Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63122

⸱

15 lutego 2022

 ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Amsterdam UMC, Vrije Universiteit Amsterdam, 2Department of Physiology, Amsterdam Cardiovascular Sciences, Amsterdam UMC, Vrije Universiteit Amsterdam, 3Laboratory of Experimental Cardiology, Department of Cardiology, Leiden University Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodę opartą na hodowli eksplantatów do izolacji i hodowli pierwotnych, specyficznych dla pacjenta ludzkich komórek mięśni gładkich aorty i fibroblastów skóry. Ponadto przedstawiono nowatorską metodę pomiaru skurczu komórek i późniejszej analizy, która może być wykorzystana do badania specyficznych dla pacjenta różnic w tych komórkach.

Streszczenie

Komórki mięśni gładkich (SMC) są dominującym typem komórek w aortach. Ich mechanizm skurczowy jest ważny dla przenoszenia siły w aorcie i reguluje zwężenie i rozszerzenie naczyń krwionośnych. Mutacje w genach kodujących białka aparatu skurczowego SMC są związane z chorobami aorty, takimi jak tętniaki aorty piersiowej. Pomiar skurczu SMC in vitro jest wyzwaniem, zwłaszcza w sposób wysokoprzepustowy, który jest niezbędny do badań przesiewowych materiału pacjenta. Obecnie dostępne metody nie są odpowiednie do tego celu. W artykule przedstawiono nowatorską metodę opartą na wykrywaniu impedancji ogniwa elektrycznego i podłoża (ECIS). Po pierwsze, opisano protokół eksplantacji w celu wyizolowania specyficznych dla pacjenta ludzkich pierwotnych SMC z biopsji aorty i specyficznych dla pacjenta ludzkich pierwotnych fibroblastów skóry do badania tętniaków aorty. Następnie podano szczegółowy opis nowej metody skurczu w celu zmierzenia odpowiedzi skurczowej tych komórek, w tym późniejszą analizę i sugestię porównania różnych grup. Metoda ta może być stosowana do badania skurczu przylegających komórek w kontekście badań translacyjnych (sercowo-naczyniowych) oraz badań przesiewowych pacjentów i leków.

Wprowadzenie

Komórki mięśni gładkich (SMC) są dominującym typem komórek w przyśrodkowej warstwie aorty, najgrubszej warstwie aorty. W obrębie ściany są one zorientowane promieniowo i biorą udział między innymi w zwężeniu naczyń krwionośnych i rozszerzeniu naczyń krwionośnych1. Maszyneria kurczliwa SMC bierze udział w przenoszeniu siły w aorcie poprzez funkcjonalne połączenie z macierzą zewnątrzkomórkową2. Mutacje w genach kodujących białka aparatu skurczowego SMC, takie jak łańcuch ciężki miozyny mięśni gładkich (MYH11) i aktyna mięśni gładkich (ACTA2), zostały powiązane z przypadkami rodzinnych tętniaków aorty piersiowej, podkreślając znaczenie skurczu SMC w utrzymaniu strukturalnej i funkcjonalnej integralności aorty1,2. Co więcej, mutacje w szlaku sygnałowym TGFβ są również związane z tętniakami aorty, a ich wpływ na patofizjologię tętniaka aorty można również badać w fibroblastach skóry3.

