Artykuł metodologiczny

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63148

⸱

14 lutego 2022

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Streszczenie

Manipulowanie ekspresją genów w rozwijającym się mózgu myszy w macicy ma ogromny potencjał do badań genetyki funkcjonalnej. Jednak wcześniej było to w dużej mierze ograniczone do manipulacji etapami embrionalnymi po neurulacji. Opracowano protokół wstrzykiwania do jamy owodniowej w dniu embrionalnym (E)7.5 i dostarczania lentiwirusa, kodującego cDNA lub shRNA, celującego w >95% płytki nerwowej i komórek grzebienia nerwowego, przyczyniając się do przyszłego mózgu, rdzenia kręgowego i obwodowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje kroki niezbędne do osiągnięcia udanej transdukcji, w tym mielenie szklanych igieł kapilarnych, weryfikację ciąży, ocenę stopnia zaawansowania za pomocą obrazowania ultradźwiękowego oraz optymalne objętości wstrzyknięć dopasowane do stadiów embrionalnych.

Podążając za tym protokołem, możliwe jest osiągnięcie transdukcji >95% rozwijającego się mózgu za pomocą lentiwirusa o wysokim mianie, a tym samym przeprowadzenie manipulacji genetycznej całego mózgu. W przeciwieństwie do tego, możliwe jest osiągnięcie transdukcji mozaikowej przy użyciu niższych mian wirusa, co pozwala na genetyczne badania przesiewowe lub śledzenie linii. Wstrzyknięcie E7,5 jest również ukierunkowane na ektodermę i grzebień nerwowy, przyczyniając się do powstania odrębnych przedziałów oka, języka i obwodowego układu nerwowego. Technika ta daje zatem możliwość manipulowania ekspresją genów w tkankach pochodzących z płytek nerwowych i ektodermy myszy od etapów preneurulacji, z korzyścią dla zmniejszenia liczby myszy wykorzystywanych w eksperymentach.

Wprowadzenie

Mózg i rdzeń kręgowy są jednymi z pierwszych organów, które inicjują formowanie się podczas embriogenezy1,2. Chociaż geny związane z zaburzeniami neurorozwojowymi są identyfikowane, funkcjonalne badanie wariantów genetycznych pozostaje w tyle3,4. Ponieważ generowanie myszy z warunkowym nokautem może trwać miesiące lub lata, interesująca jest alternatywna technika szybkiego badania funkcji genów w rozwijającym się mózgu. W zarodkach myszy neurulacja - proces morfogenetyczny, w którym płytka nerwowa przekształca się w cewę nerwową, dając początek ośrodkowemu układowi nerwowemu (OUN) - występuje między 8 a 10 dniem po zapłodnieniu5. Przed rozpoczęciem neurulacji płytka nerwowa, jako część ektodermy, składa się z pojedynczej warstwy komórek kolumnowych, które będą się namnażać i różnicować w liczne typy komórek neuronalnych i glejowych w CNS6,7. Dlatego, aby eksperymentalnie wywołać długotrwałe zmiany w ekspresji genów w OUN, celowanie w płytkę nerwową oferuje oczywiste korzyści, w tym dostępność wszystkich komórek progenitorowych.

W neurobiologii, w elektroporacji ovo8,9 i transdukcja wirusowa embrionalnych zarodków myszy zostały wykorzystane do manipulowania embrionalną ekspresją genów OUN. Rozwijający się zarodek pisklęcia jest modelem z wyboru do badania funkcji genów podczas rozwoju rdzenia kręgowego ze względu na dostępność zarodka pisklęcia w jaju i wynikającą z tego łatwość manipulowania ekspresją genów. W szczególności elektroporacja plazmidu in ovo generuje warunki eksperymentalne i kontrolne w każdym rdzeniu kręgowym pisklęcia. Elektroporacja powoduje przenikanie błony komórkowej i kieruje ujemnie naładowane DNA z (ujemnej) katody w kierunku (dodatniej) anody poprzez przyłożenie impulsu elektrycznego za pośrednictwem dwóch elektrod do zarodka. U myszy elektroporacja in utero była na ogół ograniczona do etapów embrionalnych, w których zakończyła się neurulacja, a mózg lub rdzeń kręgowy składa się już z kilku warstw komórek, co skutkuje niską wydajnością elektroporacji10. Elektroporacja plazmidu powoduje przejściową ekspresję genów i zazwyczaj celuje w kilka komórek.

