Artykuł metodologiczny

Izolowanie RNA specyficznych dla typu komórki z zatrzaskowo mrożonych próbek tkanek heterogenicznych bez sortowania komórek

DOI:

10.3791/63143

⸱

8 grudnia 2021

 , 
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ma na celu wyizolowanie specyficznych dla typu komórki translujących rybosomalnych mRNA za pomocą mysiego modelu NuTRAP.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heterogeniczność komórkowa stanowi wyzwanie dla zrozumienia funkcji złożonych tkanek na poziomie transkryptomu. Stosowanie RNA specyficznych dla typu komórki pozwala uniknąć potencjalnych pułapek spowodowanych niejednorodnością tkanek i uwalnia potężną analizę transkryptomu. Opisany tutaj protokół pokazuje, jak wykorzystać metodę TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification) do wyizolowania RNA związanych z rybosomami z niewielkiej ilości komórek wykazujących ekspresję EGFP w złożonej tkance bez sortowania komórek. Protokół ten jest odpowiedni do izolowania RNA specyficznych dla typu komórki przy użyciu niedawno dostępnego modelu myszy NuTRAP i może być również używany do izolowania RNA z dowolnych komórek wykazujących ekspresję EGFP.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podejścia wysokoprzepustowe, w tym sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) i mikromacierze, umożliwiły badanie profili ekspresji genów na poziomie całego genomu. W przypadku tkanek złożonych, takich jak serce, mózg i jądra, dane specyficzne dla typu komórki dostarczą więcej szczegółów porównujących użycie RNA z całej tkanki1,2,3. Aby przezwyciężyć wpływ heterogeniczności komórkowej, od początku 2010 roku rozwijana jest metoda oczyszczania powinowactwa do rybosomów (TRAP)4. TRAP jest w stanie wyizolować RNA związane z rybosomami z określonych typów komórek bez dysocjacji tkanek. Metoda ta została wykorzystana do analizy translatomu (mRNA, które są rekrutowane do rybosomu w celu translacji) w różnych organizmach, w tym do celowania w niezwykle rzadką populację komórek mięśniowych w zarodkach Drosophila5, badania różnych komórek korzeniowych w roślinie modelowej Arabidopsis thaliana6, oraz przeprowadzania analizy transkryptomu komórek śródbłonka u ssaków7.

TRAP wymaga modyfikacji genetycznej, aby oznaczyć rybosom organizmu modelowego. Evan Rosen i jego koledzy opracowali niedawno mysi model o nazwie Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse8, który jest dostępny w Jackson Laboratory od 2017 roku. Krzyżując się z linią myszy Cre, naukowcy mogą wykorzystać ten mysi model NuTRAP do wyizolowania RNA i jąder komórkowych związanych z rybosomami z komórek wykazujących ekspresję Cre bez sortowania komórek. W komórkach z ekspresją Cre, które również przenoszą allel NuTRAP, rybosom znakowany EGFP / L10a umożliwia izolację translujących mRNA za pomocą testów obniżania powinowactwa. W tej samej komórce błona jądrowa znakowana peptydem rozpoznającym ligazę biotyny (BLRP), która jest również mCherry dodatnia, umożliwia izolację jądrową poprzez zastosowanie oczyszczania opartego na powinowactwie lub fluorescencji. Ten sam zespół badawczy wygenerował również podobną linię myszy, w której błona jądrowa jest oznaczona tylko mCherry bez biotyny8. Te dwie genetycznie zmodyfikowane linie myszy dają dostęp do scharakteryzowania sparowanych profili epigenomicznych i transkryptomicznych określonych typów komórek będących przedmiotem zainteresowania.

Szlak sygnałowy jeża (Hh) odgrywa kluczową rolę w rozwoju tkanek9. GLI1, członek rodziny GLI, działa jako aktywator transkrypcji i pośredniczy w sygnalizacji Hh. Komórki Gli1+ można znaleźć w wielu narządach wydzielających hormony, w tym w nadnerczach i jądrach. Aby wyizolować DNA i RNA specyficzne dla typu komórki z komórek Gli1+ przy użyciu modelu mysiego NuTRAP, myszy Gli1-CreERT2 skrzyżowano z myszami NuTRAP. Myszy Shh-CreERT2 skrzyżowano również z myszami NuTRAP w celu wyizolowania komórek eksprymujących jeża dźwiękowego (Shh). Poniższy protokół pokazuje, jak używać Gli1-CreERT2; Myszy NuTRAP do izolowania RNA związanych z rybosomami z komórek Gli1 + w jądrach dorosłych myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie przeprowadzone eksperymenty na zwierzętach były zgodne z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Auburn.