Wysokoprzepustowy pomiar skurczu SMC in vitro jest wyzwaniem. Ponieważ kurczliwości SMC nie można zmierzyć in vivo u ludzi, testy in vitro na komórkach ludzkich stanowią realną alternatywę. Co więcej, rozwój tętniaka aorty brzusznej (AAA) w modelach zwierzęcych jest albo indukowany chemicznie, na przykład przez perfuzję elastazy, albo spowodowany określoną mutacją. W związku z tym dane na zwierzętach nie są porównywalne z rozwojem AAA u ludzi, który w większości przypadków ma przyczynę wieloczynnikową, taką jak palenie tytoniu, wiek i/lub miażdżyca. Metody in vitro Kurczliwość SMC była do tej pory mierzona głównie za pomocą mikroskopii siły pociągowej4,5, oznaczanie ilościowe wewnątrzkomórkowych strumieni wapnia fluorescencji Fura-26 oraz testy marszczenia kolagenu7. Chociaż mikroskopia sił trakcyjnych dostarcza nieocenionych danych numerycznych na temat sił generowanych przez pojedynczą komórkę, nie nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych ze względu na złożone przetwarzanie danych matematycznych i analizę jednej komórki na raz, co oznacza, że pomiar reprezentatywnej liczby komórek na dawcę jest bardzo czasochłonny. Testy barwienia barwnika Fura-2 i kolagenu pozwalają na powierzchowne określenie skurczu i nie dają precyzyjnych danych liczbowych, co czyni je mniej odpowiednimi do rozróżniania różnic specyficznych dla pacjenta. Upośledzony skurcz SMC w komórkach pochodzących z aorty pacjentów z tętniakiem aorty brzusznej wykazano po raz pierwszy poprzez optymalizację nowatorskiej metody pomiaru skurczu SMC in vitro8. Dokonano tego poprzez zmianę przeznaczenia metody wykrywania impedancji podłoża elektrycznego (ECIS). ECIS to średnioprzepustowy test w czasie rzeczywistym do ilościowego określania zachowania i kurczenia się przylegających komórek9,10,11 takich jak wzrost i zachowanie SMC w testach gojenia się ran i migracji12,13,14. Dokładna metoda jest opisana w sekcji protokołu. W ten zoptymalizowany sposób ECIS może być również wykorzystywany do badania skurczu fibroblastów ze względu na ich podobny rozmiar i morfologię.

Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowego opisu metody pomiaru skurczu SMC in vitro za pomocą ECIS8 i porównania skurczu między kontrolnymi i pacjentskimi SMC. Po pierwsze, wyjaśniono izolację i hodowlę pierwotnych SMC z kontrolnych i biopsji aorty pacjenta, które można wykorzystać do pomiaru skurczu. Po drugie, opisano pomiary i analizę skurczu, wraz z weryfikacją ekspresji markera SMC. Ponadto w artykule opisano metodę izolacji specyficznych dla pacjenta fibroblastów skóry, których skurcz można zmierzyć przy użyciu tej samej metodologii. Komórki te mogą być wykorzystywane w badaniach specyficznych dla pacjenta skoncentrowanych na tętniaku aorty lub innych patologiach sercowo-naczyniowych15 lub badaniach prognostycznych wykorzystujących protokół transdyferencjacji, który umożliwia pomiar skurczu przed operacją tętniaka16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Biopsje aorty pobrano podczas otwartej operacji naprawy tętniaka w Amsterdam University Medical Centers, VU University Medical Center w Amsterdamie, Zaans Medisch Centrum w Zaandam oraz w szpitalu Dijklander w Hoorn w Holandii. Kontrolną tkankę aorty pobrano z fragmentu aorty przymocowanego do tętnicy nerkowej, pozyskanego podczas pobierania nerek do transplantacji. Do badania włączono wyłącznie pacjentów powyżej 18 roku życia, a wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę na udział w badaniu. Wszystkie materiały zostały zebrane zgodnie z postanowieniami Deklaracji Helsińskiej WMA oraz wytycznymi instytucjonalnymi Komisji Etyki Medycznej VU Medical Center. Wszystkie eksperymenty i protokoły eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, za zgodą Komisji Etyki Medycznej VU Medical Center. Pełne informacje na temat wykorzystanych linii komórkowych od pacjentów i kontrolnych znajdują się w 8.

1. Izolacja pierwotnych ludzkich SMC z biopsji aorty

UWAGA: Poniższe kroki należy przeprowadzić w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek. Podczas pracy z próbkami ludzkiej krwi i tkanek należy nosić rękawiczki i stosować standardowe techniki aseptyki. SMC hoduje się w pożywce 231 Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium z dodatkiem 100 U/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny oraz Smooth Muscle Growth Supplement, określanej dalej jako pożywka SMC.

