Artykuł metodologiczny

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/63136

⸱

11 kwietnia 2022

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans) okazały się być cennym modelem do badania procesów rozwojowych i biologicznych komórek. Zrozumienie tych procesów biologicznych często wymaga długotrwałego i wielokrotnego obrazowania tego samego zwierzęcia. Długi czas rekonwalescencji związany z konwencjonalnymi metodami unieruchamiania wykonywanymi na podkładkach agarowych ma szkodliwy wpływ na zdrowie zwierząt, co sprawia, że wielokrotne obrazowanie tego samego zwierzęcia przez długi czas jest niewłaściwe. W artykule opisano projekt chipa mikroprzepływowego, metodę wytwarzania, protokół hodowli C. elegans na chipie oraz trzy przykłady długoterminowego obrazowania w celu zbadania procesów rozwojowych u poszczególnych zwierząt. Chip, wykonany z polidimetylosiloksanu i przyklejony do szkła nakrywkowego, unieruchamia zwierzęta na szklanym podłożu za pomocą membrany elastomerowej, która jest odchylana za pomocą gazowego azotu. Całkowite unieruchomienie C. elegans umożliwia solidne obrazowanie poklatkowe zdarzeń komórkowych i subkomórkowych w sposób wolny od znieczulenia. Geometria kanału o dużym przekroju poprzecznym pozwala zwierzęciu na swobodne poruszanie się w dwóch częściowo uszczelnionych błonach izolacyjnych, co umożliwia wzrost w kanale przy ciągłym dopływie pokarmu. Za pomocą tego prostego chipa można przeprowadzić obrazowanie zjawisk rozwojowych, takich jak wzrost procesów neuronalnych, rozwój sromu i arboryzacja dendrytyczna w neuronach czuciowych PVD, gdy zwierzę rośnie wewnątrz kanału. Chip do długoterminowego wzrostu i obrazowania działa z pojedynczą linią ciśnieniową, bez zewnętrznych zaworów, niedrogich płynnych materiałów eksploatacyjnych i wykorzystuje standardowe protokoły obsługi ślimaków, które mogą być łatwo dostosowane przez inne laboratoria przy użyciu C. elegans.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans okazał się być potężnym organizmem modelowym do badania biologii komórki, starzenia się, biologii rozwoju i neurobiologii. Zalety, takie jak przezroczysta powłoka, krótki cykl życia, łatwa konserwacja, określona liczba komórek, homologia z kilkoma ludzkimi genami i dobrze zbadana genetyka, sprawiły, że C. elegans stał się popularnym modelem zarówno dla podstawowych odkryć biologicznych, jak i badań stosowanych1,2. Zrozumienie procesów biologicznych i rozwojowych zachodzących w komórce na podstawie wielokrotnych, długotrwałych obserwacji poszczególnych zwierząt może okazać się korzystne. Konwencjonalnie C. elegans jest znieczulana na podkładkach agarowych i obrazowana pod mikroskopem. Niekorzystny wpływ środków znieczulających na zdrowie zwierząt ogranicza stosowanie znieczulonych zwierząt do długotrwałego i powtarzającego się przerywanego obrazowania tego samego zwierzęcia3,4. Najnowsze postępy w technologiach mikroprzepływowych i ich adaptacja do odłowu C. elegans bez znieczulenia przy znikomym zagrożeniu dla zdrowia umożliwiają obrazowanie tego samego zwierzęcia w wysokiej rozdzielczości w krótkim i długim okresie czasu.

Mikroprzepływowe chipy zostały zaprojektowane dla C. elegans'5 wysokoprzepustowych badań przesiewowych6,7,8, pułapkowanie i dozowanie9, badanie przesiewowe leków10,11, stymulacja neuronów za pomocą obrazowania w wysokiej rozdzielczości12 i wysoka rozdzielczość Obrazowanie zwierzęcia12,13,14. Opracowano również ultracienkie arkusze mikroprzepływowe do unieruchamiania na szkiełkach15. Długoterminowe badania C. elegans przeprowadzono przy użyciu obrazów o niskiej rozdzielczości zwierząt rosnących w płynnej kulturze, aby obserwować wzrost, dynamikę wapnia, wpływ leków na ich zachowanie16,17,18,19, ich długowieczność i starzenie się20. Przeprowadzono długoterminowe badania z wykorzystaniem mikroskopii o wysokiej rozdzielczości w celu oceny rozwoju synaptycznego21, regeneracji neuronów22 oraz addycji mitochondrialnej23. Długoterminowe obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i śledzenie losu i różnicowania komórek zostało przeprowadzone w urządzeniach wielokanałowych24,25. Kilka zdarzeń komórkowych i subkomórkowych zachodzi w skali czasowej kilku godzin i wymaga uwięzienia tego samego osobnika w różnych punktach czasowych podczas jego rozwoju, aby scharakteryzować wszystkie pośrednie etapy procesu w celu zrozumienia dynamiki komórkowej in vivo. Aby zobrazować procesy biologiczne, takie jak organogeneza, rozwój neuronów i migracja komórek, zwierzę musi być unieruchomione w tej samej orientacji w wielu punktach czasowych. Wcześniej opublikowaliśmy protokół obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości przez ponad 36 godzin, aby określić, gdzie mitochondria są dodawane wzdłuż neuronów receptora dotyku (TRN)23.

