Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63127

⸱

5 listopada 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Texas Biomedical Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje dynamikę infekcji wirusowych za pomocą rekombinowanego (r)SARS-CoV-2 z ekspresją lucyferazy i fluorescencji oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) u transgenicznych myszy K18 hACE2, aby przezwyciężyć potrzebę wtórnych podejść wymaganych do badania infekcji SARS-CoV-2 in vivo.

Streszczenie

Pandemia choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) została wywołana przez koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Do tej pory SARS-CoV-2 był odpowiedzialny za ponad 242 miliony zakażeń i ponad 4,9 miliona zgonów na całym świecie. Podobnie jak w przypadku innych wirusów, badanie SARS-CoV-2 wymaga zastosowania metod eksperymentalnych w celu wykrycia obecności wirusa w zakażonych komórkach i/lub w modelach zwierzęcych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy rekombinowany (r)SARS-CoV-2 z kompetencjami replikacyjnymi, który wykazuje ekspresję białek bioluminescencyjnych (nanolucyferazy, Nluc) lub fluorescencyjnych (Wenus). Te rSARS-CoV-2 wykazujące ekspresję reporterową umożliwiają śledzenie infekcji wirusowych in vitro i in vivo w oparciu o ekspresję genów reporterowych Nluc i Venus. W niniejszym badaniu opisano zastosowanie rSARS-CoV-2/Nluc i rSARS-CoV-2/Venus do wykrywania i śledzenia zakażenia SARS-CoV-2 we wcześniej opisanym transgenicznym mysim modelu zakażenia K18 ludzkim enzymem konwertującym angiotensynę 2 (hACE2) przy użyciu systemów obrazowania in vivo (IVIS). Te rSARS-CoV-2/Nluc i rSARS-CoV-2/Venus wykazują patogenność podobną do rSARS-CoV-2/WT i replikację wirusa in vivo. Co ważne, ekspresja Nluc i Venus pozwala nam bezpośrednio śledzić infekcje wirusowe in vivo i ex vivo, u zakażonych myszy. Te rSARS-CoV-2/Nluc i rSARS-CoV-2/Venus stanowią doskonałą opcję do badania biologii SARS-CoV-2 in vivo, zrozumienia infekcji wirusowej i związanej z nią choroby COVID-19 oraz określenia skutecznych metod profilaktycznych i/lub terapeutycznych w celu zwalczania zakażenia SARS-CoV-2.

Wprowadzenie

Koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) to jednoniciowy wirus RNA, który należy do linii Betacoronavirus z rodziny Coronaviridae1. Ta rodzina wirusów jest podzielona na koronawirusa alfa, beta, gamma i delta1. Alfa- i Betakoronawirusy infekują głównie ssaki, podczas gdy Gamma- i Deltakoronawirusy infekują prawie wyłącznie ptaki2. Do tej pory siedem koronawirusów (CoV) przekroczyło bariery gatunkowe i pojawiło się jako koronawirusy ludzkie (HCoV): dwa alfa-CoV (HCoV-229E i HCoV-NL63) i pięć beta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego [MERS-CoV] i SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV i SARS-CoV-2 są wysoce zjadliwe, powodując poważne infekcje dolnych dróg oddechowych7. Przed pojawieniem się SARS-CoV-2 miały miejsce dwa ogniska epidemiczne wywołane przez CoV: SARS-CoV w Guangdong Providence w Chinach w latach 2002-2003, ze wskaźnikiem śmiertelności przypadków (CFR) wynoszącym około 9,7%; oraz MERS-CoV na Bliskim Wschodzie od 2012 r. do chwili obecnej, z CFR wynoszącym około 34%7,8. SARS-CoV-2 ma ogólny CFR między 3,4%-49%, przy czym warunki podstawowe przyczyniają się do wyższego CFR8,9. Od czasu odkrycia w grudniu 2019 r. w Wuhan w Chinach SARS-CoV-2 jest odpowiedzialny za ponad 242 miliony infekcji u ludzi i ponad 4,9 miliona zgonów ludzi na całym świecie7,10,11,12. Warto zauważyć, że od końca 2020 r. nowe warianty SARS-CoV-2 budzące obawy (VoC) i warianty będące przedmiotem zainteresowania (VoI) wpłynęły na charakterystykę wirusa, w tym na transmisję i antygenowość9,13 oraz ogólny kierunek pandemii COVID-19. W leczeniu zakażeń SARS-CoV-2 istnieje obecnie tylko jeden Stany Zjednoczone (USA) Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) terapeutyczny lek przeciwwirusowy (remdesivir) i jeden lek dopuszczony do użytku w nagłych wypadkach (EUA) (baricytynib, do stosowania w połączeniu z remdesivirem)14. Istnieje również 6 zatwierdzonych przeciwciał monoklonalnych EUA: REGEN-COV (kasiriwymab i imdewymab, podawane razem), sotrowimab, tocilizumab oraz bamlaniwimab i etesewimab podawane razem15,16,17,18,19. Obecnie istnieje tylko jedna szczepionka profilaktyczna zatwierdzona przez FDA, Pfizer-BioNTech, a dwie inne szczepionki profilaktyczne (Moderna i Janssen) zostały zatwierdzone przez EUA20,21,22,23,24. Jednak przy niekontrolowanym wskaźniku zakażeń i pojawieniu się VoC i VoI, SARS-CoV-2 nadal stanowi zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. W związku z tym pilnie potrzebne są nowe podejścia w celu zidentyfikowania skutecznych środków profilaktycznych i terapeutycznych w celu kontrolowania zakażenia SARS-CoV-2 i wciąż trwającej pandemii COVID-19.

