Artykuł metodologiczny

Spektroskopia CD do badania interakcji DNA-białko

DOI:

10.3791/63147

⸱

10 lutego 2022

 ,  , 
1Jawaharlal Nehru University New Delhi

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcja zależnego od ATP czynnika remodelującego chromatynę z ligandem DNA jest opisana za pomocą spektroskopii CD. Indukowane zmiany konformacyjne na promotorze genu analizowane przez wygenerowane piki można wykorzystać do zrozumienia mechanizmu regulacji transkrypcji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektroskopia dichroizmu kołowego (CD) jest prostą i wygodną metodą badania drugorzędowej struktury i interakcji biomolekuł. Ostatnie postępy w spektroskopii CD umożliwiły szczegółowe badanie interakcji DNA-białko i dynamiki konformacyjnej DNA w różnych mikrośrodowiskach w celu lepszego zrozumienia regulacji transkrypcji in vivo. Obszar wokół potencjalnej strefy transkrypcji musi zostać rozwinięty, aby nastąpiła transkrypcja. Jest to złożony proces wymagający koordynacji modyfikacji histonów, wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA i innych czynności związanych z przebudową chromatyny. Za pomocą spektroskopii CD możliwe jest badanie zmian konformacyjnych w regionie promotora spowodowanych przez białka regulatorowe, takie jak zależne od ATP remodelery chromatyny, w celu promowania transkrypcji. Można również monitorować zmiany konformacyjne zachodzące w białku. Ponadto pytania dotyczące powinowactwa białka do docelowego DNA i swoistości sekwencji można rozwiązać poprzez włączenie mutacji w docelowym DNA. Krótko mówiąc, unikalne zrozumienie tej czułej i niedrogiej metody może przewidywać zmiany w dynamice chromatyny, poprawiając w ten sposób zrozumienie regulacji transkrypcji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dichroizm kołowy (CD) to technika spektroskopowa, która opiera się na wrodzonej chiralności makrocząsteczek biologicznych, co prowadzi do zróżnicowanej absorpcji prawoskrętnego i lewoskrętnego światła spolaryzowanego kołowo. Ta absorpcja różnicowa jest znana jako dichroizm kołowy. Technika ta może być zatem wykorzystana do nakreślenia konformacji makrocząsteczek biologicznych, takich jak białka i DNA, z których oba zawierają centra chiralne1,2.

Fale elektromagnetyczne zawierają zarówno elementy elektryczne, jak i magnetyczne. Zarówno pole elektryczne, jak i magnetyczne oscylują prostopadle do kierunku rozchodzenia się fali. W przypadku światła niespolaryzowanego pola te oscylują w wielu kierunkach. Gdy światło jest spolaryzowane kołowo, uzyskuje się dwa pola elektromagnetyczne o różnicy faz 90°. Cząsteczki chiralne wykazują kołową skręcalność optyczną (dwójłomność) tak, że w różnym stopniu absorbują prawoskrętne światło spolaryzowane kołowo i lewoskrętne światło spolaryzowane kołowo3. Powstałe pole elektryczne zostanie prześledzone jako elipsa, w funkcji długości fali. Widmo CD jest zatem rejestrowane jako eliptyczność (q), a dane są prezentowane jako średnia eliptyczność pozostałości w funkcji długości fali.

W przypadku białek, Cα aminokwasów (z wyjątkiem glicyny) jest chiralne, co jest wykorzystywane przez spektroskopię CD do określenia drugorzędowej struktury tej makrocząsteczki4. Widma CD cząsteczek białek są zwykle rejestrowane w zakresie dalekiego promieniowania UV. Białka α-helisowe mają dwa ujemne pasma przy 222 nm i 208 nm oraz jeden dodatni pik przy 193 nm4. Białka o antyrównoległej strukturze drugorzędowej β-arkuszowej wykazują ujemny pik przy 218 nm i dodatni pik przy 195 nm4. Białka o nieuporządkowanej strukturze wykazują niską eliptyczność w pobliżu 210 nm i ujemny pik przy 195 nm4. W ten sposób dobrze zdefiniowane piki/prążki dla różnych struktur drugorzędowych sprawiają, że CD jest wygodnym narzędziem do wyjaśniania zmian konformacyjnych zachodzących w drugorzędowej strukturze białek podczas denaturacji, a także wiązania ligandów.