Ten artykuł zawiera protokół do ustanowienia metodologii opartej na mikrofluidyce dla wielokrotnego obrazowania w wysokiej rozdzielczości. To urządzenie, z pojedynczym kanałem przepływu, najlepiej nadaje się do wielokrotnego obrazowania pojedynczego zwierzęcia na urządzenie. Aby zwiększyć przepustowość i obrazować wiele zwierząt jednocześnie, wiele urządzeń można podłączyć do tego samego przewodu ciśnieniowego, ale z oddzielnymi trójdrożnymi złączami sterującymi pojedynczym zwierzęciem w każdym urządzeniu. Projekt jest przydatny w badaniach, które wymagają obrazów poklatkowych o wysokiej rozdzielczości, takich jak procesy rozwojowe po zarodku, migracja komórek, transport organelli, badania ekspresji genów itp. Technologia ta może być ograniczona w przypadku niektórych zastosowań, takich jak badania nad długością życia i starzeniem się, które wymagają równoległego wzrostu i obrazowania wielu zwierząt w późnym stadium rozwoju. Elastomer polidimetylosiloksanu (PDMS) został użyty do produkcji tego urządzenia ze względu na jego biostabilność26, biocompatibility27,28, przepuszczalność gazu29,30, oraz przestrajalny moduł sprężystości31. To dwuwarstwowe urządzenie umożliwia wzrost zwierząt przy ciągłym dostarczaniu pokarmu w kanale mikroprzepływowym oraz wychwytywanie pojedynczych C. elegans poprzez kompresję membrany PDMS przy użyciu gazowego azotu. To urządzenie jest rozszerzeniem poprzednio opublikowanego urządzenia z tą zaletą, że hoduje i obrazuje to samo zwierzę w mikrokanale pod ciągłym podawaniem pokarmu3. Dodatkowa sieć membran izolacyjnych oraz membrana pułapkowa o szerokości 2 mm umożliwiają skuteczne unieruchomienie rozwijających się zwierząt. Urządzenie było używane do obserwacji rozwoju neuronów, rozwoju sromu i arboryzacji dendrytycznej w neuronach czuciowych PVD. Zwierzęta rosną w urządzeniu bez negatywnych skutków zdrowotnych i mogą być wielokrotnie unieruchamiane, aby ułatwić obrazowanie zdarzeń subkomórkowych u tego samego zwierzęcia podczas jego rozwoju.

Cały protokół jest podzielony na pięć części. Część 1 opisuje produkcję urządzenia do wzrostu i obrazowania chipa. W części 2 opisano, jak ustawić system ciśnieniowy dla ugięcia membrany PDMS w celu unieruchomienia i odizolowania poszczególnych C. elegans. Część 3 opisuje, jak zsynchronizować C. elegans na płytce pożywki wzrostowej nicieni (NGM) do obrazowania urządzenia. Część 4 opisuje, jak załadować pojedyncze zwierzę do urządzenia i hodować je w urządzeniu mikroprzepływowym przez kilka dni. W części 5 opisano, jak unieruchomić pojedyncze zwierzę w wielu punktach czasowych, rejestrować obrazy w wysokiej rozdzielczości przy użyciu różnych obiektywów i analizować obrazy za pomocą Fidżi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzenia do wzrostu i obrazowania

