Method Article

Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

DOI:

10.3791/63137

⸱

February 10th, 2022

 ,  , 
1Research Group Pharmaceutical Biotechnology, TH Köln - University of Applied Sciences, 2Institute of Technical Chemistry, Leibniz University Hannover

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia wirusa Gag.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test wychwytywania cząsteczek wirusopodobnych (VLP) to metoda immunoprecypitacji, powszechnie znana jako 'test pull-down', używany do oczyszczania i izolowania VLP wyświetlających antygen. Przeciwciała specyficzne dla antygenu powierzchniowego są sprzężone, a tym samym unieruchomione na stałej i nierozpuszczalnej matrycy, takiej jak kulki. Ze względu na ich wysokie powinowactwo do antygenu docelowego, przeciwciała te mogą wychwytywać VLP ozdobione pokrewnym antygenem zakotwiczonym w otoczce błonowej VLP. Protokół ten opisuje wiązanie przeciwciał specyficznych dla antygenu z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem A lub G. W naszym badaniu badane są VLP pochodzące z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) utworzone przez specyficzne dla grupy białko prekursorowe rdzenia wirusa p55 Gag i wykazujące glikoproteiny otoczki (Env) HIV. VLP są wychwytywane przy użyciu szeroko neutralizujących przeciwciał (bNAb) skierowanych przeciwko wrażliwym na neutralizację epitopom w Env. Opisany tutaj test wychwytywania VLP stanowi czułą i łatwą do wykonania metodę wykazania, że (i) VLP są ozdobione odpowiednim antygenem docelowym, (ii) antygen powierzchniowy zachował swoją integralność strukturalną, jak wykazano przez specyficzne dla epitopu wiązanie bNAb użyte w teście oraz (iii) integralność strukturalną VLP ujawnioną przez wykrycie białek Gag w późniejszej analizie Western blot. W związku z tym wykorzystanie bNAbs do immunoprecypitacji ułatwia przewidywanie, czy szczepionki VLP będą w stanie wywołać neutralizującą odpowiedź limfocytów B u zaszczepionych ludzi. Przewidujemy, że protokół ten dostarczy innym badaczom cennego i prostego podejścia eksperymentalnego do badania potencjalnych szczepionek opartych na VLP.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cząsteczki wirusopodobne (VLP) przypominają strukturę natywnych cząsteczek wirusa, ale nie mają genomu wirusa, zapewniając tym samym wysoki profil bezpieczeństwa1,2. VLP reprezentują indywidualną klasę szczepionek, które są coraz częściej rozwijane ze względu na ich wysoką immunogenność3,4,5,6,7. Dotyczy to w szczególności VLP z powłoką błonową, co pozwala na wyświetlanie nie tylko homologicznych antygenów powierzchniowych wirusa, ale także antygenów heterologicznych, takich jak antygeny nowotworowe8,9,10. Rysunek 1 przedstawia przykładowy przegląd struktury VLP ozdobionego antygenem w otoczce. Podczas procesu opracowywania szczepionek opartych na VLP niezbędne są testy umożliwiające analizę odpowiedniego docelowego antygenu wyświetlanego na powierzchni VLP. Takie testy powinny mieć zasadnicze znaczenie dla wyjaśnienia składu szczepionki w postaci cząstek stałych: (i) Czy VLP są ozdobione odpowiednim antygenem powierzchniowym? (ii) Czy antygen powierzchniowy zachował swoją natywną strukturę, jak wykazano przez rozpoznawanie przez epitopy przeciwciał neutralizujących (bNAbs) oraz (iii) czy integralność strukturalna VLP może zostać potwierdzona dzięki wykryciu białka wirusowego pośredniczącego w tworzeniu VLP?

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja VLP z powłoką membranową. VLP są tworzone przez niedojrzałe białka rdzeniowe prekursorów Gag i otoczone błoną lipidową pochodzącą z komórki gospodarza. Antygeny, np. glikoproteiny otoczkowe, są włączane do błony lipidowej i wyświetlane na powierzchni VLP (po prawej). Przeciwciała specyficzne dla antygenu rozpoznają antygen. Po lewej stronie pokazany jest łysy VLP bez dekoracji antygenowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Szczególnie VLP utworzone przez białko prekursorowe p55 ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) stworzone przez specyficzny dla grupy wirusowej antygen (Gag) są preferowanymi rusztowaniami do wyświetlania antygenów w procesie opracowywania szczepionek, ponieważ dostępne są liczne przeciwciała, a zestawy ELISA umożliwiają ilościowe określenie tych VLPs11,12. Glikoproteiny otoczki HIV-1 (Env), a mianowicie białko transbłonowe gp41 (gp41-TM) i rozpuszczalna jednostka powierzchniowa gp120 (gp120-SU) tworzące heterodimery, są włączane do otoczki błonowej cząstek i są kluczowymi antygenami docelowymi do opracowania szczepionek przeciwko zakażeniu wirusem HIV13,14,15. Wykazanie wrażliwych na neutralizację epitopów w tych docelowych antygenach jest warunkiem wstępnym do wywołania szeroko neutralizującej odpowiedzi przeciwciał u osób zaszczepionych. Oprócz odpowiedzi limfocytów T skierowanej przeciwko białkom Gag, jest to uważane za ważny korelat ochrony przed zakażeniem wirusem HIV16. W związku z tym, a także po zaprojektowaniu i wyprodukowaniu VLP ozdobionych kandydatami na docelowe antygeny, późniejsza analiza jakości wyświetlanych antygenów stanowi krytyczny krok w procesie opracowywania szczepionki.