Kwasy nukleinowe mają trzy źródła chiralności: cząsteczkę cukru, spiralność struktury drugorzędowej oraz trzeciorzędowe uporządkowanie DNA w środowisku o dużym zasięgu5,6. Widma CD kwasów nukleinowych są zwykle rejestrowane w zakresie od 190 do 300 nm5,6. Każda konformacja DNA, podobnie jak białka, daje charakterystyczne spektrum, chociaż piki/prążki mogą różnić się o pewien stopień ze względu na warunki rozpuszczalnika i różnice w sekwencjach DNA7. B-DNA, najpowszechniejsza forma, charakteryzuje się dodatnim pikiem około 260-280 nm i ujemnym pikiem około 245 nm6. Piki/prążki DNA w formie B są na ogół małe, ponieważ pary zasad są prostopadłe do podwójnej helisy, nadając cząsteczce słabą chiralności. A-DNA daje dominujący pik dodatni przy 260 nm i pik ujemny około 210 nm6. Z-DNA, lewoskrętna helisa, daje ujemne pasmo przy 290 nm i dodatni pik około 260 nm6. To DNA daje również skrajnie ujemny pik przy 205 nm6.

Oprócz tych konformacji, DNA może również tworzyć tripleksy, kwadrupleksy i spinki do włosów, z których wszystkie można rozróżnić za pomocą spektroskopii CD. Równoległy G-quadruplex daje dominujące pasmo dodatnie przy 260 nm, podczas gdy antyrównoległy G-quadruplex daje pasmo ujemne przy 260 nm i dodatni szczyt przy 290 nm, co ułatwia rozróżnienie między dwiema formami struktur kwadrupleksu6. Tripleksy nie dają charakterystycznego spektrum8. Na przykład widma DNA o długości 36 nukleotydów, które mogą tworzyć wewnątrzcząsteczkową potrójną helisę zawierającą pary zasad G.G.C i T.A.T w obecności Na+, wykazują silne pasmo ujemne przy 240 nm i szeroki dodatni pik. Szeroki dodatni pik pokazuje wkłady przy 266, 273 i 286 nm. Ten sam oligonukleotyd w obecności Na+ i Zn+ wykazuje cztery pasma ujemne (213, 238, 266 i 282 nm) oraz dodatni pik przy 258 nm. Tak więc widma potrójnego DNA mogą się różnić w zależności od warunków soli8.

Oprócz tych konformacji, widma CD umożliwiły identyfikację innej formy DNA zwanej X-DNA. X-DNA powstaje, gdy sekwencja DNA zawiera naprzemienne reszty adeniny i tyminy. Widma CD X-DNA zawierają dwa ujemne piki przy 250 i 280 nm. Dostępnych jest bardzo niewiele informacji na temat X-DNA, chociaż spekuluje się, że funkcjonuje ono jako zlew dla dodatniego superzwijania6,9. Zmiany w widmach CD mogą również ujawnić szczegóły dotyczące interakcji ligand-białko i dlatego zostały dodane do arsenału metod molekularnych do wykrywania interakcji lek-białko10,11,12,13,14. Widma CD zostały również wykorzystane do monitorowania zmian w drugorzędowej strukturze białek podczas procesu fałdowania15. Podobnie, widma CD mogą być również używane do sondowania interakcji ligand-DNA16,17.

Spektroskopia CD, jest zatem łatwą i tanią metodą rozróżniania różnych form konformacji DNA, pod warunkiem, że istnieje dostęp do nie tak taniego sprzętu i oprogramowania. Metoda jest niezwykle czuła i szybka. Wymaga tylko niewielkiej ilości DNA, co daje mu przewagę nad alternatywną techniką spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Miareczkowanie ligandami i substratami jest również łatwe do wykonania. Głównym ograniczeniem jest to, że DNA powinno być bardzo czyste. Zaleca się stosowanie DNA oczyszczonego z elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (PAGE).