Badanie SARS-CoV-2 wymaga pracochłonnych technik i drugorzędnych podejść do identyfikacji obecności wirusa w zakażonych komórkach i/lub zweryfikowanych zwierzęcych modelach infekcji. Zastosowanie genetyki odwrotnej pozwoliło na wytworzenie rekombinowanych wirusów, które odpowiadają na ważne pytania z zakresu biologii infekcji wirusowych. Na przykład techniki genetyki odwrotnej dostarczyły środków do odkrycia i zrozumienia mechanizmów infekcji wirusowych, patogenezy i choroby. Podobnie, podejścia oparte na genetyce odwrotnej utorowały drogę do inżynierii rekombinowanych wirusów pozbawionych białek wirusowych, aby zrozumieć ich udział w patogenezie wirusa. Ponadto techniki genetyki odwrotnej wykorzystano do wygenerowania rekombinowanych wirusów wykazujących ekspresję genów reporterowych do zastosowań in vitro i in vivo, w tym do identyfikacji podejść profilaktycznych i/lub terapeutycznych w leczeniu infekcji wirusowych. Białka fluorescencyjne i bioluminescencyjne są najczęściej stosowanymi genami reporterowymi ze względu na ich czułość, stabilność i łatwe wykrywanie w oparciu o ulepszenia nowych technologii25,26. W badaniach in vitro wykazano, że białka fluorescencyjne służą jako lepsza opcja do lokalizacji wirusów w zakażonych komórkach, podczas gdy lucyferazy są wygodniejsze w badaniach ilościowych27,28,29. In vivo, lucyferazy są preferowane w stosunku do białek fluorescencyjnych w obrazowaniu całych zwierząt, podczas gdy białka fluorescencyjne są preferowane do identyfikacji zakażonych komórek lub obrazowania ex vivo30,31,32. Zastosowanie rekombinowanych wirusów wykazujących ekspresję reporterową posłużyło jako potężne narzędzie do badania wirusów w wielu rodzinach, w tym między innymi flawiwirusów, enterowirusów, alfawirusów, lentiwirusów, arenawirusów i wirusów grypy28,33,34,35,36.