  1. Produkcja form SU8
    1. Wzorce projektowe 1 (warstwa przepływu) i 2 (warstwa kontrolna) przy użyciu prostokątnych kształtów w edytorze tekstu (lub oprogramowaniu CAD do projektowania wspomaganego komputerowo) i wydrukuj fotomaski za pomocą plotera laserowego o minimalnym rozmiarze elementu 8 μm na folii na bazie poliestru (Rysunek 1).
    2. Pokrój wafle silikonowe na kawałki 2,5 cm × 2,5 cm i czyść je 20% KOH przez 1 min. Opłucz wafle w wodzie dejonizowanej (DI). Użyj po jednym waflu do przepływu i warstwy kontrolnej.
      UWAGA: KOH jest i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
    3. Wysuszyć kawałki sprężonym azotem o ciśnieniu 14 psi, a następnie odwodnić na gorącej płycie w temperaturze 120 °C przez 4 godziny. Przed przejściem do następnego kroku ostudź oba kawałki do temperatury pokojowej.
    4. Weź jeden z kawałków silikonu i umieść go na uchwycie powlekarki wirowej i włącz próżnię, aby utrzymać wafel na miejscu. Na kawałek silikonu umieść ~20 μl heksametylodilanu (HMDS) i pokryj go za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 500 obrotów na minutę (rpm) przez 5 s, a następnie 3,000 obr./min przez 30 s.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać w żółtym świetle. Nie używaj białego światła w pomieszczeniu.
    5. Aby uzyskać jednolitą grubość fotorezystu ~40 μm (specyficzną dla warstwy przepływowej; odpowiednią do obrazowania wczesnych zwierząt w stadium larwalnym od 1 do stadium 3 (L1 - L3)), pokryj płytkę krzemową ~ 1,5 ml ujemnego fotorezystu-1 za pomocą powlekarki wirowej przy 500 obr./min przez 5 s, a następnie 2,000 obr./min przez 30 s.
    6. Powtórz kroki 1.1.4 i 1.1.5 z drugą płytką, aby uzyskać jednolitą grubość fotorezystu ~40 μm właściwą dla warstwy kontrolnej.
    7. Alternatywnie, aby zwiększyć grubość warstwy przepływowej do ~80 μm dla starszych zwierząt, pokryj płytki krzemowe ~1,5 ml ujemnego fotorezystu-2 za pomocą powlekarki wirowej przy 500 obr./min przez 5 s, a następnie 2,000 obr./min przez 30 s. Ta grubość jest odpowiednia dla etapu L3 do dorosłych zwierząt.
      UWAGA: Trzymaj płytki silikonowe za boki, aby uniknąć uszkodzenia warstw pokrytych wirowaniem. Na tym etapie należy wyłączyć białe światła.
    8. Piecz kawałki krzemu pokrytego fotorezystem (dla warstwy przepływowej i kontrolnej) na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 1 minutę, a następnie w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Schłodzić upieczone kawałki do temperatury pokojowej.
      UWAGA: Upieczone kawałki silikonu można przechowywać przez jeden dzień przed przejściem do następnego kroku. Przechowywać w ciemności i nie wystawiać na działanie białego światła.
    9. Umieść miękko wypieczone kawałki silikonu na stoliku naświetlającym UV z powierzchnią pokrytą fotorezystem skierowaną w stronę lampy UV. Wystaw oba elementy oddzielnie na działanie promieniowania UV przez 15 s, używając lampy o mocy 200 W, przez fotomaskę z wzorami 1 i 2, aby uzyskać odpowiednio warstwy przepływu i kontrolne.
      UWAGA: Nosić okulary ochronne i unikać bezpośredniej ekspozycji na światło UV. Nie włączaj białego światła w pomieszczeniu podczas tego stage.
    10. Piecz dwa odsłonięte kawałki silikonu warstwą powlekaną skierowaną do góry, w temperaturze 65 °C, a następnie w temperaturze 95 °C odpowiednio przez 1 minutę i 10 minut. Ostudź kawałki do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku.
    11. Opracuj wzory, mocząc kawałki krzemu w roztworze wywoływacza fotorezystu (rozcieńczenie wywoływacza w izopropanolu w stosunku 1:3) przez 20 minut. Gdy wzór będzie widoczny, spłucz kawałki czystym alkoholem izopropylowym (IPA) i delikatnie wysusz suszarką przy użyciu gazowego azotu (14 psi).
      UWAGA: Do tego zabiegu chemicznego należy używać dobrze wentylowanego środowiska, aby uniknąć narażenia ludzi. Używaj białego światła tylko po wywołaniu cech i przepłukaniu IPA.