Informacje uzyskane przez widma CD były głównie wykorzystywane do dedukowania cech strukturalnych białek i identyfikacji odrębnych konformerów DNA. W tym badaniu widma CD wykorzystano do zintegrowania wyników uzyskanych z eksperymentu immunoprecypitacji chromatyny in vivo (ChIP) w celu określenia, czy białko będące przedmiotem zainteresowania / przewidywany czynnik transkrypcyjny może powodować zmianę konformacyjną w regionie promotorowym swoich genów efektorowych. Współpraca ta pomaga w postępie tradycyjnych technik spektroskopowych CD poprzez przewidywanie mechanizmu regulacji transkrypcji przez przewidywany czynnik transkrypcyjny na i wokół miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS) promotora.

Przebudowa chromatyny to dobrze zdefiniowany mechanizm regulujący procesy metaboliczne DNA poprzez udostępnianie ciasno upakowanej chromatyny różnym czynnikom regulacyjnym, takim jak czynniki transkrypcyjne, składniki replikacji DNA lub białka naprawiające uszkodzenia. Zależne od ATP remodelery chromatyny, znane również jako rodzina białek SWI/SNF, są kluczowymi białkami remodelującymi obecnymi w komórkach eukariotycznych18,19. Grupowanie filogenetyczne podzieliło rodzinę białek SWI/SNF na 6 podgrup20: podobne do Snf2, podobne do Swr1, podobne do SSO1653, podobne do Rad54, podobne do Rad5/16 i odległe. SMARCAL1, białko będące przedmiotem zainteresowania w tym badaniu, należy do odległej podgrupy20. Białko to zostało wykorzystane do zbadania jego sposobu regulacji transkrypcji za pomocą spektroskopii CD.

>jove_content21,22. Jednak nie wykazano, aby niektórzy członkowie tej rodziny przebudowywali nukleosomy, np. SMARCAL1. Mimo że badania wykazały, że SMARCAL1 wiąże się z chromosomami politenowymi, brakuje eksperymentalnych dowodów dotyczących jego zdolności do przebudowy nukleosomów23. W związku z tym postulowano, że SMARCAL1 może regulować transkrypcję poprzez zmianę konformacji DNA24. Spektroskopia CD dostarczyła łatwej i łatwo dostępnej metody walidacji tej hipotezy.

SMARCAL1 jest zależnym od ATP białkiem remodelującym chromatynę, które przede wszystkim pełni funkcję helikazy wyżarzającej25,26,27. Postuluje się modulację transkrypcji poprzez przebudowę konformacji DNA24. Aby przetestować tę hipotezę, zbadano rolę SMARCAL1 w regulacji transkrypcji genów podczas uszkodzeń DNA wywołanych doksorubicyną. W tych badaniach SMARCAL1 wykorzystano do analizy in vivo i ADAAD do testów in vitro28,29. Wcześniejsze badania wykazały, że ADAAD może rozpoznawać DNA w sposób zależny od struktury, ale niezależny od sekwencji30,31. Białko wiąże się optymalnie z cząsteczkami DNA posiadającymi dwuniciowe do jednoniciowych regionów przejściowych, podobnie jak DNA pętli macierzystej, i hydrolizuje ATP 30,31.

Eksperymenty in vivo wykazały, że SMARCAL1 reguluje ekspresję MYC, DROSHA, DGCR8 i DICER poprzez wiązanie się z regionami promotora28,29. Region interakcji został zidentyfikowany za pomocą eksperymentów ChIP28,29. Technika ChIP służy do analizy interakcji białka z pokrewnym DNA w komórce. Jego celem jest ustalenie, czy określone białka, takie jak czynniki transkrypcyjne na promotorach lub innych miejscach wiązania DNA, są związane z określonymi obszarami genomu. Białko związane z DNA jest najpierw sieciowane za pomocą formaldehydu. Następnie następuje izolacja chromatyny. Wyizolowana chromatyna jest ścinana do fragmentów o długości 500 pz za pomocą sonikacji lub trawienia nukleazy, a białko związane z DNA jest immunoprecypitowane przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka. Sieciowanie jest odwrócone, a DNA jest analizowane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) lub ilościowego PCR w czasie rzeczywistym.

Wyniki ChIP doprowadziły do hipotezy, że SMARCAL1 prawdopodobnie pośredniczy w regulacji transkrypcji, wywołując zmianę konformacyjną w regionach promotorowych tych genów. Mapper QGRS i oprogramowanie Mfold zostały wykorzystane do zidentyfikowania potencjału tych regionów promotora do tworzenia struktur drugorzędowych28,29. Mapper QGRS służy do przewidywania G-quadruplexes32, podczas gdy Mfold33 analizuje zdolność sekwencji do tworzenia drugorzędnych struktur, takich jak pętle macierzyste.