Aby przezwyciężyć potrzebę wtórnego podejścia do badania SARS-CoV-2 i scharakteryzowania infekcji SARS-CoV-2 w czasie rzeczywistym in vivo, wygenerowaliśmy rekombinowany (r)SARS-CoV-2 kompetentny replikacyjnie, który wyraża białka bioluminescencyjne (nanolucyferaza, Nluc) lub fluorescencyjne (Venus) przy użyciu naszej wcześniej opisanej genetyki odwrotnej opartej na sztucznych chromosomach bakteryjnych (BAC), które są utrzymywane jako pojedyncza kopia u E. coli W celu zminimalizowania toksyczności sekwencji wirusa podczas jego namnażania się w bakteriach37,38. Warto zauważyć, że rSARS-CoV-2/Nluc i rSARS-CoV-2/Venus wykazywały patogenność podobną do rSARS-CoV-2/WT in vivo. Wysoki poziom ekspresji Venus z rSARS-CoV-2/Venus pozwolił na wykrycie infekcji wirusowej w płucach zakażonych transgenicznych myszy K18 hACE2 za pomocą systemu obrazowania in vivo (IVIS)39. Poziomy ekspresji Wenus dobrze korelowały z mianami wirusa wykrywanymi w płucach, co wskazuje na możliwość wykorzystania ekspresji Wenus jako ważnego substytutu zakażenia SARS-CoV-2. Korzystając z rSARS-CoV-2/Nluc, byliśmy w stanie śledzić dynamikę infekcji wirusowej w czasie rzeczywistym i długookresowo oceniać infekcję SARS-CoV-2 in vivo, stosując to samo podejście IVIS u myszy transgenicznych K18 hACE2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły z udziałem transgenicznych myszy K18 hACE2 zostały zatwierdzone przez Teksański Instytut Badań Biomedycznych (TBRI), Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) oraz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Wszystkie eksperymenty są zgodne z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych Narodowej Rady ds. Badań Naukowych40. Podczas pracy z myszami wymagane są odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).

1. Użycie myszy transgenicznych K18 hACE2

  1. Zakup i utrzymanie 4-6-tygodniowej suczki B6. Myszy Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J (myszy transgeniczne K18 hACE2) w placówce opieki nad zwierzętami o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-2 w określonych warunkach wolnych od patogenów.
    1. Po przybyciu do obiektów BSL2 należy pozwolić zwierzętom zaaklimatyzować się przez 7 dni i przenieść je do obiektu dla zwierząt BSL-3 w celu przeprowadzenia infekcji i innych procedur eksperymentalnych.
    2. Postępując zgodnie z protokołami IACUC, umieść 4 myszy w klatce. Aby upewnić się, że zwierzę nie żyje, po zakażeniu myszy rSARS-CoV-2 i obrazowaniu in vivo, należy poddać zwierzęta eutanazji za pomocą śmiertelnej dawki Fatal-Plus (>100 mg/kg).

2. Bezpieczeństwo biologiczne

UWAGA: W tym manuskrypcie rSARS-CoV-2 jest generowany przy użyciu odwrotnych systemów genetycznych opartych na BAC dla szczepu SARS-CoV-2 USA-WA1/2020, jak wcześniej opisano37. Wszystkie procedury in vivo obejmujące zakażenia rSARS-CoV-2/Nluc lub rSARS-CoV-2/Venus muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego w warunkach BSL-3.

  1. Wyczyść komorę bezpieczeństwa biologicznego 2% środkiem dezynfekującym Wexicide i 70% Ethanol kolejno przed i po wykonaniu wszystkich procedur eksperymentalnych opisanych w tym artykule.
  2. Wysterylizuj cały materiał preparacyjny (nożyczki, kleszcze preparacyjne itp.) oraz homogenizator przed i po każdym użyciu.
  3. Wyczyść komorę izolacyjną i zdezynfekuj za pomocą tabletek MB10 przed i po każdym użyciu zgodnie z instrukcją producenta.
  4. Odrzucić cały materiał biologiczny wytworzony podczas procedur zgodnie z wytycznymi IBC i IACUC.