Mikroiniekcja in utero pod kontrolą ultradźwięków została wykorzystana do manipulowania różnymi strukturami embrionalnymi, takimi jak skóra i mózg11,12,13,14. Jednak wstrzyknięcia ukierunkowane na rozwijający się mysi OUN wykazały niską skuteczność lub negatywnie wpłynęły na przeżycie zarodka12,13,14. W związku z tym opracowano ulepszony protokół dostarczania lentiwirusa o wysokim mianie do jamy owodniowej (AC) w E7.5, który został nazwany NEPTUNE dla neural plate targeting z in utero nano-injection15. Zastrzyki skutkowały długotrwałą skutecznością celowania wynoszącą >95% całego mózgu przy E13,5. Ponadto podczas ultradźwiękowej weryfikacji ciąży wprowadzono etap oceny stopnia zaawansowania, aby posortować samice i ciąże według etapu rozwoju, aby zminimalizować niepotrzebne procedury na zwierzętach badawczych i zmaksymalizować sukces wstrzyknięcia. Wydajność wtrysku i przeżywalność są ściśle związane ze wzrostem wielkości AC. Dlatego w tym artykule opisano, jak zmierzyć wielkość AC przed wstrzyknięciem, aby dostarczyć odpowiednią objętość AC, która nie spowoduje resorpcji zarodka. NEPTUNE jest solidną alternatywą dla obecnych podejść in utero i może być zaadaptowany do kilku zastosowań, w tym między innymi do badań nad zyskiem i utratą funkcji, śledzenia linii lub badań przesiewowych15,16.

Protokół

Myszy CD1 typu dzikiego były utrzymywane zgodnie z europejskimi przepisami, w standardowym cyklu dnia i nocy, z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Samice CD1 były kojone z samcami CD1 przez noc, a rano sprawdzano obecność czopów pochwowych (E0.3). Do iniekcji wykorzystano wyłącznie samice w ciąży. Zgoda etyczna na wszystkie opisane tutaj eksperymenty została wydana przez Szwedzką Radę Rolnictwa (Jordbruksverket).

1. Przygotowanie szklanych mikroelektrod: wyciąganie i szlifowanie igieł

UWAGA: Chociaż można kupić igły wcześniej szlifowane, samodzielne przygotowanie igieł w laboratorium pozwala na łatwą regulację długości igły, średnicy otworu oraz kąta ścięcia.