Po analizie struktury drugorzędowej, przeprowadzono dalsze eksperymenty in vitro z rekombinowaną 6-krotnie znakowaną aktywną domeną ATPazy A zależnej od DNA (ADAAD), bydlęcym homologiem SMARCAL1, oczyszczonym z Escherichia coli34. Testy ATPazy przeprowadzono przy użyciu ADAAD w celu ustalenia, że zidentyfikowane sekwencje DNA mogą działać jako efektory28,29. Na koniec przeprowadzono spektroskopię CD w celu monitorowania zmian konformacyjnych indukowanych w cząsteczce DNA przez ADAAD28,29.

Aby udowodnić, że aktywność ATPazy białka była niezbędna do wywołania zmiany konformacyjnej w cząsteczce DNA, dodano albo kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) do chelatu Mg+2, albo dodano aktywny inhibitor domeny ATPazy A Neomycyny (ADAADiN), specyficzny inhibitor białka SWI/SNF35,36. Ta technika spektroskopowa CD może być stosowana z dowolnym oczyszczonym białkiem, które zostało wykazane przez ChIP lub inny odpowiedni test, aby wiązać się z przewidywanym regionem genomu promotora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Stężenie robocze składników reakcji

  1. Przygotować stężenia robocze dla CD i innych składników reakcji na świeżo (patrz Tabela 1) i utrzymywać je w temperaturze 4 °C przed rozpoczęciem reakcji><. UWAGA: Dla reakcji CD opisanych w niniejszej pracy stężenia robocze składników są następujące: Bufor fosforanu sodu (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Białko 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.

2. Aktywność ATPazy

  1. Przed spektroskopią CD należy ustalić aktywność ATPazy białka w obecności cząsteczek DNA, aby upewnić się, że białko użyte w spektroskopii CD jest aktywne i zidentyfikować cząsteczki DNA, które są optymalnie skuteczne w wywoływaniu hydrolizy ATP.
  2. Zmierzyć aktywność ATPazy białka w obecności różnych cząsteczek DNA za pomocą testu utleniania sprzężonego z NADH, składającego się z następujących dwóch reakcji.
    1. Wymieszaj 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA i 1x bufor REG na 96-dołkowej płytce do końcowej objętości 250 μL.
      UWAGA: Enzym kinazy pirogronianowej wykorzystuje ADP i Pi do przekształcania fosfoenolopirogronianu w pirogronian, regenerując w ten sposób ATP. Gwarantuje to, że ATP jest zawsze w stężeniu nasycenia w reakcji. W drugiej reakcji pirogronian powstały w wyniku działania kinazy pirogronianowej jest przekształcany przez dehydrogenazę mleczanową w mleczan. W tej reakcji jedna cząsteczka NADH jest utleniana do NAD+. Zużycie NADH mierzy się, mierząc absorbancję cząsteczki przy 340 nm.
    2. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
    3. Zmierz ilość NAD+ przy 340 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
    4. Aby zmierzyć ilość NAD+, użyj oprogramowania dostarczonego wraz z czytnikiem mikropłytek.
      1. Kliknij test NADH, aby zmierzyć absorbancję przy 340 nm.
      2. Umieść 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki w instrumencie. Kliknij przycisk Odczytaj płytkę, aby zapisać absorbancję.
        UWAGA: Stężenie NAD+ oblicza się przy użyciu molowego współczynnika ekstynkcji NADH jako 6,3 mM−1 za pomocą eq (1).
        A = εcl (1)

        Tutaj A = absorbancja
        ε = Współczynnik ekstynkcji molowej
        c = stężenie molowe
        l = długość drogi optycznej w cm

3. Wybór i przygotowanie kuwet CD

  1. Zbieraj widma CD w przezroczystych kuwetach kwarcowych. Używaj kuwet prostokątnych lub cylindrycznych.
    UWAGA: Kuweta kwarcowa CD (objętość nominalna 0,4 ml, długość drogi 1 mm) została użyta do wszystkich reakcji opisanych w tej pracy.
  2. Użyj roztworu do czyszczenia kuwety, aby wyczyścić kuwetę. Dodać 1% roztwór do czyszczenia kuwety w wodzie, aby uzyskać 400 μl roztworu, wlać go do kuwety i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. Umyj kuwetę kilkakrotnie wodą, aby ją wyczyścić. Wykonaj skan wody lub bufora w kuwecie, aby sprawdzić, czy jest czysta.
    UWAGA: Woda lub bufor muszą dawać odczyt w zakresie od 0 do 1 mdeg.