3. Charakterystyka in vivo rSARS-CoV-2

  1. Infekcje myszy
    1. Umieść samice 4-6-tygodniowych myszy transgenicznych K18 hACE2 w oznakowanych klatkach, zidentyfikuj myszy w każdej klatce za pomocą kodu dziurkacza w uchu i umieść 4 myszy w klatce. Użyj grupy myszy do pomiaru masy ciała i przeżycia, a innej grupy zwierząt do miareczkowania wirusa i obrazowania.
    2. Przed infekcją należy ogolić klatkę piersiową myszy po stronie brzusznej od brodawki piersiowej do okolicy brodawki pachwinowej, aby ułatwić sygnał bioluminescencji.
    3. Przygotować inokulum rSARS-CoV-2 z 105 jednostkami tworzącymi płytkę (PFU)/mysz w sterylnych warunkach w całkowitej objętości 50 μL przy użyciu sterylnego 1x buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS).
      UWAGA: Oblicz ilość rSARS-CoV-2, która ma być użyta w rozcieńczeniu wirusa, według wzoru: potrzebny wirus = (105 PFU na mysz / 50 μL) x objętość końcowa) / podstawowe miano wirusa.
    4. Przechowywać inokulum wirusa w stanie schłodzonym na lodzie.
    5. Użyj myszy zakażonych pozorami (1x PBS) i rSARS-CoV-2/WT jako kontroli wewnętrznej. Umieść pozorowane zakażone myszy w osobnej klatce niż myszy zakażone rSARS-CoV-2.
    6. Znieczulić myszy za pomocą 5% uspokojenia gazowego izofluranem w komorze anestezjologicznej i utrzymywać z 3% izofluranem.
    7. Po potwierdzeniu reakcji posturalnej i odruchu prostowania umieść mysz w pozycji leżącej grzbietowej.
    8. Chwyć szyję myszy między palcem wskazującym a kciukiem i przytrzymaj ogon przy dłoni małym palcem, aby utrzymać zwierzę w pozycji grzbietowej.
    9. Umieścić końcówkę pipety zawierającą 50 μl inokulum wirusa w nozdrzu i powoli wysunąć roztwór. Upewnij się, że inokulum wirusa jest wdychane i nie ma refluksu, obserwując, jak kropla inokulum znika.
  2. Monitorowanie bioluminescencji Transgeniczne myszy K18 hACE2 zakażone rSARS-CoV-2/Nluc ( Rysunek 1 i Rysunek 2)
    UWAGA: Ten eksperyment jest zgodny ze schematem i wykorzystuje wirusy wyświetlane w Rysunek 1. Do systemu obrazowania in vivo (IVIS) wymagana jest nasadka do znieczulenia izofluranem. Szczegółowe informacje na temat wymaganych przyrządów i systemów można znaleźć w Tabeli materiałów.
    1. Uruchom oprogramowanie do obrazowania i ustaw parametry, kliknij tryb obrazu na Bioluminescencja, otwórz filtr i ustaw czas ekspozycji na automatyczny.
    2. Po zainicjowaniu maszyny IVIS umieść myszy w komorze izolacyjnej, będąc jeszcze w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Indukuj myszy izofluranem w stężeniu 5%. Po potwierdzeniu utraty reakcji posturalnej i odruchu prostowania należy utrzymywać z 3% izofluranem.
    3. Gdy myszy zostaną znieczulone, usuń je z komory izolacyjnej i podaj po orbicie substrat lucyferazy rozcieńczony 1:10 w 1x PBS (końcowa objętość 100 μL / mysz) za pomocą igły 25 G.
    4. Po podaniu substratu lucyferazy umieść myszy z powrotem w komorze izolacyjnej z klatką piersiową skierowaną do góry i jamą nosową wewnątrz stożka kolektora, aby utrzymać zwierzę w stanie znieczulenia podczas procedury obrazowania.
    5. Przenieś komorę izolacyjną do maszyny IVIS i natychmiast po zamknięciu drzwiczek imagera IVIS wybierz Acquire w oprogramowaniu, aby zainicjować (Rysunek 2A).
    6. Aby przeanalizować uzyskane obrazy bioluminescencyjne, użyj narzędzia ROI (region zainteresowania) w oprogramowaniu, aby wyznaczyć dokładny sygnał i zmierzyć strumień (Rysunek 2B).
    7. Kliknij Zmierz i pozwól systemowi rozpocząć ocenę bioluminescencji fotonów, aby zapewnić bezwzględną emisję fotonów porównywalną z pomiarami wyjściowymi zapewnianymi przez różne parametry.
    8. Obrazuj myszy po 1, 2, 4 i 6 dniach od infekcji.
    9. Po obrazowaniu umieść myszy z powrotem w klatce.
  3. Analiza fluorescencji u transgenicznych myszy K18 hACE2 zakażonych rSARS-CoV-2/Venus ( Rysunek 3 i Rysunek 4)
    UWAGA: Ten eksperyment jest zgodny ze schematyczną reprezentacją i rSARS-CoV-2 pokazanym na Rysunek 3. Szczegółowe informacje na temat wymaganych przyrządów i systemów można znaleźć w Tabeli materiałów.
    1. Uruchom oprogramowanie do obrazowania i ustaw parametry, ustaw wzbudzenie (500 nm) i filtry emisyjne (530 nm), kliknij tryb obrazu na Fluorescencja i ustaw czas ekspozycji na automatyczny.