    12. Kawałki silikonu należy przechowywać w eksykatorze powlekaną powierzchnią skierowaną do góry. Wystaw kawałki na działanie oparów silanu, wlewając 50 μl czystego trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylu) silanu na mały plastikowy kubek lub szklane szkiełko. Umieścić kubek/szkiełko w eksykatorze i inkubować przez 2 godziny
      UWAGA: Unikaj bezpośredniego narażenia na opary silanu. Do obróbki parami silanu należy zawsze używać szczelnej komory.
      UWAGA: W razie potrzeby opracowane kawałki krzemu można przechowywać przez 1-2 dni przed przejściem do następnego kroku.
  2. Produkcja chipów PDMS
    1. Wykonaj PDMS w plastikowym kubku, mieszając bazę elastomerową z utwardzaczem w stosunku 10:1. Dobrze wymieszaj zawartość, ciągle mieszając przez 3 minuty. Mieszanie spowoduje powstanie dużej ilości pęcherzyków powietrza w mieszance PDMS.
    2. Odgazuj mieszaninę PDMS w eksykatorze przez 30 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
      UWAGA: Upewnij się, że pęcherzyki powietrza zostały usunięte z mieszanki PDMS przed wylaniem jej na elementy, ponieważ pęcherzyki mogą powodować wadliwe i niedziałające urządzenia.
    3. Umieść płytki krzemowe z warstwą kontrolną (wzór 2) na szalce Petriego. Delikatnie wylej warstwę mieszanki PDMS o grubości 5 mm na kawałek silikonu, unikając tworzenia się pęcherzyków.
    4. Odgazowuje mieszaninę PDMS w eksykatorze w celu usunięcia dodatkowych pęcherzyków, które powstają podczas procesu nalewania PDMS.
    5. Umieść wafel krzemowy z warstwą przepływową (wzór 1) na uchwycie przędzalnicy, stosując podciśnienie 200-500 mTorr, aby utrzymać wafel. Wlej ~ 1 ml PDMS na płytkę krzemową i pokryj ją za pomocą wirówki z prędkością 500 obr./min przez 5 s, a następnie 1,000 obr./min przez 30 s, aby uzyskać warstwę o grubości ~ 80 μm.
    6. Piecz dwie płytki krzemowe z powlekanym wirowo PDMS i wylać warstwy PDMS w temperaturze 50 °C w piecu konwekcyjnym na gorące powietrze przez 6 godzin. Po upieczeniu poczekaj, aż kawałki ostygną w temperaturze pokojowej.
    7. Odetnij warstwę PDMS o grubości 5 mm z kawałka silikonu wokół warstwy kontrolnej (wzór 2) za pomocą ostrego ostrza i oderwij ją od podłoża silikonowego.
    8. Przebić dwa otwory o średnicy ~1 mm za pomocą dziurkacza Harris w zbiorniku bloku PDMS, aby połączyć kanał unieruchamiający i wloty kanału izolacyjnego z przewodami gazowymi w celu odchylenia membrany PDMS.
    9. Umieść kawałek silikonu z warstwą PDMS pokrytą spinem na wzorze 1 (warstwa przepływowa), powierzchnią pokrytą PDMS do góry, na plastikowej tacy. Trzymaj dziurkowany blok PDMS ze wzorem 2 (warstwa kontrolna) na tacy uformowaną stroną do góry.
    10. Umieść plastikową tacę w myjce plazmowej i wystawiaj dwie powierzchnie PDMS na działanie plazmy powietrznej o mocy 18 W przez 2 minuty pod niską próżnią (200-600 mTorr). Zastosuj próżnię, aż komora zmieni kolor na jasnofioletowy. Wykonaj ten krok przy słabym oświetleniu, aby zobaczyć zmianę koloru plazmy.
    11. Wyjmij dwa bloki poddane obróbce plazmowej i delikatnie zwiąż bloki, ściskając ze sobą powierzchnie poddane obróbce plazmowej wzorów 1 i 2. Piecz połączone wzory w temperaturze 50 °C przez 2 godziny w piecu konwekcyjnym na gorące powietrze.
    12. Wyjmij połączone urządzenie z piekarnika. Wytnij połączone urządzenie z płytki krzemowej ze wzorem 1 i wzorem 2 i przebij otwory w zbiornikach wlotowych i wylotowych warstwy przepływowej za pomocą dziurkacza Harris.
    13. Umieść połączony blok PDMS warstwą przepływową skierowaną do góry na plastikowej tacy. Trzymaj czystą szklankę nakrywkową (#1.5) na tej samej tacy. Wystawić klocki i szkło nakrywkowe na działanie plazmy powietrznej o mocy 18 W przez 2 minuty. Dostosuj podciśnienie, aby zobaczyć fioletową komorę.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać w słabym świetle, aby zobaczyć zmianę koloru plazmy. Aby wyczyścić szkło nakrywkowe, umyj je alkoholem izopropylowym i wysusz suszarką przy użyciu azotu o ciśnieniu 14 psi.
    14. Umieść naświetlony plazmą blok PDMS na wierzchu szkła nakrywkowego i piecz połączoną strukturę w piecu w temperaturze 50 °C przez 2 godziny. Przechowuj urządzenie w czystej komorze do przyszłych eksperymentów.