  1. Sterylizujemy dwie pary pincet chirurgicznych oraz skalpel poprzez zanurzenie ich w 70% etanolu, a następnie wycieramy do sucha.
  2. Do szalki Petriego, w której zostanie przeprowadzona sekcja tkanki, pipetujemy 2 ml pożywki SMC.
  3. Do dwóch kolb T25 pipetować 2,5 ml pożywki SMC. Kolbami okrężnie potrząsnąć tak, aby niewielka objętość pożywki pokryła całą powierzchnię.
  4. Przenieść pobraną biopsję ściany aorty ludzkiej z sali operacyjnej do laboratorium w warunkach chłodniczych, w sterylnym plastikowym probówce z zimnym, sterylnym roztworem do transportu tkanek (patrz na Tabela materiałów) lub 0,9% NaCl.
  5. Otwórz probówkę z tkanką wewnątrz komory do hodowli tkankowej. Wyjmij biopsjat z probówki za pomocą wysterylizowanej pęsety i umieść go w szalce Petriego (Rycina 1A).
  6. Wizualnie obejrzyj biopsjat, aby zidentyfikować trzy warstwy aorty: tunica intima (warstwa wewnętrzna), media (warstwa środkowa) oraz adventitia (warstwa zewnętrzna). Poszukaj obecności blaszek miażdżycowych po stronie intima oraz śluzowatej tkanki łącznej po stronie adventitia (Rycina 1B) w celu rozróżnienia warstw.
  7. Aby wyizolować SMC z medium, należy usunąć dwie pozostałe warstwy. Najpierw należy umieścić tkankę stroną z blaszką miażdżycową wewnątrzintimy skierowaną do góry (Rysunek 1B). Usuń stałą blaszkę, odciągając ją pęsetą od tkanki, jednocześnie dociskając tkankę drugą pęsetą. Usuwaj kolejne warstwy blaszki, aż stanie się widoczna różowa, jednorodna warstwa środkowa.
  8. Odwróć tkankę (Rycina 1C). Powtórzyć tę samą procedurę, opisaną w kroku 1.7, poprzez odciągnięcie warstwy adventycjalnej (Rysunek 1D). Należy upewnić się, że wszystkie widoczne fragmenty zostały usunięte, powtarzając tę czynność tyle razy, ile będzie to konieczne, ponieważ warstwa ta nie odrywa się łatwo od podłoża.
    UWAGA: Niezbędne jest prawidłowe usunięcie warstwy wewnętrznej (intimy) oraz zewnętrznej (adwentycji), aby uzyskać możliwie jak najczystszą populację SMC.
  9. Po wyizolowaniu warstwy środkowej należy pociąć tkankę na sześciany o wymiarach około 1 mm x 1 mm x 1 mm. Przycisnąć materiał pęsetą i przeciąć tkankę w jednym kierunku za pomocą skalpela. Nie należy wykonywać ruchów posuwisto-zwrotnych; należy wykonywać czyste cięcia jednokierunkowe, aby zminimalizować uszkodzenia. Należy starać się uzyskać jak największą liczbę sześcianów, biorąc pod uwagę wielkość biopsatu (Rycina 1E).
  10. Za pomocą pęsety umieść fragmenty tkanki w górnej ćwiartce kolby T25. Jeśli ilość materiału na to pozwala, umieść od 10 do 20 kostek w każdej kolbie (Rycina 1F).
    UWAGA: Należy używać gładkich pęset, aby zminimalizować przyleganie tkanki do ząbków pęsety i ułatwić przeniesienie tkanki do kolby.
  11. Inkubować kostki tkankowe w kolbach T25 przez około 10 dni w atmosferze 5% CO22 w 37 °C w inkubatorze.
    UWAGA: Pierwszy przerost komórek jest oczekiwany w tym czasie. Komórki, które migrują jako pierwsze, mogą wydawać się mniejsze niż typowe SMC.
  12. Po zaobserwowaniu wzrostu komórek do kolby należy dodać 2,5 ml pożywki, dbając o to, aby nie pipetować jej bezpośrednio na fragmenty tkanki, co zapobiegnie ich odczepieniu.
  13. Po upływie około 5 kolejnych dni, gdy wokół fragmentów tkanki zaobserwuje się skupiska komórek, należy wymienić pożywkę hodowlaną. Jeśli fragmenty tkanki odkleją się, należy je usunąć, ponieważ nie przytwierdzą się ponownie.
  14. Po osiągnięciu przez komórki 80–90% konfluencji przenieść je do kolby T75 i kontynuować hodowlę w tym formacie.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie stosunku podziału 1:2 lub 1:3. Należy zamrozić zapasową partię komórek na wczesnym pasażu. Komórki zazwyczaj zachowują swoje właściwości do 10. pasażu; późniejsze pasażu nie powinny być wykorzystywane do eksperymentów.