4. Przygotowanie białek i oligonukleotydów DNA

  1. Utrzymuj objętość białka poniżej 50 μl w reakcji, aby zminimalizować ilości składników buforowych, które czasami powodują powstawanie niejednoznacznych pików. Utrzymuj białko na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu, aby uniknąć degradacji.
  2. Używaj oligonukleotydów DNA oczyszczonych przez PAGE w reakcjach.
    UWAGA: W opisanych tutaj reakcjach DNA wykorzystano zarówno w formie natywnej, jak i chłodzonej termicznie (szybko chłodzonej (FC) i wolno chłodzonej (SC)). Szybkie chłodzenie sprzyja wiązaniom wewnątrzcząsteczkowym w DNA, dając więcej struktur drugorzędowych. W przeciwieństwie do tego, powolne chłodzenie sprzyja wiązaniom międzycząsteczkowym w DNA, co skutkuje mniejszą liczbą struktur drugorzędowych.
  3. W celu szybkiego schładzania należy podgrzać DNA w temperaturze 94 °C przez 3 minuty na bloku grzewczym i natychmiast schłodzić je na lodzie. W przypadku powolnego chłodzenia należy ogrzewać DNA w temperaturze 94 °C przez 3 minuty i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej z szybkością 1 °C na minutę.

5. Ustawianie eksperymentów kontrolnych do rejestrowania widm linii bazowej

  1. Utrzymuj objętość reakcji na poziomie 300 μl we wszystkich reakcjach. Ustaw łącznie 5 reakcji wyjściowych w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml, jedna po drugiej, w następujący sposób: i) Bufor + Woda; ii) Bufor + MgCl2 + ATP + Woda; iii) Bufor + MgCl2 + ATP + Białko + Woda; iv) iii + EDTA lub ADAADiN; v) Bufor + Białko + Woda.

6. Ustawianie eksperymentów do nagrywania widm płyt CD

  1. Ustaw w sumie 5 reakcji, jedna po drugiej, w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml w następujący sposób: i) Bufor + DNA + Woda; ii) Bufor + DNA + MgCl2 + ATP + Woda; iii) Bufor + DNA + MgCl2 + ATP + Białko + Woda; iv) iii + EDTA lub ADAADiN; v) Bufor + DNA + Białko + Woda.

7. Skanowanie nagrań

  1. Włącz gaz i włącz spektrometr CD.
  2. Włączyć lampę po 10-15 minutach. Włączyć łaźnię wodną i ustawić temperaturę oprawki na 37 °C.
  3. Otwórz oprogramowanie CD spectrum.
    1. Ustaw temperaturę na 37 °C.
    2. Ustaw zakres długości fali na 180 - 300 nm.
    3. Ustaw czas na punkt na 0,5 s.
    4. Ustaw numer skanowania na 5.
    5. Kliknij Pro-Data Viewer, utwórz nowy plik i zmień jego nazwę, podając szczegółowe informacje o eksperymencie i dacie.
  4. Utrzymuj wszystkie składniki reakcyjne na lodzie, aby uniknąć degradacji. Przygotować linie podstawowe i reakcje, jedna po drugiej, w probówkach wirówkowych i wymieszać je przez pipetowanie. Ostrożnie przenieś mieszaninę reakcyjną do kuwety, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
  5. W przypadku przeprowadzania eksperymentu w czasie, należy inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez wymagany czas i wykonać skanowanie. Dodaj EDTA do buforu zawierającego DNA, ATP, Mg+2 i białko, aby zatrzymać hydrolizę ATP.
  6. Zwiększ stężenie EDTA i czas jego inkubacji, aby całkowicie zahamować aktywność ATPazy.
  7. Odejmij linie podstawowe od odpowiednich reakcji w oprogramowaniu (np. odejmij reakcję 1 od linii podstawowej 1). Wygładź dane w oprogramowaniu widma CD lub w oprogramowaniu do tworzenia wykresów danych. Wykreśl dane w oprogramowaniu do drukowania danych.
    UWAGA: Odjęcie linii podstawowych od odpowiednich reakcji da widma netto CD tylko DNA.

