Method Article

Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością

DOI:

10.3791/63131

⸱

November 4th, 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, ETH Zurich, 2Department of Materials, ETH Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy technologię, która wykorzystuje wspomagany kapilarność montaż w platformie mikroprzepływowej do modelowania mikroobiektów zawieszonych w cieczy, takich jak bakterie i koloidy, w określone tablice na podłożu z polidimetylosiloksanu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrolowane tworzenie wzorów mikroorganizmów w określonych układach przestrzennych oferuje unikalne możliwości dla szerokiego zakresu zastosowań biologicznych, w tym badań nad fizjologią i interakcjami mikroorganizmów. Na najprostszym poziomie, dokładne wzorce przestrzenne mikroorganizmów umożliwiłyby wiarygodne, długoterminowe obrazowanie dużej liczby pojedynczych komórek i zwiększyłyby możliwości ilościowego badania zależnych od odległości interakcji między mikroorganizmami. Co bardziej wyjątkowe, sprzężenie dokładnych wzorców przestrzennych i pełnej kontroli nad warunkami środowiskowymi, jakie oferuje technologia mikroprzepływowa, zapewniłoby potężną i wszechstronną platformę do badań pojedynczych komórek w ekologii drobnoustrojów.

Ten artykuł przedstawia platformę mikroprzepływową do tworzenia wszechstronnych i zdefiniowanych przez użytkownika wzorów mikroorganizmów w kanale mikroprzepływowym, umożliwiając pełny dostęp optyczny dla długoterminowego, wysokoprzepustowego monitorowania. Ta nowa technologia mikroprzepływowa opiera się na kapilarnym składaniu cząstek i wykorzystuje siły kapilarne powstające w wyniku kontrolowanego ruchu parującej zawiesiny wewnątrz kanału mikroprzepływowego do osadzania pojedynczych mikroobiektów w szeregu pułapek mikrowytwarzanych na podłożu z polidimetylosiloksanu (PDMS). Osadzanie sekwencyjne generuje pożądany układ przestrzenny jednego lub wielu typów obiektów o rozmiarach mikro, podyktowany wyłącznie geometrią pułapek i kolejnością napełniania.

Platforma została skalibrowana przy użyciu cząstek koloidalnych o różnych wymiarach i materiałach: okazała się potężnym narzędziem do generowania różnorodnych wzorów koloidalnych i funkcjonalizacji powierzchni uwięzionych cząstek. Ponadto platforma została przetestowana na komórkach mikrobiologicznych, wykorzystując komórki Escherichia coli jako bakterię modelową. Tysiące pojedynczych komórek zostało wymodelowanych na powierzchni, a ich wzrost był monitorowany w czasie. W tej platformie sprzężenie osadzania pojedynczych komórek i technologii mikroprzepływowej umożliwia zarówno geometryczne wzorce mikroorganizmów, jak i precyzyjną kontrolę warunków środowiskowych. Otwiera to tym samym okno na fizjologię pojedynczych drobnoustrojów i ekologię interakcji mikroorganizm-mikroorganizm, jak wykazały wstępne eksperymenty.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przestrzenne wzorcowanie pojedynczych mikroorganizmów, szczególnie w obszarach eksperymentalnych, które umożliwiają pełną kontrolę nad warunkami środowiskowymi, takich jak urządzenia mikroprzepływowe, jest wysoce pożądane w szerokim zakresie kontekstów. Na przykład, układanie mikroorganizmów w regularne tablice pozwoliłoby na dokładne obrazowanie dużej liczby pojedynczych komórek i badanie ich wzrostu, fizjologii, ekspresji genów w odpowiedzi na bodźce środowiskowe, i podatność na leki. Pozwoliłoby to również na badanie interakcji komórka-komórka, które są szczególnie interesujące w badaniach nad komunikacją komórkową (np. quorum sensing), karmieniem krzyżowym (np. symbioza glonów i bakterii) lub antagonizmem (np. allelopatia), z pełną kontrolą nad lokalizacją przestrzenną komórek względem siebie. Badania nad fizjologią i ewolucją komórek1, badania interakcji komórka-komórka2, badania przesiewowe różnicowania fenotypowego3, monitoring środowiskowy4, oraz badania przesiewowe leków5 należą do dziedzin, które mogą znacznie skorzystać z technologii zdolnej do przeprowadzenia takiej ilościowej analizy pojedynczej komórki.

