Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół stopniowej rekonstytucji syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich użycie do badania wyjścia synaptycznego z aktywowanych limfocytów T.

Streszczenie

Komórki prezentujące antygen (APC) prezentują trzy sygnały aktywujące limfocyty T wchodzące w kontakt fizyczny: 1) antygen, 2) kostymulacja/koprepresja, oraz 3) cytokiny rozpuszczalne. Limfocyty T uwalniają dwa rodzaje cząstek efektorowych w odpowiedzi na aktywację: pęcherzyki transsynaptyczne (tSV) i supramolekularne cząstki ataku, które odpowiednio przenoszą przekaźniki międzykomórkowe i pośredniczą w cytotoksyczności. Jednostki te są szybko internalizowane przez APC zaangażowane w fizyczny kontakt z limfocytami T, co sprawia, że ich charakterystyka jest zniechęcająca. W tym artykule przedstawiono protokół wytwarzania i stosowania dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki (BSLB) jako mimetyki komórek prezentujących antygen (APC) do wychwytywania i analizowania tych cząstek transsynaptycznych. Opisano również protokoły bezwzględnych pomiarów gęstości białek na powierzchni komórek, odtwarzania BSLB o takich poziomach fizjologicznych oraz procedury cytometrii przepływowej do śledzenia uwalniania cząstek synaptycznych przez limfocyty T. Protokół ten można dostosować do badania wpływu pojedynczych białek, złożonych mieszanin ligandów, determinantów wirulencji patogenów i leków na efektorową produkcję limfocytów T, w tym limfocytów T pomocniczych, cytotoksycznych limfocytów T, limfocytów T regulatorowych i limfocytów T eksprymujących chimeryczny receptor antygenowy (CART).

Wprowadzenie

Synapsa immunologiczna (IS) to kluczowa struktura molekularna utworzona na styku komórek w kontakcie fizycznym, która ułatwia regulowaną wymianę informacji o jukstrarynie. W literaturze opisano różne chromosomy IS, a coraz więcej dowodów sugeruje, że te ośrodki molekularne są konserwatywną cechą sieci komórkowych. Różne komórki odpornościowe, w tym limfocyty B, komórki NK , komórki dendrytyczne, makrofagi i limfocyty T, wymieniają informacje poprzez montaż krótkotrwałych kontaktów¹. Badania multiomiczne pogłębiają wiedzę na temat nowych podzbiorów leukocytów i komórek zrębu napędzających patogenne sieci komórkowe i eksprymujących białka powierzchniowe o nieznanych funkcjach. Jako syntetyczne APC, BSLB umożliwiają bezpośrednie badanie funkcjonalnej roli poszczególnych białek w integracji sygnałów aktywujących, a mianowicie antygenów i kostymulacji/corepression, przez limfocyty T i wynikającym z tego uwalnianiu cząstek efektorowych określanych jako sygnał czwarty.

Ten artykuł opisuje protokoły i krytyczne kwestie techniczne, które należy wziąć pod uwagę podczas korzystania z BSLB do naśladowania składu powierzchni modelowych transporterów opancerzonych. Przedstawiono protokoły ilościowego pomiaru receptorów immunologicznych i innych białek powierzchniowych na APC wraz z protokołem odtwarzania syntetycznych APC zawierających te zmierzone ilości. Następnie przedstawiono etapy wymagane do kokulturacji limfocytów T i BSLB wraz z protokołem ilościowego pomiaru transferu cząstek transsynaptycznych za pomocą cytometrii przepływowej. Co najbardziej niezwykłe, BSLB ułatwiają badanie populacji tSV pochodzących z błony plazmatycznej, zwanych ektosomami synaptycznymi (SE). SE wzbogacone w receptor antygenu komórek T (TCR⁺) są wydalane w odpowiedzi na wyzwalanie TCR² i skutecznie wychwytywane przez BSLBs³, co stanowi doskonały odczyt do oceny agonistycznych właściwości antygenów i modelowanego składu błony. Egzosomy CD63 ⁺ i supramolekularne cząstki atakujące (SMAP) są również uwalniane przez stymulowane limfocyty T i wychwytywane przez BSLB. Mogą być one wykorzystywane jako dodatkowe odczyty aktywacji i wynikającego z niej wydzielania granulek egzocytarnych i litycznych przez limfocyty T. Mobilizacja pęcherzyków egzocytarnych do współpracującego bieguna limfocytu T ułatwia również kierunkowe uwalnianie cytokin, takich jak IL-2, IFN-γ i IL-10 w odpowiedzi na aktywację^4,5,6,7,8. Chociaż cytokiny uwalniane przez limfocyty T można również wykryć na BSLB, obecnie opracowywane jest bardziej dedykowane badanie w celu walidacji ilościowej analizy uwalniania cytokin w synapsie immunologicznej.

Aby zbadać, jak specyficzny skład błony wpływa na wydajność synaptyczną komórek T, konieczne jest zdefiniowanie fizjologicznej gęstości docelowego składnika błony. Kwantyfikacja białek powierzchniowych komórek oparta na cytometrii przepływowej jest niezbędnym krokiem w tym protokole i wymaga: 1) zastosowania przeciwciał o znanej liczbie fluorochromów na przeciwciało (F / P) oraz 2) kulek wzorcowych zapewniających standardowe odniesienie do interpolacji cząsteczek fluorochromu ze zmierzonych średnich intensywności fluorescencji (MIF).

Te wzorce porównawcze składają się z pięciu populacji koralików, z których każda zawiera rosnącą liczbę równoważnych rozpuszczalnych fluorochromów (MESF), które obejmują dynamiczny zakres arbitralnego wykrywania fluorescencji. Te standardowe populacje dają dyskretne piki fluorescencji, ułatwiając konwersję dowolnych jednostek fluorescencji na MESF za pomocą prostej regresji liniowej. Powstałe MESF są następnie używane wraz z wartościami F/P przeciwciał w celu obliczenia średniej liczby związanych cząsteczek na komórkę (lub BSLB w późniejszych etapach). Zastosowanie szacowanych powierzchni komórek do średniej liczby wykrytych cząsteczek umożliwia następnie obliczenie gęstości fizjologicznych w postaci cząsteczek/^μm2. Ten protokół kwantyfikacji można również dostosować do pomiaru gęstości białek na limfocytach T i biochemicznej rekonstytucji kompozycji błonowych pośredniczących w tworzeniu homotypowych synaps komórek T (tj. Synapsy T-T⁹). W razie potrzeby można dodatkowo oszacować wartość wiązania przeciwciał za pomocą rekombinowanych celów znakowanych znaną liczbą fluorochromów na cząsteczkę. Następnie można obliczyć wartościowość wiązania przeciwciał dla tej samej populacji BSLB, jednocześnie porównując liczbę związanych białek fluorescencyjnych i przeciwciał kwantyfikacyjnych (przy użyciu dwóch różnych fluorochromów kwantyfikacyjnych i wzorców MESF).

Rekonstrukcja membran APC wymaga montażu podpartych dwuwarstw lipidowych (SLB) na kulkach krzemionkowych¹. Stada liposomów zawierające różne gatunki fosfolipidów można wykorzystać do stworzenia wszechstronnej dwuwarstwowej matrycy lipidowej, umożliwiającej zakotwiczenie rekombinowanych białek o różnej chemii wiązania (przygotowanie liposomów jest szczegółowo opisane w 10). Po zdefiniowaniu gęstości fizjologicznej (lub gęstości) odpowiedniego liganda "na komórkach", ten sam protokół cytometrii przepływowej jest dostosowywany do oszacowania stężenia rekombinowanego białka potrzebnego do pokrycia BSLB docelową gęstością fizjologiczną. Dwa różne systemy kotwienia mogą być stosowane w połączeniu lub oddzielnie.

Po pierwsze, SLB zawierające końcowe 12,5% mol% fosfolipidów zawierających Ni²⁺ jest wystarczające do zapewnienia około 10 000 miejsc wiązania znacznika Hisa na mikron kwadratowy¹⁰ i dobrze nadaje się do ozdabiania BSLB najbardziej dostępnymi na rynku białkami, których gęstości fizjologiczne nie przekraczają tej maksymalnej ładowności. Drugi system ładowania wykorzystuje fosfolipidy zawierające biotynę (w przeliczeniu na mol%) do ładowania biotynylowanych anty-CD3e Fab (lub monomerów HLA/MHC) za pośrednictwem mostków streptawidyny. Połączenie tych dwóch metod zdobienia BSLB umożliwia elastyczne dostosowywanie BSLB jako syntetycznych APC. W przypadku bardzo złożonych kompozycji powierzchniowych APC, mol% fosfolipidów i białek można zwiększyć, aby załadować tyle białek, ile wymaga dane pytanie. Po określeniu stężeń roboczych białek i mol% biotynylowanych fosfolipidów, BSLB można złożyć w celu zbadania wyjścia synaptycznego komórek T za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.

