Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Spektroskopia CD do badania interakcji DNA-białko

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63147

⸱

10 lutego 2022

 ,  , 
1Jawaharlal Nehru University New Delhi

W tym artykule

Podsumowanie

Interakcja zależnego od ATP czynnika remodelującego chromatynę z ligandem DNA jest opisana za pomocą spektroskopii CD. Indukowane zmiany konformacyjne na promotorze genu analizowane przez wygenerowane piki można wykorzystać do zrozumienia mechanizmu regulacji transkrypcji.

Streszczenie

Spektroskopia dichroizmu kołowego (CD) jest prostą i wygodną metodą badania drugorzędowej struktury i interakcji biomolekuł. Ostatnie postępy w spektroskopii CD umożliwiły szczegółowe badanie interakcji DNA-białko i dynamiki konformacyjnej DNA w różnych mikrośrodowiskach w celu lepszego zrozumienia regulacji transkrypcji in vivo. Obszar wokół potencjalnej strefy transkrypcji musi zostać rozwinięty, aby nastąpiła transkrypcja. Jest to złożony proces wymagający koordynacji modyfikacji histonów, wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA i innych czynności związanych z przebudową chromatyny. Za pomocą spektroskopii CD możliwe jest badanie zmian konformacyjnych w regionie promotora spowodowanych przez białka regulatorowe, takie jak zależne od ATP remodelery chromatyny, w celu promowania transkrypcji. Można również monitorować zmiany konformacyjne zachodzące w białku. Ponadto pytania dotyczące powinowactwa białka do docelowego DNA i swoistości sekwencji można rozwiązać poprzez włączenie mutacji w docelowym DNA. Krótko mówiąc, unikalne zrozumienie tej czułej i niedrogiej metody może przewidywać zmiany w dynamice chromatyny, poprawiając w ten sposób zrozumienie regulacji transkrypcji.

Wprowadzenie

Dichroizm kołowy (CD) to technika spektroskopowa, która opiera się na wrodzonej chiralności makrocząsteczek biologicznych, co prowadzi do zróżnicowanej absorpcji prawoskrętnego i lewoskrętnego światła spolaryzowanego kołowo. Ta absorpcja różnicowa jest znana jako dichroizm kołowy. Technika ta może być zatem wykorzystana do nakreślenia konformacji makrocząsteczek biologicznych, takich jak białka i DNA, z których oba zawierają centra chiralne1,2.

Fale elektromagnetyczne zawierają zarówno elementy elektryczne, jak i magnetyczne. Zarówno pole elektryczne, jak i magnetyczne oscylują prostopadle do kierunku rozchodzenia się fali. W przypadku światła niespolaryzowanego pola te oscylują w wielu kierunkach. Gdy światło jest spolaryzowane kołowo, uzyskuje się dwa pola elektromagnetyczne o różnicy faz 90°. Cząsteczki chiralne wykazują kołową skręcalność optyczną (dwójłomność) tak, że w różnym stopniu absorbują prawoskrętne światło spolaryzowane kołowo i lewoskrętne światło spolaryzowane kołowo3. Powstałe pole elektryczne zostanie prześledzone jako elipsa, w funkcji długości fali. Widmo CD jest zatem rejestrowane jako eliptyczność (q), a dane są prezentowane jako średnia eliptyczność pozostałości w funkcji długości fali.

W przypadku białek, Cα aminokwasów (z wyjątkiem glicyny) jest chiralne, co jest wykorzystywane przez spektroskopię CD do określenia drugorzędowej struktury tej makrocząsteczki4. Widma CD cząsteczek białek są zwykle rejestrowane w zakresie dalekiego promieniowania UV. Białka α-helisowe mają dwa ujemne pasma przy 222 nm i 208 nm oraz jeden dodatni pik przy 193 nm4. Białka o antyrównoległej strukturze drugorzędowej β-arkuszowej wykazują ujemny pik przy 218 nm i dodatni pik przy 195 nm4. Białka o nieuporządkowanej strukturze wykazują niską eliptyczność w pobliżu 210 nm i ujemny pik przy 195 nm4. W ten sposób dobrze zdefiniowane piki/prążki dla różnych struktur drugorzędowych sprawiają, że CD jest wygodnym narzędziem do wyjaśniania zmian konformacyjnych zachodzących w drugorzędowej strukturze białek podczas denaturacji, a także wiązania ligandów.