W ostatnich latach zaproponowano kilka strategii izolowania i obsługi pojedynczych komórek, od holograficznych pułapek optycznych6 i heterogenicznych metod funkcjonalizacji powierzchni7,8,9,10 do jednokomórkowych chemostatów11 i mikrofluidyki kropelkowej12. Metody te są albo bardzo wymagające technicznie, albo wpływają na fizjologię komórki i nie zapewniają wysokoprzepustowej platformy do modelowania drobnoustrojów, które można badać przez długi czas, zapewniając rozdzielczość pojedynczej komórki, pełny dostęp optyczny i kontrolę nad warunkami środowiskowymi. Celem tego artykułu jest opisanie platformy do modelowania bakterii z mikrometryczną precyzją w określonych układach przestrzennych na powierzchni PDMS poprzez montaż wspomagany kapilarnie. Platforma ta umożliwia precyzyjne i elastyczne przestrzenne wzorcowanie mikroorganizmów oraz umożliwia pełny dostęp optyczny i kontrolę nad warunkami środowiskowymi, dzięki swojej mikroprzepływowej naturze.

Technologia stojąca za tą platformą to opracowana w ostatnich latach technologia montażu, nazwana sCAPA13,14,15 (sekwencyjny montaż cząstek wspomagany kapilarnością), który został zintegrowany z platformą mikroprzepływową16. Menisk parującej kropli cieczy, cofając się nad wzorzystym substratem z polidimetylosiloksanu (PDMS) wewnątrz kanału mikroprzepływowego, wywiera siły kapilarne, które zatrzymują poszczególne cząstki koloidalne zawieszone w cieczy w mikrometrycznych studzienkach mikrowytwarzanych na podłożu (Rysunek 1A). Zawieszone cząstki są najpierw transportowane do granicy faz powietrze-ciecz za pomocą prądów konwekcyjnych, a następnie umieszczane w pułapkach za pomocą kapilaryzacji. Siły kapilarne wywierane przez poruszającą się łąkotkę działają na większą skalę w porównaniu z siłami biorącymi udział w oddziaływaniach cząstek.

Tak więc, na mechanizm montażu nie ma wpływu materiał, wymiary i właściwości powierzchni cząstek. Parametry takie jak stężenie cząstek, prędkość menisku, temperatura i napięcie powierzchniowe zawiesiny są jedynymi parametrami, które wpływają na wydajność procesu modelowania. Szczegółowy opis wpływu w/w parametrów na proces tworzenia wzorców czytelnik znajdzie w13,14,15. W oryginalnej technologii sCAPA13,14,15, proces tworzenia wzoru koloidalnego został przeprowadzony w systemie otwartym i wymagał bardzo precyzyjnego stopnia piezoelektrycznego do prowadzenia zawieszenia po szablonie. Platforma ta wykorzystuje inną strategię i umożliwia tworzenie wzorów za pomocą standardowego sprzętu powszechnie stosowanego w mikrofluidyce w kontrolowanym środowisku, minimalizując w ten sposób ryzyko zanieczyszczenia próbek.

Ta platforma mikroprzepływowa została najpierw zoptymalizowana na cząstkach koloidalnych, aby stworzyć regularne tablice cząstek obojętnych, a następnie z powodzeniem zastosowana do bakterii. Obie platformy mikroprzepływowe są opisane w tym artykule (Rysunek 1B,C). Większość etapów przygotowawczych i sprzętu eksperymentalnego opisanego w protokole jest wspólna dla obu zastosowań (Rysunek 2). Przedstawiamy wzór koloidalny, aby pokazać, że technika ta może być używana do wykonywania wielu sekwencyjnych osadzania na tej samej powierzchni w celu tworzenia złożonych, wielomateriałowych wzorów. W szczególności na każdym etapie osadzano pojedynczą cząstkę na pułapkę, tworząc układy koloidalne o określonej geometrii i składzie, podyktowane wyłącznie geometrią pułapek i kolejnością napełniania. Jeśli chodzi o wzorzec bakteryjny, opisano pojedyncze osadzania, w wyniku których jedna bakteria jest osadzana w jednej pułapce. Gdy komórki są wzorowane na powierzchni, kanał mikroprzepływowy jest przepłukiwany pożywką w celu pobudzenia wzrostu bakterii, co jest wstępnym etapem każdego badania jednokomórkowego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie wzorca krzemowego

UWAGA: Szablony PDMS zawierające mikrofabrykowane pułapki, które tworzą szablon do koloidalnego i mikrobiologicznego wzorcowania, zostały wykonane zgodnie z metodą wprowadzoną przez Geisslera i wsp.17. Krzemowy wzorzec został przygotowany za pomocą konwencjonalnej litografii w pomieszczeniu czystym. Zapoznaj się z poniższymi krokami, aby zapoznać się z procedurą i tabelą materiałów dla sprzętu.