Protokół

1. Pomiar gęstości białek na powierzchni komórki za pomocą ilościowej cytometrii przepływowej

1. Przygotować przefiltrowany przez 0,22 μm ludzki bufor cytometryczny przepływowy (hFCB), dodając EDTA (do końcowego stężenia 2 mM) i ludzką surowicę AB (do końcowych 10%) do sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4 (patrz Tabela 1). Przefiltrować roztwór za pomocą jednostki filtrującej pory 0,22 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń z surowicy i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Odzyskać komórki i osadać je przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
3. Umyj komórki dwukrotnie PBS. Na każdym etapie płukania ponownie zawiesić komórki w PBS do pierwotnej objętości (przed odwirowaniem) i odwirować do 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Policz trypanowe zawiesiny komórek zabarwione na niebiesko w hemocytometrze¹¹. Alternatywnie policz komórki za pomocą wykluczenia prądu elektrycznego. W tym ostatnim przypadku należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta CASY-TT (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Licznik komórek CASY-TT umożliwia określenie procentu żywotnych komórek, rozmiaru komórki i objętości komórki.
5. Obliczyć objętość PBS zawierającą rozcieńczenie 1:1 000 barwnika eFluor 780 lub podobnego barwnika (patrz tabela materiałów) wymaganej do ponownego zawieszenia komórek do stężenia barwiącego^10-7 komórek/ml.
6. Zawiesić komórki za pomocą roztworu PBS z barwnikiem żywotności i inkubować na lodzie przez 30 minut.
7. Usuń barwnik żywotności, dodając jedną objętość lodowatego hFCB. Wirować w temperaturze 300 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Od teraz utrzymuj nieprzerwany łańcuch chłodniczy.
8. Przemyć komórki hFCB zawierającym roztwór blokujący receptor Fc w rozcieńczeniu 1:50 (patrz tabela materiałów). Doprowadzić objętość do końcowego stężenia 10-7 komórek/ml i inkubować przez dodatkowe 15 minut, aby uzyskać skuteczne blokowanie FcgR.
9. Rozprowadzić 100 μl zawiesiny komórek (tj. 10⁶ komórek) na dołek 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U lub z dnem w kształcie litery V. Trzymaj komórki na lodzie i chroń przed światłem (przykryj folią aluminiową).
10. Przygotuj główną mieszankę przeciwciał w hFCB, określając optymalne stężenia przeciwciał dla każdego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem, a co najważniejsze, dla tych przeciwciał, które są używane do określania gęstości białek powierzchniowych. Na przykład, w celu ilościowego określenia ekspresji ICAM-1 w populacjach komórek migdałków, jak pokazano na Rysunek 1, przygotuj mieszaninę zawierającą 1:200 rozcieńczeń anty-CD4, anty-CD19 i anty-CXCR5 wraz ze stężeniami nasycania przeciwciała anty-ICAM-1 ze znanymi fluorochromami AF647 na przeciwciało (tj. 10 μg / ml, które zostały określone przez niezależne eksperymenty miareczkowania przeciwciał).
11. Jako dodatkowe kontrole, należy przygotować główną mieszankę przeciwciał zawierającą odpowiednie kontrole izotypu przeciwciał (w tych samych skutecznych stężeniach, co ich odpowiedniki sprzężone z tymi samymi fluorochromami w celu odjęcia tła), tj. użyć 10 μg/ml odpowiedniej kontroli izotypu AF647.
    UWAGA: W powyższym przykładzie taka kontrola izotypu jest używana do odejmowania fluorescencji tła od prawdziwego sygnału ICAM-1 na komórkach.
12. Podczas ilościowego określania gęstości białek w podzbiorach komórek obecnych z niską częstotliwością w tkankach, należy przygotować kontrole fluorescencji minus jeden (FMO) zawierające wszystkie przeciwciała barwiące z wyjątkiem markerów będących przedmiotem zainteresowania (patrz więcej szczegółów w ¹²).
13. Odwirować 96-dołkową płytkę zawierającą komórki w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl głównej mieszaniny przeciwciał do oznaczania ilościowego lub głównej mieszaniny przeciwciał izotypowych.
14. Inkubować komórki przez co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C i 400 obr./min przy użyciu wytrząsarki do płytek. Chroń talerze przed światłem (przykryj folią aluminiową).
15. Umyć komórki trzykrotnie za pomocą hFCB i odwirować w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
16. Zawiesić osad komórkowy przy użyciu 200 μl PBS (tj. do końcowego stężenia 5 × 10⁶ komórek/ml).
17. Do nabycia:
    1. W przypadku korzystania ze standardowego podajnika BD FACS należy przenieść próbki do probówek okrągłodennych z polistyrenu o pojemności 5 ml (patrz Tabela materiałów).
    2. W przypadku korzystania z próbników o wysokiej przepustowości (HTS, nazywanych również czytnikami płytek) należy natychmiast przejść do kroku 1.19.
18. Przed przystąpieniem do zbierania danych dla wzorców MESF należy sprawdzić maksymalne i minimalne limity liniowości intensywności fluorescencji dla kanałów kwantyfikacji.
19. Przed kompensacją należy pozyskać dane dla standardów MESF, upewniając się, że zarówno najciemniejsze, jak i najjaśniejsze populacje mieszczą się w liniowym zakresie pomiaru.
20. Zdobądź próbki kompensacji. Utrzymuj wartości napięcia lampy fotopowielacza (PMT) dla kanałów kwantyfikacji bez zmian, aby zachować dynamiczny zakres wykrywania. Wykonaj niewielkie korekty napięcia PMT innych kanałów przed obliczeniem macierzy kompensacji.
21. Oblicz i zastosuj odszkodowanie.
22. Zdobądź i zapisz co najmniej 2 × 10⁴ całkowitych kulek MESF dla każdego z kanałów kwantyfikacji.
23. Wybierz populację pojedynczych komórek na podstawie ich bocznych i przednich obszarów rozpraszania światła (odpowiednio SSC-A i FSC-A, jak pokazano na Rysunek 1A (i)), a następnie wybór zdarzeń wewnątrz kontinuum czasu (Rysunek 1A (ii)) i niski czas przelotu (W) zarówno w FSC, jak i SSC w porównaniu z ich wysokościami (tj. FSC-W/FSC-H, a następnie bramkowanie SSC-W/SSC-H, jak pokazano na Rysunek 1A (iii) i (iv), odpowiednio). Zdefiniuj końcową bramkę pojedynczego zdarzenia zawierającą zdarzenia o proporcjonalnym rozkładzie FSC-A w stosunku do FSC-H (Rysunek 1A (v)).
24. Pobieranie próbek kontrolnych (kontrole znakowane izotypem i FMO).
25. Pobieraj próbki i rejestruj do momentu pozyskania co najmniej 10 000 komórek docelowych.
    UWAGA: solidne określenie średniej gęstości molekularnej wymaga analizy kilku donorów w niezależnych eksperymentach. Ma to kluczowe znaczenie przy analizie podzbiorów komórek znajdujących się w zmniejszonej częstotliwości lub pochodzących z rzadkiego materiału biologicznego (np. z biopsji tkanek ludzkich).
26. Umyj cytometr pracujący przez 5 minut roztworem czyszczącym FACS, a następnie 5 minutami ultraczystej wody przed wyłączeniem przyrządu. W przypadku korzystania z HTS postępuj zgodnie z opcjami znajdującymi się na karcie HTS i program Clean Plate.
    UWAGA: Aby zmniejszyć przenoszenie próbki do próbki, aktywuj opcje płukania próbnika (próbnika) lub mycia próbnika o wysokiej przepustowości, które automatycznie umyją cytometr między probówkami lub studzienkami. Przed rozpoczęciem akwizycji należy przepuścić ultraczystą wodę na 10 minut przy dużym natężeniu przepływu, aby usunąć wszelkie nieumyte zanieczyszczenia biologiczne z linii próbki cytometru.
27. Eksportuj pliki wzorca cytometrii przepływowej (FCS).