2. Gruntowanie membrany PDMS

  1. Weź urządzenie i umieść je w mikroskopie stereoskopowym i zamocuj rurki. Podłącz rurkę micro flex (średnica wewnętrzna ~5 mm, średnica zewnętrzna ~8 mm) do przewodu gazowego ze sprężonym azotem na jednym końcu. Podłącz złącze trójdrożne na drugim końcu. Rurki 1 i 2 łączników trójdrożnych zostaną podłączone odpowiednio do syfonu i membrany izolacyjnej.
  2. Podłącz dwie rurki micro flex (średnica wewnętrzna ~1,6 mm, średnica zewnętrzna ~5 mm) do dwóch portów wylotowych zaworu trójdrogowego. Podłącz drugi koniec dwóch probówek do igły 18 G o długości 8 mm.
  3. Napełnij warstwę przepływową buforem M9 za pomocą mikropipety przez otwór wlotowy. Napełnij obie probówki wodą DI przez koniec podłączony do igły. Włóż dwie igły do wybitych otworów, łącząc odpowiednio membranę izolacyjną i pułapkową.
  4. Otwórz regulator azotu gazowego przy ciśnieniu 14 psi i przekręć zawór trójdrogowy z rurki 1, aby wepchnąć wodę do urządzenia przez kanały mikroprzepływowe w warstwach kontrolnych, a mianowicie w membranach syfonu i izolacji.
  5. Poczekaj, aż woda wypełni kanał bez obecności kropelki powietrza w obu kanałach. Gdy kanały zostaną całkowicie wypełnione wodą, kanały uważa się za zagruntowane.
  6. Zwolnij ciśnienie za pomocą trójdrogowego kranu po napełnieniu kanałów wodą i zalaniu. Zalewanie może prowadzić do powstawania pęcherzyków w warstwie przepływowej, usuń pęcherzyki, przepływając dodatkowe media przez kanał przepływowy.

