Artykuł metodologiczny

Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63137

⸱

10 lutego 2022

 ,  , 
1Research Group Pharmaceutical Biotechnology, TH Köln - University of Applied Sciences, 2Institute of Technical Chemistry, Leibniz University Hannover

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia wirusa Gag.

Streszczenie

Test wychwytywania cząsteczek wirusopodobnych (VLP) to metoda immunoprecypitacji, powszechnie znana jako 'test pull-down', używany do oczyszczania i izolowania VLP wyświetlających antygen. Przeciwciała specyficzne dla antygenu powierzchniowego są sprzężone, a tym samym unieruchomione na stałej i nierozpuszczalnej matrycy, takiej jak kulki. Ze względu na ich wysokie powinowactwo do antygenu docelowego, przeciwciała te mogą wychwytywać VLP ozdobione pokrewnym antygenem zakotwiczonym w otoczce błonowej VLP. Protokół ten opisuje wiązanie przeciwciał specyficznych dla antygenu z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem A lub G. W naszym badaniu badane są VLP pochodzące z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) utworzone przez specyficzne dla grupy białko prekursorowe rdzenia wirusa p55 Gag i wykazujące glikoproteiny otoczki (Env) HIV. VLP są wychwytywane przy użyciu szeroko neutralizujących przeciwciał (bNAb) skierowanych przeciwko wrażliwym na neutralizację epitopom w Env. Opisany tutaj test wychwytywania VLP stanowi czułą i łatwą do wykonania metodę wykazania, że (i) VLP są ozdobione odpowiednim antygenem docelowym, (ii) antygen powierzchniowy zachował swoją integralność strukturalną, jak wykazano przez specyficzne dla epitopu wiązanie bNAb użyte w teście oraz (iii) integralność strukturalną VLP ujawnioną przez wykrycie białek Gag w późniejszej analizie Western blot. W związku z tym wykorzystanie bNAbs do immunoprecypitacji ułatwia przewidywanie, czy szczepionki VLP będą w stanie wywołać neutralizującą odpowiedź limfocytów B u zaszczepionych ludzi. Przewidujemy, że protokół ten dostarczy innym badaczom cennego i prostego podejścia eksperymentalnego do badania potencjalnych szczepionek opartych na VLP.

Wprowadzenie

Cząsteczki przypominające wirusy (VLP) naśladują strukturę natywnych cząsteczek wirusa, lecz nie posiadają genomu wirusowego, co zapewnia im wysoki profil bezpieczeństwa1,2. VLP stanowią odrębną klasę szczepionek, coraz częściej opracowywanych ze względu na ich wysoką immunogenność3,4,5,6,7. Dotyczy to w szczególności VLP otoczonych błoną, co umożliwia prezentację nie tylko homologicznych antygenów powierzchniowych wirusa, ale także antygenów heterologicznych, takich jak antygeny nowotworowe8,9,10. Rysunek 1 przedstawia przykładowy przegląd struktury VLP otoczonej błoną i zdobionej antygenami. W procesie opracowywania szczepionek opartych na VLP niezbędne są testy umożliwiające analizę odpowiedniego antygenu docelowego prezentowanego na powierzchni VLP. Takie analizy powinny służyć wyjaśnieniu składu cząsteczkowej szczepionki: (i) czy VLP są zdobione odpowiednim antygenem powierzchniowym? (ii) czy antygen powierzchniowy zachował swoją natywną strukturę, co potwierdzono poprzez rozpoznawanie epitopów przez neutralizujące przeciwciała szeroko oddziałujące (bNAbs) oraz (iii) czy można potwierdzić integralność strukturalną VLP poprzez wykrycie białka wirusowego pośredniczącego w formowaniu VLP?

Schemat cząsteczki przypominającej wirusa; białko rdzeniowe Gag, błona lipidowa, antygen, znakowanie przeciwciałami.
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja VLP otoczonej błoną. VLP są tworzone przez niedojrzałe białka prekursorowe rdzenia Gag i otoczone błoną lipidową pochodzącą z komórki gospodarza. Antygeny, np. glikoproteiny otoczki, są wbudowane w błonę lipidową i eksponowane na powierzchni VLP (po prawej stronie). Przeciwciała swoiste względem antygenu rozpoznają antygen. Po lewej stronie przedstawiono „gołe” VLP bez dekoracji antygenowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Szczególnie cząsteczki przypominające wirusy (VLP) tworzone przez prekursor białka rdzeniowego antygenu specyficznego dla grupy wirusowej (Gag) p55 wirusa upośledzenia odporności u ludzi typu 1 (HIV-1) są preferowanymi rusztowaniami do prezentacji antygenów w opracowywaniu szczepionek, ponieważ dostępne jest wiele przeciwciał i zestawów ELISA umożliwiających ilościowe oznaczenie tych VLP11,12. Glikoproteiny otoczki HIV-1 (Env), a mianowicie białko transbłonowe gp41 (gp41-TM) oraz rozpuszczalna jednostka powierzchniowa gp120 (gp120-SU) tworzące heterodimery, są wbudowane w otoczkę błoniastą cząsteczek i stanowią kluczowe antygeny docelowe dla rozwoju szczepionek przeciwko zakażeniu HIV13,14,15. Prezentacja epitopów wrażliwych na neutralizację w tych antygenach docelowych jest warunkiem koniecznym do wywołania szerokiej odpowiedzi przeciwciał neutralizujących u osób szczepionych. Oprócz odpowiedzi limfocytów T skierowanej przeciwko białkom Gag, uważa się to za ważny korelat ochrony przed zakażeniem HIV16. W konsekwencji, po zaprojektowaniu i produkcji VLP udekorowanych kandydatami na antygeny docelowe, późniejsza analiza jakości prezentowanych antygenów stanowi krytyczny etap w procesie opracowywania szczepionek.