2. MESF przekorygował analizy regresji średniej (lub mediany) intensywności fluorescencji (MFI)

1. Otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i załaduj pliki FCS eksperymentu. Wybierz populację koralików na podstawie ich bocznych i przednich obszarów rozpraszania światła (SSC-A kontra FSC-A), jak pokazano na rysunku Rysunek 1A (i).
2. Kontroluj jakość danych, sprawdzając rozkład pojedynczych zdarzeń w czasie, jak wskazano w kroku 1.24.
   UWAGA: Bąbelki tworzą luki w rozkładzie zdarzeń w czasie; zwykle pojawia się na początku akwizycji za pomocą HTS. Unikaj wybierania zdarzeń flankujących luki w czasie akwizycji, ponieważ dodają one błędy pomiaru spowodowane aberracjami optycznymi.
3. Skup się na pojedynczych wydarzeniach.
   1. Komórek
      1. Najpierw zidentyfikuj pojedyncze komórki na podstawie ich rozkładu SSC-A i FSC-A (Rysunek 1A (i)), a następnie zdarzenia niskie dla W w sekwencyjnych bramkach FSC-W/FSC-H (singlets-1, Rysunek 1A panel (iii)) i SSC-W/SSC-H (singlets-2; Rysunek 1A panel (iv)). Zdefiniuj dodatkową bramkę singlets-3 wybierając zdarzenia z proporcjonalnymi FSC-A i FSC-H (Rysunek 1A, panel (v)). Na koniec zidentyfikuj żywe komórki jako te, które są ujemne dla możliwego do utrwalenia barwnika żywotności.
   2. Koraliki MESF
      1. Postępuj zgodnie z tą samą dyskryminacją singletów-1 do singletów-3, jak w kroku 2.3.1.1 (Rysunek 1B, panele (i) do (v)). Zidentyfikuj każdą z populacji MESF (ślepa, 1, 2, 3 i 4) na podstawie ich poziomów intensywności fluorescencji (patrz Rysunek 1B, panel (vi)).
4. Wyodrębnić MIF z frakcji MESF w stanie ślepym i od 1 do 4.
5. Generowanie skorygowanych wartości MIF (cMFI) dla frakcji MESF od 1 do 4 poprzez odjęcie MIF populacji ślepych kulek od każdej frakcji.
6. Oblicz linię najlepszego dopasowania dla relacji między cMFI a wartościami MESF dostarczonymi przez dostawcę (zmienna niezależna, będąca ułamkiem pustym równym zero).
7. Wyodrębnij nachylenie (b w poniższym równaniu) regresji liniowej MESF nad cMFI (Rysunek 1B panel (viii) pokazuje regresję, w której y = a + bx; gdzie a = 0).
8. Wyodrębnij medianę (dla bimodalnych rozkładów fluorescencji) lub średnią (dla normalnych lub logarytmiczno-normalnych rozkładów fluorescencji) intensywności fluorescencji z populacji będących przedmiotem zainteresowania (komórki TFH i B w Rysunek 1A panel (vii)).
9. Podobnie jak w krokach 2.5-2.7, wyodrębnij wartości MIF z komórek kontrolnych oznaczonych izotypem.
10. Jeśli F/P kontroli izotypu jest takie samo jak przeciwciała do oznaczania ilościowego, skoryguj MFI barwionych komórek, odejmując MFI od komórek znakowanych izotypem.
11. Jeżeli F/P izotypów różni się od przeciwciał do oznaczania ilościowego, należy wyekstrahować MESF z izotypów, dzieląc MIF komórek znakowanych izotypem przez nachylenie obliczone w kroku 2.7. Odejmij izotyp MESF od kwantyfikacji MESF przed oszacowaniem związanych przeciwciał kwantyfikacyjnych.
12. Podzielić MESF przez F/P przeciwciał do oznaczania ilościowego, aby oszacować liczbę związanych cząsteczek na komórkę (Molec._komórka, jak pokazano na schemacie przepływu Rysunek 1C).
13. Podziel liczbę związanych cząsteczek przez szacowaną powierzchnię komórki (CSA (μm²)), aby wyodrębnić gęstość białek jako mol./μm² (Rysunek 1C). Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z sekcją reprezentatywnych wyników.

3. Funkcjonalne gatunki fosfolipidów do użycia w kalibracji białek pokrywających BSLB

1. Użyj 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina) jako główny składnik matrycy lipidowej tworzącej podpartą dwuwarstwę lipidową. Rozcieńczyć wszystkie inne gatunki lipidów w tym roztworze DOPC.
2. Użyj od 0,2 do 1 mol% 0,4 mM DOPE (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy) sprzężonej z barwnikami, w tym ATTO 390, 488 lub 565 (patrz tabela materiałów), w celu wytworzenia BSLB o wewnętrznej fluorescencji.
   UWAGA: Wewnętrzna fluorescencja BSLB ułatwia identyfikację pojedynczych BSLB i pojedynczych komórek w eksperymentach z transferem synaptycznym.
3. Użyj 12,5% mol% 0,4 mM DGS-NTA(Ni) (1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-[(Kwas N-(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacet) sukcynylu]) do zakotwiczenia białek znakowanych His. Utrzymuj mol% DGS-NTA(Ni) na stałym poziomie i wykonaj 2-krotne miareczkowanie białek znakowanych His, zaczynając od 100 nM jako najwyższego stężenia. Pozostaw jeden warunek bez białka jako kontrolę ujemną dla bezwzględnych ocen ilościowych.
   UWAGA: Sygnały akcesoryjne i cząsteczki adhezyjne, takie jak ICAM-1, są zaprojektowane ze znacznikiem 12-His w celu zwiększenia powinowactwa białka do DGS-NTA(Ni).
4. Użyj Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) do zakotwiczenia biotynylowanych białek za pomocą mostków biotyna-streptawidyna-biotyna. Zastosować 5-krotne miareczkowanie seryjne 0,4 mM Biotinyl Cap PE obejmujące od 10 mol% do 0 mol% (jako kontrola ujemna). Utrzymuj stałe stężenie streptawidyny i biotynylowanych białek (200 nM) zarówno w eksperymentach kalibracyjnych, jak i podczas odtwarzania syntetycznych APC do eksperymentów z transferem synaptycznym.
   UWAGA: Analizy regresji empirycznych gęstości biotynylowanych białek w stosunku do końcowego mol% Biotinyl Cap PE w matrycy lipidowej (zawierającej również DGS-NTA(Ni) do zakotwiczenia białek znakowanych His) określą mol%, który należy zastosować do odtworzenia docelowych gęstości antygenu.

4. Przygotowanie suplementowanej buforowanej soli fizjologicznej HEPES zawierającej 1% albuminy surowicy

UWAGA: Uzupełniona sola fizjologiczna buforowana przez HEPES, zawierająca 1% albuminy surowicy ludzkiej (HBS/HSA) lub 1% albuminy surowicy bydlęcej (HBS/BSA) jest wymagana na etapach płukania i ładowania białka BSLB (Tabela 1). Przygotować 10-krotny roztwór podstawowy HBS i bufor roboczy tak świeży, jak to możliwe; Przechowywać w lodówce i zużyć w ciągu jednego miesiąca. Chociaż BSA jest tańszą alternatywą dla HSA, zapewnia skuteczną blokadę lipidów chelatujących Ni¹³ i jest zalecany do eksperymentów o wysokiej przepustowości.

1. Przygotować 10-krotny podstawowy roztwór buforowy uzupełnionego HBS zawierającego 200 mM HEPES, 7 mM Na₂HPO₄, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM glukozy, 10 mM CaCl₂ i 20 mM MgCl₂,
   UWAGA: Rozpuszczanie MgCl₂ jest wysoce egzotermiczne i grozi poparzeniem. Dodawaj tę sól powoli i w dużej objętości rozpuszczalnika. Należy unikać przygotowywania stężonych roztworów (tj. 1 M) tych soli, ponieważ mają one tendencję do wytrącania się z czasem, co utrudnia ich precyzyjne dodanie do buforu roboczego.
2. Przefiltrować 10-krotny roztwór za pomocą jednostki filtrującej 0,22 μm i utrzymywać go w sterylnej temperaturze 4 °C.
3. Na 500 ml HBS/has weź 50 ml uzupełnionego 10x roztworu HBS, w razie potrzeby dostosuj pH do 7,4 i uzupełnij objętość do 483,4 ml ultraczystą wodą.
4. Dodaj 16,6 ml 30% roztworu HSA do 483,4 ml HBS, pH 7,4.
5. Na 500 ml HBS/BSA rozpuścić 5 g BSA w HBS i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Następnie delikatnie mieszaj w temperaturze pokojowej, okresowo odwracając butelkę, aż nie będzie widocznych kryształów białka ani grudek.
6. Przefiltrować otrzymany roztwór z kroku 4.5 za pomocą jednostki filtrującej 0,22 μm (patrz tabela materiałów) i przechowywać go w temperaturze 4 °C.