8. Analiza i interpretacja danych

  1. Użyj wzoru podanego przez eq (2), aby przeliczyć wartości uzyskane w milistopniach na średnią eliptyczność pozostałości.
    figure-protocol-1 (2)
    Tutaj S to sygnał CD w milistopniach, c to stężenie DNA w mg / ml, mRw to średnia masa pozostałości, a l to długość drogi w cm.
  2. Narysuj wykres w odniesieniu do długości fali i średniej eliptyczności pozostałości za pomocą oprogramowania do wykreślania danych i przeanalizuj piki.
  3. Aby wykreślić wykres, wybierz średnią eliptyczność pozostałości na osi Y i długość fali na osi X, a następnie wykreśl wykres w linii prostej.
    UWAGA: Ten wykres dostarczy charakterystyki pików różnych form DNA. Formy DNA odpowiadające pikom można zidentyfikować za pomocą istniejącej literatury6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ADAAD stabilizuje strukturę przypominającą pętlę macierzystą na promotorze MYC
Wcześniejsze dowody eksperymentalne wykazały, że SMARCAL1 jest negatywnym regulatorem MYC29. Analiza regionu promotora genu MYC o długości 159 pz za pomocą mapera QGRS wykazała, że nić przednia ma potencjał do tworzenia G-kwadrupleksu (Tabela 2). Mfold wykazał, że obie nici DNA MYC mogą tworzyć strukturę podobną ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego artykułu jest przedstawienie techniki spektroskopii CD jako podejścia do badania zmian konformacyjnych zachodzących w DNA w obecności białek remodelujących chromatynę zależnych od ATP oraz powiązanie tych zmian konformacyjnych z ekspresją genów. Spektroskopia CD zapewnia szybką i łatwo dostępną metodę badania zmian konformacyjnych w DNA.

Kluczowym punktem, który należy wziąć pod uwagę w przypadku tej techniki, jest czystość DNA i białka. Wskazane jest, aby zarówno DNA, jak i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, za spektrofotometr CD. V.J. i A.D. byli wspierani przez stypendium z CSIR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolFisher scientificO3446I-100
Hydrat soli disodowej 5′-trifosforanu adenozynySigmaaldrichA2383
CD Kuweta kwarcowaSTARNA21-Q-1
Chirascan V100CD Fizyka stosowanaNiedostępne
EDTA Sól disodowa DihydratSRL43272
Sefroza glutationu 4BGE Healthcare17-0756-01Chromatografia powinowactwa glutationu
Roztwór czyszczący Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507
Dehydrogenaza L-mlekowaSigmaaldrich  L2625
Octan magnezu czterowodnyFisher scientificBP215-500
Sześciowodny chlorek magnezuFisher scientificM33-500
NADH sól disodowaSigmaaldrich10107735001
Fosfoenolopirogronian Sól monocykloheksyloamoniowaSRL40083
Octan potasuFisher scientificP178-3
Kinaza pirogronianowaSigmaaldrichP1506
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnyFisher scientificS374-500
Fosforan sodu jednowodny monohydratFisher scientificS369-500
Synergy HT czytnik mikropłytekBioTekNiedostępny
Tris BaseFisher scientificZobacz materiał BP152-500