Immunoprecypitacja (IP) jest powszechnie stosowaną techniką do wykrywania interakcji białko-białko i oczyszczania kompleksów białkowych na małą skalę17. Barret i wsp. Po raz pierwszy poinformowano o rozwoju własności intelektualnej w 1960 r., jednak metoda ta jest stale ulepszana. IP umożliwia przechwycenie i wyizolowanie docelowego antygenu (ofiary) z roztworu poprzez zastosowanie przeciwciała specyficznego dla antygenu (przynęty) unieruchomionego przez sprzężenie z kulkami18,19. W tym protokole demonstrujemy odmianę klasycznej aplikacji IP przy użyciu VLP utworzonych przez p55 Gag z otoczką błonową jako zdobyczy i bNAb, które rozpoznają wrażliwe na neutralizację epitopy w białkach otoczki wyświetlanych na powierzchni VLP jako białka przynęty. Pomyślne zastosowanie tego testu wychwytywania VLP ułatwia przewidywanie, czy testowane VLP z dodatnim antygenem będą w stanie wywołać neutralizującą odpowiedź komórek B u osób zaszczepionych. Takie właściwości immunogenne kandydatów na szczepionki oparte na VLP są często wykazywane w małych modelach zwierzęcych20,21,22.

Aby ocenić jakość nowo opracowanego kandydata na szczepionkę VLP, z powodzeniem zastosowano testy wychwytywania VLP5,23,24. Jednak liczba opublikowanych metod jest ograniczona. Przedstawiony tutaj test wychwytywania VLP rozpoczyna się od unieruchomienia bNAb specyficznych dla Env na kulkach sprzężonych z białkiem G, które wiążą się z regionem Fc przeciwciał pochodzących od ssaków. Typowymi matrycami do unieruchomienia wybranego przeciwciała są agaroza lub kulki magnetyczne. Jednak kulki magnetyczne są korzystne dla zastosowań o wysokiej przepustowości25. W następnym kroku VLP wyświetlające docelowy antygen są wychwytywane przez kulki pokryte bNAb. Utworzone kompleksy immunologiczne składające się z Env-dodatnich VLP i unieruchomionych bNAb można łatwo wzbogacić za pomocą magnesu. Wyizolowane kompleksy immunologiczne są eluowane w ostatnim etapie. Następnie VLP można scharakteryzować biochemicznie. Tutaj przeprowadziliśmy analizę Western blot z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia wirusa p55 Gag, aby wykazać, że wytrącone docelowe antygeny Env nie tylko zawierały wrażliwe na neutralizację epitopy, ale były również wyświetlane na VLP utworzonych przez Gag. Co więcej, wykrycie białek Gag rdzenia wirusa zwiększa czułość testu wychwytywania, ponieważ białka Gag występują w większej ilości niż Env w VLP. W HIV-1 białka Env są obecne tylko w liczbie jedno- lub dwucyfrowej26, podczas gdy ponad 3500 cząsteczek Gag tworzy rdzeń cząstki27.

W porównaniu z innymi technikami badania interakcji białko-białko28,29, test przechwytywania VLP stanowi alternatywną metodę dla laboratoriów badawczych, które nie mają dostępu do drogich instrumentów analitycznych. Na przykład analiza transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), spektroskopia powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR) i analiza śledzenia nanocząstek (NTA) mogą być kosztowne. Przedstawiony tutaj test wychwytywania pozwala również na późniejsze poddanie przechwyconych próbek VLP z dodatnim antygenem dalszej charakterystyce białek, np. z zastosowaniem odpowiednio elektroforezy żelowej, immunoblottingu, mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas (MS). Biorąc pod uwagę, że natywna struktura docelowego antygenu jest zachowywana podczas testu wychwytywania VLP, można również wykorzystać działanie natywnej PAGE i późniejszych technik immunoblottingu.

Test wychwytywania VLP reprezentuje łatwą w użyciu i czułą metodę badania dekoracji VLP docelowymi antygenami, eksponując epitopy wrażliwe na neutralizację, a tym samym ich użyteczność jako przyszłych kandydatów na szczepionki.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki

  1. Zasiewaj linie komórek zawiesinowych producenta VLP pochodzące z komórek 293-F wykazujących ekspresję genów strukturalnych HIV gag samodzielnie lub w połączeniu z env 30 przy niskiej gęstości komórek 0,5 x 106 komórek na ml w pożywce ekspresyjnej 293-F.
  2. Pozwól im rozszerzać się przez 3-4 dni w temperaturze 37 °C i 8% CO2 w inkubatorze wytrząsarki obracającej się z orbitą 5 cm i 135 rundami na minutę (obr./min).
  3. Komórki produkcyjne osadzać przez odwirowanie przy 100 x g przez 5 minut. Przefiltrować oczyszczony supernatant w celu usunięcia resztek komórek i resztek komórkowych za pomocą filtrów strzykawkowych z membraną z polifluorku winylidenu (PVDF) 0,45 μm w celu uzyskania bezkomórkowego supernatantu do hodowli komórkowych (CFSN).
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. CFSN można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Albo użyć CFSN bezpośrednio do eksperymentu, albo osadzać VLP z 35 ml CFSN, stosując ultrawirowanie (112 700 x g, 4 °C, 1,5 h).
  5. Po ultraodwirowaniu wyrzucić supernatant i zawiesić granulki VLP w 200 μl 15% (w/v) roztworu trehalozy na probówkę wirówkową.
    UWAGA: Granulka VLP często nie jest widoczna gołym okiem. W tym miejscu protokół można wstrzymać. VLP mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.
  6. Przed testem wychwytywania VLP należy określić stężenie białka rdzeniowego wirusa w próbkach zawierających VLP za pomocą testu ELISA. Ten krok jest ważny dla standaryzacji danych wejściowych testu przechwytywania.

2. Test wychwytywania VLP

UWAGA: Przegląd przepływu pracy jest przedstawiony w Rysunek 2.

  1. Zawiesić kulki magnetyczne, pipetując w górę i w dół lub mieszając na rotatorze z prędkością 50 obr./min przez co najmniej 5 minut.
  2. W międzyczasie należy przygotować roztwór przeciwciał zawierający bNAbs. Użyć 10 μg każdego bNAb w 200 μl buforu wiążącego i myjącego przeciwciała (patrz tabela materiałów) na reakcję.
    UWAGA: Ilości przeciwciał mogą się różnić w zależności od powinowactwa bNAb i gęstości dekoracji antygenu na użytych VLP.
  3. Użyć 50 μl roztworu kulek magnetycznych (patrz Tabela materiałów) na reakcję i przenieść kulki do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Umieść probówki na stojaku do separacji magnetycznej.
    UWAGA: Alternatywnie, do każdej rurki można użyć silnego pojedynczego magnesu, aby oddzielić kulki od supernatantu.
  4. Poczekaj kilka minut, aż koraliki zbiorą się na ściance rury, aby upewnić się, że wszystkie koraliki zostały zebrane. Usunąć supernatant.
  5. Usunąć magnes i zawiesić kulki w 200 μl roztworu bNAb przygotowanego w kroku 2.2. Inkubować przez 30 minut do 3 godzin, mieszając na rotatorze przy 50 obr./min w temperaturze pokojowej.
  6. Ponownie umieścić probówki reakcyjne w stojaku do separacji magnetycznej, odczekać i usunąć supernatant.
  7. Wyjmij probówki z magnesu i umyj kulki, ponownie zawieszając w 200 μl buforu wiążącego przeciwciała i myjącego.
  8. Powtórz krok 2.4. Usuń jak najwięcej buforu do mycia.
  9. Dodaj próbki do powiązanego ze stopkami bNAbs.
    UWAGA: Wejście VLP do testu wychwytywania przy użyciu cząstek pochodzących z HIV powinno wynosić co najmniej 15 ng białka rdzenia wirusa na reakcję. Ilości VLP mogą się różnić w zależności od powinowactwa bNAb i gęstości dekoracji antygenu na użytych VLP.
  10. Jeśli objętość próbki dodanej w kroku 2.9 jest mniejsza niż 1 ml, dodaj PBS, aby dostosować objętość próbki do 1 ml. Delikatnie zawiesić kulki, pipetując.
  11. Inkubować próbki i kulki przez 2,5 godziny na rotatorze w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że kulki pozostają w zawiesinie, a roztwór jest dokładnie wymieszany podczas inkubacji.
  12. Umieść rurki na magnesie i usuń supernatant.
  13. Umyj kulki magnetyczne, zawieszając je w 200 μl buforu myjącego (patrz Tabela Materiałów). Powtórz krok prania trzy razy.
  14. Zawiesić kulki w 100 μl buforu płuczącego i przenieść zawiesinę do czystej (żaroodpornej) rurki reakcyjnej.
  15. Umieścić probówkę na stojaku do separacji magnetycznej (patrz Tabela materiałów) i całkowicie usunąć supernatant.
  16. Przygotować zdenaturowane próbki SDS-PAGE zgodnie z krokami 2.16.1-2.16.2 lub próbki niedenaturowane, eluując VLP z kulek magnetycznych zgodnie z krokami 2.16.3-2.16.5.
    1. Aby przygotować zdenaturowane próbki SDS-PAGE, zawiesić kulki w 20–80 μl buforu Laemmli (0,8 μl buforu Laemmli na 1 ng wejściowego testu p55 Gag) i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    2. Postępuj bezpośrednio z SDS-PAGE lub przechowuj próbki w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Bufor Laemmli zawiera 2-merkaptoetanol i dodecylosiarczan sodu. Nosić rękawice ochronne i okulary ochronne. Unikaj kontaktu ze skórą, oczami i ubraniami. Nie wdychać oparów. Pracuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, np. pod wyciągiem.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    3. Alternatywnie należy wykonać etap elucji bez denaturacji, aby otrzymać VLP z zachowaną natywną strukturą białkową.
    4. Dodać 25 μl buforu elucyjnego (często dostarczanego z kulkami) do kulek magnetycznych i inkubować przez 2-5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Usuń kulki i przenieś eluat do czystej probówki. Eluat należy wykorzystać do kolejnych testów lub przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Analiza przechwyconych próbek VLP

