Ten protokół opisuje dynamikę infekcji wirusowych za pomocą rekombinowanego (r)SARS-CoV-2 z ekspresją lucyferazy i fluorescencji oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) u transgenicznych myszy K18 hACE2, aby przezwyciężyć potrzebę wtórnych podejść wymaganych do badania infekcji SARS-CoV-2 in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pandemia choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) została wywołana przez koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Do tej pory SARS-CoV-2 był odpowiedzialny za ponad 242 miliony zakażeń i ponad 4,9 miliona zgonów na całym świecie. Podobnie jak w przypadku innych wirusów, badanie SARS-CoV-2 wymaga zastosowania metod eksperymentalnych w celu wykrycia obecności wirusa w zakażonych komórkach i/lub w modelach zwierzęcych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy rekombinowany (r)SARS-CoV-2 z kompetencjami replikacyjnymi, który wykazuje ekspresję białek bioluminescencyjnych (nanolucyferazy, Nluc) lub fluorescencyjnych (Wenus). Te rSARS-CoV-2 wykazujące ekspresję reporterową umożliwiają śledzenie infekcji wirusowych in vitro i in vivo w oparciu o ekspresję genów reporterowych Nluc i Venus. W niniejszym badaniu opisano zastosowanie rSARS-CoV-2/Nluc i rSARS-CoV-2/Venus do wykrywania i śledzenia zakażenia SARS-CoV-2 we wcześniej opisanym transgenicznym mysim modelu zakażenia K18 ludzkim enzymem konwertującym angiotensynę 2 (hACE2) przy użyciu systemów obrazowania in vivo (IVIS). Te rSARS-CoV-2/Nluc i rSARS-CoV-2/Venus wykazują patogenność podobną do rSARS-CoV-2/WT i replikację wirusa in vivo. Co ważne, ekspresja Nluc i Venus pozwala nam bezpośrednio śledzić infekcje wirusowe in vivo i ex vivo, u zakażonych myszy. Te rSARS-CoV-2/Nluc i rSARS-CoV-2/Venus stanowią doskonałą opcję do badania biologii SARS-CoV-2 in vivo, zrozumienia infekcji wirusowej i związanej z nią choroby COVID-19 oraz określenia skutecznych metod profilaktycznych i/lub terapeutycznych w celu zwalczania zakażenia SARS-CoV-2.
Wprowadzenie
Koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) to jednoniciowy wirus RNA, który należy do linii Betacoronavirus z rodziny Coronaviridae1. Ta rodzina wirusów jest podzielona na koronawirusa alfa, beta, gamma i delta1. Alfa- i Betakoronawirusy infekują głównie ssaki, podczas gdy Gamma- i Deltakoronawirusy infekują prawie wyłącznie ptaki2. Do tej pory siedem koronawirusów (CoV) przekroczyło bariery gatunkowe i pojawiło się jako koronawirusy ludzkie (HCoV): dwa alfa-CoV (HCoV-229E i HCoV-NL63) i pięć beta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, koronawirus bliskowsch....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokoły z udziałem transgenicznych myszy K18 hACE2 zostały zatwierdzone przez Teksański Instytut Badań Biomedycznych (TBRI), Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) oraz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Wszystkie eksperymenty są zgodne z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych Narodowej Rady ds. Badań Naukowych40. Podczas pracy z myszami wymagane są odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).
1. Użycie myszy transgenicznych K18 hACE2
- Zakup i utrzymanie 4-6-tygodniowej suczki B6. Mys....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zakażenie rSARS-CoV-2/Nluc u myszy transgenicznych K18 hACE2 (Rycina 1 i 2)
Rycina 1A przedstawia schematyczne ujęcie rSARS-CoV-2/WT (góra) oraz rSARS-CoV-2/Nluc (dół) wykorzystanych do oceny zakażeń in vivo. Rycina 1B pokazuje schematyczny przebieg procedury zastosowanej w celu oceny dynamiki zakażenia rSARS-CoV-2/Nluc u myszy transgenicznych K18 hACE2. Samice myszy transgenicznych K18.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten demonstruje wykonalność wykorzystania tych genów reporterowych eksprymujących rSARS-CoV-2 do monitorowania infekcji wirusowych in vivo. Oba rekombinowane wirusy wykazujące ekspresję reporterową stanowią doskonałe narzędzie do badania zakażeń SARS-CoV-2 in vivo. Opisane systemy obrazowania ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) i in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) stanowią doskonałą opcję do zrozumienia dynamiki zakażenia SARS-CoV-2, patogenezy wirusa oraz identyfikacji zakażonych komórek/nar.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakiegokolwiek komercyjnego, finansowego i niefinansowego lub osobistego konfliktu interesów w związku z opisywaną pracą.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować członkom naszego instytutu (Texas Biomedical Research Institute) za ich wysiłki w utrzymaniu naszych obiektów w pełni funkcjonalnych i bezpiecznych podczas pandemii COVID-19. Chcielibyśmy również podziękować naszemu Instytucjonalnemu Komitetowi ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) i firmie Spell (IACUC) za przegląd naszych protokołów w sposób efektywny czasowo. Dziękujemy dr Thomasowi Moranowi z Icahn School of Medicine w Mount Sinai za dostarczenie reaktywnego krzyżowo przeciwciała monoklonalnego białka nukleokapsydu (N) SARS-CoV. Badania nad SARS-CoV-2 w laboratorium Martinez-Sobrido są obecnie wspierane przez granty NIAID/NIH RO1AI161363-....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% roztworem formaliny, neutralnie buforowanym | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| 24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% wodorowęglan sodu | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Komórki nabłonka nerki afrykańskiej zielonej małpy (Vero E6) | ATCC CRL-1586 | ||
| Ami HT | Instrumenty spektralne Obrazowanie | ||
| Aura Oprogramowanie do obrazowania 3.2.0 | Instrumenty spektralne Obrazowanie | Oprogramowanie do analizy obrazu | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Przechowuj w 4 &stopniach; C |
| Woda klasy hodowli komórkowej | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Przechowywać w 4 & stopni; C |
| Maszyna do znieczulenia gazem | Weterynaryjne systemy anestezjologiczne, Inc. | VAS 2001R | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C |
| Cztero- do sześciotygodniowych samic transgenicznych myszy K18-hACE2 | Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism w wersji 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Sklep w RT |
| Oprogramowanie do analizy danych MARS | Tabletki BMG LABTECH | ||
| MB10 | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Sklep w RT |
| Odczynnik do oznaczania lucyferazy Nano-Glo | Promega | N1110 | Ten odczynnik służy do pomiaru aktywności Nluc. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C |
| Nunc MicroWell 96-dołkowe mikropłytki | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-dołkowe mikropłytki | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicylina/Streptomycyna/L-glutamina (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Przechowywać w temperaturze -20 ° C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution homogenizator | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Homogenizator tkanek miękkich CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, peroksydaza | Zestaw ABC Vector Laboratories | PK-4002 | i zestaw substratu peroksydazy DAB |
Bibliografia
- V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome cor....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