Kwasy nukleinowe mają trzy źródła chiralności: cząsteczkę cukru, spiralność struktury drugorzędowej oraz trzeciorzędowe uporządkowanie DNA w środowisku o dużym zasięgu5,6. Widma CD kwasów nukleinowych są zwykle rejestrowane w zakresie od 190 do 300 nm5,6. Każda konformacja DNA, podobnie jak białka, daje charakterystyczne spektrum, chociaż piki/prążki mogą różnić się o pewien stopień ze względu na warunki rozpuszczalnika i różnice w sekwencjach DNA7. B-DNA, najpowszechniejsza forma, charakteryzuje się dodatnim pikiem około 260-280 nm i ujemnym pikiem około 245 nm6. Piki/prążki DNA w formie B są na ogół małe, ponieważ pary zasad są prostopadłe do podwójnej helisy, nadając cząsteczce słabą chiralności. A-DNA daje dominujący pik dodatni przy 260 nm i pik ujemny około 210 nm6. Z-DNA, lewoskrętna helisa, daje ujemne pasmo przy 290 nm i dodatni pik około 260 nm6. To DNA daje również skrajnie ujemny pik przy 205 nm6.

Oprócz tych konformacji, DNA może również tworzyć tripleksy, kwadrupleksy i spinki do włosów, z których wszystkie można rozróżnić za pomocą spektroskopii CD. Równoległy G-quadruplex daje dominujące pasmo dodatnie przy 260 nm, podczas gdy antyrównoległy G-quadruplex daje pasmo ujemne przy 260 nm i dodatni szczyt przy 290 nm, co ułatwia rozróżnienie między dwiema formami struktur kwadrupleksu6. Tripleksy nie dają charakterystycznego spektrum8. Na przykład widma DNA o długości 36 nukleotydów, które mogą tworzyć wewnątrzcząsteczkową potrójną helisę zawierającą pary zasad G.G.C i T.A.T w obecności Na+, wykazują silne pasmo ujemne przy 240 nm i szeroki dodatni pik. Szeroki dodatni pik pokazuje wkłady przy 266, 273 i 286 nm. Ten sam oligonukleotyd w obecności Na+ i Zn+ wykazuje cztery pasma ujemne (213, 238, 266 i 282 nm) oraz dodatni pik przy 258 nm. Tak więc widma potrójnego DNA mogą się różnić w zależności od warunków soli8.

Oprócz tych konformacji, widma CD umożliwiły identyfikację innej formy DNA zwanej X-DNA. X-DNA powstaje, gdy sekwencja DNA zawiera naprzemienne reszty adeniny i tyminy. Widma CD X-DNA zawierają dwa ujemne piki przy 250 i 280 nm. Dostępnych jest bardzo niewiele informacji na temat X-DNA, chociaż spekuluje się, że funkcjonuje ono jako zlew dla dodatniego superzwijania6,9. Zmiany w widmach CD mogą również ujawnić szczegóły dotyczące interakcji ligand-białko i dlatego zostały dodane do arsenału metod molekularnych do wykrywania interakcji lek-białko10,11,12,13,14. Widma CD zostały również wykorzystane do monitorowania zmian w drugorzędowej strukturze białek podczas procesu fałdowania15. Podobnie, widma CD mogą być również używane do sondowania interakcji ligand-DNA16,17.

Spektroskopia CD, jest zatem łatwą i tanią metodą rozróżniania różnych form konformacji DNA, pod warunkiem, że istnieje dostęp do nie tak taniego sprzętu i oprogramowania. Metoda jest niezwykle czuła i szybka. Wymaga tylko niewielkiej ilości DNA, co daje mu przewagę nad alternatywną techniką spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Miareczkowanie ligandami i substratami jest również łatwe do wykonania. Głównym ograniczeniem jest to, że DNA powinno być bardzo czyste. Zaleca się stosowanie DNA oczyszczonego z elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (PAGE).