2. Izolacja pierwotnych fibroblastów skóry z biopsji skóry

UWAGA: Poniższe kroki należy przeprowadzić w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek. Podczas pracy z ludzką krwią i próbkami ludzkich tkanek należy używać rękawiczek i stosować standardowe techniki aseptyki. Fibroblasty hoduje się w Medium Podstawowym uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny oraz 100 µg/mL streptomycyny, określanym jako pożywka do fibroblastów.

  1. Zesterylizuj dwie pary pęset chirurgicznych oraz skalpel, zanurzając je w 70 % etanolu, a następnie wycierając do sucha.
  2. Pipetuj 2 mL pożywki do fibroblastów do szalki Petriego, w której przeprowadzona zostanie sekcja tkanki.
  3. Pipetuj 2,5 mL pożywki do fibroblastów do dwóch kolb T25. Zakręć kolbami tak, aby niewielka objętość pożywki pokryła całą powierzchnię.
  4. Przenieś pobraną biopsję skóry z sali operacyjnej do laboratorium w lodzie, w zimnym, sterylnym roztworze do przenoszenia tkanek (patrz Tabela materiałów) lub 0,9% NaCl w sterylnej probówce plastikowej.
  5. Otwórz probówkę z tkanką wewnątrz dygestorium do hodowli komórkowych. Wyjmij biopsję z probówki za pomocą wysterylizowanej pęsety i umieść ją w szalce Petriego (Rysunek 2A).
  6. Obejrzyj biopsję wizualnie, aby zidentyfikować trzy warstwy skóry: naskórek, skórę właściwą i tkankę tłuszczową podskórną. Szukaj rozpoznawalnej powierzchni skóry, czasami z widocznymi włosami, aby zidentyfikować naskórek. Po przeciwnej stronie szukaj tkanki tłuszczowej podskórnej, która często jest żółta i śliska. Warstwę między naskórkiem a tkanką tłuszczową podskórną zidentyfikuj jako skórę właściwą – źródło żywotnych fibroblastów (Rysunek 2B).
  7. Aby wyizolować fibroblasty ze skóry właściwej, usuń dwie pozostałe warstwy i ułóż tkankę na boku tak, aby wszystkie trzy warstwy były widoczne.
    UWAGA: W przeciwieństwie do tkanki aorty, warstwy skóry nie można rozdzielić przez rozciąganie; dlatego muszą one zostać wycięte. Tkanka jest również bardziej gumowata, co utrudnia cięcie. Użyj ostrego skalpela.
  8. Przytrzymaj tkankę pęsetą. Tnij równolegle do granicy między naskórkiem a skórą właściwą. Wytnij cały naskórek. Staraj się ciąć jedną czystą linią i nie przesuwaj ostrza w przód i w tył, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.
  9. Obróć tkankę. Powtórz procedurę opisaną w kroku 2.8; tym razem tnij w obrębie skóry właściwej równolegle do granicy z tkanką tłuszczową podskórną.
  10. Po wyizolowaniu skóry właściwej pokrój tkankę w kostki o wymiarach około 1 x 1 x 1 mm3. Dociśnij tkankę pęsetą i przecinaj ją w jednym kierunku za pomocą skalpela. Nie tnij w przód i w tył; wykonuj czyste, jednokierunkowe cięcia, aby zminimalizować uszkodzenia. Postaraj się przygotować jak najwięcej kostek, biorąc pod uwagę wielkość biopsji (Rysunek 2C).
  11. Za pomocą pęsety umieść fragmenty tkanki w górnej ćwiartce kolby T25. Umieść 10-20 kostek na kolbę, jeśli ilość materiału na to pozwala (Rysunek 2D).
    UWAGA: Używaj gładkich pęset, aby zminimalizować przyleganie tkanki do ząbków pęsety i łatwiej przenieść tkankę do kolby.
  12. Inkubuj kostki tkanki w kolbach T25 przez około 10 dni w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
    UWAGA: W tym czasie spodziewany jest pierwszy wypust komórek. Komórki, które migrują jako pierwsze, mogą wydawać się mniejsze niż typowe fibroblasty.
  13. Po zaobserwowaniu wzrostu komórek dodaj do kolby 2,5 mL pożywki, dbając o to, aby nie pipetować jej bezpośrednio na fragmenty tkanki, co mogłoby spowodować ich odklejenie.
  14. Po kolejnych około 5 dniach, gdy wokół fragmentów tkanki pojawią się skupiska komórek, wymień pożywkę hodowlaną. Jeśli fragmenty tkanki odkleją się, usuń je, ponieważ nie przyłączą się ponownie.
  15. Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, przenieś je do kolby T75 i kontynuuj hodowlę w tym formacie.
    UWAGA: Zaleca się stosunek pasażowania 1:2 lub 1:3. Zamroź zapas komórek na wczesnym pasażu. Komórki zazwyczaj zachowują swoje właściwości do 10. pasażu; późniejsze pasażu nie powinny być wykorzystywane do eksperymentów.

