicy ECIS
   1. Podgrzej 1% sterylny roztwór żelatyny w łaźni wodnej przez 30 min.
      UWAGA: Roztwór jest przechowywany w lodówce i może zastygnąć, co utrudnia pipetowanie.
   2. Następnie pokryć studzienki 100 μl 1 % roztworu żelatyny na studzienkę i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.
   3. Odessać żelatynę ze studzienek.
   4. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i zasiej SMC w trzech egzemplarzach przy gęstości wysiewu 30 000 komórek/dołek w 200 μl pożywki SMC.
   5. Umieścić płytkę z SMC w uchwycie ECIS 96-dołkowym w inkubatorze do hodowli komórkowych. Kliknij dwukrotnie oprogramowanie ECIS Applied Biophysics, aby otworzyć program i naciśnij przycisk Setup.
   6. Sprawdź, czy wszystkie elektrody stykają się z uchwytem (zielony; czerwony w przypadku braku połączenia) w lewym dolnym panelu oznaczonym Konfiguracja studni. Jeśli elektrody nie są prawidłowo podłączone, wyreguluj płytkę w uchwycie przed rozpoczęciem pomiaru.
   7. Wybierz typ płyty (tablica 96-dołkowa) w tym samym panelu, klikając opcję Typ tablicy.
   8. W prawym górnym panelu Ustawienia zbierania danych kliknij pojedynczą częstotliwość i zmień wartość impedancji na 4000 Hz, a interwał na 8 s.
   9. Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć pomiary. Poczekaj, aż otworzy się nowy panel, w którym można zapisać plik ECIS.
   10. Pozwól komórkom się przyłączyć i utwórz monowarstwę przez 48 godzin
       UWAGA: Przyczepienie i rozproszenie ogniw na elektrodach generuje podstawową wartość rezystancji (Rysunek 3B).
3. Stymulacja komórek w celu wywołania skurczu
   1. Indukuj skurcz SMC poprzez stymulację komórek 10 μg/ml jonoforu wapnia, jonomycyny.
      UWAGA: Jonomycyna indukuje napływ zewnątrzkomórkowego Ca²⁺, aktywując kaskadę skurczową; zobacz Rysunek 4A dla reprezentatywnych obrazów niestymulowanych i stymulowanych skurczonych komórek.
   2. Rozcieńczyć 1 mg proszku jonomycyny w 100 μl dimetylosulfotlenku do uzyskania roztworu podstawowego 10 mg/ml i przechowywać 10 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór jonomycyny w stosunku 1:10 w pożywce SMC, aby przygotować roztwór roboczy, który zostanie dodany do komórek.
   3. Stymulację komórek należy przeprowadzić, gdy matryca nadal znajduje się w uchwycie macierzy wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych, a elektrody są przymocowane do systemu.
      1. Aby pobudzić komórki, zdejmij pokrywę i umieść ją na sterylnej powierzchni wewnątrz inkubatora. Przygotować dwie pipety, ustawione na 2 μl i 150 μl.
      2. Przed rozpoczęciem stymulacji naciśnij Zaznacz w oprogramowaniu i umieść komentarz.
         UWAGA: Ułatwi to znalezienie dokładnego czasu stymulacji podczas analizy danych.
      3. Odpipetować 2 μl roztworu roboczego jonomycyny do każdego dołka tak szybko, jak to możliwe. Po stymulacji wszystkich komórek wymieszać pożywkę w studzienkach za pomocą drugiej pipety.