5. Kalibracje gęstości białek na BSLB

1. Przed pobraniem niefunkcjonalizowanych kulek krzemionkowych o średnicy 5,00 ±0,05 μm, należy dobrze wymieszać roztwór podstawowy i ponownie zawiesić wszelkie duże grudki kulek osadzone na dnie kolb.
   UWAGA: Kulki krzemionkowe mają tendencję do szybkiego osadzania się, co może prowadzić do błędów liczenia. Mieszać energicznie, pipetując w górę i w dół połowę maksymalnej objętości mikropipety P1000.
2. Rozcieńczyć 1 μl roztworu kulek w 1 000 μl PBS, policzyć kulki za pomocą komory hemocytometru i obliczyć ich stężenie na ml.
   UWAGA: Barwienie błękitem trypanowym nie jest potrzebne do wizualizacji kulek krzemionkowych.
3. Obliczyć objętość kulek krzemionki potrzebną do uzyskania 5 ×^{10 5} końcowych BSLB na punkt miareczkowania.
4. Przenieś wymaganą objętość kulek krzemionkowych do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
5. Umyj kulki krzemionkowe trzykrotnie 1 ml sterylnego PBS, odwiruj kulki przez 15 s na mikrowirówce stołowej przy RT (przy stałej prędkości obrotowej).
   UWAGA: Podczas wyjmowania roztworu myjącego należy unikać naruszania granulki kulki. Mała kolumna buforowa nie wpłynie na rozprzestrzenianie się liposomów tworzących główną mieszankę liposomów, ponieważ znajdują się one również w PBS.
6. Przygotować trzy objętości głównej mieszanki liposomowej w celu złożenia BSLB na przemytych kulkach krzemionkowych (np. jeśli początkowa całkowita objętość kulek krzemionkowych wynosi 20 μl, należy przygotować co najmniej 60 μl głównej mieszanki liposomowej).
7. Do miareczkowania mol% Biotinyl Cap PE
   1. Przygotować główne mieszaniny lipidów zawierające 5-krotne rozcieńczenia Biotinyl Cap PE.
      1. Rozcieńczyć 0,4 mM Biotinyl Cap PE mol% w 100% matrycy DOPC.
      2. Zmieszać każdy punkt miareczkowania mol% Biotinyl Cap PE w stosunku 1:1 (obj. do obj.) z roztworem 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni) tak, aby końcowe 12,5% mol% lipidów zawierających Ni było obecne we wszystkich miareczkowaniach.
         UWAGA: 12,5% mol (obj. obj.) lipidów zawierających Ni reprezentuje mieszany skład lipidowy BSLB, na których białka znakowane Hisem mogą być również testowane w równoległych kalibracjach. Na przykład, ponieważ wszystkie stada liposomów są przygotowywane przy tym samym stężeniu molowym, aby osiągnąć docelową mieszaninę mol% w 200 μl końcowej mieszanki liposomów, wystarczy zmieszać 100 μl 25 mol% DGS-NTA zawierającego Ni ze 100 μl 100% mol% DOPC.
   2. Przenieść 5 × 10⁵ przemytych kulek krzemionki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, tak aby w każdej probówce zebrał się jeden punkt miareczkowania mol% Biotinyl Cap PE.
   3. Dodać główne mieszanki miareczkowania mol% Biotinyl Cap PE do przemytych kulek krzemionki i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół połowę całkowitej objętości. Unikaj tworzenia się pęcherzyków, które w nadmiarze niszczą dwuwarstwę lipidową.
   4. Dodaj argon (lub azot) do probówki zawierającej tworzące się teraz BSLB, aby wyprzeć powietrze i chronić lipidy przed utlenianiem podczas mieszania.
   5. Dodać argon do zapasów lipidów o stężeniu 0,4 mM przed przechowywaniem i manipulować przy użyciu sterylnej techniki.
      UWAGA: Podłącz małą rurkę do butli z argonem/azotem. Przed dodaniem gazu do rurek należy wyregulować regulator butli gazowej tak, aby ciśnienie nie było wyższe niż 2 psi. Podłącz sterylną końcówkę pipety do rurki wylotowej, aby skierować strumień gazu do wnętrza liposomu na 5 s i szybko zamknij pokrywę. W przypadku zapasów lipidów należy uszczelnić wieczko probówki folią parafinową przed przechowywaniem jej w temperaturze 4 °C.
   6. Przenieś BSLB do pionowego miksera laboratoryjnego o zmiennym kącie nachylenia (patrz tabela materiałów) i mieszaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, używając mieszania orbitalnego 10 obr./min.
      UWAGA: Ten krok zapobiegnie sedymentacji kulek podczas tworzenia podpartej dwuwarstwy lipidowej.
   7. Odwiruj kulki, wirując przez 15 s w temperaturze pokojowej na miniwirówce stołowej, a następnie przemyj trzykrotnie 1 ml HBS/HSA (BSA), aby usunąć nadmiar liposomów.
   8. Zablokuj utworzone BSLB, dodając 1 ml 5% kazeiny lub 5% BSA zawierającego 100 μM NiSO₄ w celu nasycenia miejsc NTA i 200 nM streptawidyny, aby równomiernie pokryć wszystkie miejsca zakotwiczenia biotyny na BSLB. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół połowę całkowitej objętości i inkubować w mieszalniku pionowym nie dłużej niż 20 minut przy temperaturze pokojowej i 10 obr./min.
   9. Odwiruj BSLB, wirując przez 15 s w temperaturze pokojowej na miniwirówce stołowej, a następnie umyj trzykrotnie 1 ml buforu HBS/HSA (BSA).
      UWAGA: Umyte koraliki należy przechowywać pionowo z niewielką objętością bufora do płukania zakrywającego BSLB. Unikaj odwodnienia BSLB, ponieważ powietrze zniszczy dwuwarstwę lipidową.
8. Do miareczkowania białek znakowanych His na 12,5% mol BSLB zawierających DGS-(Ni) NTA
   1. Przygotować trzy objętości głównej mieszaniny liposomów zawierającej końcowe 12,5% molowe DGS-NTA(Ni).
   2. Użyj głównej mieszanki liposomów, aby ponownie zawiesić umyte kulki krzemionki i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół połowę całkowitej objętości. Unikaj tworzenia się pęcherzyków, które w nadmiarze uszkadzają dwuwarstwę lipidową.
   3. Dodaj argon (lub azot) do probówki zawierającej tworzące się teraz BSLB, aby wyprzeć powietrze i chronić lipidy przed utlenianiem podczas mieszania.
   4. Dodaj argon do zapasów lipidów o wielkości 0,4 mM przed przechowywaniem i manipuluj przy użyciu sterylnej techniki.
   5. Przenieś BSLB do mieszalnika pionowego i mieszaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, używając mieszania orbitalnego z prędkością 10 obr./min.
   6. Odwiruj kulki, wirując przez 15 s w temperaturze pokojowej na miniwirówce stołowej, a następnie przemyj trzykrotnie 1 ml HBS/HSA (BSA), aby usunąć nadmiar liposomów.
   7. Zablokuj utworzone BSLB, dodając 1 ml 5% kazeiny (lub 5% BSA) zawierającej 100 μM NiSO₄ w celu nasycenia miejsc NTA na BSLB. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w mieszalniku pionowym nie dłużej niż 20 minut przy temperaturze pokojowej i 10 obr./min.
   8. Przemyć trzy razy za pomocą HBS/HSA (BSA) w celu usunięcia nadmiaru roztworu blokującego.
   9. Na nowej 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U przygotować 2-krotne seryjne rozcieńczenia białek.
      1. Przygotować początkowe stężenie 100 nM dla białka będącego przedmiotem zainteresowania w całkowitej objętości 200 μl buforu HBS/HSA (BSA), rozprowadzić 100 μl tego roztworu w pierwszej kolumnie, a pozostałe 100 μl na wierzchu kolumny #2 zawierającej 100 μl buforu HBS/HSA (BSA).
      2. Kontynuuj, przenosząc kolejno 100 μl z kolumny #2 do kolumny #3 i powtórz w razie potrzeby, aby pokryć wszystkie punkty miareczkowania. Pozostawić ostatnią kolumnę serii bez białka, ponieważ zostanie ona wykorzystana jako ślepa próba odniesienia do oznaczania ilościowego.
   10. Zawiesić przygotowane BSLB w objętości w taki sposób, aby 5 ×^{10 5} BSLB znajdowało się w 100 μl buforu HBS/HSA (BSA).
   11. Przenieść 100 μl zawiesiny BSLB do studzienek drugiej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U, tak aby każda studzienka otrzymała 5 × 10⁵ BSLB.
   12. Odwirować drugą płytkę zawierającą BSLB przez 2 minuty w temperaturze 300 × g i RT i odrzucić supernatant.
   13. Przenieść 100 μl objętości z płytki do miareczkowania białek na płytkę zawierającą osadzone BSLB. Delikatnie wymieszać, unikać nadmiernego wytwarzania pęcherzyków podczas pipetowania i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej i 1 000 obr./min za pomocą wytrząsarki do płytek. Chronić przed światłem folią aluminiową.
   14. Przemyć płytkę trzykrotnie buforem HBS/HSA (BSA), stosując etapy sedymentacji 300 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
   15. Jeżeli rekombinowane białko użyte w kalibracji jest bezpośrednio sprzężone z fluorochromami i ma znane wartości F/P, należy przejść do kroku 5.8.20.
   16. Jeśli rekombinowane białko użyte w kalibracji jest nieznakowane lub sprzężone z fluorochromami lub nie jest dostępny żaden wzorzec kulkowy MESF, należy użyć przeciwciał sprzężonych z Alexa Fluor 488 lub 647 o znanych wartościach F/P do barwienia BSLB pokrytego białkiem.
   17. Barwienie nasyconymi stężeniami przeciwciał kwantyfikacyjnych.
       UWAGA: W zależności od docelowego poziomu ekspresji wahają się one od 5 do 10 μg/ml.
   18. Bejcować przez 30 minut przy temperaturze obrotowej i 1 000 obr./min za pomocą wytrząsarki płytowej. Chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
   19. Przemyć dwukrotnie buforem HBS/HSA (BSA) i raz PBS, stosując etapy sedymentacji 300 × g przez 2 minuty w temperaturze RT.
       UWAGA: Użyj PBS, pH 7,4, aby ponownie zawiesić umyte BSLB przed nabyciem. Nie należy stosować zawierających białko, ponieważ prowadzi to do tworzenia się pęcherzyków podczas automatycznego mieszania próbek z próbnikami o wysokiej przepustowości.
   20. Zdobądź wzorce MESF, upewniając się, że najjaśniejsze piki pozostają w liniowym zakresie detekcji dla detektora kwantyfikacyjnego (kanału), jak pokazano na Rysunek 1B (vii).
   21. Próbki należy pobierać ręcznie lub za pomocą HTS. W przypadku korzystania z tego ostatniego należy ponownie zawiesić BSLB w 100 μl PBS i uzyskać 80 μl, stosując natężenie przepływu od 2,5 do 3,0 μl/s, objętość mieszania 100 μl (lub 50% całkowitej objętości, jeśli objętość refuzji jest mniejsza), prędkość mieszania 150 μl/s i pięć mieszanek, aby zapewnić monodyspersję BSLB.
   22. Wyeksportuj pliki FCS.
   23. Skoncentruj się na pojedynczych zdarzeniach w analizach (Rysunek 2A), ponieważ dublety lub trojaczki wprowadzą błąd w określeniu. Użyj zagnieżdżonej identyfikacji pojedynczych zdarzeń, jak wskazano w kroku 1.2.3 protokołu.
   24. Zmierz MIF każdej frakcji MESF (1-4) i odejmij MIF od pustych kulek, aby wyodrębnić skorygowane MIF (cMIF).
   25. Wykonaj analizę regresji liniowej, aby wyodrębnić nachylenie (b) MESF w stosunku do cMFI obliczonego dla standardów MESF, które zostanie użyte w kroku 5.33.
   26. Wyodrębnij MIF z każdego punktu miareczkowania i odejmij MFI z kulek bez białka, aby otrzymać cMIF.
   27. Podzielić cMIF za pomocą nachylenia obliczonego w kroku 5.31, aby wyodrębnić MESF związany z BSLB dla każdego punktu miareczkowania.
   28. Podzielić MESF związany z BSLB przez wartość F/P przeciwciała oznaczającego ilościowo, aby wyekstrahować średnią liczbę cząsteczek związanych na BSLB.
   29. Korzystając ze średnicy BSLB (5,00 ± 0,05 μm), ekstrahować powierzchnię kulki (SA = 4pr²) w celu obliczenia końcowej gęstości białka (mol/μm²) na punkt miareczkowania (stężenie białka).
   30. Wykonaj nową analizę regresji stężenia białka w stosunku do gęstości białka, aby obliczyć nachylenie (b) linii najlepszego dopasowania.
       UWAGA: Stężenie 12,5 mol% DGS-NTA(Ni) nadaje maksymalną zdolność zakotwiczenia około 10 000 molów./μm^{2 10} bez indukowania niespecyficznej aktywacji limfocytów T lub wpływu na ruchomość boczną SLB.