UWAGA: Poniższy protokół wykorzystuje jedno jądro (około 100 mg) w P28 od Gli1-CreERT2; Myszy NuTRAP (Mus musculus). Może być konieczne dostosowanie objętości odczynników w zależności od rodzaju próbek i liczby tkanek.

1. Pobieranie tkanek

  1. Poddaj myszy eutanazji za pomocą komory CO2, zdezynfekuj powierzchnię brzucha 70% etanolem.
  2. Otwórz dolną część brzucha nożyczkami i usuń jądra. Użyj ciekłego azotu (LN2), aby natychmiast zamrozić jądra.
  3. Próbki należy przechowywać w fazie gazowej LN2 do czasu użycia.

2. Przygotowanie odczynników i kulek

  1. Przygotować roztwór podstawowy do homogenizacji: dodać 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 i 1 mg/ml heparyny. Roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia (do 1 miesiąca).
  2. Przygotować bufor roboczy do homogenizacji z roztworu podstawowego (krok 2.1) świeżo przed użyciem: dodać DTT (stężenie końcowe: 1 mM), cykloheksymid (stężenie końcowe: 100 μg/ml), rekombinowaną rybonukleazę (stężenie końcowe: 200 jednostek/ml) i koktajl inhibitora proteazy (stężenie końcowe: 1x) do roztworu podstawowego homogenizacji, aby uzyskać wymaganą ilość buforu roboczego do homogenizacji. Przechowuj świeżo przygotowany bufor roboczy na lodzie do czasu użycia.
  3. Przygotuj do płukania o niskiej zawartości soli i o wysokiej zawartości soli:
    1. Aby przygotować bufor do płukania o niskiej zawartości soli, zmieszaj 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl i 1% NP-40. Przed użyciem dodać DTT (stężenie końcowe: 1 mM) i cykloheksymid (stężenie końcowe: 100 μg/ml).
    2. Aby przygotować bufor do płukania o wysokiej zawartości soli, wymieszaj 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Przed użyciem dodać DTT (stężenie końcowe: 2 mM) i cykloheksymid (stężenie końcowe: 100 μg/ml).
  4. Przygotuj kulki białkowe G (Tabela Materiałów):
    1. Każda próbka będzie potrzebowała 50 μl kulek białka G. Umieść wymaganą ilość kulek w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i oddziel kulki od roztworu za pomocą stojaka magnetycznego, pozostawiając probówkę na stojaku na 30-60 s.
    2. Usunąć szwadron przez pipetowanie. Umyj kulki trzykrotnie 1 ml lodowatego buforu do płukania o niskiej zawartości soli za każdym razem.

3. Liza i homogenizacja tkanek

  1. Dodać 2 ml lodowatego buforu roboczego do homogenizacji (świeżo przygotowanego z kroku 2.2) do zestawu do mielenia tkanek szklanych. Szybko umieść zamrożoną próbkę w młynku i homogenizuj tkankę za pomocą 30 pociągnięć na lodzie za pomocą luźnego tłuczka.
  2. Przenieść homogenat do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml i odwirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 ml. Zaoszczędź 100 μl w probówce o pojemności 1,5 ml jako "wejście".
  4. Inkubować supernatant w probówce o pojemności 2 ml z przeciwciałem anty-GFP (5 μg/ml; 1:400) w temperaturze 4 °C na rotatorze typu end-to-end (24 obr./min) przez noc.