UWAGA: W celu analizy przechwyconych VLP, przeprowadź SDS-PAGE, a następnie Western blot-analysis31,32.

  1. Umieść probówki z próbkami na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od roztworu.
  2. Załadować 10 μl każdej próbki do indywidualnych studzienek żelu.
    UWAGA: W tym protokole wirusowe białka rdzeniowe p55 Gag wykryto przy użyciu poliklonalnych przeciwciał króliczych skierowanych przeciwko HIV Gag i drugorzędowych poliklonalnych przeciwciał anty-króliczych IgG kurczaka sprzężonych z przeciwciałami peroksydazy chrzanowej (HRP). Białka rdzenia wirusa zwizualizowano za pomocą detekcji chemiluminescencyjnej.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schematyczna ilustracja kluczowych etapów testu wychwytywania VLP przy użyciu supernatantów bezkomórkowych. (1) Test wychwytywania VLP rozpoczyna się od wiązania bNAb HIV-1 z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. W międzyczasie przygotowuje się roztwór VLP o określonym stężeniu p55. Supernatant do hodowli bezkomórkowych składa się z mieszaniny p55 Gag VLPs, białek komórek gospodarza i kwasów nukleinowych. (2) Kulki magnetyczne sprzężone z bNAbs i roztworem VLP przenosi się do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml, a następnie inkubuje się pod wpływem rotacji. (3) VLP wyświetlające antygen są wychwytywane przez kulki pokryte bNAbs. Oddzielenie tych kompleksów immunologicznych od zanieczyszczeń pochodzących z komórek gospodarza odbywa się w polu magnetycznym. (4) Supernatant usuwa się przez pipetowanie, a kulki przemywa się trzykrotnie w celu usunięcia niezwiązanych VLP. (5) W następnym kroku do kompleksów immunologicznych składających się z kulek magnetycznych pokrytych bNAbs i wychwyconych VLP dodaje się bufor redukujący białko. (6) Gotowanie próbki dysocjuje bNAbs i antygen docelowy od kulek magnetycznych i powoduje lizę VLP. (7) Kulki magnetyczne są oddzielane od roztworu w polu magnetycznym. (8) Próbki białek poddaje się SDS-PAGE. (9) Analizę Western blot przeprowadza się w celu wykrycia wirusowych białek rdzeniowych p55 Gag. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 3 pokazuje reprezentatywny wynik VLP najpierw wychwyconych z granulek CFSN i VLP, odpowiednio, przy użyciu bNAbs, a następnie poddanych analizie Western blot w celu wykrycia białek rdzenia wirusa. Kulki użyte do testu wychwytywania zostały pokryte trzema różnymi bNAbami skierowanymi przeciwko wrażliwym na neutralizację epitopom glikoprotein Env i przeciwciałom izotypowym służącym odpowiednio jako kontrola ujemna. Używając kulek pokrytych przeciwciałami izotypowymi, nie wykryto żadnych białek Gag w próbkach zawierających Env-ujemne (łyse VLP) lub VLP wyświetlające Env przy użyciu analizy Western blot. Wykazało to, że niespecyficzne wiązanie VLP z kulkami pokrytymi ludzkimi przeciwciałami nie pośredniczyło w wychwytywaniu VLP. Łyse VLP nie były również związane przez kulki pokryte bNAbs, a co za tym idzie, ponownie, nie wykrywano żadnych białek Gag. W przeciwieństwie do tego, wszystkie trzy bNAb wychwyciły VLP wykazujące białka Env (Env VLP), a zatem białka Gag były następnie łatwo wykrywane. Jak widać na Rysunek 3, test wychwytywania może być wykorzystany do analizy docelowego antygenu wyświetlającego VLP odpowiednio w próbkach CFSN i granulowanych VLP.