3. Pomiar skurczu (przykład SMCs)

  1. Przygotuj matrycę ECIS 96w10e (patrz Rysunek 3A w celu uzyskania reprezentacyjnego obrazu matrycy z powiększeniem elektrod i wysianymi na nich komórkami).
    UWAGA: Następujące kroki należy wykonywać w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkankowych.
    1. Pokryj sterylną matrycę 96w10e 200 µL 10 mM L-cysteiny na studzienkę i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    2. Przepłucz płytkę dwukrotnie sterylną wodą. Pozostaw płytkę do wyschnięcia przez noc w komorze do hodowli tkankowych z lekko uchyloną pokrywką.
      UWAGA: Pokrywanie płytki L-cysteiną jest konieczne tylko podczas pierwszego użycia płytki.
    3. Następnego dnia wysterylizuj płytkę i pokrywkę promieniowaniem UV przez 30 min. Odwróć pokrywkę do góry, aby wysterylizować jej wnętrze. Po sterylizacji nie otwieraj płytki poza komorą z laminarnym przepływem powietrza.
  2. Wysiewanie komórek na matrycę ECIS
    1. Podgrzej 1% sterylny roztwór żelatyny w kąpieli wodnej przez 30 min.
      UWAGA: Roztwór jest przechowywany w lodówce i może stężeć, co utrudnia pipetowanie.
    2. Następnie pokryj studzienki 100 µL 1% roztworu żelatyny na studzienkę i inkubuj płytkę w 37 °C przez co najmniej 1 h.
    3. Odsącz żelatynę ze studzienek.
    4. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i wysiej SMC w trzech powtórzeniach przy gęstości 30 000 komórek/studzienkę w 200 µL pożywki do SMC.
    5. Umieść płytkę z SMC w uchwycie ECIS na 96 studni w inkubatorze do hodowli komórkowej. Kliknij dwukrotnie oprogramowanie ECIS Applied Biophysics, aby otworzyć program, i naciśnij przycisk Setup.
    6. Sprawdź w lewym dolnym panelu opisanym jako Well Configuration, czy wszystkie elektrody mają kontakt z uchwytem (zielony; czerwony w przypadku braku połączenia). Jeśli elektrody nie są prawidłowo podłączone, skoryguj położenie płytki w uchwycie przed rozpoczęciem pomiaru.
    7. W tym samym panelu wybierz typ płytki (matryca 96-studzienkowa), klikając Array type.
    8. W prawym górnym panelu Data Collection Setup kliknij single frequency i zmień wartość impedancji na 4000 Hz oraz interwał na 8 s.
    9. Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć pomiary. Poczekaj na otwarcie nowego panelu, w którym można zapisać plik ECIS.
    10. Pozostaw komórki na 48 h, aby mogły przylgnąć i utworzyć monowarstwę.
      UWAGA: Przywieranie i rozprzestrzenianie się komórek na elektrodach generuje bazową wartość rezystancji (Rysunek 3B).
  3. Stymulacja komórek w celu wywołania skurczu
    1. Wywołaj skurcz SMC, stymulując komórki 10 µg/mL jonoforu wapnia, ionomycyną.
      UWAGA: Ionomycyna wywoła napływ zewnątrzkomórkowego Ca2+, aktywując kaskadę skurczową; reprezentacyjne obrazy komórek niestymulowanych i stymulowanych w skurczu przedstawiono na Rysunku 4A.
    2. Rozpuść 1 mg proszku ionomycyny w 100 µL dimetylosulfotlenku, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 10 mg/mL, a następnie przechowuj aliquoty po 10 µL w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńcz roztwór ionomycyny 1:10 w pożywce do SMC, aby przygotować roztwór roboczy do dodania do komórek.
    3. Przeprowadź stymulację komórek, gdy matryca wciąż znajduje się w uchwycie w inkubatorze do hodowli komórkowej, a elektrody są podłączone do systemu.
      1. Aby stymulować komórki, zdejmij pokrywkę i połóż ją na sterylnej powierzchni wewnątrz inkubatora. Przygotuj dwie pipety ustawione na 2 µL i 150 µL.