Informacje uzyskane przez widma CD były głównie wykorzystywane do dedukowania cech strukturalnych białek i identyfikacji odrębnych konformerów DNA. W tym badaniu widma CD wykorzystano do zintegrowania wyników uzyskanych z eksperymentu immunoprecypitacji chromatyny in vivo (ChIP) w celu określenia, czy białko będące przedmiotem zainteresowania / przewidywany czynnik transkrypcyjny może powodować zmianę konformacyjną w regionie promotorowym swoich genów efektorowych. Współpraca ta pomaga w postępie tradycyjnych technik spektroskopowych CD poprzez przewidywanie mechanizmu regulacji transkrypcji przez przewidywany czynnik transkrypcyjny na i wokół miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS) promotora.

Przebudowa chromatyny to dobrze zdefiniowany mechanizm regulujący procesy metaboliczne DNA poprzez udostępnianie ciasno upakowanej chromatyny różnym czynnikom regulacyjnym, takim jak czynniki transkrypcyjne, składniki replikacji DNA lub białka naprawiające uszkodzenia. Zależne od ATP remodelery chromatyny, znane również jako rodzina białek SWI/SNF, są kluczowymi białkami remodelującymi obecnymi w komórkach eukariotycznych18,19. Grupowanie filogenetyczne podzieliło rodzinę białek SWI/SNF na 6 podgrup20: podobne do Snf2, podobne do Swr1, podobne do SSO1653, podobne do Rad54, podobne do Rad5/16 i odległe. SMARCAL1, białko będące przedmiotem zainteresowania w tym badaniu, należy do odległej podgrupy20. Białko to zostało wykorzystane do zbadania jego sposobu regulacji transkrypcji za pomocą spektroskopii CD.

>jove_content21,22. Jednak nie wykazano, aby niektórzy członkowie tej rodziny przebudowywali nukleosomy, np. SMARCAL1. Mimo że badania wykazały, że SMARCAL1 wiąże się z chromosomami politenowymi, brakuje eksperymentalnych dowodów dotyczących jego zdolności do przebudowy nukleosomów23. W związku z tym postulowano, że SMARCAL1 może regulować transkrypcję poprzez zmianę konformacji DNA24. Spektroskopia CD dostarczyła łatwej i łatwo dostępnej metody walidacji tej hipotezy.

SMARCAL1 jest zależnym od ATP białkiem remodelującym chromatynę, które przede wszystkim pełni funkcję helikazy wyżarzającej25,26,27. Postuluje się modulację transkrypcji poprzez przebudowę konformacji DNA24. Aby przetestować tę hipotezę, zbadano rolę SMARCAL1 w regulacji transkrypcji genów podczas uszkodzeń DNA wywołanych doksorubicyną. W tych badaniach SMARCAL1 wykorzystano do analizy in vivo i ADAAD do testów in vitro28,29. Wcześniejsze badania wykazały, że ADAAD może rozpoznawać DNA w sposób zależny od struktury, ale niezależny od sekwencji30,31. Białko wiąże się optymalnie z cząsteczkami DNA posiadającymi dwuniciowe do jednoniciowych regionów przejściowych, podobnie jak DNA pętli macierzystej, i hydrolizuje ATP 30,31.

Eksperymenty in vivo wykazały, że SMARCAL1 reguluje ekspresję MYC, DROSHA, DGCR8 i DICER poprzez wiązanie się z regionami promotora28,29. Region interakcji został zidentyfikowany za pomocą eksperymentów ChIP28,29. Technika ChIP służy do analizy interakcji białka z pokrewnym DNA w komórce. Jego celem jest ustalenie, czy określone białka, takie jak czynniki transkrypcyjne na promotorach lub innych miejscach wiązania DNA, są związane z określonymi obszarami genomu. Białko związane z DNA jest najpierw sieciowane za pomocą formaldehydu. Następnie następuje izolacja chromatyny. Wyizolowana chromatyna jest ścinana do fragmentów o długości 500 pz za pomocą sonikacji lub trawienia nukleazy, a białko związane z DNA jest immunoprecypitowane przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka. Sieciowanie jest odwrócone, a DNA jest analizowane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) lub ilościowego PCR w czasie rzeczywistym.

Wyniki ChIP doprowadziły do hipotezy, że SMARCAL1 prawdopodobnie pośredniczy w regulacji transkrypcji, wywołując zmianę konformacyjną w regionach promotorowych tych genów. Mapper QGRS i oprogramowanie Mfold zostały wykorzystane do zidentyfikowania potencjału tych regionów promotora do tworzenia struktur drugorzędowych28,29. Mapper QGRS służy do przewidywania G-quadruplexes32, podczas gdy Mfold33 analizuje zdolność sekwencji do tworzenia drugorzędnych struktur, takich jak pętle macierzyste.