Immunoprecypitacja (IP) jest powszechnie stosowaną techniką wykrywania oddziaływań białko-białko oraz oczyszczania kompleksów białkowych w małej skali17. Barret et al. po raz pierwszy opisali rozwój metody IP w 1960 roku, jednak metoda ta była stale udoskonalana. IP umożliwia wychwycenie i izolację docelowego antygenu (ofiary) z roztworu poprzez zastosowanie swoistego dla antygenu przeciwciała (przynęty), unieruchomionego poprzez sprzęgnięcie z kuleczkami18,19. W niniejszym protokole prezentujemy wariant klasycznego zastosowania IP, wykorzystując otoczone błoną VLP utworzone z p55 Gag jako ofiarę oraz bNAb rozpoznające epitopy wrażliwe na neutralizację w białkach otoczki wyeksponowanych na powierzchni VLP jako białka przynęty. Skuteczne zastosowanie tego testu wychwytywania VLP ułatwia przewidzenie, czy testowane VLP dodatnie pod kątem antygenowym będą w stanie wywołać neutralizującą odpowiedź komórek B u zaszczepionych osób. Takie właściwości immunogenne kandydatów na szczepionki oparte na VLP są często demonstrowane w modelach małych zwierząt20,21,22.

W celu oceny jakości nowo opracowanego kandydata na szczepionkę VLP z sukcesem zastosowano testy wychwytu VLP5,23,24. Jednak liczba opublikowanych metod jest ograniczona. Przedstawiony tutaj test wychwytu VLP rozpoczyna się od unieruchomienia specyficznych dla Env bNAb na kuleczkach sprzężonych z białkiem G, które wiążą się z regionem Fc przeciwciał pochodzenia ssaczego. Typowymi macierzami do unieruchamiania wybranego przeciwciała są kuleczki agarozowe lub magnetyczne. Jednak kuleczki magnetyczne są korzystniejsze w zastosowaniach wysokoprzepustowych25. W kolejnym kroku VLP wykazujące docelowy antygen są wychwytywane przez kuleczki powlekane bNAb. Powstałe kompleksy immunologiczne składające się z Env-dodatnich VLP i unieruchomionych bNAb są łatwo wzbogacane przy użyciu magnesu. Odizolowane kompleksy immunologiczne są eluowane w końcowym etapie. Następnie VLP mogą zostać scharakteryzowane biochemicznie. W tym przypadku przeprowadzono analizę Western blot z użyciem przeciwciał specyficznych dla wirusowego białka rdzeniowego p55 Gag, aby wykazać, że wytrącone docelowe antygeny Env nie tylko zawierały epitopy wrażliwe na neutralizację, ale były również prezentowane na VLP utworzonych przez Gag. Ponadto detekcja wirusowych białek rdzeniowych Gag zwiększa czułość testu wychwytu, ponieważ białka Gag są bardziej obfite niż Env w cząsteczce VLP. W przypadku HIV-1 białka Env występują jedynie w liczbie jednocyfrowej lub dwucyfrowej26, podczas gdy rdzeń cząsteczki tworzy ponad 3 500 cząsteczek Gag27.

W porównaniu do innych technik badania oddziaływań białko-białko28,29, test wychwytu VLP stanowi alternatywną metodę dla laboratoriów badawczych nieposiadających dostępu do kosztownych instrumentów analitycznych. Przykładowo, analiza za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM), spektroskopia rezonansu plazmonu powierzchniowego (SPR) oraz analiza śledzenia nanocząstek (NTA) mogą być kosztowne. Przedstawiony tutaj test wychwytu pozwala również na późniejsze poddanie próbek VLP dodatnich pod kątem antygenu dalszej charakterystyce białek, np. z zastosowaniem odpowiednio elektroforezy żelowej, immunoblottingu, mikroskopii elektronowej oraz spektrometrii mas (MS). Biorąc pod uwagę, że podczas testu wychwytu VLP zachowana zostaje natywna struktura docelowego antygenu, można również wykorzystać natywną elektroforezę PAGE oraz następujące po niej techniki immunoblottingu.

Test wychwytywania VLP stanowi łatwy w użyciu i czuły sposób badania dekoracji VLP antygenami docelowymi eksponującymi epitopy wrażliwe na neutralizację, a tym samym ich przydatności jako przyszłych kandydatów na szczepionki.

