Artykuł metodologiczny

Spektroskopia CD do badania interakcji DNA-białko

DOI:

10.3791/63147

⸱

10 lutego 2022

 ,  , 
1Jawaharlal Nehru University New Delhi

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcja zależnego od ATP czynnika remodelującego chromatynę z ligandem DNA jest opisana za pomocą spektroskopii CD. Indukowane zmiany konformacyjne na promotorze genu analizowane przez wygenerowane piki można wykorzystać do zrozumienia mechanizmu regulacji transkrypcji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektroskopia dichroizmu kołowego (CD) jest prostą i wygodną metodą badania drugorzędowej struktury i interakcji biomolekuł. Ostatnie postępy w spektroskopii CD umożliwiły szczegółowe badanie interakcji DNA-białko i dynamiki konformacyjnej DNA w różnych mikrośrodowiskach w celu lepszego zrozumienia regulacji transkrypcji in vivo. Obszar wokół potencjalnej strefy transkrypcji musi zostać rozwinięty, aby nastąpiła transkrypcja. Jest to złożony proces wymagający koordynacji modyfikacji histonów, wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA i innych czynności związanych z przebudową chromatyny. Za pomocą spektroskopii CD możliwe jest badanie zmian konformacyjnych w regionie promotora spowodowanych przez białka regulatorowe, takie jak zależne od ATP remodelery chromatyny, w celu promowania transkrypcji. Można również monitorować zmiany konformacyjne zachodzące w białku. Ponadto pytania dotyczące powinowactwa białka do docelowego DNA i swoistości sekwencji można rozwiązać poprzez włączenie mutacji w docelowym DNA. Krótko mówiąc, unikalne zrozumienie tej czułej i niedrogiej metody może przewidywać zmiany w dynamice chromatyny, poprawiając w ten sposób zrozumienie regulacji transkrypcji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dichroizm kołowy (CD) to technika spektroskopowa, która opiera się na wrodzonej chiralności makrocząsteczek biologicznych, co prowadzi do zróżnicowanej absorpcji prawoskrętnego i lewoskrętnego światła spolaryzowanego kołowo. Ta absorpcja różnicowa jest znana jako dichroizm kołowy. Technika ta może być zatem wykorzystana do nakreślenia konformacji makrocząsteczek biologicznych, takich jak białka i DNA, z których oba zawierają centra chiralne1,2.

Fale elektromagnetyczne zawierają zarówno elementy elektryczne, jak i magnetyczne. Zarówno pole elektryczne, jak i magnetyczne oscylują pros....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Stężenie robocze składników reakcji

  1. Przygotować stężenia robocze dla CD i innych składników reakcji na świeżo (patrz Tabela 1) i utrzymywać je w temperaturze 4 °C przed rozpoczęciem reakcji><. UWAGA: Dla reakcji CD opisanych w niniejszej pracy stężenia robocze składników są następujące: Bufor fosforanu sodu (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Białko 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.

2. Aktywność ATPazy

  1. Przed spektroskopią CD należy ustalić aktywność ATPazy białka w obecności cząsteczek DNA, aby upewnić się, że białko użyte w spektros....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ADAAD stabilizuje strukturę przypominającą pętlę macierzystą na promotorze MYC
Wcześniejsze dowody eksperymentalne wykazały, że SMARCAL1 jest negatywnym regulatorem MYC29. Analiza regionu promotora genu MYC o długości 159 pz za pomocą mapera QGRS wykazała, że nić przednia ma potencjał do tworzenia G-kwadrupleksu (Tabela 2). Mfold wykazał, że obie nici DNA MYC mogą tworzyć strukturę podobną .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego artykułu jest przedstawienie techniki spektroskopii CD jako podejścia do badania zmian konformacyjnych zachodzących w DNA w obecności białek remodelujących chromatynę zależnych od ATP oraz powiązanie tych zmian konformacyjnych z ekspresją genów. Spektroskopia CD zapewnia szybką i łatwo dostępną metodę badania zmian konformacyjnych w DNA.

Kluczowym punktem, który należy wziąć pod uwagę w przypadku tej techniki, jest czystość DNA i białka. Wskazane jest, aby zarówno DNA, jak i.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, za spektrofotometr CD. V.J. i A.D. byli wspierani przez stypendium z CSIR.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolFisher scientificO3446I-100
Hydrat soli disodowej 5′-trifosforanu adenozynySigmaaldrichA2383
CD Kuweta kwarcowaSTARNA21-Q-1
Chirascan V100CD Fizyka stosowanaNiedostępne
EDTA Sól disodowa DihydratSRL43272
Sefroza glutationu 4BGE Healthcare17-0756-01Chromatografia powinowactwa glutationu
Roztwór czyszczący Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507
Dehydrogenaza L-mlekowaSigmaaldrich  L2625
Octan magnezu czterowodnyFisher scientificBP215-500
Sześciowodny chlorek magnezuFisher scientificM33-500
NADH sól disodowaSigmaaldrich10107735001
Fosfoenolopirogronian Sól monocykloheksyloamoniowaSRL40083
Octan potasuFisher scientificP178-3
Kinaza pirogronianowaSigmaaldrichP1506
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnyFisher scientificS374-500
Fosforan sodu jednowodny monohydratFisher scientificS369-500
Synergy HT czytnik mikropłytekBioTekNiedostępny
Tris BaseFisher scientificZobacz materiał BP152-500

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Woody, R. W. Circular dichroism. Methods in Enzymology. 246, 34-71 (1995).
  2. Kelly, S., Price, N. The Use of Circular Dichroism in the Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein & Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
  3. Rodg....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

CD SpectroscopyDNA Protein InteractionsCircular DichroismChromatin RemodelingTranscription RegulationATPase ActivityG Quadruplex DNAPromoter RegionSecondary StructureOligonucleotide Structure

Powiązane artykuły