6. Przeprowadzanie eksperymentów z transferem synaptycznym między limfocytami T a BSLB

1. Przed uruchomieniem eksperymentu z transferem synaptycznym
   1. Zdobądź niefluorescencyjne BSLB, BSLB z fluorescencyjnymi lipidami, niebarwione komórki (lub kulki kompensacyjne; patrz Tabela materiałów) oraz jednokolorowe komórki barwione (lub koraliki kompensacyjne), aby zidentyfikować oddziaływania widma fluorescencji instrumentu. Skoncentruj się na tych detektorach, które mają wysoki rozlew rozlewania się, aby przeprojektować panel polichromatyczny, zwiększyć czułość i zmniejszyć błąd pomiaru na detektorach krytycznych (patrz ¹⁴).
   2. Miareczkowanie przeciwciał detekcji w celu znalezienia optymalnego stężenia, umożliwiającego wykrywanie zdarzeń pozytywnych bez uszczerbku dla wykrywania przeciwciał ujemnych.
      UWAGA: Powtórz ten krok za każdym razem, gdy nastąpi zmiana partii przeciwciał, ponieważ wartości F/P i jasność różnią się w zależności od partii.
   3. Opcjonalnie: Zoptymalizuj napięcia PMT, pobierając próbkę w różnych zakresach napięcia (tj. spacery napięciowe), aby znaleźć PMT prowadzące do optymalnego sygnału w stosunku do szumu (tj. separacji negatywów i dodatnich przy jednoczesnym zapewnieniu, że sygnał najjaśniejszej populacji pozostaje w zakresie liniowym).
2. Pomiar transferu wyjściowego komórek T do BSLB
   1. Przygotować suplementowany RPMI 1640 (w tym przypadku pożywkę R10) zawierający 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 μM aminokwasów endogennych, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Użyj pożywki R10 do hodowli i ekspansji limfocytów T.
   2. W dniu 1 wyizoluj limfocyty T z komór krwi obwodowej lub układu leukoredukcji (LRS). Użyj zestawów do izolacji i separacji komórek o immunogęstości (patrz tabela materiałów) do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD4 ⁺ i CD8 ⁺.
   3. Wysiewaj komórki w końcowym stężeniu w zakresie od 1,5 do 2,0 × 10⁶ komórek/ml, używając 6-dołkowych płytek o łącznej zawartości nie większej niż 5 ml na dołek.
   4. Aktywuj limfocyty T za pomocą kulek magnetycznych w stosunku 1:1 do aktywacji ludzkich limfocytów T (anty-CD3 / anty-CD28) (patrz tabela materiałów) i dodaj 100 IU rekombinowanej ludzkiej IL-2 w celu wsparcia proliferacji i przeżycia komórek.
   5. W dniu 3 usuń aktywujące kulki magnetyczne za pomocą kolumn magnetycznych (patrz Tabela Materiałów). Upewnij się, że koraliki magnetyczne pozostają przymocowane do boków rurki przed odzyskaniem komórek w celu wykonania dodatkowych etapów mycia.
   6. Umyj kulki magnetyczne jeszcze raz 5 ml świeżej pożywki R10, dobrze wymieszaj i włóż je z powrotem do magnesu. Odzyskaj tę objętość i wymieszaj z komórkami odzyskanymi w kroku 6.2.5.
   7. Ponownie zawiesić komórki na 1,5-2 × 10⁶ komórek/ml w świeżym R10 zawierającym 100 U/ml IL-2. Uzupełnić pożywkę po 48 godzinach, upewniając się, że ostatnie dodanie IL-2 nastąpiło 48 godzin przed dniem eksperymentu (dni od 7 do 14 hodowli).
   8. W dniu eksperymentu z transferem synaptycznym należy przygotować pożywkę do oznaczania transferu synaptycznego (patrz Tabela 1), uzupełniając pożywkę RPMI 1640 wolną od czerwieni fenolowej 10% FBS, 100 μM aminokwasów endogennych, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Nie należy włączać rekombinowanej ludzkiej IL-2.
   9. Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym lub wykluczenia prądem elektrycznym i ponownie je zawiesić do końcowego stężenia 2,5 × 10⁶ komórek/ml w pożywce. Jeśli obserwuje się nadmierną śmierć komórek (>10%), usuń martwe/umierające komórki za pomocą mieszaniny polisacharydu i diatrizoinianu sodu (patrz Tabela materiałów) w następujący sposób:
      1. Warstwę 15 ml hodowli komórkowej nałożyć na 13 ml roztworu ditrizoinianu polisacharydu i sodu.
      2. Wirować do 1 250 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej przy minimalnym przyspieszaniu i zmniejszaniu. Zebrać warstwę komórkową (chmurę) na granicy faz między pożywką a roztworem diatrizoinianu polisacharydu i sodu.
      3. Przemyć komórki co najmniej dwukrotnie podgrzanym roztworem do testów transferu synaptycznego (przygotowanym w kroku 6.2.7).
      4. Policz i ponownie zawieś komórki do końcowego stężenia 2,5 ×^{10 6}/ml za pomocą pożywki do testu transferu synaptycznego. Kokultura 100 μl tej zawiesiny komórek z BSLB (patrz krok 6.2.15).
   10. Obliczyć liczbę BSLB potrzebnych do eksperymentu; należy wziąć pod uwagę wszystkie różne główne mieszanki białek i miareczkowanie antygenów, które mają być badane (albo biotynylowane monomery peptydowe HLA/MHC, albo monobiotynylowany anty-CD3ε Fab).
   11. Złóż BSLB, wykonując te same kroki z sekcji 5 protokołu, ale tym razem połącz wszystkie miareczkowania białek i lipidów wymagane do odtworzenia złożonej błony APC (Rysunek 3A). Zachowaj te same zależności objętościowo-objętościowe między początkową objętością kulek krzemionki a objętością mieszanki białkowej użytej podczas kalibracji, a także czasy i temperatury używane do ładowania BSLB. Na przykład, jeśli do wstępnej kalibracji użyto 0,5 μl kulek krzemionki / studzienki i 100 μl / studzienki mieszanki białkowej, utrzymuj proporcje 5: 1 000 obj. i obj., aby przygotować BSLB do kohodowli z limfocytami T.
   12. Po załadowaniu BSLB mieszanką białkową, która Cię interesuje, przemyj je dwukrotnie HBS/HSA (BSA), aby usunąć nadmiar niezwiązanych białek. Stosować prędkość sedymentacji 300 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej na każdym etapie płukania i odrzucić supernatanty.
   13. Zawiesić 5 × 10⁵ BSLB na studzienkę w 200 μl.
   14. Przenieś 100 μl na studzienkę na nową 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U, aby uzyskać duplikat, tak aby ostateczna ilość BSLB na studzienkę wynosiła 2,5 × 10⁵.
   15. Odkręcać BSLB o masie 300 × g przez 2 minuty i RT, a następnie wyrzucić supernatant.
   16. Zawiesić BSLB za pomocą 100 μl zawiesiny limfocytów T; delikatnie wymieszać, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków.
   17. Inkubować kokultury przez 90 minut w temperaturze 37 °C.