      2. Przed rozpoczęciem stymulacji naciśnij Mark w oprogramowaniu i dodaj komentarz.
        UWAGA: Ułatwi to znalezienie dokładnego momentu stymulacji podczas analizy danych.
      3. Pipetuj 2 µL roztworu roboczego ionomycyny do każdej studzienki tak szybko, jak to możliwe. Po stymulacji wszystkich komórek wymieszaj pożywkę w studzienkach za pomocą drugiej pipety.
        UWAGA: Ze względu na szybkie działanie nie jest konieczne zmienianie końcówek między różnymi liniami komórkowymi i warunkami. Pracuj szybko podczas stymulacji i mieszania, ponieważ ionomycyna działa gwałtownie. Przy stymulacji pełnej płytki stymuluj maksymalnie 3 kolumny naraz. Po każdej stymulacji odczekaj co najmniej 30 min przed następną, aby komórki mogły dojść do siebie po zmianie temperatury i stężenia CO2 spowodowanej otwarciem drzwi inkubatora.
      4. Bezpośrednio po zakończeniu stymulacji naciśnij ponownie Mark, aby dodać komentarz o zakończeniu stymulacji.
    4. Zakończenie eksperymentu stymulacyjnego
      1. Rejestruj wartości impedancji przez około 5 min po stymulacji ionomycyną. Zakończ rejestrację, naciskając Finish.
      2. Matryce ECIS można wykorzystać do trzech razy: przemyj studzienki dwukrotnie sterylną wodą i inkubuj płytkę w 37 °C przez 2-3 h z trypsyną lub podobnym odczynnikiem. Powtórz kroki 3.1.2 i 3.1.3.
  4. Eksportowanie danych
    1. Aby wyeksportować dane, kliknij File | Export data | To Excel (Selected. Wybierz folder do zapisu pliku.
    2. Kliknij Separate, gdy program zapyta o połączenie lub rozdzielenie arkuszy.
  5. Analiza odpowiedzi skurczowej
    1. Aby obliczyć odpowiedź skurczową, użyj następującego równania (1), gdzie C oznacza skurcz (wyrażony jako % zmiany w stosunku do poziomu bazowego), prestymulacja (PrS) oznacza wartość rezystancji (wyrażoną w Ω) tuż przed stymulacją ionomycyną, a postymulacja (PoS) oznacza rezystancję (wyrażoną w Ω) 2 min po zakończeniu stymulacji.
      Równanie równowagi statycznej, obliczanie C w badaniach, ilustracja formuły. (1)
      UWAGA: Jak pokazano w równaniu (1), od wszystkich wyników w końcowym obliczeniu odejmowana jest wartość impedancji studzienki wypełnionej pożywką hodowlaną bez przytwierdzonych komórek (wartość 290 Ω). Zaleca się pomiar odpowiedzi skurczowych w trzech powtórzeniach w każdym eksperymencie oraz przeprowadzenie trzech niezależnych eksperymentów z tą samą linią komórkową, aby uwzględnić zmienność między- i wewnątrzeksperymentalną.
    2. Po przeprowadzeniu trzech niezależnych eksperymentów zgrupuj dane, obliczając średnią z trzech pomiarów wraz z odchyleniem standardowym (SD).
  6. Porównywanie różnych grup
    1. Aby zdefiniować zakres normalnego skurczu i zbadać kolejne specyficzne pytania badawcze, wykorzystaj grupę kontrolną do zdefiniowania „normalnego skurczu” i porównaj go z odpowiedzią skurczową pacjentów lub grup leczonych.
    2. Oblicz średnią i SD dla całej grupy kontrolnej, tj. dla wartości końcowych dla wszystkich linii komórkowych, jak opisano w kroku 3.5.2.
    3. Użyj zakresu średnia ± 2SD, aby zidentyfikować komórki w drugiej grupie, które wykraczają poza ten zakres, co wskazuje na zmienioną odpowiedź skurczową.
      UWAGA: Mechanizm stojący za zmienioną odpowiedzią skurczową zależy od konkretnych pytań badawczych, rodzaju komórek i warunków i nie będzie omawiany w niniejszym protokole.