Protokół

1. Przygotowanie próbek

  1. Zasiać linie komórkowe w zawiesinie producentów VLP pochodzące z komórek 293-F wykazujących ekspresję genów strukturalnych HIV gag samodzielnie lub w połączeniu z env 30 przy niskiej gęstości komórek wynoszącej 0,5 x 106 komórek na mL w Medium Ekspresyjnym 293-F.
  2. Pozostawić je do namnożenia przez 3-4 dni w temperaturze 37 °C i 8% CO2 w inkubatorze wytrząsowym z orbitą 5 cm i prędkością 135 obrotów na minutę (rpm).
  3. Osadzić komórki producentów przez wirowanie przy 100 x g przez 5 min. Przefiltrować oczyszczony nadsącz, aby usunąć pozostałe komórki i szczątki komórkowe, używając filtrów strzykawkowych z membraną z polifluorku winylidenu (PVDF) o rozmiarze 0,45 µm, w celu uzyskania nadsączu z hodowli komórkowej wolnego od komórek (CFSN).
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać. CFSN można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Użyć CFSN bezpośrednio do eksperymentu lub osadzić VLP z 35 mL CFSN za pomocą ultrawirowania (112 700 x g, 4 °C, 1,5 h).
  5. Po ultrawirowaniu odrzucić nadsącz i zawiesić osady VLP w 200 µL 15% (w/v) roztworze trehalozy na każdą probówkę wirówki.
    UWAGA: Osad VLP często nie jest widoczny gołym okiem. Protokół można w tym miejscu przerwać. VLP można przechowywać w temperaturze -80 °C.
  6. Przed analizą wychwytu VLP określić stężenia białek rdzenia wirusa w próbkach zawierających VLP za pomocą testu ELISA. Ten krok jest istotny dla standaryzacji ilości materiału wejściowego w analizie wychwytu.

2. Test wychwytywania VLP

UWAGA: Przegląd schematu postępowania przedstawiono na Rysunku 2.

  1. Resuspender kuleczki magnetyczne, pipetując ciecz w górę i w dół lub mieszając na rotatorze przy 50 rpm przez co najmniej 5 min.
  2. W międzyczasie przygotować roztwór przeciwciał zawierający bNAbs. Na każdą reakcję użyć 10 µg każdego bNAb w 200 µL buforu do wiązania i płukania przeciwciał (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Ilość przeciwciał może się różnić w zależności od powinowactwa bNAb oraz gęstości rozmieszczenia antygenu na użytych VLP.
  3. Na każdą reakcję użyć 50 µL zawiesiny kuleczek magnetycznych (patrz Tabela materiałów) i przenieść kuleczki do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mL. Umieścić probówki na statywie do separacji magnetycznej.
    UWAGA: Alternatywnie można użyć mocnego pojedynczego magnesu dla każdej probówki, aby oddzielić kuleczki od supernatantu.
  4. Odczekać kilka minut, aż kuleczki zgromadzą się przy ściance probówki, aby upewnić się, że wszystkie zostały zebrane. Usunąć supernatantu.
  5. Zdjąć magnes i resuspender kuleczki w 200 µL roztworu bNAb przygotowanego w kroku 2.2. Inkubować przez 30 min do 3 h, mieszając na rotatorze przy 50 rpm w temperaturze pokojowej.
  6. Ponownie umieścić probówki reakcyjne w statywie do separacji magnetycznej, odczekać i usunąć supernatantu.
  7. Zdjąć probówki z magnesu i wypłukać kuleczki, resuspender je w 200 µL buforu do wiązania i płukania przeciwciał.
  8. Powtórzyć krok 2.4. Usunąć jak największą ilość buforu do płukania.
  9. Dodać próbki do związanych z kuleczkami bNAbs.
    UWAGA: Ilość VLP dla testu wychwytu z użyciem cząstek pochodzących z HIV powinna wynosić co najmniej 15 ng białka rdzenia wirusowego na reakcję. Ilość VLP może się różnić w zależności od powinowactwa bNAb oraz gęstości rozmieszczenia antygenu na użytych VLP.
  10. Jeśli objętość próbki dodanej w kroku 2.9 jest mniejsza niż 1 mL, dodać PBS, aby dostosować objętość próbki do 1 mL. Delikatnie resuspender kuleczki za pomocą pipety.
  11. Inkubować próbki i kuleczki przez 2,5 h na rotatorze w temperaturze pokojowej. Upewnić się, że kuleczki pozostają w zawiesinie, a roztwór jest dokładnie zmieszany podczas inkubacji.
  12. Umieścić probówki na magnesie i usunąć supernatantu.
  13. Wypłukać kuleczki magnetyczne, suspendując je w 200 µL buforu do płukania (patrz Tabela materiałów). Powtórzyć etap płukania trzy razy.
  14. Suspendować kuleczki w 100 µL buforu do płukania i przenieść zawiesinę do czystej (żaroodpornej) probówki reakcyjnej.
  15. Umieścić probówkę na statywie do separacji magnetycznej (patrz Tabela materiałów) i całkowicie usunąć supernatantu.
  16. Przygotować zdenaturowane próbki do SDS-PAGE zgodnie z krokami 2.16.1-2.16.2 lub próbki niezdenaturowane poprzez elucję VLP z kuleczek magnetycznych zgodnie z krokami 2.16.3-2.16.5.
    1. Aby przygotować zdenaturowane próbki do SDS-PAGE, suspendować kuleczki w 20-80 µL buforu Laemmliego (0,8 µL buforu Laemmliego na 1 ng p55 Gag wprowadzonego do analizy) i inkubować w 95 °C przez 5 min.
    2. Przejść bezpośrednio do SDS-PAGE lub przechowywać próbki w -20 °C.
      OSTRZEŻENIE: Bufor Laemmliego zawiera 2-merkaptoetanol i dodecylosiarczan sodu. Należy stosować rękawice ochronne i ochronę oczu. Unikać kontaktu ze skórą, oczami i odzieżą. Nie wdychać oparów. Pracować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, np. w dygestorium.
      UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.
    3. Alternatywnie przeprowadzić etap elucji niezdenaturowanej, aby uzyskać VLP z zachowaną natywną strukturą białka.
    4. Dodać 25 µL buforu do elucji (często dostarczanego wraz z kuleczkami) do kuleczek magnetycznych i inkubować przez 2-5 min w temperaturze pokojowej.
    5. Usunąć kuleczki i przenieść eluat do czystej probówki. Użyć eluatu do kolejnych analiz lub przechowywać go w 4 °C.
      UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.