       UWAGA: Alternatywnie, komórki i kulki można ponownie zawiesić w buforze HBS/HSA (BSA) zamiast RPMI wolnego od fenolu i czerwieni dla kokultury. W takim przypadku inkubację należy przeprowadzić w inkubatorze innym niż CO_{2 ,} ponieważ gaz ten szybko zakwasi bufor przy braku wodorowęglanu.
   18. Schłodzić kokultury komórek BSLB-T, najpierw inkubując komórki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut. Chronić je przed światłem.
   19. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy stężeniu 500 × g i temperaturze pokojowej; odrzucić supernatant.
   20. Ponownie zawiesić komórki w RT 2% BSA-PBS (wolne od Ca²⁺ i Mg²⁺) w celu zablokowania. Umieść komórki na lodzie na 45 minut. Chronić przed światłem.
   21. Podczas inkubacji komórek przygotuj główną mieszankę przeciwciał, używając lodowatego filtra 0,22 μm 2% BSA w PBS jako buforu barwiącego, który zapewni dodatkowe blokowanie.
       UWAGA: Niektóre partie przeciwciał sprzężonych z barwnikami Brilliant Violet mają tendencję do niespecyficznego wiązania się z BSLB. Blokowanie za pomocą 5% BSA-PBS pomaga zredukować ten szum. Od teraz upewnij się, że łańcuch chłodniczy nie zostanie przerwany.
   22. Wirować kokultury w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przed wyrzuceniem supernatantów należy na krótko upewnić się, że osad jest obecny, sprawdzając spód płytki 96-dołkowej za pomocą podświetlenia.
   23. Za pomocą pipety wielokanałowej ponownie zawiesić komórki w mieszance wzorcowej barwienia zawierającej zoptymalizowane stężenia przeciwciał.
       UWAGA: Używaj końcówek do pipet bez filtra, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza i błędom w rozkładzie objętości barwienia.
   24. Uwzględnij komórki znakowane izotypem i BSLB, fluorescencyjne i niefluorescencyjne BSLB oraz komórki i BSLB barwione samodzielnie. Przestrzegaj całkowitej liczby zdarzeń na basenik dla wszystkich kontrolnych (tj. tylko BSLB zawierających 5 ×^{10 5} BSLB/basenik i tylko kontrole komórek zawierających 5 × 10⁵ komórek/basenik, aby uniknąć względnego wzrostu przeciwciał na zabarwione zdarzenie).
   25. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół połowę objętości i inkubować przez 30 minut na lodzie. Chronić przed światłem.
   26. Umyć komórki i BSLB dwukrotnie, używając lodowatego 2% BSA-PBS, pH 7,4 i etapów sedymentacji 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić umyte kokultury w 100 μl PBS i natychmiast uzyskać.
   27. Jeśli potrzebne jest utrwalenie, utrwal za pomocą 0,5% w/v PFA w PBS przez 10 minut, umyj raz i trzymaj w PBS do momentu nabycia. Chronić przed światłem.
   28. Przed kompensacją należy uzyskać standardy MESF, zapewniając, że zarówno najciemniejsze, jak i najjaśniejsze populacje mieszczą się w liniowym zakresie pomiaru.
   29. Pobierz próbki kompensacji, oblicz kompensację i zastosuj macierz kompensacji (link) do eksperymentu.
   30. Zdobądź i zapisz co najmniej 2 ×^{10 4} łącznych wzorców MESF dla każdego z kanałów kwantyfikacji.
   31. W przypadku akwizycji za pomocą próbników o wysokiej przepustowości należy ustawić akwizycję przyrządów na standardową, ustawić akwizycję próbki na 80 μl (lub 80% całkowitej objętości), natężenie przepływu próbki między 2,0 a 3,0 μl/s, objętość mieszania próbki 50 μl (lub 50% całkowitej objętości, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków podczas mieszania), mieszanie próbki 150 μl/s, i mieszanie na studzienkę od 3 do 5.
   32. Zdobądź co najmniej 1 × 10⁴ pojedynczych BSLB na próbkę (patrz Rysunek 3B panele (i)-(vi) dla referencyjnej strategii bramkowania).
   33. Umyj cytometr działający przez 5 minut roztworem czyszczącym, a następnie 5 minut ultraczystej wody przed wyłączeniem instrumentu. Jeśli korzystasz z HTS, postępuj zgodnie z opcjami na karcie HTS i opcji Wyczyść.
   34. Eksport plików FCS.

7. Pomiar transferu synaptycznego cząstek do BSLB

1. Otwórz pliki FCS eksperymentu. Wybierz populację komórek i BSLB na podstawie ich bocznych i przechodzących obszarów rozpraszania światła (SSC-A kontra FSC-A), jak pokazano w Rysunek 3B (i).
2. Wybierz zdarzenia w oknie ciągłej akwizycji (Rysunek 3B (ii)).
3. Skoncentruj się na pojedynczych zdarzeniach zarówno komórek, jak i BSLB; najpierw zidentyfikuj pojedyncze komórki na podstawie niskiego W w bramkach sekwencyjnych FSC-W/FSC-H (singlets-1, Rysunek 3B panel (iii)) i SSC-W/SSC-H (singlets-2; Rysunek 3B panel (iv)). Zdefiniuj dodatkową bramkę singlets-3, wybierając zdarzenia z proporcjonalnymi FSC-A i FSC-H (Rysunek 3B, panel (v)).
4. Ekstrahować MFI z frakcji MESF w stanie ślepej próby i od 1 do 4 oraz z pojedynczych komórek i MESF dla każdej próbki doświadczalnej.
5. Generowanie skorygowanych wartości MIF (cMFI) dla frakcji MESF od 1 do 4, odejmując MFI populacji ślepych kulek od każdej frakcji.
6. Wygeneruj cMFI dla pojedynczych BSLB i komórek (patrz Rysunek 3C panel (i)).
7. Użyj sygnału z BSLB wybarwionego przeciwciałami kontrolnymi izotypu, aby skorygować MFI BSLB wybarwionego przeciwciałami przeciwko odpowiednim markerom limfocytów T. Użyj cMFI, aby obliczyć znormalizowany procent transferu synaptycznego (NST%) za pomocą równania pokazanego w Rysunek 3C panel (ii).
8. Jeśli zamiast tego interesują Cię cząstki specyficznie przenoszone w odpowiedzi na wyzwolenie TCR, odejmij sygnał z zerowych BSLB od MFI agonistycznych BSLB. Użyj tego cMFI do obliczenia NST% sterowanego przez TCR, korzystając z równania pokazanego w Rysunek 3C panel (ii).
9. Jeśli jesteś zainteresowany określeniem całkowitej liczby cząsteczek przenoszonych jako ładunek cząstek przez granicę faz limfocytów T-BSLB, zdobądź kulki wzorcowe MESF przy użyciu tych samych ustawień przyrządu i sesji akwizycji dla kokultur limfocytów T-BSLB.
10. Przeanalizuj populacje ściegów MESF i wyodrębnij ich cMFI, jak wskazano w krokach protokołu od 5.8.15 do 5.8.17. Oblicz nachylenie linii najlepszego dopasowania dla analizy regresji MESF nad cMFI.
11. Użyj obliczonego nachylenia, aby wyodrębnić liczbę MESF zdeponowanych na BSLB. Użyj cMFI obliczonych przy użyciu kontrolek izotypu lub zerowego BSLB jako ślepych miejsc, aby wyodrębnić liczbę MESF przeniesionych specjalnie do stymulujących BSLB.
12. Obliczyć liczbę cząsteczek markerów przeniesionych do BSLB, dzieląc obliczone (średnie) MESF na BSLB przez wartość F/P przeciwciała do oznaczania ilościowego.