4. Wykrywanie obecności specyficznych markerów SMC

  1. Izolacja RNA
    1. Wysiać te same linie komórkowe pacjentów, które były wykorzystywane do pomiarów skurczów, na płytki 6-dołkowe, w przeliczeniu na jedną linię komórkową na dołek. Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i wysiać je z gęstością 200 000 komórek/dołek w pożywce dla SMC, a następnie pozostawić do przyczepienia na noc.
    2. Przemyć komórki raz sterylnym PBS.
    3. Zlizować komórki i wyizolować RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Synteza cDNA
    1. Przeprowadzić syntezę cDNA w 20 µL mieszaniny reakcyjnej do odwrotnej transkrypcji. Rozcieńczyć stężenia całkowitego wyizolowanego RNA zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta.
  3. qPCR
    1. Zmierzyć ekspresję genów markerowych SMC, np. ACTA2, CNN1, SMTN oraz TAGLN, aby potwierdzić, że wyizolowane komórki są rzeczywiście SMC i wykryć markery SMC. Sprawdzić korelację wyników z wynikami skurczowymi.
    2. Użyć co najmniej dwóch genów referencyjnych do normalizacji danych, np. YWHAZ oraz TBP.
      UWAGA: Analizę i przebieg qPCR można przeprowadzić przy użyciu różnych urządzeń do PCR i kompatybilnego oprogramowania, w zależności od dostępności i optymalizacji w laboratorium. Sekwencje starterów znajdują się w Tabeli uzupełniającej S1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby przetestować powtarzalność tej metody, w pierwszej kolejności przeprowadzono jej walidację z wykorzystaniem wyłącznie kontrolnych SMC. W celu określenia powtarzalności pomiarów między doświadczeniami, dwa niezależne pomiary wszystkich uwzględnionych linii komórkowych kontrolnych i pacjentów przedstawiono na wykresie Blanda-Altmana (Rycina 3B). Wykres wykazał, że metoda ta nie wykazuje zmienności poza przedziałem ufności, z wyjątkiem jednej linii komórkowej będącej wartością odstającą. Po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W pracy przedstawiono metodę pomiaru skurczu SMC in vitro, w oparciu o zmiany impedancji i zajętości powierzchni. Po pierwsze, opisano izolację, hodowlę i ekspansję specyficznych dla pacjenta pierwotnych ludzkich SMC i fibroblastów skóry, a następnie sposób ich wykorzystania do pomiarów skurczu.