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Woody, R. W. Circular dichroism. Methods in Enzymology. 246, 34-71 (1995).
  2. Kelly, S., Price, N. The Use of Circular Dichroism in the Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein & Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
  3. Rodger, A., Marshall, D. Beginners guide to circular dichroism. The Biochemist. 43 (2), 58-64 (2021).
  4. Greenfield, N. J. Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure. Nature Protocols. 1 (6), 2876-2890 (2006).
  5. Kypr, J., Kejnovská, I., Bednářová, K., Vorlíčková, M. Circular Dichroism Spectroscopy of Nucleic Acids. Comprehensive Chiroptical Spectroscopy. , 575-586 (2012).
  6. Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
  7. Miyahara, T., Nakatsuji, H., Sugiyama, H. Helical Structure and Circular Dichroism Spectra of DNA: A Theoretical Study. The Journal of Physical Chemistry A. 117 (1), 42-55 (2013).
  8. Khomyakova, E. B. Parallel intramolecular DNA triple helix with G and T bases in the third strand stabilized by Zn2+ ions. Nucleic Acids Research. 28 (18), 3511-3516 (2000).
  9. Kypr, J., et al. The unusual X-form DNA in oligodeoxynucleotides: dependence of stability on the base sequence and length. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 13 (6), 999-1006 (1996).
  10. Zohoorian-Abootorabi, T., Sanee, H., Iranfar, H., Saberi, M. R., Chamani, J. Separate and simultaneous binding effects through a non-cooperative behavior between cyclophosphamide hydrochloride and fluoxymesterone upon interaction with human serum albumin: multi-spectroscopic and molecular modeling approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 88, 177-191 (2012).
  11. Sharifi-Rad, A., Mehrzad, J., Darroudi, M., Saberi, M. R., Chamani, J. Oil-in-water nanoemulsions comprising Berberine in olive oil: biological activities, binding mechanisms to human serum albumin or holo-transferrin and QMMD simulations. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (3), 1029-1043 (2021).
  12. Mokaberi, P., Babayan-Mashhadi, F., Amiri Tehrani Zadeh, Z., Saberi, M. R., Chamani, J. Analysis of the interaction behavior between Nano-Curcumin and two human serum proteins: combining spectroscopy and molecular stimulation to understand protein-protein interaction. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (9), 3358-3377 (2021).
  13. Danesh, N., et al. Determining the binding site and binding affinity of estradiol to human serum albumin and holo-transferrin: fluorescence spectroscopic, isothermal titration calorimetry and molecular modeling approaches. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 36 (7), 1747-1763 (2018).
  14. Sadeghzadeh, F., et al. Characterizing the binding of angiotensin converting enzyme I inhibitory peptide to human hemoglobin: influence of electromagnetic fields. Protein and Peptide Letters. 27 (10), 1007-1021 (2020).
  15. Chamani, J., et al. Cooperative alpha-helix formation of beta-lactoglobulin induced by sodium n-alkyl sulfates. Journal of Colloid and Interface Science. 293 (1), 52-60 (2006).
  16. Dareini, M., et al. A novel view of the separate and simultaneous binding effects of docetaxel and anastrozole with calf thymus DNA: Experimental and in silico approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 228, 117528(2020).
  17. Dehghani Sani, F., et al. Changes in binding affinity between ofloxacin and calf thymus DNA in the presence of histone H1: Spectroscopic and molecular modeling investigations. Journal of Luminescence. 203, 599-608 (2018).
  18. Hargreaves, D. C., Crabtree, G. R. ATP-dependent chromatin remodeling: genetics, genomics and mechanisms. Cell Research. 21 (3), 396-420 (2011).
  19. Morettini, S., Podhraski, V., Lusser, A. ATP-dependent chromatin remodeling enzymes and their various roles in cell cycle control. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 5522-5532 (2008).
  20. Flaus, A., Martin, D. M. A., Barton, G. J., Owen-Hughes, T. Identification of multiple distinct Snf2 subfamilies with conserved structural motifs. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2887-2905 (2006).
  21. Flaus, A., Owen-Hughes, T. Mechanisms for ATP-dependent chromatin remodelling: the means to the end. The FEBS Journal. 278 (19), 3579-3595 (2011).