  1. Projektuj funkcje za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD).
  2. Przygotuj maskę ze szkła chromowego z warstwą dodatniego fotorezystu, naświetlając zaprojektowane cechy za pomocą bezpośredniego lasera nagrywającego UV.
    1. Opracuj maskę ze szkła chromowego za pomocą wywoływacza wirowego za pomocą wywoływacza o stosunku fotorezystu do wody 1:4 przez 15 s.
    2. Zanurz maskę w wytrawiaczu chromowym na 50 s.
    3. Obróbka plazmowa 10 cm płytki krzemowej przez 3 minuty przy mocy 600 W.
    4. Osadzać parę na warstwę heksametylodizylu i piec w temperaturze 110 °C, aby poprawić przyczepność do fotorezystu.
    5. Umieść warstwę fotorezystu na 4 500 × g na 2 min.
    6. Wystaw element na działanie promieniowania UV przez maskę ze szkła chromowanego za pomocą wyrównywacza maski przez 2 sekundy i wywołaj za pomocą wywoływacza, tak jak w przypadku maski.
  3. Aby zakończyć wytwarzanie wzorca krzemowego, wytrawić płytkę za pomocą głębokiej reaktywnej wymiany jonowej, dostosowując czas trawienia (<2 min), aby osiągnąć żądaną głębokość (mierzoną za pomocą profilometru).

2. Przygotowanie formy mikrokanałowej

  1. Zaprojektuj kanał za pomocą oprogramowania CAD i pokrój go za pomocą oprogramowania slicer, aby przekształcić zaprojektowany model w instrukcje dla drukarki 3D, ustawiając odległość krojenia na 0,05 mm.
  2. Wydrukuj kanał za pomocą drukarki 3D przez ~1 h.
  3. Umyj i utwardź formę w dedykowanej maszynie do utwardzania i mycia.
    1. Umieść formę w pojemniku wypełnionym czystym alkoholem izopropylowym (IPA) i zmieszaj płyn (myj przez 20 min). Wyjmij pojemnik wypełniony IPA z maszyny.
    2. Po wyjęciu umytej formy z pojemnika IPA włóż ją z powrotem do pralki i utwardzaj przez 15 minut w temperaturze 35 °C.
      UWAGA: Tabela materiałów zawiera informacje o drukarce 3D oraz maszynie do utwardzania i mycia używanej w protokole przygotowania formy. Model 3D został pocięty za pomocą zastrzeżonego oprogramowania slicera drukarki 3D.
  4. Umieść wydruk w piecu UV na 12 godzin i umieść go w piekarniku w temperaturze 80 °C na 12 h.
    UWAGA: Ten krok zapewnia, że cały polimer zostanie utwardzony, a cały nieutwardzony polimer zostanie usunięty z wydruku, ponieważ uniemożliwiłoby to utwardzenie PDMS.
  5. Silanizuj formę poprzez osadzanie z fazy gazowej silanu trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktyl).
    1. Umieść formę 3D w eksykatorze próżniowym wraz z 20 μl 100% stężonego silanu trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylu) pipetowanego na folii aluminiowej umieszczonej w pobliżu formy.
    2. Wytworzyć próżnię w eksykatorze, aby wytworzyć parę i pozostawić na 40 minut.
    3. Wyjmij formę z eksykatora i przepłucz ją czystym etanolem przed wylaniem na nią PDMS.