Wyniki

FCM do bezwzględnej kwantyfikacji białka na powierzchni komórki
Rekonstytucja BSLB prezentująca fizjologiczne gęstości ligandów wymaga oszacowania całkowitej gęstości białek w modelowanym podzbiorze komórek. Aby odtworzyć BSLB, należy uwzględnić wszelkie istotne ligandy, które mają odgrywać rolę w interesującej nas osi sygnalizacyjnej, wraz z białkami wspierającymi adhezję i funkcjonalną interakcję między BSLB a komórkami, takimi jak ICAM-1 i cząsteczki kostymulujące, np. receptory CD40, CD58 i B7 (C...

Dyskusja

BSLB są wszechstronnymi narzędziami do badania emisji cząstek stałych przez limfocyty T stymulowane przez modelowe błony APC. Elastyczność metody pozwala na odtworzenie złożonych i redukcjonistycznych kompozycji błonowych w celu zbadania wpływu ligandów i ich sygnałów na wydzielanie tSV i supramolekularnych cząstek atakujących oraz ich składników. Przetestowaliśmy tę technologię na różnych limfocytach T, w tym wstępnie aktywowanych limfocytach T, CTL, Tregs i CART¹⁵. Protokół ten działa również do...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-[(Kwas N-(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacet)sukcynylo] (sól niklu)	Avanti Polar Lipids	790404C-25mg	18:1 DGS-NTA(Ni) w chloroformie
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µ L	Gilson	FA10011
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina	Avanti Polar Lipids	850375C-25mg	18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC) w chloroformie
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DOPE) ATTO 390	ATTO-TEC	AD 390-165	DOPE ATTO 390
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DOPE) ATTO 488	ATTO-TEC	AD 488-165	DOPE ATTO 488
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DOPE) ATTO 565	ATTO-TEC	AD 565-165	DOPE ATTO 565
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(kap biotynyl) (sól sodowa)	Avanti Polar Lipids	870273C-25mg	18:1 Biotinyl Cap PE w chloroformie
200 &mikro; L żółte końcówki 10 x 96 Końcówki, Stos	Starlab	S1111-0206
mL polistyrenowe probówki okrągłodenne	Falcon®
5,00 ± 0,05 &mikro; m niefunkcjonalizowane kulki krzemionkowe	Bangs Laboratories Inc.
96-dołkowa płytka do hodowli komórek U-bottom z pokrywką, poddana hodowli tkankowej, niepirogenna.	Costar®	3799	Do barwienia FCM i kohodowli BSLB i komórek.
96 Płytka do hodowli komórek dołkowych V-bottom z pokrywką, hodowla tkankowa poddana obróbce, nie pirogenna.	Costar®	3894	Do barwienia FCM komórek lub kulek w zawiesinie.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (ester sukcynimidylu)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester sukcynimidylu)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 i A20006
Wirówka Allegra X-12R	Beckman Coulter		Do normalnego barwienia w probówce próbek biologicznych do
folii aluminiowej	Dowolna marka		Do ochrony komórek i BSLB przed światłem
anty-ludzkim CD154 (CD40L), klonuj odpowiednio 24-31	BioLegend	310815 i 310818	koniugaty Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 647.
anty-ludzki CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, klon J252D4	BioLegend	356934	Do ilościowej analizy FCM komórek migdałków, jak pokazano na ryc. 1E
anty-ludzki CD19 Brilliant Violet 421, klon HIB19	BioLegend	302234	Do ilościowej analizy FCM komórek migdałków, jak pokazano na ryc. 1E
anty-ludzki CD2, klon RPA-2.10	BioLegend	300202	Oznaczone w domu Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anty-ludzki CD2, klon TS1/8	BioLegend	309218	koniugatem Brilliant Violet 421.
anty-ludzki CD252 (OX40L), klon 11C3.1	BioLegend		Alexa Fluor 647 koniugat
anty-ludzki CD28, klon CD28.2	eBioscience	16-0289-85	Oznaczony w domu Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anty-ludzki CD317 (BST2, PDCA-1), klon 26F8	ThermoFisher Scientific, invitrogen	53-3179-42	Alexa Fluor 488 koniugat, stwierdziliśmy, że ten klon jest czystszy niż klon RS38E.
anty-ludzki CD38, klon HB-7	BioLegend	356624	Alexa Fluor 700 koniugat
anty-ludzki CD38, klon HIT2	BioLegend	303514	Alexa Fluor 647 koniugat
anty-ludzki CD39, klon A1	BioLegend		Oznakowany w domu Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anty-ludzki CD4 Brilliant Violet 650, klon OKT4	BioLegend	317436	Do ilościowej analizy FCM komórek migdałków, jak pokazano na ryc. 1E
anty-ludzkiego CD4, klonu A161A1	BioLegend	357414 i 357421	koniugatów PerCP/Cyjanine5.5 i Alexa Fluor 647, odpowiednio
anty-ludzkiego CD4, klonu OKT4	BioLegend	317414 i	koniugatów 317422 PE/Cy7 i Alexa Fluor 647, odpowiednio
anty-ludzkiego CD40, klonu 5C3	BioLegend	334304	Oznaczone we własnym zakresie za pomocą Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anty-ludzkiego CD40, klon G28.5	BioLegend		Oznaczone w domu Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anty-human CD45, klon HI30	BioLegend	304056 i 368516	koniugaty Alexa Fluor 647 i APC/Cy7
anty-ludzkie CD47, klon CC2C6	BioLegend	323118	koniugat
Alexa Fluor 647anty-ludzki CD54 (ICAM-1), klon HCD54	BioLegend	322702	Oznakowany w domu z Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anty-ludzki CD63 (LAMP-3), klon H5C6	BioLegend	353020 i	koniugaty 353015 PerCP/Cyjanine5.5 i Alexa Fluor 647, odpowiednio
anty-ludzki CD73, klon AD2	BioLegend	344002	Znakowany we własnym zakresie za pomocą Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anty-ludzki CD80, klon 2D10	BioLegend	305216	koniugat Alexa Fluor 647
anty-ludzki CD81, klon 5A6	BioLegend	349512 i	koniugat 349502 PE/Cy7 i znakowane w domu odpowiednio za pomocą Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester).
anty-ludzki CD82, klon ASL-24	BioLegend	342108	Alexa Fluor 647 koniugat
anty-ludzki CD86, klon IT2.2	BioLegend	305416	Alexa Fluor 647 koniugat
anty-ludzki CD8a, klon HIT8a	BioLegend	300920	Alexa Fluor 700 koniugat
anty-ludzki CD8a, klon SK1	BioLegend	344724	Alexa Fluor 700 koniugat
anty-ludzki HLA-A/ B/C/E, klon w6/32	BioLegend	311414 i	koniugat 311402 Alexa Fluor 647 i oznaczone w domu odpowiednio z Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anty-ludzkim HLA-DR, klonem L243	BioLegend	307656 i 307622	koniugatami Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 647.
anty-ludzki ICAM-1, klon HCD54	BioLegend	322702	Oznaczony w domu z Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anty-ludzki ICOS, klon C398.4A	BioLegend	313516	Chomik ormiański IgG
anty-ludzki ICOSL, klon MIH12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 sprzężony
anty-ludzki ICOSL, klon MIH12	eBioscience	16-5889-82	Oznaczone we własnym zakresie Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anty-ludzki LFA-1, klon TS1/22	BioLegend	Wyprodukowane we własnym	Oznaczone we własnym zakresie z Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anty-ludzki OX40, klon Ber-ACT35 (ACT35)	BioLegend	350018	Alexa Fluor 647 koniugat
anty-ludzki PD-1 , klon EH12.2H7	BioLegend	135230 i 329902	Koniugat Alexa Fluor 647 i oznakowany w domu z Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anty-ludzki PD-L1, klon 29E.2A3	BioLegend	329702	Oznakowany w domu z Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anty-ludzki PD-L2, klon 24F.10C12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 koniugat
anty-ludzki PD-L2, klon MIH18	BioLegend	345502	Oznaczone odpowiednio antyludzkim TCRab Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester),
klonem IP26	BioLegend	306712 i 306714	koniugatami Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 647.
antti-ludzki CD156c (ADAM10), klon SHM14	BioLegend	352702
antti-ludzki CD317 (BST2, Tetherin), klon RS38E	BioLegend	348404	Alexa Fluor 647 koniugat