Po analizie struktury drugorzędowej, przeprowadzono dalsze eksperymenty in vitro z rekombinowaną 6-krotnie znakowaną aktywną domeną ATPazy A zależnej od DNA (ADAAD), bydlęcym homologiem SMARCAL1, oczyszczonym z Escherichia coli34. Testy ATPazy przeprowadzono przy użyciu ADAAD w celu ustalenia, że zidentyfikowane sekwencje DNA mogą działać jako efektory28,29. Na koniec przeprowadzono spektroskopię CD w celu monitorowania zmian konformacyjnych indukowanych w cząsteczce DNA przez ADAAD28,29.

Aby udowodnić, że aktywność ATPazy białka była niezbędna do wywołania zmiany konformacyjnej w cząsteczce DNA, dodano albo kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) do chelatu Mg+2, albo dodano aktywny inhibitor domeny ATPazy A Neomycyny (ADAADiN), specyficzny inhibitor białka SWI/SNF35,36. Ta technika spektroskopowa CD może być stosowana z dowolnym oczyszczonym białkiem, które zostało wykazane przez ChIP lub inny odpowiedni test, aby wiązać się z przewidywanym regionem genomu promotora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Stężenie robocze składników reakcji

  1. Przygotować świeżo robocze stężenia buforów do CD oraz pozostałych komponentów reakcji (patrz Tabela 1) i przechowywać je w temperaturze 4 °C przed rozpoczęciem reakcji.
    UWAGA: Dla opisanych w niniejszej pracy reakcji CD robocze stężenia komponentów są następujące: bufor fosforanowy sodu (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, białko 1 µM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 µM.

2. Aktywność ATPazy

  1. Przed przeprowadzeniem spektroskopii CD należy określić aktywność ATPase białka w obecności cząsteczek DNA, aby upewnić się, że białko użyte w spektroskopii CD jest aktywne oraz aby zidentyfikować cząsteczki DNA, które najskuteczniej indukują hydrolizę ATP.
  2. Aktywność ATPase białka w obecności różnych cząsteczek DNA należy zmierzyć za pomocą testu utleniania sprzężonego z NADH, składającego się z następujących dwóch reakcji.
    1. W płytce 96-dołkowej wymieszać 0.1 µM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA oraz 1x bufor REG do końcowej objętości 250 µL.
      UWAGA: Enzym kinaza pirogronianowa wykorzystuje ADP i Pi do przekształcenia fosfoenolopirogronianu w pirogronian, regenerując tym samym ATP. Zapewnia to stałe, nasycające stężenie ATP w reakcji. W drugiej reakcji pirogronian powstały w wyniku działania kinazy pirogronianowej jest przekształcany przez dehydrogenazę mleczanową w mleczan. W tej reakcji jedna cząsteczka NADH zostaje utleniona do NAD+. Zużycie NADH mierzy się poprzez pomiar absorbancji tej cząsteczki przy 340 nm.
    2. Inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
    3. Zmierzyć ilość NAD+ przy 340 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
    4. W celu pomiaru ilości NAD+ należy użyć oprogramowania dostarczonego wraz z czytnikiem mikropłytek.
      1. Kliknąć NADH assay , aby zmierzyć absorbancję przy 340 nm.
      2. Umieścić płytkę 96-dołkową w uchwycie na płytki w urządzeniu. Kliknąć przycisk Read Plate, aby zarejestrować absorbancję.
        UWAGA: Stężenie NAD+ jest obliczane na podstawie molowego współczynnika ekstynkcji NADH wynoszącego 6.3 mM−1 zgodnie z równaniem (1).
        A = εcl (1)

        Gdzie A = Absorbancja
        ε = Molowy współczynnik ekstynkcji
        c = Stężenie molowe
        l = Długość drogi optycznej w cm

3. Wybór i przygotowanie kuwet CD

  1. Rejestruj widma CD w kuwetach kwarcowych o wysokiej przejrzystości. Stosuj kuwety prostokątne lub cylindryczne.
    UWAGA: Do wszystkich reakcji opisanych w niniejszej pracy użyto kwarcowej kuwety do CD (objętość nominalna 0,4 mL, droga optyczna 1 mm).
  2. Użyj roztworu do czyszczenia kuwet w celu ich oczyszczenia. Przygotuj 400 µL 1% roztworu do czyszczenia kuwet w wodzie, wlej go do kuwety i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 h.
  3. Kilkukrotnie przemyj kuwetę wodą, aby ją oczyścić. Wykonaj skan wody lub buforu w kuwecie, aby sprawdzić, czy jest ona czysta.
    UWAGA: Odczyt dla wody lub buforu musi mieścić się w zakresie od 0 do 1 mdeg.