figure-results-1
Rysunek 3: Wykrywanie wrażliwych na neutralizację epitopów w glikoproteinach otoczki HIV-1 wyświetlanych na VLP utworzonych przez p55 Gag przy użyciu szeroko neutralizujących przeciwciał. Reprezentatywne wyniki analizy Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia wirusa Gag po przeprowadzeniu testu wychwytywania VLP z wykorzystaniem trzech różnych szeroko neutralizujących przeciwciał (bNAb 1, bNAb 2 i bnAb 3) ukierunkowanych na epitopy w glikoproteinach otoczki HIV-1 (Env). Przeciwciała ludzkie o izotypie zebrane z surowic ludzkich służyły jako kontrola negatywna. Supernatanty do hodowli komórkowych zebrano z zawiesinowych kultur komórkowych wytwarzających VLP z białkami Env (Env VLPs) i łysymi VLP (Env-ujemnymi), a także z komórek naiwnych niewykazujących ekspresji żadnych białek wirusowych (mock). Zarówno supernatanty z łysej hodowli komórkowej producenta VLP, jak i z pozorowanej hodowli komórkowej służyły jako kontrole negatywne. Supernatanty uwolniono od zanieczyszczających komórek za pomocą wirowania z niską prędkością, a następnie filtracji w celu uzyskania supernatantów bezkomórkowych (CFSN) do analizy. Po immunoprecypitacji przeprowadzono analizę Western blot przy użyciu poliklonalnych przeciwciał króliczych skierowanych przeciwko koniugatom Gag i drugorzędowym koniugatom anty-króliczym IgG-HRP. Pozorna masa cząsteczkowa w kilodaltonach (kDa) widoczna na podstawie markera masy cząsteczkowej (MW) jest przedstawiona po lewej stronie. Strzałki wskazują wykryte białko prekursorowe p55 Gag. (A) Dla każdej próbki, CFSN zawierający 100 ng białka Gag zastosowano do testu wychwytywania w celu standaryzacji ilości wejściowej VLP. CFSN inkubowano bezpośrednio z kulkami pokrytymi przeciwciałami. (B) Granulki VLP otrzymano przez ultrawirowanie CFSN. Granulki zawierające 100 ng białka Gag zastosowano do testu wychwytywania przy użyciu przeciwciał izotypowych i bNAb 3. Próbki dla bNAb 1 i bNAb 2 zawierały tylko 25 ng Gag. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed testem wychwytywania VLP należy ocenić tworzenie VLP i ekspresję docelowego antygenu w liniach komórkowych producentów VLP. Metody instrumentalne to cytometria przepływowa polegająca na analizie ekspresji antygenu na powierzchni komórki, a także test ELISA CFSN i granulowane VLP specyficzne dla antygenu i białka rdzenia wirusa.

Krytycznymi etapami testu wychwytywania VLP są powlekanie kulek przeciwciałami wychwytującymi - w tym przypadku bNAbs - a następnie wychwytywanie VLP dodatnich antygenowo przez kulki pokryte przeciwciałem. Pomyślne pokrycie kulek przeciwciałami zależy od wyboru sprzężonego białka wiążącego immunoglobulinę (Ig). Gatunki dawców, jak również klasa Ig przeciwciał określają, czy preferowane są kulki sprzężone z białkiem G, czy białkiem A. Dla większości gatunków i klas Ig białko G jest ligandem z wyboru33. Jako alternatywę dla kulek sprzężonych z białkiem A/G dostępne są kulki streptawidyny do powlekania z biotynylowanymi przeciwciałami. Koraliki mogą być również kowalencyjnie sprzężone z przeciwciałami.

Wychwytywanie VLP za pomocą kulek pokrytych przeciwciałem zależy od dokładnego wymieszania, wystarczającego czasu inkubacji, obfitości antygenu i powinowactwa przeciwciała wychwytującego. Z naszego doświadczenia wynika, że dokładne wymieszanie kulek pokrytych przeciwciałami z próbkami VLP najlepiej osiągnąć poprzez wykorzystanie objętości >500 μl w probówkach o pojemności 1,5 ml pod kątem rotacji przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub 4 °C. Kolejną potencjalną przeszkodą jest zbyt mała liczba VLP w próbie. W przypadku przeciwciał silnie wiążących antygen docelowy, wejścia VLP tak niskie, jak 15 ng białka Gag, zwykle pozwalają na łatwo wykrywalne ilości białek rdzenia wirusa przy użyciu analizy Western blot. Jednak przeciwciała o niskim powinowactwie wymagają większych ilości wejściowych, np. 100 ng białka Gag, aby uzyskać rozstrzygające wyniki (Figura 3, bNAb 3).

Niektóre antygeny powierzchniowe są podatne na degradację proteazy. W tym przypadku zalecamy dodanie inhibitorów proteazy do próbek VLP i inkubację w temperaturze 4 °C. Niespecyficzna adhezja białek komórek gospodarza i VLP do przeciwciał związanych z kulkami jest rzadko obserwowana i powinna być wykluczona poprzez zastosowanie odpowiednich kontroli ujemnych, jak wykazaliśmy tutaj przy użyciu prób pozornych i łysych VLP oraz przeciwciał kontrolnych izotypu. Strategie mające na celu ograniczenie niespecyficznego wiązania obejmują wydłużone etapy płukania i dodanie kazeiny do buforu myjącego34. Co więcej, test wychwytywania można również ulepszyć, określając optymalny stosunek ilości przeciwciał do ilości VLP wyświetlających antygen.