Ograniczenie badania jest związane z pozyskiwaniem komórek za pomocą protokołu eksplantacji. Komórki, które namnażają się w wyniku biopsji, mogą mieć inne właściwości niż oryginalna tkanka

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy serdecznie podziękować Tarze van Merrienboer, Albertowi van Wijk, Jolandzie van der Velden, Janowi D. Blankensteijnowi, Lan Tranowi, Peterowi L. Hordijkowi, zespołowi PAREL-AAA oraz wszystkim chirurgom naczyniowym z UMC w Amsterdamie, Zaans Medisch Centrum i szpitalowi Dijklander za dostarczenie materiałów i wsparcie dla tego badania. To badanie jest finansowane przez Holenderską Fundację Serca, Dekkerbeurs senior clinical scientist, nr projektu 2019T065.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa tablicaBiofizyka stosowana96W10idf PETTablica używana do pomiaru skurczu w konfiguracji ECIS
CustodiolDr. Franz Hö hler Chemie GmbHRVG 12801Roztwór stosowany do przenoszenia tkanek z sali operacyjnej do laboratorium
DimetylosulfotlenekSigma-Aldrich472301Roztwór stosowany do rozcieńczania jonomycyny
Surowica bydlęcapłodu Gibco26140079Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych
Mieszanka składników odżywczych F-10 dla szynkiGibco11550043Pożywka stosowana do hodowli fibroblastów skóry
Ludzkie komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych Podłoże podstawowe (dawniej ''Medium 231'')GibcoM231500Pożywka używana do hodowli komórek mięśni gładkich
Invitrogen hrabina IIThermo Fisher ScientificAMQAX1000Automatyczny licznik komórek
Sól wapniowa jonomycyny ze Streptomyces conglobatusSigma-AldrichI0634-1MGZwiązek stosowany do stymulacji skurczu
NaCl 0,9% Fresenius KabiB230561Roztwór używany do przenoszenia tkanek z sali operacyjnej do laboratorium
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122Antybiotyki stosowane w pożywce do hodowli komórkowych
Fospathe buforowana sól fizjologicznaGibco10010023Służy do mycia komórek
Quick-RNA Miniprep KitZymo ResearchR1055Zestaw używany do izolacji
RNASuplement na wzrost mięśni gładkich (SMGS)GibcoS00725Suplement dodawany do pożywki do hodowli komórek mięśni gładkich
SuperScript VILO Zestaw do syntezy cDNAThermo Fisher Scientific11754250Kit używany do syntezy cDNA
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4309155Odczynnik do qPCR
Trypsin-EDTAGibco15400-054Służy do trypsynizacji komórki
ZThetaBiofizyka stosowanaZThetaECIS instrument służący do pomiarów skurczu

Bibliografia

  1. Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
  2. Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
  3. Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
  4. Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
  5. Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
  6. Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
  7. Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
  8. Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
  9. Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
  10. Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
  11. Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
  12. Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
  13. Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
  14. Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
  15. Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
  16. Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

skurcz SMCizolacja komórekimpedancja elektryczna komórka-podłożekomórki specyficzne dla pacjentatętniak aortyWestern blotfibroblasty skóryodpowiedź skurczowa
Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.