4. Przygotowanie białek i oligonukleotydów DNA

  1. Aby zminimalizować ilość składników buforu, które mogą powodować powstawanie niejednoznacznych pików, należy utrzymać objętość białka w reakcji poniżej 50 µL. Przez cały czas trwania eksperymentu białko powinno znajdować się na lodzie, aby uniknąć jego degradacji.
  2. W reakcjach należy stosować oligonukleotydy DNA oczyszczane metodą PAGE.
    UWAGA: W opisanych tutaj reakcjach DNA stosowano zarówno w formie natywnej, jak i w formach chłodzonych termicznie (szybko chłodzonych (FC) oraz wolno chłodzonych (SC)). Szybkie chłodzenie sprzyja tworzeniu wiązań wewnątrzmolekularnych w DNA, co prowadzi do powstania większej liczby struktur drugorzędowych. Z kolei wolne chłodzenie sprzyja tworzeniu wiązań międzymolekularnych w DNA, co skutkuje mniejszą liczbą struktur drugorzędowych.
  3. W przypadku szybkiego chłodzenia należy podgrzać DNA w temperaturze 94 °C przez 3 min w bloku grzejnym, a następnie natychmiast schłodzić na lodzie. W przypadku wolnego chłodzenia należy podgrzać DNA w temperaturze 94 °C przez 3 min i pozwolić mu ostygnąć do temperatury pokojowej w tempie 1 °C na minutę.

5. Przygotowanie eksperymentów kontrolnych w celu zarejestrowania widm bazowych

  1. Zachowaj objętość reakcji na poziomie 300 µL we wszystkich reakcjach. Przygotuj łącznie 5 reakcji bazowych w probówkach wirówkowych o pojemności 1.5 mL, jedna po drugiej, w następujący sposób: i) bufor + woda; ii) bufor + MgCl2 + ATP + woda; iii) bufor + MgCl2 + ATP + białko + woda; iv) iii + EDTA lub ADAADiN; v) bufor + białko + woda.

6. Przygotowanie eksperymentów do rejestracji widm CD

  1. Przygotować łącznie 5 reakcji, jedna po drugiej, w probówkach wirówkowych o pojemności 1.5 mL w następujący sposób: i) bufor + DNA + woda; ii) bufor + DNA + MgCl2 + ATP + woda; iii) bufor + DNA + MgCl2 + ATP + białko + woda; iv) iii + EDTA lub ADAADiN; v) bufor + DNA + białko + woda.

7. Rejestracja skanu

  1. Włączyć dopływ gazu i uruchomić spektrometr CD.
  2. Włączyć lampę po 10-15 min. Włączyć łaźnię wodną i ustawić temperaturę uchwytu na 37 °C.
  3. Otworzyć oprogramowanie CD spectrum.
    1. Ustawić temperaturę na 37 °C.
    2. Ustawić zakres długości fali na 180 - 300 nm.
    3. Ustawić czas na punkt na 0.5 s.
    4. Ustawić liczbę skanów na 5.
    5. Kliknąć Pro-Data Viewer, utworzyć nowy plik i zmienić jego nazwę, dodając szczegóły dotyczące eksperymentu oraz datę.
  4. Wszystkie komponenty reakcji przechowywać w lodzie, aby uniknąć ich degradacji. Przygotować próbki baseline oraz mieszaniny reakcyjne, jedna po drugiej, w probówkach wirówkowych i wymieszać je poprzez pipetowanie. Ostrożnie przenieść mieszaninę reakcyjną do kuwety, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza.
  5. W przypadku przeprowadzania eksperymentu kinetycznego inkubować reakcje w 37 °C przez wymagany czas, a następnie wykonać skan. Dodać EDTA do buforu zawierającego DNA, ATP, Mg+2 i białko, aby zatrzymać hydrolizę ATP.
  6. Zwiększyć stężenie EDTA oraz czas inkubacji, aby całkowicie zahamować aktywność ATPazy.
  7. W oprogramowaniu odjąć sygnały baseline od odpowiadających im reakcji (np. odjąć reakcję 1 od baseline 1). Wygładzić dane w oprogramowaniu CD spectrum lub w programie do wykresów. Wykreślić dane w programie do wykresów.
    UWAGA: Odjęcie sygnałów baseline od odpowiadających im reakcji pozwoli uzyskać netto widma CD samego DNA.