    2. Uśpienie dootrzewnowe myszy za pomocą śmiertelnej dawki Fatal-Plus (>100 mg/kg). Po eutanazji należy zdezynfekować miejsce nacięcia 70% etanolem.
    3. Za pomocą pęsety pociągnij skórę, wykonaj nacięcie od mostka do brzucha i odetnij nacięcie z boków nożyczkami. Przeciąć żyłę wątrobową, aby zminimalizować ilość krwi w płucach i uniknąć wysokich sygnałów tła podczas obrazowania.
    4. Za pomocą nożyczek przetnij mostek i otwórz klatkę piersiową. Następnie odetnij koniec tchawicy nożyczkami i usuń płuca pęsetą.
    5. Umieść wycięte płuca w 6-dołkowej płytce zawierającej 2 ml 1x PBS i spłucz w celu usunięcia nadmiaru krwi. Zminimalizuj możliwość zanieczyszczenia między próbkami, dezynfekując i czyszcząc narzędzia chirurgiczne między próbkami przy użyciu 70% etanolu.
    6. Po zainicjowaniu urządzenia IVIS umieść płuca w czarnej tacce i oddziel tkanki od siebie.
    7. Umieść tacę w komorze izolacyjnej wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego, a następnie przenieś komorę izolacyjną do IVIS. Zamknij drzwi i kliknij Pobierz, aby uruchomić system obrazowania (Rysunek 4A).
    8. Aby przeanalizować fluorescencję, użyj narzędzia ROI i narysuj ROI wokół każdego z poszczególnych płuc. Zmierz każdy zwrot z inwestycji ręcznie, a następnie użyj podanych średnich wartości wydajności promieniowania i odejmij od wartości pozorowanych zainfekowanych myszy (Rysunek 4B).
    9. Po zakończeniu obrazowania umieść tkanki na lodzie do analizy tego samego dnia lub w krioprobówce do zamrażania suchego lodu w celu przechowywania w temperaturze -80 °C do późniejszego przetwarzania.
  4. Obrazowanie i ocena patologii płuc w jasnym polu transgenicznych myszy K18 hACE2 zakażonych rSARS-CoV-2 / Nluc (Figura 2A-C) i rSARS-CoV-2 / Venus (Figura 4A-C)
    1. Po zobrazowaniu bioluminescencji myszy zakażonych rSARS-CoV-2/Nluc, rSARS-CoV-2/WT i pozorowanych zakażonych, należy przywrócić myszy do ich klatek. Kontynuuj eutanazję i obrazowanie ex vivo w jasnym polu płuc myszy (Rysunek 2A).
    2. Po zobrazowaniu ex vivo fluorescencji płuc zakażonych myszy, wykonaj obrazy płuc w jasnym polu (Rysunek 4A).
    3. Przeanalizuj duże zmiany na powierzchni płuc za pomocą ImageJ (Rysunki 2C i 4C).
    4. Otwórz obraz płuca, który ma zostać przeanalizowany w ImageJ.
    5. Oblicz stosunek pikseli do cm, użyj narzędzia Prosty i zmierz rzeczywistą długość obrazu.
    6. Po wybraniu kliknij Analizuj > mierz, aby obliczyć długość pikseli dla długości.
    7. Kliknij Analiza > Ustaw skalę i wprowadź liczby obliczone w poprzednim kroku.
    8. Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne i zaznacz całą powierzchnię płuca. Kliknij Analizuj > Mierz, aby zmierzyć całkowitą powierzchnię płuc.
    9. Kliknij Edytuj > Zaznaczenie > Odwróć, aby zaznaczyć resztę obszaru płuc, a następnie naciśnij Usuń lub Backspace, aby usunąć tło.
    10. Usuń zaznaczony obszar, a następnie kliknij Obraz > Dostosuj próg koloru >.
    11. Aby wybrać obszar zmiany patologicznej, ustaw jasność na minimum (od 1 do 50) i maksimum (od 50 do 200), w zależności od obecnego poziomu zatorów i krwotoków.
    12. Po wybraniu zmian patologicznych kliknij Wybierz u dołu panelu kolorów progu, a następnie kliknij Analizuj > mierz, aby zmierzyć obszary patologiczne.
    13. Obliczyć procent zmian patologicznych za pomocą wzoru: % obszaru patologicznego = (pomiar obszaru patologicznego/całkowitej powierzchni płuc) x 100.
  5. Miareczkowanie wirusa (Rysunek 2D i Rysunek 4D)
    1. Po obrazowaniu zakończ eutanazję myszy i zbierz płuca, mózg i błonę śluzową nosa.
    2. Umieść płuca, mózg i błonę śluzową nosa w oddzielnych sterylnych homogenizatorach tkankowych i dodaj 1 ml zimnego 1x PBS.
    3. Homogenizować próbki, odwirowując przy 21 500 x g przez 10 minut, aby uzyskać resztki komórek. Zebrać i przenieść supernatanty do nowej sterylnej probówki i wyrzucić osad.
    4. Jeżeli miareczkowanie wirusa przeprowadza się tego samego dnia, supernatanty należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Alternatywnie, supernatant z homogenizowanych próbek należy zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu późniejszej oceny.