3. Konserwacja i synchronizacja C. elegans

UWAGA: Szczepy C. elegans: W badaniu wykorzystano następujące transgeny PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) dla rozwoju sromu32, jsIs609 (mec7p::MLS(sygnał lokalizacji macierzy mitochondrialnej)::GFP)33 do rozwoju neuronów receptora dotyku (TRN) i obrazowania transportu mitochondriów, oraz wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) do śledzenia rozwoju PVD34. Przestrzegano standardowego protokołu hodowli i konserwacji C. elegans35.

  1. Hodować C. elegans na podłożu wzrostu nicieni (NGM) na płytkach Petriego z E. coli OP50 jako źródłem pożywienia w temperaturze 22 °C. Utrzymuj szczepy C. elegans poprzez wielokrotne przenoszenie kilku hermafrodytów lub kawałkowanie niewielkiej ilości agaru z kilkoma zwierzętami na nową płytkę NGM z trawnikiem OP50.
  2. Po 3-5 dniach sprawdź płytkę NGM pod kątem wzrostu zwierząt i jaj C. elegans. Zbierz i przenieś około 30 jaj z talerza na świeży talerz NGM z trawnikiem OP50.
  3. Aby zsynchronizować zwierzęta do obrazowania, należy co 2 godziny przenosić wszystkie niewyklute jaja z płytki na nową płytkę i utrzymywać je w temperaturze 22 °C. Na każdej szalce wykluje się około 15-20 jaj.
  4. Zwierzęta należy zbierać między 14-16 godzinami i 28-30 godzinami po wykluciu, odpowiednio dla stadium larwalnego 2 (L2) i larwy 3 (L3). Przenieś zwierzęta do urządzenia mikroprzepływowego w celu obrazowania. Dodaj zapas pokarmu zgodnie z opisem w następnej sekcji, aby utrzymać zwierzę wewnątrz urządzenia do długotrwałych eksperymentów związanych z wzrostem i obrazowaniem.

4. Wzrost C. elegans wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego do wzrostu i obrazowania

  1. Zamontuj urządzenie mikroprzepływowe do wzrostu i obrazowania na mikroskopie odwróconym i view wzór 2, po połączeniu membran izolacyjnych i membrany unieruchamiającej, przy małych powiększeniach (4x lub 10x). Upewnij się, że kanały są wypełnione czystą wodą destylowaną.
  2. Przygotować świeży 1 l roztwór pożywki S, używając 10 ml 1 M cytrynianu potasu o pH 6,0, 10 ml roztworu metali śladowych, 3 ml 1 M CaCl2, 3 ml 1 M MgSO4. Przygotować roztwór w sterylnych warunkach. Nie sterylizować w autoklawie pożywki S.
  3. Napełnij kanał przepływowy pożywką wzrostową (pożywka S) 10 minut przed eksperymentem. Unikaj pęcherzyków powietrza w kanale przepływowym. W razie potrzeby przelej dodatkowe medium, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
  4. Za pomocą mikropipety należy pobrać pojedyncze zwierzę z wymaganego stadium rozwojowego z płytki NGM w 10 μl pożywki S i wepchnąć zwierzę do kanału przepływowego przez otwór wlotowy.
  5. Monitoruj pozycję zwierzęcia w kanale przepływowym za pomocą obiektywu o małym powiększeniu. Przepuść dodatkowe medium przez wlot lub wylot, aby popchnąć zwierzę i umieścić je w kanale przepływowym ograniczonym między dwiema membranami izolacyjnymi.
  6. Otwórz trójdrogowy zawór odcinający, aby zastosować ciśnienie 14 psi w kanałach izolacyjnych i wepchnij membrany w dół do kanału przepływowego.
    UWAGA: Membrana częściowo uszczelnia kanał przepływowy i ogranicza ruch zwierząt do obszaru między dwiema membranami izolacyjnymi.
  7. Użyj pojedynczej kolonii E. coli OP50 z płytki z prążkami, aby zaszczepić 250 ml bulionu L (2,5 g bakto-tryptonu, 1,25 g drożdży bakto-drożdżowych, 1,25 g NaCl w H2O). Zaszczepioną kulturę hodować przez noc w temperaturze 37 °C.
  8. Porcję 500 μl kultury OP50 rozlać do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i przechowywać bulion i podwielokrotność przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C.
  9. Osad OP50 należy rozprowadzić przez odwirowanie w ilości 1,3 x g przez 5 min. Rozpuść osad w 1 ml świeżej pożywki S (0,5x rozcieńczenie) i przechowuj w temperaturze pokojowej przez 3-4 dni. Użyj tego rozcieńczonego OP50 do karmienia C. elegans wewnątrz urządzeń mikroprzepływowych.
  10. Pozostaw kroplę medium S na górze zbiorników wlotowych i wylotowych, aby zmniejszyć parowanie medium S w kanale przepływowym.
  11. Pobrać rozcieńczony roztwór OP50 do mikropipety o pojemności 10 μl. Wyjmij z pipety mikrokońcówkę wypełnioną roztworem OP50 i wciśnij końcówkę do zbiornika wlotowego. Następnie umieść kolejną końcówkę mikropipety z 10 μl roztworu spożywczego i włóż ją do zbiornika wylotowego.
  12. Uszczelnij głowicę końcówki, dociskając palcem, aby zapewnić ciągłość roztworów spożywczych bez szczeliny powietrznej. Końcówkę mikropipety z roztworem OP50 należy wymieniać codziennie, nie wcześniej niż 3-4 dni.
  13. Uzupełnij dodatkowe 20-30 μl roztworu spożywczego do obu końcówek. Dodaj lub usuń roztwór pokarmowy do i z końcówki mikropipety, aby dostosować gradient w celu wepchnięcia zwierzęcia do kanału przepływu i dostosowania pozycji zwierzęcia pod membraną pułapki w celu obrazowania.
  14. Monitoruj przepływ bakterii, aby upewnić się, że jest on ciągły przez częściowo zamknięte membrany izolacyjne w kanale przepływowym, korzystając z obrazów w jasnym polu.
    UWAGA: W przypadku braku przepływu bakterii zwierzęta mogą zjadać dostępne bakterie w kanale przepływowym między dwiema membranami izolacyjnymi. W przypadku braku bakterii lub braku przepływu w kanale, wymień dwie końcówki mikropipet na wlocie i wylocie na nowe końcówki do pipet wypełnione świeżo przygotowanymi zapasami żywności.