4. Immunoprecypitacja

  1. Przenieść mieszaninę homogenatu/przeciwciała do nowej probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml zawierającej przemyte kulki białka G z kroku 2.4. Inkubować w temperaturze 4 °C na rotatorze typu "koniec po kroku" (24 obr./min) przez 2 godziny.
  2. Oddziel kulki magnetyczne od supernatantu za pomocą stojaka magnetycznego. Zachowaj supernatant jako "frakcję ujemną". Frakcja ujemna zawiera (1) RNA w komórkach EGFP-ujemnych i (2) RNA w komórkach EGFP-dodatnich, które nie są związane z rybosomami.
  3. Dodaj 1 ml buforu do płukania o wysokiej zawartości soli do kulek i krótko przekręć probówkę, aby umyć kulki. Umieść rurkę w stojaku na magnesy.
  4. Usuń bufor do mycia. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy. Koraliki zawierają teraz kompleks koraliki-rybosom-RNA z komórek EGFP-dodatnich.

5. Ekstrakcja RNA

UWAGA: Poniższe kroki są zaczerpnięte z zestawu do izolacji RNA (Tabela Materiałów). Traktuj każdą frakcję (tj. wejściową, dodatnią i ujemną) jako niezależną próbkę i niezależnie izoluj RNA.

  1. Inkubować kulki z kroku 4.4 z 50 μl buforu ekstrakcyjnego (z zestawu do izolacji RNA) w termomikserze (42 °C, 500 obr./min) przez 30 minut, aby uwolnić RNA z kulek.
  2. Oddziel kulki za pomocą stojaka magnetycznego, przenieś supernatant zawierający kompleks kulek-rybosom-RNA do probówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Odwirować probówkę o masie 3000 x g przez 2 minuty, a następnie pipetować supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Ta probówka zawiera "frakcję dodatnią" kroku TRAP.
    UWAGA: Dla frakcji wejściowej i ujemnej ekstrahować RNA z 25 μl próbek za pomocą 1 ml buforu ekstrakcyjnego. Inkubować w termomikserze (42 °C, 500 obr./min) przez 30 min.
  4. Wstępnie kondycjonuj kolumnę oczyszczającą RNA: Odpipetować 250 μl buforu kondycjonującego na kolumnie oczyszczającej. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odwirować kolumnę przy 16 000 x g przez 1 min.
  5. Odmierzyć pipetą równą objętość 70% EtOH do supernatantu z kroku 5.3 (około 50 μl 70% EtOH dla frakcji dodatniej i 1 ml 70% EtOH dla frakcji wejściowej i ujemnej). Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
  6. Odpipetować mieszaninę do kolumny z kroku 5.4.
  7. Odwirować kolumnę przy 100 x g przez 2 minuty, aby umożliwić związanie RNA z membraną w kolumnie, a następnie natychmiast kontynuować wirowanie przy 16 000 x g przez 30 s. Wyrzuć przepływ.
    UWAGA: Dla frakcji wejściowej i ujemnej należy za każdym razem dodawać do kolumny 250 μL mieszaniny. Powtarzać kroki 5.6 i 5.7, aż wszystkie mieszaniny zostaną zużyte.
  8. Odpipetować 100 μl buforu płuczącego 1 (W1) do kolumny i odwirować przy 8 000 x g przez 1 min. Wyrzucić przepływ.
  9. Odpipetować 75 μl roztworu DNazy wymieszać bezpośrednio z membraną kolumny oczyszczającej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  10. Odpipetować 40 μl W1 do kolumny i odwirować przy 8 000 x g przez 30 s. Wyrzucić przepływ.
  11. Odpipetować 100 μl buforu płuczącego 2 (W2) do kolumny i odwirować przy 8 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.
  12. Odpipetować 100 μl W2 do kolumny i odwirować przy 16 000 x g przez 2 minuty. Wyrzucić przepływ. Ponownie odwirować tę samą kolumnę przy 16 000 x g przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie ślady buforu płuczącego przed etapem elucji.
  13. Przenieść kolumnę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  14. Odpipetować 12 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na membranę kolumny oczyszczającej. Końcówka pipety nie powinna dotykać membrany. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę i wirować przy 1000 x g przez 1 minutę. Następnie kontynuuj wirowanie przy 16 000 x g przez 1 minutę w celu elucji RNA.