         UWAGA: Ze względu na szybkie efekty nie jest konieczna zmiana końcówek między różnymi liniami komórkowymi i warunkami. Działaj szybko, stymulując i mieszając, ponieważ jonomycyna ma ostre działanie. Podczas stymulacji pełnego talerza stymuluj maksymalnie 3 kolumny jednocześnie. Po każdej stymulacji należy odczekać co najmniej 30 minut do następnej stymulacji, aby komórki mogły dojść do siebie po zmianie temperatury i CO₂ spowodowanej otwarciem drzwi inkubatora.
      4. Bezpośrednio po zakończeniu stymulacji ponownie naciśnij przycisk Mark, aby dodać komentarz, że stymulacja została zakończona.
   4. Zakończenie eksperymentu ze stymulacją
      1. Zapisuj wartości impedancji przez około 5 minut po stymulacji jonomycyną. Zakończ nagrywanie, naciskając przycisk Zakończ.
      2. Ponownie użyć tablic ECIS do trzech razy: umyć studzienki dwukrotnie sterylną wodą i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny z trypsyną lub podobnym odczynnikiem. Powtórz kroki 3.1.2 i 3.1.3.
4. Eksport danych
   1. Aby wyeksportować dane, kliknij Plik | Eksport danych | do Excela (wybrane). Wybierz folder, w którym chcesz zapisać plik.
   2. Kliknij przycisk Rozdziel, gdy program poprosi o połączenie lub rozdzielenie arkuszy.
5. Analiza produktu skurczowego
   1. Aby obliczyć odpowiedź skurczową, użyj następującego równania (1), gdzie C oznacza skurcz (wyrażony w % zmiany w stosunku do wartości wyjściowej), prestymulacja (PrS) oznacza wartość oporu (wyrażoną w Ω) tuż przed stymulacją jonomycyną, a po stymulacji (PoS) oznacza opór (wyrażony w Ω) 2 minuty po zakończeniu stymulacji.
      (1)
      UWAGA: Jak pokazano w równaniu (1), wartość impedancji studzienki wypełnionej pożywką hodowlaną bez żadnych przyłączonych komórek (wartość 290 Ω) jest odejmowana od wszystkich wyników w obliczeniach końcowych. Zaleca się pomiar odpowiedzi skurczowych w trzech egzemplarzach w każdym eksperymencie i przeprowadzenie trzech niezależnych eksperymentów na tej samej linii komórkowej w celu uwzględnienia wszelkich zmian między- i wewnątrzeksperymentalnych.
   2. Po przeprowadzeniu trzech niezależnych eksperymentów pogrupuj dane razem, obliczając średnią z trzech pomiarów, w tym odchylenie standardowe (SD).
6. Porównywanie różnych grup
   1. Aby zdefiniować zakres normalnego skurczu i zbadać kolejne szczegółowe pytania badawcze, użyj grupy kontrolnej do zdefiniowania "normalnego skurczu" i porównania go z reakcją skurczową pacjentów lub grup leczonych.
   2. Obliczyć średnią i SD całej grupy kontrolnej, tj. wartości końcowe dla wszystkich linii komórkowych, jak opisano w kroku 3.5.2.
   3. Użyj zakresu średniej ± 2SD, aby zidentyfikować komórki w drugiej grupie, które nie mieszczą się w tym zakresie, wskazując, że mają zmienioną odpowiedź skurczową.
      UWAGA: Mechanizm stojący za zmienioną reakcją skurczową jest przedmiotem szczegółowych pytań badawczych i jest zależny od komórki i stanu i nie będzie omawiany w tym protokole.