8. Analiza i interpretacja danych

  1. Użyj wzoru podanego w równaniu (2), aby przeliczyć wartości uzyskane w milostopniach na średnią eliptyczność pozostałości.
    Wzór równowagi statycznej [θ]=(S×mRw)/(10cL), równanie matematyczne do analizy naukowej.  (2)
    Gdzie S to sygnał CD w milostopniach, c to stężenie DNA w mg/mL, mRw to średnia masa pozostałości, a l to długość drogi optycznej w cm.
  2. Wykorzystując oprogramowanie do wykresów, sporządź wykres zależności średniej eliptyczności pozostałości od długości fali i przeanalizuj piki.
  3. Aby sporządzić wykres, wybierz średnią eliptyczność pozostałości na osi Y oraz długość fali na osi X i wykreśl linię.
    UWAGA: Wykres ten pozwoli określić charakterystyczne piki różnych form DNA. Formy DNA odpowiadające poszczególnym pikom można zidentyfikować na podstawie istniejącej literatury6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

ADAAD stabilizuje strukturę przypominającą pętlę spinkową na MYC promotor
Wcześniejsze dowody eksperymentalne wykazały, że SMARCAL1 jest negatywnym regulatorem MYC29Analiza regionu promotorowego o długości 159 bp MYC mapowanie genu za pomocą programu QGRS mapper wykazało, że nić prowadząca posiada potencjał do tworzenia G-kwadrupleksu (Tabela 2). Program Mfold wykazał, że obie nici MYC DNA m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Celem tego artykułu jest przedstawienie techniki spektroskopii CD jako podejścia do badania zmian konformacyjnych zachodzących w DNA w obecności białek remodelujących chromatynę zależnych od ATP oraz powiązanie tych zmian konformacyjnych z ekspresją genów. Spektroskopia CD zapewnia szybką i łatwo dostępną metodę badania zmian konformacyjnych w DNA.

Kluczowym punktem, który należy wziąć pod uwagę w przypadku tej techniki, jest czystość DNA i białka. Wskazane jest, aby zarówno DNA, jak i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, za spektrofotometr CD. V.J. i A.D. byli wspierani przez stypendium z CSIR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolFisher scientificO3446I-100
Hydrat soli disodowej 5′-trifosforanu adenozynySigmaaldrichA2383
CD Kuweta kwarcowaSTARNA21-Q-1
Chirascan V100CD Fizyka stosowanaNiedostępne
EDTA Sól disodowa DihydratSRL43272
Sefroza glutationu 4BGE Healthcare17-0756-01Chromatografia powinowactwa glutationu
Roztwór czyszczący Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507
Dehydrogenaza L-mlekowaSigmaaldrich  L2625
Octan magnezu czterowodnyFisher scientificBP215-500
Sześciowodny chlorek magnezuFisher scientificM33-500
NADH sól disodowaSigmaaldrich10107735001
Fosfoenolopirogronian Sól monocykloheksyloamoniowaSRL40083
Octan potasuFisher scientificP178-3
Kinaza pirogronianowaSigmaaldrichP1506
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnyFisher scientificS374-500
Fosforan sodu jednowodny monohydratFisher scientificS369-500
Synergy HT czytnik mikropłytekBioTekNiedostępny
Tris BaseFisher scientificZobacz materiał BP152-500