3. Analiza przechwyconych próbek VLP

UWAGA: W celu analizy wychwyconych VLP należy przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE, a następnie analizę Western blot31,32.

  1. Umieść probówki z próbkami na statywie magnetycznym, aby oddzielić kuleczki od roztworu.
  2. Nanieś 10 µL każdej próbki do poszczególnych dołków żelu.
    UWAGA: W niniejszym protokole białka rdzeniowe wirusowego p55 Gag wykryto z zastosowaniem poliklonalnych przeciwciał króliczych skierowanych przeciwko HIV Gag oraz wtórnych poliklonalnych przeciwciał kurzych anty-króliczych IgG sprzężonych z peroksydazą chrzanową (HRP). Białka rdzeniowe wirusa wizualizowano za pomocą detekcji chemiluminescencyjnej.

Schemat oczyszczania białek za pomocą kulek magnetycznych wraz z wynikiem elektroforezy, przedstawiający kluczowe etapy.
Rycina 2: Schematyczne przedstawienie kluczowych etapów testu wychwytu VLP z wykorzystaniem supernatantów wolnych od komórek. (1) Test wychwytu VLP rozpoczyna się od wiązania bNAb przeciwko HIV-1 z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. W międzyczasie przygotowywany jest roztwór VLP o określonym stężeniu p55. Supernatant z hodowli wolnej od komórek składa się z mieszaniny VLP p55 Gag, białek komórek gospodarza oraz kwasów nukleinowych. (2) Kuleczki magnetyczne sprzężone z bNAb oraz roztwór VLP przenosi się do probówki reakcyjnej o pojemności 1.5 mL, a następnie inkubuje w rotacji. (3) VLP prezentujące antygen są wychwytywane przez kuleczki pokryte bNAb. Oddzielenie tych kompleksów immunologicznych od zanieczyszczeń pochodzących z komórek gospodarza przeprowadza się w polu magnetycznym. (4) Supernatant jest usuwany za pomocą pipety, a kuleczki są płukane trzykrotnie w celu usunięcia niewiązanych VLP. (5) W następnym kroku do kompleksów immunologicznych, składających się z kuleczek magnetycznych pokrytych bNAb i wychwyconych VLP, dodaje się redukujący bufor do ładowania białek. (6) Gotowanie próbki powoduje dysocjację bNAb i antygenu docelowego z kuleczek magnetycznych oraz lizę VLP. (7) Kuleczki magnetyczne są oddzielane od roztworu w polu magnetycznym. (8) Próbki białek poddaje się analizie SDS-PAGE. (9) Wykonuje się analizę Western blot w celu wykrycia wirusowych białek rdzenia p55 Gag. Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Wyniki

Rycina 3 przedstawia reprezentatywny wynik analizy VLP wyizolowanych odpowiednio z CFSN oraz z osadów VLP przy użyciu bNAb, a następnie poddanych analizie Western blot w celu wykrycia wirusowych białek rdzeniowych. Kulki wykorzystane w teście wychwytu były powlekane trzema różnymi bNAb skierowanymi przeciwko epitopom wrażliwym na neutralizację glikoprotein Env oraz przeciwciałami izotypowymi służącymi jako kontrole negatywne. Przy użyciu kulek powlekanych przeciwciałami izotypowymi, w próbkach zawierających VLP pozbawione Env (bald VLPs) lub VLP eksponujące Env, nie wykryto białek Gag w analizie Western blot. Wykazało to, że niespecyficzne wiązanie VLP z kulkami powlekanymi ludzkimi przeciwciałami nie pośredniczyło w wychwycie VLP. Bald VLPs nie wiązały się również z kulkami powlekanymi bNAb, w konsekwencji białka Gag ponownie nie zostały wykryte. W przeciwieństwie do nich, wszystkie trzy bNAb wychwyciły VLP eksponujące białka Env (Env VLPs), dzięki czemu białka Gag zostały następnie łatwo wykryte. Jak widać na Rycynie 3, test wychwytu może być wykorzystywany do analizy VLP eksponujących docelowy antygen odpowiednio w CFSN oraz w próbkach z osadu VLP.