    5. Wykorzystując supernatanty uzyskane z homogenatów tkankowych, wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenia i zainfekuj zlewające się monowarstwy komórek Vero E6 1 ml każdego rozcieńczenia supernatantu (format płytki 6-dołkowej, 1,2 × 106 komórek / dołek, trzykrotnie).
    6. Pozwól wirusowi adsorbować się przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2
      7. .
    7. Po adsorpcji wirusa przemyć komórki 1 ml 1x PBS i inkubować w 2 ml pożywki poinfekcyjnej zawierającej 1% agaru w wilgotnym inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.
    8. Po inkubacji inaktywować płytki w 10% obojętnej buforowanej formalinie przez 24 godziny w temperaturze 4 °C, upewnić się, że cała płytka jest zanurzona.
    9. Wyjmij płytki z BSL3 i umyj komórki trzykrotnie 1 ml 1x PBS i przepuszczaj 1 ml 0,5% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    10. Zablokować komórki 1 ml 2,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie inkubować w 1 ml 1 μg/ml wirusa monoklonalnego reagującego krzyżowo białka nukleokapsydu (N) SARS-CoV (1C7C7), rozcieńczonego w 2,5% BSA przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    11. Umyj komórki trzykrotnie 1 ml 1x PBS i rozwiń blaszki za pomocą zestawu ABC i zestawu substratu peroksydazy DAB zgodnie z instrukcjami producenta.
    12. Oblicz miana wirusa jako PFU/mL.
      UWAGA: Obliczyć za pomocą wzoru PFU/ml = współczynnik rozcieńczenia x liczba blaszek x (1 ml/objętość inokulum).
  6. Aktywność Nluc w tkankach transgenicznych myszy K18 hACE2 zakażonych rSARS-CoV-2/Nluc (Rysunek 2E)
    1. Określ ilościowo obecność Nluc w homogenatach narządowych od pozorowanych, zakażonych rSARS-CoV-2/WT i rSARS-CoV-2/Nluc transgenicznych myszy K18 hACE2 za pomocą testu lucyferazy zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Ocena zachorowalności i śmiertelności (Rysunek 2F, G i Rysunek 4E, F)
    1. Inkażować donosowo 4-6-tygodniowe samice transgenicznych myszy K18 hACE2 za pomocą 105 PFU rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc lub pozorowanego zakażenia, jak opisano w sekcji 3.1.
    2. Monitoruj i waż myszy przez 12 dni w tym samym czasie, aby zminimalizować różnice w wadze spowodowane spożyciem pokarmu. Poddaj eutanazji myszy, które tracą 25% początkowej masy ciała, odkąd osiągnęły humanitarny punkt końcowy i zauważ, że myszy te ulegają infekcji wirusowej.
    3. Po 12 dniach poddaj eutanazji myszy, które przeżyły infekcję wirusową i oblicz % zmiany masy ciała i przeżycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zakażenie rSARS-CoV-2/Nluc u myszy transgenicznych K18 hACE2 (Rycina 1 i 2)
Rycina 1A przedstawia schematyczne ujęcie rSARS-CoV-2/WT (góra) oraz rSARS-CoV-2/Nluc (dół) wykorzystanych do oceny zakażeń in vivo. Rycina 1B pokazuje schematyczny przebieg procedury zastosowanej w celu oceny dynamiki zakażenia rSARS-CoV-2/Nluc u myszy transgenicznych K18 hACE2. Samice myszy transgenicznych K18...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten demonstruje wykonalność wykorzystania tych genów reporterowych eksprymujących rSARS-CoV-2 do monitorowania infekcji wirusowych in vivo. Oba rekombinowane wirusy wykazujące ekspresję reporterową stanowią doskonałe narzędzie do badania zakażeń SARS-CoV-2 in vivo. Opisane systemy obrazowania ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) i in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) stanowią doskonałą opcję do zrozumienia dynamiki zakażenia SARS-CoV-2, patogenezy wirusa oraz identyfikacji zakażonych komórek/nar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakiegokolwiek komercyjnego, finansowego i niefinansowego lub osobistego konfliktu interesów w związku z opisywaną pracą.