3. Produkcja chipa mikroprzepływowego

  1. Przygotować mieszaninę PDMS, mieszając elastomer z jego środkiem sieciującym (tabela materiałów). Energicznie mieszaj mieszaninę, aby równomiernie zmiksować oba składniki, aż utworzą się pęcherzyki powietrza, a mieszanina PDMS będzie wyglądać na nieprzezroczystą.
    UWAGA: Ilość środka sieciującego powinna wynosić 10% wagowo ilości elastomeru.
  2. Odgazowanie mieszaniny elastomeru i środka sieciującego w eksykatorze próżniowym w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków powietrza. Przenieść mieszaninę z eksykatora do pojemnika używanego do mieszania (krok 3.1). Kontynuuj proces odgazowywania, aż wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte, a mieszanina znów będzie przezroczysta.
    UWAGA: Zazwyczaj czas potrzebny do wysuszenia wynosi 30 minut.
  3. Wlej 3 g mieszaniny na wzorzec krzemowy, aby wytworzyć szablon, który posłuży jako "podłoga" chipa mikroprzepływowego.
    UWAGA: Grubość warstwy PDMS można dostosować, zmieniając ilość mieszanki wylewanej na master krzemowy.
    1. Aby uzyskać matrycę o grubości 400 μm, należy wlać 3 g PDMS na matrycę wzorcową krzemu, umieścić wzorzec krzemowy na powlekarce wirowej i wirować na poziomie 21 × g przez 5 s i 54 × g przez 10 s, a następnie ponownie odgazować zgodnie z opisem w kroku 3.2 w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków powietrza.
  4. Wlej 20 g mieszaniny PDMS na wydrukowaną w 3D formę, aby uzyskać mikrokanał, który posłuży jako "dach" chipa mikroprzepływowego, i odgazuj go zgodnie z opisem w kroku 3.2 przez 30 minut.
  5. Piecz zarówno wafel silikonowy, jak i wydrukowaną w 3D formę w temperaturze 70 °C przez co najmniej 2 godziny.
  6. Oderwij warstwę PDMS od formy wydrukowanej w 3D, przetnij PDMS ostrzem wokół mikrokanałów i przebij otwory, które będą służyć jako wlot i wylot kanału mikroprzepływowego.
  7. Oderwij PDMS od silikonowego wzorca i pokrój warstwę PDMS na mniejsze kawałki o tych samych wymiarach kanałów mikroprzepływowych, które zostaną połączone na wierzchu szablonów.
  8. Delikatnie przecieraj szablony i mikrokanaliki za pomocą 1% roztworu detergentu (patrz tabela materiałów) przez 5 minut, a następnie spłucz wodą dejonizowaną. Następnie przepłucz szablony i mikrokanaliki izopropanolem i spłucz je wodą dejonizowaną. Suszyć szablony i mikrokanaliki w temperaturze pokojowej przez 1 minutę sprężonym powietrzem o ciśnieniu 1 bar.
  9. Umieść szablony i mikrokanaliki w odkurzaczu plazmowym powierzchniami, które mają być sklejone, skierowanymi do góry. Włącz odkurzacz plazmowy i traktuj plazmowo szablony i mikrokanały przez 40 sekund. Wyjmij je z myjki plazmowej i natychmiast połącz mikrokanały na górze szablonów, stykając je ze sobą.
  10. Przechowuj chipy mikroprzepływowe w piecu w temperaturze 70 °C przez pięć dni, aby zapewnić hydrofobowy odzysk PDMS i mieć kąt zwilżania w optymalnym zakresie, od 30 do 60°10,11.