Analiza Western blot odpowiedzi przeciwciał na cząsteczki przypominające wirusy (VLP); pokazano prążki białkowe.
Rycina 3: Detekcja epitopów wrażliwych na neutralizację w glikoproteinach otoczki HIV-1 prezentowanych na VLP utworzonych z p55 Gag z użyciem szeroko neutralizujących przeciwciał. Reprezentatywne wyniki analizy Western blot z użyciem przeciwciał specyficznych dla białka rdzeniowego Gag wirusa po przeprowadzeniu testu wychwytu VLP z zastosowaniem trzech różnych szeroko neutralizujących przeciwciał (bNAb 1, bNAb 2 i bnAb 3) nakierowanych na epitopy w glikoproteinach otoczki (Env) HIV-1. Przeciwciała izotypowe człowieka zpoolowane z ludzkich surowic służyły jako kontrole negatywne. Nadnadstąwy z kultur komórkowych pobrano odpowiednio z kultur zawiesinowych komórek produkujących VLP z białkami Env (Env VLP) oraz tzw. „gołe” VLP (Env-ujemne), a także z komórek naiwnych nieekspresjonujących żadnych białek wirusowych (mock). Zarówno nadnadstąwy z kultury komórek produkujących gołe VLP, jak i z kultury komórek mock służyły jako kontrole negatywne. Nadnadstąwy oczyszczono z zanieczyszczających komórek za pomocą wirowania przy niskiej prędkości i następującej po nim filtracji w celu uzyskania nadnadstąw wolnych od komórek (CFSN) do analizy. Po immunoprecypitacji przeprowadzono analizę Western blot z użyciem poliklonalnych przeciwciał króliczych skierowanych przeciwko Gag oraz wtórnych koniugatów IgG-HRP przeciwciał przeciw króliczym. Pozorną masę cząsteczkową w kilodaltonach (kDa), widoczną na markerze masy cząsteczkowej (MW), przedstawiono po lewej stronie. Strzałki wskazują wykryte białko prekursorowe p55 Gag. (A) Dla każdej próbki do testu wychwytu naniesiono CFSN zawierający 100 ng białka Gag, aby ustandaryzować ilość wprowadzonych VLP. CFSN inkubowano bezpośrednio z kuleczkami pokrytymi przeciwciałami. (B) Osady VLP uzyskano poprzez ultrawirowanie CFSN. Osady zawierające 100 ng białka Gag naniesiono do testu wychwytu z użyciem przeciwciał izotypowych i bNAb 3. Próbki dla bNAb 1 i bNAb 2 zawierały tylko 25 ng Gag. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przed testem wychwytywania VLP należy ocenić tworzenie VLP i ekspresję docelowego antygenu w liniach komórkowych producentów VLP. Metody instrumentalne to cytometria przepływowa polegająca na analizie ekspresji antygenu na powierzchni komórki, a także test ELISA CFSN i granulowane VLP specyficzne dla antygenu i białka rdzenia wirusa.

Krytycznymi etapami testu wychwytywania VLP są powlekanie kulek przeciwciałami wychwytującymi - w tym przypadku bNAbs - a następnie wychwytywanie VLP dodatnich antygenowo przez kulki pokryte przeciwciałem. Pomyślne pokrycie kulek przeciwciałami zależy od wyboru sprzężonego białka wiążącego immunoglobulinę (Ig). Gatunki dawców, jak również klasa Ig przeciwciał określają, czy preferowane są kulki sprzężone z białkiem G, czy białkiem A. Dla większości gatunków i klas Ig białko G jest ligandem z wyboru33. Jako alternatywę dla kulek sprzężonych z białkiem A/G dostępne są kulki streptawidyny do powlekania z biotynylowanymi przeciwciałami. Koraliki mogą być również kowalencyjnie sprzężone z przeciwciałami.

Wychwytywanie VLP za pomocą kulek pokrytych przeciwciałem zależy od dokładnego wymieszania, wystarczającego czasu inkubacji, obfitości antygenu i powinowactwa przeciwciała wychwytującego. Z naszego doświadczenia wynika, że dokładne wymieszanie kulek pokrytych przeciwciałami z próbkami VLP najlepiej osiągnąć poprzez wykorzystanie objętości >500 μl w probówkach o pojemności 1,5 ml pod kątem rotacji przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub 4 °C. Kolejną potencjalną przeszkodą jest zbyt mała liczba VLP w próbie. W przypadku przeciwciał silnie wiążących antygen docelowy, wejścia VLP tak niskie, jak 15 ng białka Gag, zwykle pozwalają na łatwo wykrywalne ilości białek rdzenia wirusa przy użyciu analizy Western blot. Jednak przeciwciała o niskim powinowactwie wymagają większych ilości wejściowych, np. 100 ng białka Gag, aby uzyskać rozstrzygające wyniki (Figura 3, bNAb 3).

Niektóre antygeny powierzchniowe są podatne na degradację proteazy. W tym przypadku zalecamy dodanie inhibitorów proteazy do próbek VLP i inkubację w temperaturze 4 °C. Niespecyficzna adhezja białek komórek gospodarza i VLP do przeciwciał związanych z kulkami jest rzadko obserwowana i powinna być wykluczona poprzez zastosowanie odpowiednich kontroli ujemnych, jak wykazaliśmy tutaj przy użyciu prób pozornych i łysych VLP oraz przeciwciał kontrolnych izotypu. Strategie mające na celu ograniczenie niespecyficznego wiązania obejmują wydłużone etapy płukania i dodanie kazeiny do buforu myjącego34. Co więcej, test wychwytywania można również ulepszyć, określając optymalny stosunek ilości przeciwciał do ilości VLP wyświetlających antygen.