6. Stężenie i jakość RNA

  1. Użyj bioanalizatora, aby ocenić jakość i ilość wyekstrahowanego RNA10.

7. Przechowywanie i dalsza analiza

  1. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C (do 1 roku) do czasu dalszej analizy (np. mikromacierzy, ilościowego PCR (qPCR), sekwencjonowania RNA itp.).
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat analizy qPCR, w tym syntezy cDNA, można znaleźć w Lyu et al.11. Startery do qPCR są wymienione w Tabeli Materiałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysz Gli1-CreERT2 (numer seryjny Jackson Lab: 007913) została po raz pierwszy skrzyżowana z myszą reporterową NuTRAP (numer seryjny Jackson Lab: 029899) w celu wygenerowania podwójnie zmutowanych myszy. Myszom posiadającym oba genetycznie modyfikowane allele genów (tj. Gli1-CreERT2 i NuTRAP) wstrzykiwano tamoksyfen raz dziennie, co drugi dzień, przez trzy wstrzyknięcia. Próbki tkanek pobrano w 7dobie po1 dobie wstrzyknięcia. Analiza immunofluorescency...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przydatność analizy transkryptomu całej tkanki może być ograniczona, zwłaszcza podczas badania złożonych tkanek heterogenicznych. Sposób uzyskania RNA specyficznych dla typu komórki staje się pilną potrzebą uwolnienia potężnej techniki sekwencjonowania RNA. Izolacja RNA specyficznych dla typu komórki zwykle opiera się na pobraniu określonego typu komórek za pomocą mikromanipulacji, sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) lub mikrodysekcji wychwytywania laserowego (LCM)18. Opracowano r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez NIH R00HD082686. Dziękujemy za stypendium Endocrine Society Summer Research Fellowship dla H.S.Z. Dziękujemy również dr Yuan Kang za hodowlę i utrzymanie kolonii myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Actbeurofinsstartery qPCRATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (starter do przodu/starter do tyłu)
BioanalizatorAgilent2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini koktajl inhibitorów proteazy bez EDTAMillipore11836170001
cykloheksymidMilipora239764-100MG
Cyp11a1eurofinsstartery qPCRCTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (starter do przodu/starter do tyłu)
dNTPThermo Fisher ScientificR0191
DTT, DithiothreitolThermo Fisher ScientificP2325
Magnes DynaMag-2Thermo Fisher Scientific12321D
Probówki Falcon 15 mLVWR89039-666
Przeciwciało GFPAbcamab290
Zestaw młynkówdo szkła DWK Nauki Przyrodnicze357542
heparynyBEANTOWN CHEMICAL139975-250MG
em>Hsd3beurofinsstartery qPCRGACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTCTC (starter do przodu/starter do tyłu)
KClBiosciencesR005
MgCl2BiosciencesR004
Probówki do mikrowirówek 2 mlThermo Fisher Scientific02-707-354
Mysie mikromacierze testowe Clariom SThermo Fisher ScientificMicroarray
service NP-40Milipor492018-50 Ml
oligo (dT)20Invitrogen18418020
Zestaw do izolacji RNA PicoPureThermo Fisher ScientificKIT0204
Białko G DynabeadThermo Fisher Scientific10003D
Wolne od RNaz wodnekomórki do uprawyNUPW-0500
RNaseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazyThermo Fisher Scientific10777019
Sox9eurofins starteryqPCRTGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (starter do przodu/starter wsteczny
Indeks górny IV odwrotna transkryptazaInvitrogen18090050
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4309155
Sycp3eurofins starteryqPCRGAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTTTGA (starter do przodu/starter do tyłu)
TrisAlfa AesarJ62848
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
  2. Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
  3. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  4. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
  5. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985(2015).
  6. Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919(2020).
  7. Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624(2019).
  8. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  9. Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
  10. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
  11. Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
  12. King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
  13. Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
  14. Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
  15. Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
  16. Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
  17. Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481(2009).
  18. Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  19. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  20. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108(2018).
  21. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693(2020).
  22. Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
  23. Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNA specyficzne dla typu kom rekoczyszczanie rybosom w aktywnych translacyjnie metod powinowactwaRNA zwi zane z rybosomamikom rki wykazuj ce ekspresj EGFPmodel mysi NuTRAPoczyszczanie RNAizolacja za pomoc kulek magnetycznychanaliza mikromacierzyilo ciowy RT PCRhomogenizacja tkanek

Powiązane artykuły