4. Wzorce bakteryjne

  1. Na dzień przed eksperymentem należy wyhodować populację Escherichia coli (szczep MG1655 prpsM-GFP). Zaszczepić kulturę bezpośrednio z zamrożonego bulionu i rosnąć przez noc przez 20 godzin w podłożu bulionowym lizogenicznym (LB) w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C. Dodać 50 μg/ml kanamycyny, aby komórki zachowały plazmid prpsM-GFP.
  2. W dniu eksperymentu ustaw inkubator skrzynkowy (Rysunek 2A) na 37 °C na kilka godzin przed eksperymentem, aby uzyskać jednolitą i stabilną temperaturę przed rozpoczęciem eksperymentu. Ustaw pompę strzykawkową i podgrzewaną szklaną płytkę na stoliku mikroskopu (Rysunek 2B,C), ustawiając temperaturę na tę samą temperaturę, co inkubator pudełkowy.
    UWAGA: Inkubator pudełkowy, w którym zamknięty jest cały system, w tym mikroskop (Rysunek 2E), zapewnia utrzymanie jednolitej i stałej temperatury przez cały czas trwania eksperymentu, gdy kanał jest przepłukiwany pożywką.
  3. Dziewięćdziesiąt minut przed eksperymentem umieść chip mikroprzepływowy w naczyniu wypełnionym 100% etanolem (EtOH) i przepłucz kanał 100% EtOH przez co najmniej 10 minut. Umieść chip mikroprzepływowy w eksykatorze próżniowym i odgazowuj przez co najmniej 30 minut. Wymień EtOH na wodę destylowaną i poddaj go próżniowej obróbce przez co najmniej 30 minut. Włóż chip mikroprzepływowy do piekarnika w temperaturze 70 °C na 10 minut w celu wyjęcia wszelkie ślady cieczy pozostawione w kanale.
    UWAGA: Ten krok jest konieczny, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w kanale po przepłukaniu pożywką hodowlaną. Ten protokół zapobiegania pęcherzykom został zaadaptowany z Wang et al.18.
  4. Odpipetować 1 ml pożywki z kwasem 3-(N-morfolino)propanosulfonowym (MOPS) (1x) do fiolki wirówkowej i dodać 10 μl 0,132 M fosforanu potasu (K2HPO4). Wyjąć nocną kulturę z inkubatora w temperaturze 37 °C i podsycić 100 μl do fiolki wirówkowej i odwirować kulturę przy 2 300 × g przez 2 minuty. Delikatnie odpipetować supernatant z fiolek wirówkowych i ponownie zawiesić osad w 1 ml świeżej pożywki MOPS z 0,015% v/v Tween 20 i 0,01% v/v fosforanu potasu.
    UWAGA: Typowe stężenie zawiesiny bakteryjnej mieści się w przedziale 0,015-0,15 obj., co zapewnia powstanie rozszerzonej i ruchomej strefy akumulacji oraz zapobiega gromadzeniu się cząstek na podłożu. Zastąpienie pożywki na noc świeżą pożywką minimalizuje ryzyko uwolnienia warstw bakterii na szablonie. Brak źródła węgla w świeżej pożywce zapobiega wzrostowi komórek w zawiesinie podczas tworzenia wzoru matrycowego. Stężenie 0,015% v/v Tween 20 w zawiesinie jest konieczne, aby kąt zwilżania cofającej się cieczy na matrycy PDMS mieścił się w optymalnym zakresie, od 30 do 60°.
  5. Załadować zawiesinę bakteryjną do strzykawki o pojemności 1 ml i podłączyć strzykawkę do chipa za pomocą rurki mikroprzepływowej.
    1. Aby zabezpieczyć połączenie między strzykawką a rurką, należy bezpośrednio wprowadzić igłę o średnicy zewnętrznej 0,6 mm do rurki. Aby uniknąć rozsypania zawiesiny pozostałej w pobliżu wlotu w poprzek kanału, przepłucz świeże medium przez otwór używany jako wylot podczas procesu tworzenia wzoru (Rysunek 3A-III), a nie przez otwór używany jako wlot.
    2. Zamontuj strzykawkę na pompie strzykawkowej i wstrzyknij zawiesinę do chipa mikroprzepływowego przez wlot znajdujący się w górnej części kanału, aż zawiesina pokryje obszar szablonu pułapkami.
      UWAGA: Podczas procesu wtryskiwania cieczy powietrze może wydostawać się przez wylot znajdujący się na dolnym końcu kanału.
    3. Ustawić pompę strzykawkową tak, aby pobierała zawiesinę bakteryjną (Rysunek 3A-I) przy natężeniu przepływu 0,07-0,2 μL/min, co w opisanej geometrii odpowiada prędkości cofania się menisku 80-100 μm/min.
    4. Monitoruj proces tworzenia wzorów za pomocą oprogramowania mikroskopowego.
      UWAGA: W tym przypadku 10-krotne powiększenie zostało użyte do monitorowania cofającego się menisku na szablonie, a 20-krotne powiększenie użyto do monitorowania osadzania się poszczególnych bakterii w mikrofabrykowanych pułapkach.
  6. Po ułożeniu matrycy z komórkami ( Rysunek 3A-II), zwiększ natężenie przepływu pobierania, aby szybko opróżnić kanał mikroprzepływowy i przepłukać go świeżym LB, który został wcześniej odgazowany przez co najmniej 30 minut i wstępnie podgrzany w temperaturze 30 °C.
  7. Ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu 2 μl/min, aby delikatnie przepłukać kanał. Po napełnieniu kanału należy zwiększyć natężenie przepływu (15 μl/min) zgodnie z konkretnymi potrzebami eksperymentalnymi.
  8. Uzyskuj obrazy rosnących bakterii w żądanym powiększeniu i odstępie czasu.