W ostatnim etapie testu wychwytywania VLP opisujemy elucję kompleksów immunologicznych z kulek poprzez gotowanie w redukującym buforze Laemmli. Na tym etapie VLP są demontowane, a przeciwciała wychwytujące i antygeny docelowe są oddzielane od kulek. W szczególności gatunek dawcy przeciwciała pierwszorzędowego użytego w późniejszej analizie Western blot musi różnić się od dawcy przeciwciała wychwytującego, aby uniknąć niezamierzonego wykrycia przeciwciała wychwytującego przez przeciwciała sprzężone z przeciwciałami przeciw wtórnemu dawcy IgG HRP.

Przedstawiony tutaj test wychwytywania VLP zapewnia łatwą w użyciu i czułą metodę wykrywania wrażliwych na neutralizację epitopów w strukturalnych nienaruszonych antygenach docelowych wyświetlanych na powierzchniach VLP. Jednak test wychwytywania nie umożliwia bezpośredniej kwantyfikacji epitopów. Test ELISA wykonywany za pomocą bNAb ma zasadnicze znaczenie dla tego celu i powinien być prowadzony równolegle, zwłaszcza jeśli badane VLP są przeznaczone do wykorzystania w badaniach przedklinicznych z wykorzystaniem modeli zwierzęcych35. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ ilość antygenu może bezpośrednio korelować z wywołaniem odpowiedzi przeciwciał neutralizujących u uodpornionych zwierząt, jak wykazano w przypadku szczepionek przeciwko cirkowirusowi świń typu 2 (PCV2)36.

Idealna szczepionka powinna spowodować wywołanie bNAb ukierunkowanych na wrażliwe na neutralizację epitopy na powierzchni wirionu. Analiza tych epitopów, w szczególności w odniesieniu do ich pełnej integralności strukturalnej na powierzchni szczepionki w postaci cząstek stałych, ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji potencjalnych kandydatów na szczepionki. Dotyczy to nie tylko VLP pochodzących z HIV, ale także wielu innych opracowywanych szczepionek VLP37. Znane szczepionki oparte na VLP pochodzą na przykład z nieotoczkowych lub kapsydowych wirusów rodzicielskich, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego (HPV). W przeciwieństwie do cząsteczek HIV-1, które są tworzone tylko przez jedno strukturalne białko rdzeniowe, a mianowicie p55 Gag, i otoczone błoną pochodzącą z komórki wytwarzającej VLP, cząsteczki HPV składają się tylko z jednego lub dwóch strukturalnych białek rdzeniowych38,39. Podobnie, jak przedstawiono tutaj dla VLP z otoczką, test wychwytywania VLP może być również stosowany do wykrywania wrażliwych na neutralizację epitopów VLP bez otoczki.

Jako alternatywę dla testu wychwytywania, próbki VLP można bezpośrednio poddać natywnej analizie PAGE, a następnie analizie Western blot przy użyciu bNAb i odpowiednich przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z HRP40. Jednak w przypadku analizy VLP ozdobionych wirusem HIV Env test ten jest mniej czuły, ponieważ można spodziewać się tylko niskiej liczby białek antygenowych na VLP. W przeciwieństwie do tego, test wychwytywania ułatwia wykrywanie białek rdzeniowych obfitujących w dużych ilościach na VLP, w przypadku VLP pochodzących od HIV ponad 3500 białek Gag tworzy VLP27. Pozwala to na bardzo czułe pośrednie wykrywanie epitopów w Env wyświetlanych nawet przy niskich gęstościach na VLP.

Liczba ugruntowanych metod badania wrażliwych na neutralizację epitopów w antygenach powierzchniowych VLP jest ograniczona. Znakowanie antygenów wyświetlanych na VLP jest możliwe za pomocą swoistych dla epitopów koniugatów przeciwciało-fluorofor, a następnie wykrywanie za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA), co umożliwia wykrywanie i kwantyfikację VLP. Metoda ta została również z powodzeniem opracowana i zoptymalizowana pod kątem egzosomów prezentujących markery powierzchniowekomórek 41. Ponadto spektroskopia powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) pozwala na analizę oddziaływań między niesprzężonymi przeciwciałami neutralizującymi a pokrewnymi epitopami prezentowanymi na VLP. Chociaż nie nadaje się do analizy o wyższej przepustowości, VLP można również znakować za pomocą bNAb sprzężonych z cząstkami złota, a następnie badać za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)42.