  22. Mizuguchi, G., et al. ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science. 303 (5656), New York, N.Y. 343-348 (2004).
  23. Elizondo, L. I., et al. Schimke immuno-osseous dysplasia: SMARCAL1 loss-of-function and phenotypic correlation. Journal of Medical Genetics. 46 (1), 49-59 (2009).
  24. Baradaran-Heravi, A., et al. SMARCAL1 deficiency predisposes to non-Hodgkin lymphoma and hypersensitivity to genotoxic agents in vivo. American Journal of Medical Genetics. Part A. 158 (9), 2204-2213 (2012).
  25. Bansal, R., et al. SMARCAL1, the annealing helicase and the transcriptional co-regulator. IUBMB life. 72 (10), 2080-2096 (2020).
  26. Yusufzai, T., Kadonaga, J. T. HARP is an ATP-driven annealing helicase. Science. 322 (5902), New York, N.Y. 748-750 (2008).
  27. Yusufzai, T., Kong, X., Yokomori, K., Kadonaga, J. T. The annealing helicase HARP is recruited to DNA repair sites via an interaction with RPA. Genes & Development. 23 (20), 2400-2404 (2009).
  28. Patne, K., et al. BRG1 and SMARCAL1 transcriptionally co-regulate DROSHA, DGCR8 and DICER in response to doxorubicin-induced DNA damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (9), 936-951 (2017).
  29. Sharma, T., Bansal, R., Haokip, D. T., Goel, I., Muthuswami, R. SMARCAL1 negatively regulates c-Myc transcription by altering the conformation of the promoter region. Scientific Reports. 5, 17910(2015).
  30. Muthuswami, R., Truman, P. A., Mesner, L. D., Hockensmith, J. W. A eukaryotic SWI2/SNF2 domain, an exquisite detector of double-stranded to single-stranded DNA transition elements. The Journal of Biological Chemistry. 275 (11), 7648-7655 (2000).
  31. Nongkhlaw, M., Dutta, P., Hockensmith, J. W., Komath, S. S., Muthuswami, R. Elucidating the mechanism of DNA-dependent ATP hydrolysis mediated by DNA-dependent ATPase A, a member of the SWI2/SNF2 protein family. Nucleic Acids Research. 37 (10), 3332-3341 (2009).
  32. Kikin, O., D'Antonio, L., Bagga, P. S. QGRS Mapper: a web-based server for predicting G-quadruplexes in nucleotide sequences. Nucleic Acids Research. 34, 676-682 (2006).
  33. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  34. Gupta, M., et al. Ligand-induced conformation changes drive ATP hydrolysis and function in SMARCAL1. The FEBS Journal. 282 (19), 3841-3859 (2015).
  35. Dutta, P., et al. Global epigenetic changes induced by SWI2/SNF2 inhibitors characterize neomycin-resistant mammalian cells. PloS One. 7 (11), 49822(2012).
  36. Muthuswami, R., et al. Phosphoaminoglycosides inhibit SWI2/SNF2 family DNA-dependent molecular motor domains. Biochemistry. 39 (15), 4358-4365 (2000).
  37. Gondeau, C. Circular dichroism and UV melting studies on formation of an intramolecular triplex containing parallel T*A:T and G*G:C triplets: netropsin complexation with the triplex. Nucleic Acids Research. 26 (21), 4996-5003 (1998).
  38. Nongkhlaw, M., Gupta, M., Komath, S. S., Muthuswami, R. Motifs Q and I are required for ATP hydrolysis but not for ATP binding in SWI2/SNF2 proteins. Biochemistry. 51 (18), 3711-3722 (2012).
  39. Luchnik, A. N. DNA conformational transitions induced by supercoiling control transcription in chromatin. Gene Regulation and Systems Biology. 8, 89-96 (2014).
  40. Siddiqui-Jain, A., Grand, C. L., Bearss, D. J., Hurley, L. H. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule to repress c-MYC transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11593-11598 (2002).
  41. Uribe, D. J., Guo, K., Shin, Y. -J., Sun, D. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K and nucleolin as transcriptional activators of the vascular endothelial growth factor promoter through interaction with secondary DNA structures. Biochemistry. 50 (18), 3796-3806 (2011).
  42. Young, S. L., Krawczyk, S. H., Matteucci, M. D., Toole, J. J. Triple helix formation inhibits transcription elongation in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (22), 10023-10026 (1991).
  43. Dürr, H., Flaus, A., Owen-Hughes, T., Hopfner, K. -P. Snf2 family ATPases and DExx box helicases: differences and unifying concepts from high-resolution crystal structures. Nucleic Acids Research. 34 (15), 4160-4167 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

CD SpectroscopyDNA Protein InteractionsCircular DichroismChromatin RemodelingTranscription RegulationATPase ActivityG Quadruplex DNAPromoter RegionSecondary StructureOligonucleotide Structure

Powiązane artykuły