5. Wzorzec koloidalny

  1. Odpipetować 900 μl 0,015% v/v Tween 20 roztworu wodnego do fiolki wirówkowej i odpipetować do niej 100 μl oryginalnej zawiesiny koloidalnej. Odwirować zawiesinę o masie 13 500 × g przez 1 minutę. Delikatnie usunąć supernatant i zastąpić go wodnym roztworem Tween 20 (0,015% v/v). Powtórz ten proces trzy razy, aby zapewnić całkowitą wymianę rozpuszczalnika dostawcy z zawiesiny fabrycznej.
  2. Załaduj zawiesinę koloidalną do strzykawki o pojemności 1 ml i podłącz strzykawkę do chipa za pomocą rurki mikroprzepływowej. Wstrzyknąć zawiesinę do chipa mikroprzepływowego przez wlot znajdujący się w środkowej części, w górnej części kanału i stopniowo dociskać zawiesinę, aż szablon zostanie pokryty.
  3. Pobrać zawiesinę koloidalną przy natężeniu przepływu 0,07-0,2 μl/min, co odpowiada prędkości cofania się menisku wynoszącej 1-2 μm/min, i zobrazować proces modelowania za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Użyj 10-krotnego powiększenia, aby monitorować cofający się menisk na szablonie i 20-krotnego powiększenia, aby obserwować osadzanie się pojedynczych cząstek w mikrofabrykowanych pułapkach. Zwiększ natężenie przepływu, gdy menisk dotrze do końca szablonu, aby szybko opróżnić kanał.
    UWAGA: Układy koloidalne złożone z kilku cząstek można wytworzyć, uruchamiając proces tworzenia wzoru od kroków 5.1 do 5.3 szeregowo. Kanał jest ładowany nową zawiesiną koloidalną w każdej iteracji zgodnie z pożądanym składem układów koloidalnych. Każdy etap tworzenia wzoru dodaje jedną cząstkę do układu koloidalnego i może być uruchamiany sekwencyjnie, aż pułapki zostaną wypełnione żądaną sekwencją cząstek. Skład powstałych układów koloidalnych zależy wyłącznie od sekwencji zawiesin koloidalnych używanych do wypełniania pułapek (Rysunek 3B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano platformę mikroprzepływową, która wykorzystuje montaż wspomagany kapilarnością do modelowania cząstek koloidalnych i bakterii w pułapkach mikrofabrykowanych na szablonie PDMS. Dwie różne geometrie kanałów zostały zaprojektowane w celu optymalizacji wzoru koloidów i bakterii poprzez montaż wspomagany kapilarnie. Geometria pierwszego kanału (Rysunek 1B) składa się z trzech równoległych odcinków o długości 23 mm, między którymi nie ma fizycznej bariery. Dwie sekcje po bokach mają 5 mm szerokoś...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj platforma mikroprzepływowa umożliwia modelowanie obiektów o rozmiarach mikro, takich jak koloidy i bakterie, w określone układy przestrzenne na podłożu PDMS. Pełna kontrola nad warunkami środowiskowymi oferowana przez mikrofluidykę oraz możliwość modelowania komórek z mikrometryczną precyzją zapewnianą przez technologię sCAPA sprawia, że jest to bardzo obiecująca platforma dla przyszłych badań z zakresu fizjologii i ekologii.