Podsumowując, test wychwytywania VLP zapewnia kilka istotnych korzyści: (i) ocenę integralności strukturalnej epitopów wrażliwych na neutralizację na powierzchni VLP, (ii) czułe i pośrednie wykrywanie antygenów nawet wtedy, gdy są wyświetlane w niskiej gęstości na VLP, oraz (iii) metoda nie wymaga kosztownego sprzętu analitycznego.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań, program finansujący Forschung an Fachhochschulen, numery kontraktów 13FH767IA6 i 13FH242PX6 dla JS. Rysunki 1 i 2 zostały stworzone za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówki reakcyjneEppendorf
10x PBSgibco70011044
4%– 15% bezbarwne żele białkowe Mini-PROTEAN TGXBioRad4568085
Przeciwciała (bnAbs)Polymun Scientic
Isotype control antibodyinvitrogen (Thermo Fisher Scientific)02-7102
System obrazowania Chemidoc XRS+BioRad1708265
Kurczak anty-króliczy IgG sprzężony z HRPTechnologie życiaA159871:5000 w TBS-T + 2 % (w/v) mleko w proszku
Dynabeads Białko G Zestaw immunoprecypitacyjnyinvitrogen (Thermo Fisher Scientific)10007Dzawiera i roztwory myjące
Komory FreeStyle 293-Finvitrogen (Thermo Fisher Scientific)R790-07
FreeStyle 293 Expression Mediuminvitrogen (Thermo Fisher Scientific)12338026
Bibułki żeloweBuforGB005
GlycineCarl Roth0079
Stojak do separacji magnetycznejNew England BiolabsS1509Sdo probówek 12 x 1,5 ml lub 6 x 1,5 ml Metanol
Carl Roth4627Bufor do
elektroforezy Mini-PROTEAN Tetra CellBioRad
Optima XE-90Beckman Coulter
PageRuler wstępnie barwiona drabinka białkowaThermo Scientific26616
Filtry strzykawkowe z polifluorku winylidenu (PVDF), 0,45 i mikro; mCarl RothKC89.1
Mleko w proszkuCarl RothT145bufor blokujący
membrana transferowa PVDF, 0,45 &mikro; mCarl RothT830.1
QuickTiter HIV p24 ELISACell BiolabsVPK-108-H
Królik poliklonalny do HIV1 p55 + p24 + p17abcamab639171:2000 w TBS-T + 2 % (w/v) mleko w proszku
RotatorHeidolphREAX2
ROTI Load 1 (bufor laemmli)Carl RothK929.14x skoncentrowany redukujący bufor ładujący żel białkowy
ROTYFORY, 10x SDS-PAGECarl Roth3060
Chlorek soduCarl Roth3957TBS-T bufor
SuperSignal West Pico PLUS podłoże chemiluminescencyjneThermo Scientific34579
SW28 rotorBeckman Coulter
ThermomixerCel Mediabasic
Trans-Blot TurboBioRad
Trehaloza dwuwodnaCarl Roth8897.2
TRISCarl Roth5429Bufor do bibuły
Chlorowodorek TRISCarl Roth9090TBS-T Bufor
Tween-20Carl Roth9127TBS-T Bufor
Ultra Clear Probówki wirówkoweBeckman Coulter344058
do bibuły Whatman Ultrawirówka