5. Unieruchomienie i obrazowanie C. elegans

  1. Unieruchomienie C. elegans pod membraną pułapkową
    1. Zlokalizuj pojedyncze zwierzę w kanale wzrostu przy małych powiększeniach. Wyreguluj wysokość roztworu spożywczego w dwóch końcówkach mikropipet podłączonych do zbiorników wlotowych i wylotowych. Popchnij zwierzę w wymaganym kierunku, wykorzystując różnice ciśnień hydrostatycznych w kanale przepływowym.
    2. Umieść zwierzę na środku membrany pułapki i monitoruj jego zachowanie podczas pływania za pomocą obiektywu o małym powiększeniu (4x).
    3. Przekręć zawór trójdrogowy, aby powoli zwiększać ciśnienie w kanale syfonu. Unieruchomić zwierzę pod membraną pułapki w prostej pozycji wzdłuż ściany granicznej kanału wzrostu.
      UWAGA: Unikaj przytrzymywania zwierzęcia w poprzek kanału przepływu w pozycji zgięcia Z lub U. Powoduje to, że ciało zwierzęcia jest ściskane z większym naciskiem i powoduje trwały uszczerbek na jego zdrowiu.
  2. Obrazowanie C. elegans i uwalnianie z błony
    1. Przenoś i załaduj urządzenie na stolik mikroskopu. Ustaw mikroskop odwrócony z żądanymi ustawieniami obrazowania ze wszystkimi niezbędnymi elementami optycznymi (obiektywem, źródłem światła, filtrami fluorescencyjnymi i detektorem) do uzyskania jasnego pola o wysokiej rozdzielczości, kontrastu obrazowania różnicowego (DIC) lub obrazowania fluorescencyjnego (rysunek uzupełniający 1).
    2. Uzyskaj jeden lub kilka poklatkowych obrazów fluorescencyjnych, aby uchwycić zdarzenia komórkowe i subkomórkowe.
    3. Uzyskaj obrazy fluorescencyjne neuronów C. elegans w funkcji ich rozwoju za pomocą obiektywu 60x z aperturą numeryczną (NA) 1,4, lasera o długości fali 488 nm z mocą lasera 7%-10%, kamery CCD, na mikroskopie z obracającym się dyskiem. Wykonaj obrazowanie poklatkowe za pomocą oprogramowania dostarczonego z mikroskopem i uzyskaj obrazy z prędkością 4 klatek na sekundę (rysunek uzupełniający 1).
    4. Po uzyskaniu obrazów zwolnij ciśnienie pułapki i monitoruj lokomocję zwierzęcia przy małych powiększeniach - 4x i 10x. Utrzymuj zwierzę ograniczone w obszarze określonym przez błony izolacyjne (utrzymywane poniżej 14 psi przez cały czas trwania eksperymentu).
    5. Dostosuj objętość roztworu spożywczego w dwóch końcówkach mikropipet, aby kontynuować powolny, napędzany grawitacją przepływ żywności w kanale wzrostu. Ten przepływ żywności uzyskuje się poprzez regulację poziomów roztworów spożywczych w mikropipetach na wlocie i wylocie (zwykle różnica wysokości 1-5 mm).
    6. Wizualizuj przepływ w jasnym polu na podstawie wzorca przepływu bakterii w kanale wzrostu.
      UWAGA: W przypadku braku przepływu zwierzę zjada dostępne bakterie OP50, kanał wydaje się czysty, a zwierzę głoduje przez kilka godzin. Wygłodzone zwierzę zazwyczaj rozwija wysoką autofluorescencję, łatwą do zaobserwowania podczas uzyskiwania poklatkowych obrazów fluorescencyjnych. Takie zdarzenia mają szkodliwy wpływ na fizjologię zwierząt i unikano ich w eksperymentach.
    7. Powtórz kroki 5.2.1-5.2.3 po upływie określonego czasu, aby uzyskać obrazy fluorescencyjne/DIC/jasnego pola tej samej osoby w wielu punktach czasowych.
    8. Po uzyskaniu obrazów w wielu pożądanych punktach czasowych od tego samego zwierzęcia, zwolnij ciśnienie izolacji i pułapki. Przepłukać kanał buforem M9 i przepchnąć zwierzę przez zbiornik wlotowy. Odzyskaj zwierzę ze zbiornika i umieść je na świeżej płytce NGM w celu dalszego monitorowania stanu zdrowia.
    9. Przepłucz kanał buforem M9 kilka razy, aby usunąć bakterie. Przepłukać kanał przepływowy 70% alkoholem etylowym (rozcieńczonym w wodzie destylowanej). Osuszyć kanały, przepychając powietrze za pomocą strzykawki. Przechowuj urządzenie w suchym, wolnym od kurzu miejscu do wielokrotnego użytku w przyszłości.
  3. Analiza obrazu i statystyka
    1. Użyj oprogramowania FIJI ImageJ do analizy obrazu tiff. Otwórz obrazy tiff zdjęć poklatkowych PVD ze zwierząt wdIs51 na Fidżi ImageJ. Wyodrębnij najlepsze płaszczyzny ze stosu płaszczyzn Z pokazujących podstawowe procesy, wybierając kartę Obraz > Stosy > projekcie Z.
    2. Prześwietl całą serię obrazów i znajdź określone klatki obrazu, które z powodzeniem obejmują całe procesy neuronalne, używając nakładających się na siebie sekcji ramek obrazu zwierzęcia. Wybierz opcję Plugin > Analyze > Cell Counter (Analizuj licznik komórek) z paska narzędzi FIJI. Otworzy się okno do numerowania różnych gałęzi i liczenia każdego wybranego neuronu.
    3. Wybierz pozycję Zainicjuj liczniki > > Type1, a następnie zaznacz gałęzie pomocnicze. Następnie wybierz Typ 2 i zaznacz Czwartorzęd, kliknij okno Wyniki pokazujące liczby wszystkich gałęzi (Rysunek uzupełniający 2). Ta metoda spowoduje wyświetlenie gałęzi, które są już zliczone.
    4. Otwórz następny nakładający się obraz i policz pozostałe gałęzie. Ten proces zapobiegnie podwójnemu liczeniu i zapewni, że każdy proces zostanie zliczony. Zidentyfikuj i policz całkowitą liczbę gałęzi pierwszorzędowych obecnych we wczesnych stadiach larwalnych C. elegans. Podobną analizę należy przeprowadzić dla obrazów procesów wtórnych i czwartorzędowych u starszych zwierząt.
      UWAGA: Dorośli wykazują wiele procesów, które unerwiają mięśnie ściany ciała i mogą być trudne do zliczenia. Upewnij się, że każdy proces jest liczony tylko raz.
    5. Oblicz odległość między ciałami komórek PVD w zwierzętach wdIs51, rysując linię segmentową od korpusu ogniwa PVD (CB) do PVC CB. W przypadku zwierząt w stadium larwalnym 4 (L4) ciała komórek są daleko od siebie i nie znajdują się w tym samym kadrze podczas obrazowania obiektywem 60x.
    6. Wybierz nakładające się obrazy ze stosu, aby pokryć całą długość zwierzęcia od głowy do ogona, korzystając z karty Obraz > projektu Stosy > Z z ImageJ. Narysuj segmentowe linie wzdłuż procesu neuronalnego między PVD i PVC CB.
    7. Zmierz długości wszystkich linii podzielonych na segmenty za pomocą funkcji ImageJ > Analizuj > Mierz. Dodaj długości wszystkich segmentów, aby obliczyć całkowitą odległość między liniami CB PVD i PVC dla każdego punktu czasowego.