W ostatnim etapie testu wychwytywania VLP opisujemy elucję kompleksów immunologicznych z kulek poprzez gotowanie w redukującym buforze Laemmli. Na tym etapie VLP są demontowane, a przeciwciała wychwytujące i antygeny docelowe są oddzielane od kulek. W szczególności gatunek dawcy przeciwciała pierwszorzędowego użytego w późniejszej analizie Western blot musi różnić się od dawcy przeciwciała wychwytującego, aby uniknąć niezamierzonego wykrycia przeciwciała wychwytującego przez przeciwciała sprzężone z przeciwciałami przeciw wtórnemu dawcy IgG HRP.

Przedstawiony tutaj test wychwytywania VLP zapewnia łatwą w użyciu i czułą metodę wykrywania wrażliwych na neutralizację epitopów w strukturalnych nienaruszonych antygenach docelowych wyświetlanych na powierzchniach VLP. Jednak test wychwytywania nie umożliwia bezpośredniej kwantyfikacji epitopów. Test ELISA wykonywany za pomocą bNAb ma zasadnicze znaczenie dla tego celu i powinien być prowadzony równolegle, zwłaszcza jeśli badane VLP są przeznaczone do wykorzystania w badaniach przedklinicznych z wykorzystaniem modeli zwierzęcych35. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ ilość antygenu może bezpośrednio korelować z wywołaniem odpowiedzi przeciwciał neutralizujących u uodpornionych zwierząt, jak wykazano w przypadku szczepionek przeciwko cirkowirusowi świń typu 2 (PCV2)36.

Idealna szczepionka powinna spowodować wywołanie bNAb ukierunkowanych na wrażliwe na neutralizację epitopy na powierzchni wirionu. Analiza tych epitopów, w szczególności w odniesieniu do ich pełnej integralności strukturalnej na powierzchni szczepionki w postaci cząstek stałych, ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji potencjalnych kandydatów na szczepionki. Dotyczy to nie tylko VLP pochodzących z HIV, ale także wielu innych opracowywanych szczepionek VLP37. Znane szczepionki oparte na VLP pochodzą na przykład z nieotoczkowych lub kapsydowych wirusów rodzicielskich, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego (HPV). W przeciwieństwie do cząsteczek HIV-1, które są tworzone tylko przez jedno strukturalne białko rdzeniowe, a mianowicie p55 Gag, i otoczone błoną pochodzącą z komórki wytwarzającej VLP, cząsteczki HPV składają się tylko z jednego lub dwóch strukturalnych białek rdzeniowych38,39. Podobnie, jak przedstawiono tutaj dla VLP z otoczką, test wychwytywania VLP może być również stosowany do wykrywania wrażliwych na neutralizację epitopów VLP bez otoczki.

Jako alternatywę dla testu wychwytywania, próbki VLP można bezpośrednio poddać natywnej analizie PAGE, a następnie analizie Western blot przy użyciu bNAb i odpowiednich przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z HRP40. Jednak w przypadku analizy VLP ozdobionych wirusem HIV Env test ten jest mniej czuły, ponieważ można spodziewać się tylko niskiej liczby białek antygenowych na VLP. W przeciwieństwie do tego, test wychwytywania ułatwia wykrywanie białek rdzeniowych obfitujących w dużych ilościach na VLP, w przypadku VLP pochodzących od HIV ponad 3500 białek Gag tworzy VLP27. Pozwala to na bardzo czułe pośrednie wykrywanie epitopów w Env wyświetlanych nawet przy niskich gęstościach na VLP.

Liczba ugruntowanych metod badania wrażliwych na neutralizację epitopów w antygenach powierzchniowych VLP jest ograniczona. Znakowanie antygenów wyświetlanych na VLP jest możliwe za pomocą swoistych dla epitopów koniugatów przeciwciało-fluorofor, a następnie wykrywanie za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA), co umożliwia wykrywanie i kwantyfikację VLP. Metoda ta została również z powodzeniem opracowana i zoptymalizowana pod kątem egzosomów prezentujących markery powierzchniowekomórek 41. Ponadto spektroskopia powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) pozwala na analizę oddziaływań między niesprzężonymi przeciwciałami neutralizującymi a pokrewnymi epitopami prezentowanymi na VLP. Chociaż nie nadaje się do analizy o wyższej przepustowości, VLP można również znakować za pomocą bNAb sprzężonych z cząstkami złota, a następnie badać za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)42.