4. Wykrywanie obecności markerów specyficznych dla SMC

1. Izolacja RNA
   1. Wysiewaj te same specyficzne dla pacjenta linie komórkowe, które są używane do pomiarów skurczu, na płytkach 6-dołkowych, po jednej studzience na linię komórkową. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i zasiej komórki o gęstości wysiewu 200 000 komórek/dołek w pożywce SMC i pozwól im przyczepić się na noc.
   2. Umyj komórki raz sterylnym PBS.
   3. Poddać komórki lizie i wyizolować komórki zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Synteza cDNA
   1. Przeprowadzić syntezę cDNA w 20 μl mieszaniny reakcji odwrotnej transkrypcji. Rozcieńczyć stężenia całkowitego wyizolowanego RNA zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta.
3. qPCR (badanie qPCR)
   1. Zmierz ekspresję genów markerów SMC, np. ACTA2, CNN1, SMTN i TAGLN, aby potwierdzić, że izolowane komórki są rzeczywiście SMC i wykryć markery SMC. Sprawdź korelację wyników z wyjściem skurczu.
   2. Użyj co najmniej dwóch genów porządkowania, aby znormalizować dane, np. YWHAZ i TBP.
      UWAGA: Przebieg i analizę qPCR można przeprowadzić przy użyciu różnych maszyn do PCR i kompatybilnego oprogramowania, w zależności od tego, co jest dostępne i zoptymalizowane w laboratorium. Patrz Tabela uzupełniająca S1 dla sekwencji starterów.

Wyniki

Aby przetestować powtarzalność tej metody, najpierw sprawdzono ją przy użyciu tylko kontrolnych SMC. Aby określić odtwarzalność pomiarów międzyeksperymentalnych, dwa niezależne pomiary wszystkich uwzględnionych linii komórkowych kontrolnych i pacjentów zostały wykreślone jako wykres Blanda-Altmana (Figura 3B). Wykres wykazał, że metoda ta nie wykazuje zmienności poza przedziałem ufności, z wyjątkiem jednej odstającej linii komórkowej. Co więcej, wyniki te wykazały, że dwie studzienki wysiane w tym sam...

Dyskusja

W pracy przedstawiono metodę pomiaru skurczu SMC in vitro, w oparciu o zmiany impedancji i zajętości powierzchni. Po pierwsze, opisano izolację, hodowlę i ekspansję specyficznych dla pacjenta pierwotnych ludzkich SMC i fibroblastów skóry, a następnie sposób ich wykorzystania do pomiarów skurczu.

Ograniczenie badania jest związane z pozyskiwaniem komórek za pomocą protokołu eksplantacji. Komórki, które namnażają się w wyniku biopsji, mogą mieć inne właściwości niż oryginalna tkanka

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96-dołkowa tablica	Biofizyka stosowana	96W10idf PET	Tablica używana do pomiaru skurczu w konfiguracji ECIS
Custodiol	Dr. Franz Hö hler Chemie GmbH	RVG 12801	Roztwór stosowany do przenoszenia tkanek z sali operacyjnej do laboratorium
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich	472301	Roztwór stosowany do rozcieńczania jonomycyny
Surowica bydlęca	płodu Gibco	26140079	Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych
Mieszanka składników odżywczych F-10 dla szynki	Gibco	11550043	Pożywka stosowana do hodowli fibroblastów skóry
Ludzkie komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych Podłoże podstawowe (dawniej ''Medium 231'')	Gibco	M231500	Pożywka używana do hodowli komórek mięśni gładkich
Invitrogen hrabina II	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000	Automatyczny licznik komórek
Sól wapniowa jonomycyny ze Streptomyces conglobatus	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	Związek stosowany do stymulacji skurczu
NaCl 0,9%	Fresenius Kabi	B230561	Roztwór używany do przenoszenia tkanek z sali operacyjnej do laboratorium
Penicylina-Streptomycyna	Gibco	15140122	Antybiotyki stosowane w pożywce do hodowli komórkowych
Fospathe buforowana sól fizjologiczna	Gibco	10010023	Służy do mycia komórek
Quick-RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R1055	Zestaw używany do izolacji
RNASuplement na wzrost mięśni gładkich (SMGS)	Gibco	S00725	Suplement dodawany do pożywki do hodowli komórek mięśni gładkich
SuperScript VILO Zestaw do syntezy cDNA	Thermo Fisher Scientific	11754250	Kit używany do syntezy cDNA
SYBR Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4309155	Odczynnik do qPCR
Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054	Służy do trypsynizacji komórki
ZTheta	Biofizyka stosowana	ZTheta	ECIS instrument służący do pomiarów skurczu