Bibliografia

  1. Woody, R. W. Circular dichroism. Methods in Enzymology. 246, 34-71 (1995).
  2. Kelly, S., Price, N. The Use of Circular Dichroism in the Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein & Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
  3. Rodger, A., Marshall, D. Beginners guide to circular dichroism. The Biochemist. 43 (2), 58-64 (2021).
  4. Greenfield, N. J. Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure. Nature Protocols. 1 (6), 2876-2890 (2006).
  5. Kypr, J., Kejnovská, I., Bednářová, K., Vorlíčková, M. Circular Dichroism Spectroscopy of Nucleic Acids. Comprehensive Chiroptical Spectroscopy. , 575-586 (2012).
  6. Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
  7. Miyahara, T., Nakatsuji, H., Sugiyama, H. Helical Structure and Circular Dichroism Spectra of DNA: A Theoretical Study. The Journal of Physical Chemistry A. 117 (1), 42-55 (2013).
  8. Khomyakova, E. B. Parallel intramolecular DNA triple helix with G and T bases in the third strand stabilized by Zn2+ ions. Nucleic Acids Research. 28 (18), 3511-3516 (2000).
  9. Kypr, J., et al. The unusual X-form DNA in oligodeoxynucleotides: dependence of stability on the base sequence and length. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 13 (6), 999-1006 (1996).
  10. Zohoorian-Abootorabi, T., Sanee, H., Iranfar, H., Saberi, M. R., Chamani, J. Separate and simultaneous binding effects through a non-cooperative behavior between cyclophosphamide hydrochloride and fluoxymesterone upon interaction with human serum albumin: multi-spectroscopic and molecular modeling approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 88, 177-191 (2012).
  11. Sharifi-Rad, A., Mehrzad, J., Darroudi, M., Saberi, M. R., Chamani, J. Oil-in-water nanoemulsions comprising Berberine in olive oil: biological activities, binding mechanisms to human serum albumin or holo-transferrin and QMMD simulations. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (3), 1029-1043 (2021).
  12. Mokaberi, P., Babayan-Mashhadi, F., Amiri Tehrani Zadeh, Z., Saberi, M. R., Chamani, J. Analysis of the interaction behavior between Nano-Curcumin and two human serum proteins: combining spectroscopy and molecular stimulation to understand protein-protein interaction. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (9), 3358-3377 (2021).
  13. Danesh, N., et al. Determining the binding site and binding affinity of estradiol to human serum albumin and holo-transferrin: fluorescence spectroscopic, isothermal titration calorimetry and molecular modeling approaches. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 36 (7), 1747-1763 (2018).
  14. Sadeghzadeh, F., et al. Characterizing the binding of angiotensin converting enzyme I inhibitory peptide to human hemoglobin: influence of electromagnetic fields. Protein and Peptide Letters. 27 (10), 1007-1021 (2020).
  15. Chamani, J., et al. Cooperative alpha-helix formation of beta-lactoglobulin induced by sodium n-alkyl sulfates. Journal of Colloid and Interface Science. 293 (1), 52-60 (2006).
  16. Dareini, M., et al. A novel view of the separate and simultaneous binding effects of docetaxel and anastrozole with calf thymus DNA: Experimental and in silico approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 228, 117528(2020).
  17. Dehghani Sani, F., et al. Changes in binding affinity between ofloxacin and calf thymus DNA in the presence of histone H1: Spectroscopic and molecular modeling investigations. Journal of Luminescence. 203, 599-608 (2018).
  18. Hargreaves, D. C., Crabtree, G. R. ATP-dependent chromatin remodeling: genetics, genomics and mechanisms. Cell Research. 21 (3), 396-420 (2011).
  19. Morettini, S., Podhraski, V., Lusser, A. ATP-dependent chromatin remodeling enzymes and their various roles in cell cycle control. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 5522-5532 (2008).
  20. Flaus, A., Martin, D. M. A., Barton, G. J., Owen-Hughes, T. Identification of multiple distinct Snf2 subfamilies with conserved structural motifs. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2887-2905 (2006).
  21. Flaus, A., Owen-Hughes, T. Mechanisms for ATP-dependent chromatin remodelling: the means to the end. The FEBS Journal. 278 (19), 3579-3595 (2011).
  22. Mizuguchi, G., et al. ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science. 303 (5656), New York, N.Y. 343-348 (2004).