Podsumowując, test wychwytywania VLP zapewnia kilka istotnych korzyści: (i) ocenę integralności strukturalnej epitopów wrażliwych na neutralizację na powierzchni VLP, (ii) czułe i pośrednie wykrywanie antygenów nawet wtedy, gdy są wyświetlane w niskiej gęstości na VLP, oraz (iii) metoda nie wymaga kosztownego sprzętu analitycznego.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań, program finansujący Forschung an Fachhochschulen, numery kontraktów 13FH767IA6 i 13FH242PX6 dla JS. Rysunki 1 i 2 zostały stworzone za pomocą BioRender.com.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 ml probówki reakcyjneEppendorf
10x PBSgibco70011044
4%– 15% bezbarwne żele białkowe Mini-PROTEAN TGXBioRad4568085
Przeciwciała (bnAbs)Polymun Scientic
Isotype control antibodyinvitrogen (Thermo Fisher Scientific)02-7102
System obrazowania Chemidoc XRS+BioRad1708265
Kurczak anty-króliczy IgG sprzężony z HRPTechnologie życiaA159871:5000 w TBS-T + 2 % (w/v) mleko w proszku
Dynabeads Białko G Zestaw immunoprecypitacyjnyinvitrogen (Thermo Fisher Scientific)10007Dzawiera i roztwory myjące
Komory FreeStyle 293-Finvitrogen (Thermo Fisher Scientific)R790-07
FreeStyle 293 Expression Mediuminvitrogen (Thermo Fisher Scientific)12338026
Bibułki żeloweBuforGB005
GlycineCarl Roth0079
Stojak do separacji magnetycznejNew England BiolabsS1509Sdo probówek 12 x 1,5 ml lub 6 x 1,5 ml Metanol
Carl Roth4627Bufor do
elektroforezy Mini-PROTEAN Tetra CellBioRad
Optima XE-90Beckman Coulter
PageRuler wstępnie barwiona drabinka białkowaThermo Scientific26616
Filtry strzykawkowe z polifluorku winylidenu (PVDF), 0,45 i mikro; mCarl RothKC89.1
Mleko w proszkuCarl RothT145bufor blokujący
membrana transferowa PVDF, 0,45 &mikro; mCarl RothT830.1
QuickTiter HIV p24 ELISACell BiolabsVPK-108-H
Królik poliklonalny do HIV1 p55 + p24 + p17abcamab639171:2000 w TBS-T + 2 % (w/v) mleko w proszku
RotatorHeidolphREAX2
ROTI Load 1 (bufor laemmli)Carl RothK929.14x skoncentrowany redukujący bufor ładujący żel białkowy
ROTYFORY, 10x SDS-PAGECarl Roth3060
Chlorek soduCarl Roth3957TBS-T bufor
SuperSignal West Pico PLUS podłoże chemiluminescencyjneThermo Scientific34579
SW28 rotorBeckman Coulter
ThermomixerCel Mediabasic
Trans-Blot TurboBioRad
Trehaloza dwuwodnaCarl Roth8897.2
TRISCarl Roth5429Bufor do bibuły
Chlorowodorek TRISCarl Roth9090TBS-T Bufor
Tween-20Carl Roth9127TBS-T Bufor
Ultra Clear Probówki wirówkoweBeckman Coulter344058
do bibuły Whatman Ultrawirówka