    8. Aby uzyskać informacje o długości neuronów TRN u zwierząt jsIs609, załaduj obrazy w Fidżi. Narysuj segmentowaną linię wzdłuż tylnych bocznych mikrotubul (PLM; widocznych z rozpuszczalnym GFP) od ciała komórki do środka ciężkości pierwszego mitochondrium. Oblicz długość linii dla pierwszej wartości odległości.
    9. Narysuj linię segmentową od środka pierwszego do drugiego mitochondrium. Powtórz ten proces dla każdej pary mitochondriów aż do końca długości procesu neuronalnego. Dodaj wszystkie długości, aby obliczyć całkowitą długość procesu neuronalnego.
    10. Aby przeprowadzić analizę linii komórkowej, załaduj wszystkie obrazy sromu na Fidżi i wyodrębnij najlepszy obraz ostrości komórek z obrazów poklatkowych wielu płaszczyzn z.
    11. Przedstawić dane jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM). Obliczanie istotności statystycznej przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA dla więcej niż dwóch próbek lub testu t dla dwóch prób dla pary próbek. Oznacz istotność za pomocą wartości p < 0,05 (*), wartości p < 0,005 (**), a wartości p > 0,05 (ns, nieistotna).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka urządzenia: Urządzenie do wzrostu i obrazowania składa się z dwóch warstw PDMS połączonych ze sobą (Rysunek 1) za pomocą nieodwracalnego wiązania plazmowego. Warstwa przepływowa (wzór 1), która ma 10 mm długości i 40 μm lub 80 μm wysokości, pozwala nam hodować zwierzę w płynnej kulturze (Rysunek 1A). Warstwa pułapkowa (wzór 2) ma membranę o szerokości 2 mm (Rysunek 1B) do unieruchamiania zwierzęcia w celu obrazowania w wysokiej r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy opisano protokół wytwarzania i stosowania prostego urządzenia mikroprzepływowego do hodowli C. elegans ze stałym dopływem pokarmu i obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości pojedynczego zwierzęcia podczas jego rozwoju. Ten proces wytwarzania jest prosty i można go przeprowadzić w niesterylnym środowisku. Środowisko wolne od kurzu ma kluczowe znaczenie na etapach produkcji. Obecność cząstek pyłu doprowadziłaby do niewłaściwego kontaktu między dwiema powierzchniami łączącymi, co skutkowałoby słaby...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.M. i S.P.K. są autorami oczekującego na opatentowanie urządzenia do mikroprzepływowego wzrostu i obrazowania (zgłoszenie patentowe nr 640/CHE/2011).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy ośrodku obrazowania CIFF, NCBS za korzystanie z mikroskopów konfokalnych wspieranych przez DST - Centrum Nanotechnologii (No. SR/55/NM-36-2005). Dziękujemy za finansowanie badań z DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), spinning disc wspieranego przez DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK i Gautam Menon) oraz grantu HHMI-IECS numer 55007425 (SPK). Szczepy HB101, PS3239 i wdIs51 zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center (CGC), które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). S.P.K. wyprodukował jsIs609 w laboratorium Mike'a Noneta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły 18 GSigma-Aldrich, Bangalore, IndieMiernik 18
3-drogowy kranCole-ParmerWW-30600-02Złączka Masterflex z blokadą typu luer lock
Kamera CCDAndor TechnologyEMCCD C9100-13no
Folia do obwodów drukowanychFine Line Imaging, Kolorado, USAProjekty są drukowane z 65 024 punktami na cal (DPI)
Piec konwekcyjnyMeta-Lab Scientific Industries, IndieMSI-5
Szkiełka nakrywkoweNiebieskie mikroskopijne szkło nakrywkowe stat22mm x 10Gms
  IKARCT B S 22
IsopropanolFisher Scientific26895
KOHFisher Scientific
Laserowy mikroskop skaningowyZEISSLSM 5 LIVE
Końcówki do mikropipetTarsons0,5-10 i mikro; Końcówki do mikropipet L służą do zaopatrzenia w żywność
Negative Photoresist-1MicrochemSU8-2025http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2MicrochemSU8-2050http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Azot gazowyLokalny dostawcaKomercyjny gaz azotowyPojemność butli 7 metrów sześciennych
PDMS (roztwór utwardzający)Dow Corning Corporation, Michigan, Stany Zjednoczone  Sylgard roztwórutwardzający utwardzacz
PetriegoPraveen Scientific Corporation
Środek do czyszczenia plazmyHarrick Plasma, NY, USA&nbsp; PDC-32G
Maszynka do golenia i ostrzaLister chirurgiczne Ostrze
Elastomer silikonowy (podstawa)Dow Corning Corporation, MI, USAPodstawa elastomerowaSylgard 184
Rurki silikonoweFisher ScientificRurki plastikowe o średnicy wewnętrznej 1,59 mm i średnicy zewnętrznej 3,18 mm
Wafel krzemowyWafer, MA, USA[100] orientacja, 4 cale średnicaMałe kawałki (2 mm i razy 2 mm) zostały wycięte z wafla o średnicy 100 mm
Spin CoaterSPS-Europe B.V., HolandiaMikroskop SPIN 150
Spinning DiskSystem Perkin Elmer ultra-view VOXCSU-X1-A3 NSystem został wyposażony w cztery lasery (405/488/561/640 nm) i sterowany za pomocą pakietu oprogramowania Volocity.
Deweloper SU8Microchem, MA, USASU8
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo) silanSigma-Aldrich, Bangalore, Indie448931Opary trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylu) silanu są toksyczne
Lampa UVOriel Instruments, Bangalore, Indie200 W i skolimowane źródło światła UV
Oprogramowanie Volocity ObrazPerkina-Elmera analiza
Etanol Hi media Jednordzeniowy dziurkacz Harris 1mm Qiagen Z708801 Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, Indie 440191 Płyta grzejna płytki University Deweloper

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435(2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037(2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023(2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530(2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192(2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500(2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499(2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938(2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Microfluidic ChipCaenorhabditis ElegansLong Term ImagingWorm ImmobilizationPDMS DeviceNeuronal Process GrowthDendritic ArborizationNitrogen Gas ImmobilizationTime Lapse ImagingDevelopmental Biology

Powiązane artykuły