  23. Elizondo, L. I., et al. Schimke immuno-osseous dysplasia: SMARCAL1 loss-of-function and phenotypic correlation. Journal of Medical Genetics. 46 (1), 49-59 (2009).
  24. Baradaran-Heravi, A., et al. SMARCAL1 deficiency predisposes to non-Hodgkin lymphoma and hypersensitivity to genotoxic agents in vivo. American Journal of Medical Genetics. Part A. 158 (9), 2204-2213 (2012).
  25. Bansal, R., et al. SMARCAL1, the annealing helicase and the transcriptional co-regulator. IUBMB life. 72 (10), 2080-2096 (2020).
  26. Yusufzai, T., Kadonaga, J. T. HARP is an ATP-driven annealing helicase. Science. 322 (5902), New York, N.Y. 748-750 (2008).
  27. Yusufzai, T., Kong, X., Yokomori, K., Kadonaga, J. T. The annealing helicase HARP is recruited to DNA repair sites via an interaction with RPA. Genes & Development. 23 (20), 2400-2404 (2009).
  28. Patne, K., et al. BRG1 and SMARCAL1 transcriptionally co-regulate DROSHA, DGCR8 and DICER in response to doxorubicin-induced DNA damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (9), 936-951 (2017).
  29. Sharma, T., Bansal, R., Haokip, D. T., Goel, I., Muthuswami, R. SMARCAL1 negatively regulates c-Myc transcription by altering the conformation of the promoter region. Scientific Reports. 5, 17910(2015).
  30. Muthuswami, R., Truman, P. A., Mesner, L. D., Hockensmith, J. W. A eukaryotic SWI2/SNF2 domain, an exquisite detector of double-stranded to single-stranded DNA transition elements. The Journal of Biological Chemistry. 275 (11), 7648-7655 (2000).
  31. Nongkhlaw, M., Dutta, P., Hockensmith, J. W., Komath, S. S., Muthuswami, R. Elucidating the mechanism of DNA-dependent ATP hydrolysis mediated by DNA-dependent ATPase A, a member of the SWI2/SNF2 protein family. Nucleic Acids Research. 37 (10), 3332-3341 (2009).
  32. Kikin, O., D'Antonio, L., Bagga, P. S. QGRS Mapper: a web-based server for predicting G-quadruplexes in nucleotide sequences. Nucleic Acids Research. 34, 676-682 (2006).
  33. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  34. Gupta, M., et al. Ligand-induced conformation changes drive ATP hydrolysis and function in SMARCAL1. The FEBS Journal. 282 (19), 3841-3859 (2015).
  35. Dutta, P., et al. Global epigenetic changes induced by SWI2/SNF2 inhibitors characterize neomycin-resistant mammalian cells. PloS One. 7 (11), 49822(2012).
  36. Muthuswami, R., et al. Phosphoaminoglycosides inhibit SWI2/SNF2 family DNA-dependent molecular motor domains. Biochemistry. 39 (15), 4358-4365 (2000).
  37. Gondeau, C. Circular dichroism and UV melting studies on formation of an intramolecular triplex containing parallel T*A:T and G*G:C triplets: netropsin complexation with the triplex. Nucleic Acids Research. 26 (21), 4996-5003 (1998).
  38. Nongkhlaw, M., Gupta, M., Komath, S. S., Muthuswami, R. Motifs Q and I are required for ATP hydrolysis but not for ATP binding in SWI2/SNF2 proteins. Biochemistry. 51 (18), 3711-3722 (2012).
  39. Luchnik, A. N. DNA conformational transitions induced by supercoiling control transcription in chromatin. Gene Regulation and Systems Biology. 8, 89-96 (2014).
  40. Siddiqui-Jain, A., Grand, C. L., Bearss, D. J., Hurley, L. H. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule to repress c-MYC transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11593-11598 (2002).
  41. Uribe, D. J., Guo, K., Shin, Y. -J., Sun, D. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K and nucleolin as transcriptional activators of the vascular endothelial growth factor promoter through interaction with secondary DNA structures. Biochemistry. 50 (18), 3796-3806 (2011).
  42. Young, S. L., Krawczyk, S. H., Matteucci, M. D., Toole, J. J. Triple helix formation inhibits transcription elongation in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (22), 10023-10026 (1991).
  43. Dürr, H., Flaus, A., Owen-Hughes, T., Hopfner, K. -P. Snf2 family ATPases and DExx box helicases: differences and unifying concepts from high-resolution crystal structures. Nucleic Acids Research. 34 (15), 4160-4167 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dichroizm ko owyprzebudowa chromatynyregulacja transkrypcjiaktywno ATP azyG kwadrupleks DNAregion promotorastruktura drugorz dowastruktura oligonukleotydowa
Spektroskopia CD do badania interakcji DNA-białko
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.