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować członkom naszego instytutu (Texas Biomedical Research Institute) za ich wysiłki w utrzymaniu naszych obiektów w pełni funkcjonalnych i bezpiecznych podczas pandemii COVID-19. Chcielibyśmy również podziękować naszemu Instytucjonalnemu Komitetowi ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) i firmie Spell (IACUC) za przegląd naszych protokołów w sposób efektywny czasowo. Dziękujemy dr Thomasowi Moranowi z Icahn School of Medicine w Mount Sinai za dostarczenie reaktywnego krzyżowo przeciwciała monoklonalnego białka nukleokapsydu (N) SARS-CoV. Badania nad SARS-CoV-2 w laboratorium Martinez-Sobrido są obecnie wspierane przez granty NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 i R43AI165089-01; Departament Obrony (DoD) przyznaje W81XWH2110095 i W81XWH2110103; San Antonio Partnership for Precision Therapeutic (Partnerstwo na rzecz Terapii Precyzyjnej); Forum Instytutu Badań Biomedycznych w Teksasie; Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio; Fundacja Medyczna San Antonio; oraz przez Centrum Badań nad Patogenezą i Przenoszeniem Grypy (CRIPT), finansowane przez NIAID Centrum Doskonałości ds. Badań i Reagowania na Grypę (CEIRR, umowa # 75N93021C00014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5% Triton X-100J.T.BakerX198-07Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT)
1% DEAE-DextranMP Biomedicals195133
10% roztworem formaliny, neutralnie buforowanymSigma-AldrichHT501128
AgarOxoidLP0028
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowejGreiner Bio-one662160
5% wodorowęglan soduSigma AldrichS-5761
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowejGreiner Bio-one657160
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowejGreiner Bio-one655-180
Komórki nabłonka nerki afrykańskiej zielonej małpy (Vero E6)ATCC CRL-1586
Ami HTInstrumenty spektralne Obrazowanie
Aura Oprogramowanie do obrazowania 3.2.0Instrumenty spektralne ObrazowanieOprogramowanie do analizy obrazu
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), 35%Sigma-AldrichA9647Przechowuj w 4 &stopniach; C
Woda klasy hodowli komórkowejCorning25-055-CV
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVPrzechowywać w 4 & stopni; C
Maszyna do znieczulenia gazemWeterynaryjne systemy anestezjologiczne, Inc.VAS 2001R
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Seradigm1500-050Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Cztero- do sześciotygodniowych samic transgenicznych myszy K18-hACE2Jackson Laboratory34860
Graphpad Prism w wersji 9.1.0GraphPad
IsofluraneBaxter1001936040Sklep w RT
Oprogramowanie do analizy danych MARSTabletki BMG LABTECH
MB10QUIP LaboratoriesMBTAB1.5Sklep w RT
Odczynnik do oznaczania lucyferazy Nano-GloPromegaN1110Ten odczynnik służy do pomiaru aktywności Nluc. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Nunc MicroWell 96-dołkowe mikropłytkiThermoFisher Scientific269620
Nunc MicroWell 96-dołkowe mikropłytkiThermoFisher Scientific269620
Penicylina/Streptomycyna/L-glutamina (PSG) 100xCorning30-009-CIPrzechowywać w temperaturze -20 ° C
PHERAstar FSXBMG LABTECHPHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizatorBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
Homogenizator tkanek miękkich CK14 – 7 mLBertin InstrumentsP000940-LYSK0-A
T75 EasYFlaskThermoFisher Scientific156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, peroksydazaZestaw ABC Vector LaboratoriesPK-4002i zestaw substratu peroksydazy DAB

Bibliografia

  1. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423(2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847(2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309(2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947(2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611(2021).
  14. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021).
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280(2021).
  19. O'Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032(2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12(2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168(2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537(2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zaka enie SARS CoV 2myszy K18 hACE2reporterowy SARS CoV 2obrazowanie bioluminescencyjneobrazowanie fluorescencyjnekwantyfikacja wirusaledzenie wirusaobrazowanie in vivoreplikacja wirusa
Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.