Chomik ormiański IgG Alexa Fluor 647 Kontrola izotypu, klon HTK888	BioLegend	400902	Oznakowany w domu z Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Konfiguracja i śledzenie koralików	Becton Dickinson & Firma (BD)	641319	Ścieżka wyników instrumentów przed ilościowym FCM
BD FACSDiva	Becton Dickinson & Firma (BD)	23-14523-00	Oprogramowanie do akwizycji
Albumina seum bydlęcego	Merck, Sigma-Aldrich	A3294
CaCl2, Chlorek wapnia	Merck, Sigma-Aldrich	C5670	bezwodny, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórek owadów, odpowiedni do hodowli komórek roślinnych, ≥ 96,0%
Kazeina z mleka krowiego, odpowiednia jako substrat dla kinazy białkowej (po defosforylacji), oczyszczony proszek	Merck, Sigma-Aldrich	C5890
Dynabeads Ludzki aktywator T CD3/CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321D	Do usuwania Dynabeads Ludzki aktywator T CD3/CD28 w objętościach mniejszych niż 2 ml
DynaMag™-15	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301D	Do usuwania Dynabeads&handel; Ludzki aktywator T CD3/CD28 w objętościach mniejszych niż 15 ml
Kwalifikowana płodowa surowica bydlęca, One Shot	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Wymaga inaktywacji termicznej przez 30 minut przy 56 oC
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva, GE Healthcare	GE17-1440-02	Sterylny roztwór polisacharydu i ditrizoinu sodu do izolacji limfocytów
Utrwalany barwnik żywotności eFluor 780	eBiosciences	65-0865-14	Do wykluczenia martwych komórek podczas analiz
FlowJo	Becton Dickinson & Firma (BD)	Wersja 10.7.1	Oprogramowanie analityczne
Grant Bio MPS-1 Wytrząsarka wielopłytkowa	Keison Products	MPS-1	Do mieszania komórek podczas barwienia lub BSLB podczas stanowania lub ładowania białka (jako alternatywa dla mieszania orbitalnego)
Roztwór buforowy HEPES (1 M)	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-056
HEPES, kwas N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N′-(2-etanosulfonowy), kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy.	Merck, Sigma-Aldrich	H4034	Do przygotowania buforu HBS/HAS lub HBS/BSA. Certyfikat BioPerformance, ≥ 99,5% (miareczkowanie), nadaje się do hodowli komórkowych
Inkubator HERACell 150i CO2, 150 l, elektropolerowana stal nierdzewna	ThermoFisher Scientific	51026282	Do hodowli i namnażania oczyszczonych limfocytów T CD4+ i CD8+.
Mikser Hula® Mieszalnik próbek	ThermoFisher Scientific, Life Technologies	15920D	Pionowy mieszalnik laboratoryjny o zmiennym kącie nachylenia stosowany do mieszania BSLB i głównej mieszanki lipidowej, roztworów blokujących, mieszanki białkowej i barwienia przeciwciał na małą skalę.
Albumina surowicy ludzkiej, 30% roztwór wodny	Merck, Sigma-Aldrich	12667-M
Ludzki roztwór blokujący receptor Fc TruStain FcX	BioLegend	422302	Roztwór blokujący receptor Fc do blokowania receptorów Fc z biologicznie istotnych próbek
Licznik i analizator komórek Innovatis CASY TT	Biovendis Products GmbH		Do zliczania komórek oraz określania wielkości i objętości komórek na podstawie wykluczenia prądu elektrycznego.
KCl, Chlorek potasu	Merck, Sigma-Aldrich	P5405	Proszek, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
L-Glutamina 200 mM (100x)	ThermoFisher Scientific, Gibco	25030-024
MgCl2, Chlorek Magessium	Merck, Sigma-Aldrich	M2393	BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych, odpowiedni do hodowli komórek owadów
Wkładka mikroprobówki do 24 x 1,5/2,0 ml rurki	Keison Products	P-2-24	Wkładka mikroprobówkowa do mini inkubatora Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
	Labnet International	I5110A-230V	Do inkubacji (kohodowli) BSLB i komórek pod nieobecność CO2
Minimum Niezbędne pożywki Aminokwasy endogenne	ThermoFisher Scientific, Gibco	11140-035
Mysie przeciwciała poliklonalne IgG do kontroli	Merck, Sigma-Aldrich	PP54	Stosowany jako kontrola pozytywna do pomiaru przeciwciał związanych z mysimi wzorcami
kulek wychwytu IgGMysz IgG1, izotyp k, klon MOPC-21	BioLegend	400129, 400112, 400130, 400144, 400128 i 400170	Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 i Brilliant Violet 785  koniugaty.
Mysz IgG1, k Isotype, klon X40	Becton Dickinson & Firma (BD), Horizon	562438	Sprzężony fiolet brylantowy 421.
Mysz IgG1, κ Kontrola izotypu, klon P3.6.2.8.1	eBioscience	14-4714-82	Oznaczone w domu odpowiednio koniugatami Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
IgG2a, k Isotype, klon MOPC-173	BioLegend	400240	Alexa Fluor 647 koniugat
myszy IgG2b, k Isotype, klon MPC-11	BioLegend	400330 i 400355	koniugatami
Alexa Fluor 647 i Brilliant Violet 785Multiwell 6 dołków Hodowla tkankowa traktowana próżniowym osoczem gazowym	Falcon	353046	Do hodowli i namnażania oczyszczonych limfocytów T CD4+ i CD8+.
Na2HPO4, Fosforan disodowy	Merck, Sigma-Aldrich	S7907
NaCl, Chlorek sodu	Merck, Sigma-Aldrich	S5886	Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórek, odpowiedni do hodowli komórek owadów, odpowiedni do hodowli komórek roślinnych, ≥ 99%
NiSO4, siarczan niklu(II)	Merck, Sigma-Aldrich	656895	Do nasycania miejsc NTA; dodawane podczas procesu blokowania
Penicylina Streptomycyna [+]10 000 jednostek Penicylina; [+] 10 000 &mikro; g/ml Streptomycyny	ThermoFisher Scientific, Gibco	15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4, sterylna	ThermoFisher Scientific, Gibco	10010	No Ca2+ lub Mg2+ dodana
jednostka filtrująca z polieterosulfonu (PES)	Thermo Scientific Nalgene	UY-06730-43	Hydrofilowa membrana PES o niskim wiązaniu z białkami ułatwia filtrowanie roztworów o wysokiej zawartości białka
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar	BOC Sp. z o.o.	11-Y	Do ochrony zapasów lipidów przechowywanych w temperaturze +4 °C.
Oczyszczona streptawidyna	BioLegend	280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF Koraliki	Bangs Laboratories Inc.	488	Koraliki wzorcowe do interpolacji cząsteczek Alexa Fluor 488 związanych z komórkami i/lub
kulek BSLB Quantum Alexa Fluor 647 MESF	Bangs Laboratories Inc.	647	Koraliki wzorcowe do interpolacji cząsteczek Alexa Fluor 647 związanych z komórkami i/lub
BSLB Rat anty-mysi łańcuch świetlny IgG Kappa, klon OX-20	ThermoFisher Scientific, invitrogen	SA1-25258	Oznaczone w domu Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Rekombinowany ludzki IL-2	Peprotech	200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamina	ThermoFisher Scientific, Gibco	31870-025
Rozeta Koktajl wzbogacający ludzkie komórki B	STEMCELL Technologies	15064	Izolacja limfocytów B do pomiaru gęstości białek w oczyszczonych populacjach komórek
Rozeta Ludzki koktajl wzbogacający limfocyty T CD4 +	STEMCELL Technologies	15022C.1
Rozeta Ludzka CD4 + CD127 Koktajl wzbogacający limfocyty T o niskiej zawartości komórek T	STEMCELL Technologie	15361	Wstępne wzbogacenie limfocytów T CD4 + CD127Low do dalszej izolacji Treg przez FACS.
Rozeta Ludzka CD8+ Koktajl wzbogacający limfocyty T	STEMCELL Technologies	15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red	ThermoFisher Scientific, Gibco	11835-063	Do inkubacji (kohodowli) BSLB i komórek pod nieobecność CO2. Pożywka wolna od czerwieni fenolowej zmniejsza autofluorescencję komórek w pomiarach opartych na cytometrii przepływowej i mikroskopii.
Pirogronian sodu (100 mM)	ThermoFisher Scientific, Gibco	11360-070
Mini wirówka kiełkowa	FisherScientific, Heathrow Scientific LLC	120301	Mikrowirówka stołowa służąca do mycia kulek krzemionkowych i BSLB w probówkach Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.
Sterylne probówki okrągłodenne z polistyrenu o pojemności 5 ml	Falcon	352058
UltraComp eBeads Koraliki kompensacyjne	ThermoFisher Scientific, invitrogen	01-2222-42
Kolumny odsalające Zeba Spin 7K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	Numer katalogowy: 89882