Bibliografia

  1. Roldão, A., Mellado, M. C. M., Castilho, L. R., Carrondo, M. J. T., Alves, P. M. Virus-like particles in vaccine development. Expert Review of Vaccines. 9 (10), 1149-1176 (2010).
  2. Noad, R., Roy, P. Virus-like particles as immunogens. Trends in Microbiology. 11 (9), 438-444 (2003).
  3. Qian, C., et al. Recent progress on the versatility of virus-like particles. Vaccines. 8 (1), 139(2020).
  4. Zabel, F., Kündig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: On how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. 3 (3), 357-362 (2013).
  5. Garg, H., Mehmetoglu-Gurbuz, T., Joshi, A. Virus Like Particles (VLP) as multivalent vaccine candidate against Chikungunya, Japanese Encephalitis, Yellow Fever and Zika Virus. Scientific Reports. 10 (1), 4017(2020).
  6. Hodgins, B., Pillet, S., Landry, N., Ward, B. J. A plant-derived VLP influenza vaccine elicits a balanced immune response even in very old mice with co-morbidities. PLoS ONE. 14 (1), 0210009(2019).
  7. Lai, C. C., et al. Process development for pandemic influenza VLP vaccine production using a baculovirus expression system. Journal of Biological Engineering. 13, 78(2019).
  8. Caldeira, J. C., Perrine, M., Pericle, F., Cavallo, F. Virus-like particles as an immunogenic platform for cancer vaccines. Viruses. 12 (5), 488(2020).
  9. Nika, L., et al. An HER2-displaying virus-like particle vaccine protects from challenge with mammary carcinoma cells in a mouse model. Vaccines. 7 (2), 41(2019).
  10. Mohsen, M. O., Zha, L., Cabral-Miranda, G., Bachmann, M. F. Major findings and recent advances in virus-like particle (VLP)-based vaccines. Seminars in Immunology. 34, 123-132 (2017).
  11. Fontana, D., Garay, E., Cevera, L., Kratje, R., Prieto, C., Gòdia, F. Chimeric VLPs based on hiv-1 gag and a fusion rabies glycoprotein induce specific antibodies against rabies and foot-and-mouth disease virus. Vaccines. 9 (3), 251(2021).
  12. Cervera, L., et al. Production of HIV-1-based virus-like particles for vaccination: achievements and limits. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (18), 7367-7384 (2019).
  13. Gonelli, C. A., King, H. A. D., Mackenzie, C., Sonza, S., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Immunogenicity of HIV-1-based virus-like particles with increased incorporation and stability of membrane-bound env. Vaccines. 9 (3), 1-36 (2021).
  14. Trkola, A. HIV not as simple as one, two, three. Nature. 568, 321-322 (2019).
  15. Berman, P. W., et al. Protection of chimpanzees from infection by HIV-1 after vaccination with recombinant glycoprotein gp120 but not gp160. Nature. 345 (6276), 622-625 (1990).
  16. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455 (7213), 613-619 (2008).
  17. DeCaprio, J., Kohl, T. O. Immunoprecipitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (11), 449-461 (2020).
  18. Barret, B., Wood, P. A., Volwiler, W. Quantitation of gamma globulins in human serum by immunoprecipitation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 55, 605-615 (1960).
  19. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  20. Lee, S. H., Chu, K. B., Kang, H. J., Quan, F. S. Virus-like particles containing multiple antigenic proteins of Toxoplasma gondii induce memory T cell and B cell responses. PLoS ONE. 14 (8), 0220865(2019).
  21. Lee, Y. T., et al. Intranasal vaccination with M2e5x virus-like particles induces humoral and cellular immune responses conferring cross-protection against heterosubtypic influenza viruses. PLoS ONE. 13 (1), 0190868(2018).
  22. Wang, J., et al. Large-scale manufacture of VP2 VLP vaccine against porcine parvovirus in Escherichia coli with high-density fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (9), 3847-3857 (2020).
  23. Swenson, D. L., et al. Generation of Marburg virus-like particles by co-expression of glycoprotein and matrix protein. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (1), 27-31 (2004).
  24. Latham, T., Galarza, J. M. Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. Journal of Virology. 75 (13), 6154-6165 (2001).
  25. Doyle, J., Ray, M., Ouyang, A., Benton, B., Bell, P. A. Abstract 4877: High throughput proteomic applications using protein A/G magnetic beads. Association for Cancer Research (AACR) 102nd Annual Meeting. 20, 4877(2011).
  26. Zhu, P., et al. Electron tomography analysis of envelope glycoprotein trimers on HIV and simian immunodeficiency virus virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15812-15817 (2003).
  27. Lavado-García, J., Jorge, I., Boix-Besora, A., Vázquez, J., Gòdia, F., Cervera, L. Characterization of HIV-1 virus-like particles and determination of Gag stoichiometry for different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 118 (7), 2660-2675 (2021).
  28. Miura, K. An overview of current methods to confirm protein-protein interactions. Protein & Peptide Letters. 25 (8), 728-733 (2018).
  29. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Advances in molecular techniques to study diversity. Plant Biotechnology, Volume 1: Principles, Techniques, and Applications. , 341-365 (2017).
  30. Rosengarten, J. F., Schatz, S., Wolf, T., Barbe, S., Stitz, J. Components of a HIV-1 vaccine mediate virus-like particle (VLP)-formation and display of envelope proteins exposing broadly neutralizing epitopes. Virology. , 41-48 (2022).
  31. JoVE, JoVE. Grundlegende Methoden in der Zell- und Molekularbiologie. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  32. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
  33. Sheng, S., Kong, F. Separation of antigens and antibodies by immunoaffinity chromatography. Pharmaceutical Biology. 50 (8), 1038-1044 (2012).
  34. Guzzo, C., et al. Virion incorporation of integrin 47 facilitates HIV-1 infection and intestinal homing. Science Immunology. 2 (11), (2017).
  35. Wei, M., et al. Bacteria expressed hepatitis E virus capsid proteins maintain virion-like epitopes. Vaccine. 32 (24), 2859-2865 (2014).
  36. Jin, J., Park, C., Cho, S. H., Chung, J. The level of decoy epitope in PCV2 vaccine affects the neutralizing activity of sera in the immunized animals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 496 (3), 846-851 (2018).
  37. Zhang, X., et al. Lessons learned from successful human vaccines: Delineating key epitopes by dissecting the capsid proteins. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1277-1292 (2015).
  38. DiGiuseppe, S., Bienkowska-Haba, M., Guion, L. G. M., Keiffer, T. R., Sapp, M. Human papillomavirus major capsid protein L1 remains associated with the incoming viral genome throughout the entry process. Journal of Virology. 91 (16), 00537(2017).
  39. Wang, J. W., Roden, R. B. S. L2, the minor capsid protein of papillomavirus. Virology. 445 (1-2), 175-186 (2013).
  40. Binley, J. M., et al. Profiling the specificity of neutralizing antibodies in a large panel of plasmas from patients chronically infected with human immunodeficiency virus type 1 subtypes B and C. Journal of Virology. 82 (23), 11651-11668 (2008).
  41. Thane, K. E., Davis, A. M., Hoffman, A. M. Improved methods for fluorescent labeling and detection of single extracellular vesicles using nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 9 (1), 12295(2019).
  42. Mulder, A. M., et al. Toolbox for non-intrusive structural and functional analysis of recombinant VLP based vaccines: A case study with hepatitis B vaccine. PLoS ONE. 7 (4), 0033235(2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza wychwytywania VLPcz steczki przypominaj ce wirusyepitopy neutralizacjiprzeciwcia a szeroko neutralizuj ceekspozycja antygenukulki magnetyczneglikoproteiny otoczkiSDS PAGEWestern blotimmunoprecypitacja
Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.