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roldão, A., Mellado, M. C. M., Castilho, L. R., Carrondo, M. J. T., Alves, P. M. Virus-like particles in vaccine development. Expert Review of Vaccines. 9 (10), 1149-1176 (2010).
  2. Noad, R., Roy, P. Virus-like particles as immunogens. Trends in Microbiology. 11 (9), 438-444 (2003).
  3. Qian, C., et al. Recent progress on the versatility of virus-like particles. Vaccines. 8 (1), 139(2020).
  4. Zabel, F., Kündig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: On how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. 3 (3), 357-362 (2013).
  5. Garg, H., Mehmetoglu-Gurbuz, T., Joshi, A. Virus Like Particles (VLP) as multivalent vaccine candidate against Chikungunya, Japanese Encephalitis, Yellow Fever and Zika Virus. Scientific Reports. 10 (1), 4017(2020).
  6. Hodgins, B., Pillet, S., Landry, N., Ward, B. J. A plant-derived VLP influenza vaccine elicits a balanced immune response even in very old mice with co-morbidities. PLoS ONE. 14 (1), 0210009(2019).
  7. Lai, C. C., et al. Process development for pandemic influenza VLP vaccine production using a baculovirus expression system. Journal of Biological Engineering. 13, 78(2019).
  8. Caldeira, J. C., Perrine, M., Pericle, F., Cavallo, F. Virus-like particles as an immunogenic platform for cancer vaccines. Viruses. 12 (5), 488(2020).
  9. Nika, L., et al. An HER2-displaying virus-like particle vaccine protects from challenge with mammary carcinoma cells in a mouse model. Vaccines. 7 (2), 41(2019).
  10. Mohsen, M. O., Zha, L., Cabral-Miranda, G., Bachmann, M. F. Major findings and recent advances in virus-like particle (VLP)-based vaccines. Seminars in Immunology. 34, 123-132 (2017).
  11. Fontana, D., Garay, E., Cevera, L., Kratje, R., Prieto, C., Gòdia, F. Chimeric VLPs based on hiv-1 gag and a fusion rabies glycoprotein induce specific antibodies against rabies and foot-and-mouth disease virus. Vaccines. 9 (3), 251(2021).
  12. Cervera, L., et al. Production of HIV-1-based virus-like particles for vaccination: achievements and limits. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (18), 7367-7384 (2019).
  13. Gonelli, C. A., King, H. A. D., Mackenzie, C., Sonza, S., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Immunogenicity of HIV-1-based virus-like particles with increased incorporation and stability of membrane-bound env. Vaccines. 9 (3), 1-36 (2021).
  14. Trkola, A. HIV not as simple as one, two, three. Nature. 568, 321-322 (2019).
  15. Berman, P. W., et al. Protection of chimpanzees from infection by HIV-1 after vaccination with recombinant glycoprotein gp120 but not gp160. Nature. 345 (6276), 622-625 (1990).
  16. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455 (7213), 613-619 (2008).
  17. DeCaprio, J., Kohl, T. O. Immunoprecipitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (11), 449-461 (2020).
  18. Barret, B., Wood, P. A., Volwiler, W. Quantitation of gamma globulins in human serum by immunoprecipitation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 55, 605-615 (1960).
  19. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  20. Lee, S. H., Chu, K. B., Kang, H. J., Quan, F. S. Virus-like particles containing multiple antigenic proteins of Toxoplasma gondii induce memory T cell and B cell responses. PLoS ONE. 14 (8), 0220865(2019).
  21. Lee, Y. T., et al. Intranasal vaccination with M2e5x virus-like particles induces humoral and cellular immune responses conferring cross-protection against heterosubtypic influenza viruses. PLoS ONE. 13 (1), 0190868(2018).
  22. Wang, J., et al. Large-scale manufacture of VP2 VLP vaccine against porcine parvovirus in Escherichia coli with high-density fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (9), 3847-3857 (2020).
  23. Swenson, D. L., et al. Generation of Marburg virus-like particles by co-expression of glycoprotein and matrix protein. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (1), 27-31 (2004).
  24. Latham, T., Galarza, J. M. Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. Journal of Virology. 75 (13), 6154-6165 (2001).
  25. Doyle, J., Ray, M., Ouyang, A., Benton, B., Bell, P. A. Abstract 4877: High throughput proteomic applications using protein A/G magnetic beads. Association for Cancer Research (AACR) 102nd Annual Meeting. 20, 4877(2011).
  26. Zhu, P., et al. Electron tomography analysis of envelope glycoprotein trimers on HIV and simian immunodeficiency virus virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15812-15817 (2003).
  27. Lavado-García, J., Jorge, I., Boix-Besora, A., Vázquez, J., Gòdia, F., Cervera, L. Characterization of HIV-1 virus-like particles and determination of Gag stoichiometry for different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 118 (7), 2660-2675 (2021).
  28. Miura, K. An overview of current methods to confirm protein-protein interactions. Protein & Peptide Letters. 25 (8), 728-733 (2018).
  29. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Advances in molecular techniques to study diversity. Plant Biotechnology, Volume 1: Principles, Techniques, and Applications. , 341-365 (2017).
  30. Rosengarten, J. F., Schatz, S., Wolf, T., Barbe, S., Stitz, J. Components of a HIV-1 vaccine mediate virus-like particle (VLP)-formation and display of envelope proteins exposing broadly neutralizing epitopes. Virology. , 41-48 (2022).
  31. JoVE, JoVE. Grundlegende Methoden in der Zell- und Molekularbiologie. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  32. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
  33. Sheng, S., Kong, F. Separation of antigens and antibodies by immunoaffinity chromatography. Pharmaceutical Biology. 50 (8), 1038-1044 (2012).
  34. Guzzo, C., et al. Virion incorporation of integrin 47 facilitates HIV-1 infection and intestinal homing. Science Immunology. 2 (11), (2017).
  35. Wei, M., et al. Bacteria expressed hepatitis E virus capsid proteins maintain virion-like epitopes. Vaccine. 32 (24), 2859-2865 (2014).
  36. Jin, J., Park, C., Cho, S. H., Chung, J. The level of decoy epitope in PCV2 vaccine affects the neutralizing activity of sera in the immunized animals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 496 (3), 846-851 (2018).
  37. Zhang, X., et al. Lessons learned from successful human vaccines: Delineating key epitopes by dissecting the capsid proteins. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1277-1292 (2015).
  38. DiGiuseppe, S., Bienkowska-Haba, M., Guion, L. G. M., Keiffer, T. R., Sapp, M. Human papillomavirus major capsid protein L1 remains associated with the incoming viral genome throughout the entry process. Journal of Virology. 91 (16), 00537(2017).
  39. Wang, J. W., Roden, R. B. S. L2, the minor capsid protein of papillomavirus. Virology. 445 (1-2), 175-186 (2013).
  40. Binley, J. M., et al. Profiling the specificity of neutralizing antibodies in a large panel of plasmas from patients chronically infected with human immunodeficiency virus type 1 subtypes B and C. Journal of Virology. 82 (23), 11651-11668 (2008).
  41. Thane, K. E., Davis, A. M., Hoffman, A. M. Improved methods for fluorescent labeling and detection of single extracellular vesicles using nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 9 (1), 12295(2019).
  42. Mulder, A. M., et al. Toolbox for non-intrusive structural and functional analysis of recombinant VLP based vaccines: A case study with hepatitis B vaccine. PLoS ONE. 7 (4), 0033235(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

VLP Capture AssayVirus Like ParticlesNeutralization EpitopesBroadly Neutralizing AntibodiesAntigen DisplayMagnetic BeadsEnvelope GlycoproteinsSDS PAGEWestern BlotImmunoprecipitation

Related Articles