W eksperymentach przedstawionych w tej pracy master kr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony 179834 grantu SNSF PRIMA (dla E.S.), grantu badawczego ETH ETH-15 17-1 (R. S.) oraz nagrody Fundacji Gordona i Betty Moore w zakresie symbiozy mikroorganizmów wodnych (grant GBMF9197) (R. S.). Autorzy dziękują dr. Miguelowi Angelowi Fernandezowi-Rodriguezowi (Uniwersytet w Granadzie, Hiszpania) za obrazowanie bakterii metodą SEM i wnikliwe dyskusje. Autorzy dziękują dr Jen Nguyen (University of British Columbia, Kanada), dr Laurze Alvarez (ETH Zürich, Szwajcaria), Cameronowi Boggonowi (ETH Zürich, Szwajcaria) i dr Fabio Grillo za wnikliwe dyskusje.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alcatel AMS 200SE I-SpeederAlcatel Micro Machining Systemgłębokiej reaktywnej wymiany jonowej
DetergentAlconox
AZ400K developerMicroChemicalsAZ400K
BD 10 mL Strzykawka (Luer-Lock)BD300912służy do spłukiwania świeżego bulionu lizogenicznego do kanału mikroprzepływowego
Życie inkubatora pudełkowego Usługi obrazowaniastosowane w celu zapewnienia jednolitej i stałej temperatury w kanale
m (red)microParticles GmbHPS-FluoRed-Fi267
Fluorescencyjne cząstki PS o średnicy 1,08 i mikro; m (green)microParticles GmbHPS-FluoGreen-Fi182
Fluorescencyjne cząstki PS o średnicy 2,07 i mikro; m (green)microParticles GmbHPS-FluoGreen-Fi183
Fluorescencyjne cząstki PS o średnicy 2,08 i mikro; m (red)microParticles GmbHPS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 MPVA TePlasłuży do obróbki plazmowej 10 cm płytki krzemowej
H401-T-CONTROLLERSterownik Okolabpodgrzewanej płyty szklanej
H601-NIKON-TS2R-GLASSPodgrzewana płyta szklanaOkolab
Heidelberg DWL 2000Heidelberg InstrumentsBezpośredni laser UV writer
Strzykawki insulinowe, U 100, zeCodan Medical ApSCODA6216401 ml służącą do pobierania płynnej zawiesiny podczas procesu tworzenia wzoru
KlayoutOpensourceużywany do projektowania funkcji na krzemowym masterze
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Fisher Scientific244610Rosół lizogeniczny spłukiwany do kanału mikroprzepływowego
Masterflex rurka transferowaMasterflexHV-06419-050,020 '' ID, 0,06 '' OD
MOPS (10x)TeknovaM2101rozcieńczona dziesięciokrotnie wodą miliQ i używana do wymiany podłoża na noc
Nikon Eclipse Ti2Mikroskop Nikon Instruments
openSCADOpensourceużywany do projektowania formy
Grupa bankomatówOPTIspin SB2051-0002-01-00wywoływacz wirowy
Komora plazmowa ZeptoDiener ElectronicZEPTO-1służy do plazmowej obróbki matrycy i mikrokanału w celu ich połączenia
Dodatni fotorezystu AZ1505MicroChemicalsAZ1505
Fosforan potasu dwuzasadowySigma AldrichP3786dodany do MOPS 1x
Prusa utwardzanie i pralka CW1SPrusasłuży do zapewnienia, że cały polimer jest utwardzony, a nieutwardzony polimer jest usuwany z formy
Prusa Resin - ToughPrusa Research a.s.Światłoczuła płynna żywica UV 405nm do druku 3D
Drukarka 3d Prusa SL1Prusaużywana do drukowania formy
WagaVWR-CH611-2605służy do ważenia mieszaniny PDMS
Wafel krzemowy (10 cm)Silicon Materials Inc.N/Phos < 100> 1-10 Ω cm
Sü Nakładka maski ss MA6SUSS MicroTec Groupsłuży do wyrównania maski ze szkła chromowanego i podłoża oraz odsłonięcia podłoża
Zestaw elastomerów silikonowychSylgard 184Dow Corning
Techni Etch Cr01Technicwytrawiacz chromu
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktyl) silanSigma Aldrich448931używany do silianizacji formy wydrukowanej w 3D
TWEEN 20Sigma AldrichP1379służy do zapewnienia optymalnego kąta zwilżania podczas procesu modelowania
Veeco Dektak 6 MProfilometrVeeco
VTC-100 Vacuum Spin CoaterMTI corporationPróżniowa powlekarka wirowa
Wirówka Eppendorf 5424R służy do wymiany pożywki nocnej na świeżą minimalną pożywkę Fiolka wirówkowa Eppendorf 30120086 1,5 ml CETONI Base 120 Pompa strzykawkowa CETONI GmbH Fluorescencyjne cząstki PS o średnicy 0,98 i mikro; strzykawką luer ; utwardzacz

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
  2. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
  3. Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
  4. Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
  5. Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
  6. Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
  7. Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
  8. Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
  9. Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
  10. Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
  11. Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
  12. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
  13. Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
  14. Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779(2016).
  15. Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
  16. Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
  17. Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
  18. Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
  19. Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microorganism PatterningCapillarity Assisted AssemblyMicrofluidic PlatformColloidal Particle PatterningSingle Cell AnalysisMicrofluidic ChannelPDMS MicrofabricationBacterial Cell PatterningSequential DepositionMicrobe Microbe Interactions

Related Articles