  1. Zamocuj kapilarę szklaną w mikropipetowym wyciągaczu kapilar. Użyj następujących ustawień dla określonego sprzętu (patrz na Tabela materiałów): ciepło 580 jednostek; prędkość 140 jednostek; czas 200 jednostek; ciśnienie 500-800 jednostek.
    UWAGA: Jednostki poszczególnych parametrów są definiowane przez wyciągacz kapilar. Jednostki mogą się różnić w zależności od urządzenia.
  2. Naciskaj Pociągnij aby rozciągnąć kapilarę, tworząc dwie kapilary szklane o zwężonych końcach.
    UWAGA: Po wyciągnięciu końcówki dwóch kapilar szklanych są zlane ze względu na wysoką temperaturę wyciągarki do mikropipet.
  3. Odetnij końcówkę chirurgicznymi nożyczkami, aby uzyskać długość igły wynoszącą ok. 7 mm (mierzoną od miejsca, w którym igła zaczyna się zwężać) (Rycina 1A).
    UWAGA: W przypadku iniekcji w dniu E7.5 kluczowe jest zastosowanie długiej i cienkiej igły, ponieważ obszar wstrzyknięcia jest bardzo mały i delikatny. Zastosowanie igieł krótkich i o szerokim świetle doprowadzi do śmierci zarodków.
  4. Oszlifuj odciętą końcówkę igły, aby utworzyć ostry skos (Rysunek 1C-F).
    1. Szlifować igłę pod kątem 20° z maksymalną prędkością przez co najmniej 30–45 min.
      UWAGA: Do płyty szlifierskiej dodaje się wodę ultraczystą, która pełni rolę lubrykantu, zmniejsza tarcie i temperaturę oraz wypłukuje cząsteczki szkła (Rysunek 1B). Jednak nadmiar cieczy może spowolnić pracę młynka.
    2. Upewnij się, że końcówka igły (Rycina 1C) dotyka powierzchni płyty szlifierskiej (Rycina 1D) ale nie zgina się (Rycina 1E).
      UWAGA: Nieprawidłowe szlifowanie prowadzi do powstania długiej i kruchej końcówki igły o niewłaściwym kącie ścięcia, która może łatwo złamać się podczas iniekcji. Złamane igły mogą uszkodzić zarodek i muszą zostać zastąpione igłą nienaruszoną. Prawidłowo wyszlifowana końcówka została przedstawiona na Rysunek 1F,GPo szlifowaniu oczekuje się, że powstały otwór igły będzie miał średnicę wewnętrzną (ID) wynoszącą ok.15 µm oraz średnicy zewnętrznej (OD) wynoszącej około35 µm (Rysunek 1G).
  5. Napełnić strzykawkę 1 ml olejem mineralnym i założyć igłę 27 G.
  6. Zdejmij nasadkę igły i wprowadź igłę strzykawki do nowo oszlifowanej kapilary szklanej. Wstrzykuj olej mineralny, aż zacznie on kapać z końcówki kapilary. Kontynuuj wstrzykiwanie, jednocześnie wycofując igłę 27 G, aż kapilara zostanie całkowicie wypełniona olejem mineralnym, po czym igłę strzykawki można usunąć.
  7. Przechowywać igły szlifowane i wypełnione olejem mineralnym w zamkniętym środowisku, aby zapobiec ich uszkodzeniu i gromadzeniu się kurzu. W celu przechowywania należy włożyć dwa rolki plasteliny do zwykłej szalki Petriego, aby służyły one jako uchwyty (Rysunek 1H). Delikatnie ułóż igły na glinie, zachowując między nimi duży odstęp, aby ułatwić ich późniejsze wyjęcie.
    UWAGA: Ze względu na czasochłonność przygotowania igieł, najlepiej przygotować je co najmniej dzień przed wykonaniem wstrzykiwań. Igły należy utylizować po maksymalnie dwóch miotach, ponieważ ulegają stępieniu. Zawsze należy przygotować zapasowe igły na wypadek ich uszkodzenia podczas przygotowania lub wstrzykiwania.

Proces szlifowania szklanej igły kapilarnej; schemat etapów z ustawieniem mokrego szlifierza i pomiarem.
Rysunek 1: Przygotowanie igieł do iniekcji do jam płucnych w stadium E7,5. (A) Reprezentatywne przykłady wyciągniętej, ale nieciętej szklanej igły kapilarnej (lewo), igły kapilarnej odciętej na optymalną długość do iniekcji E7,5 (środek) oraz kapilary odciętej zbyt krótko (prawo). (B) Szlifierz z równomierną warstwą wody, gotowy do szlifowania igieł. (C-F) Reprezentatywne przykłady różnych końcówek igieł. (C) Odcięta, ale nieszlifowana końcówka igły zamontowana w szlifierzu; (D) idealna pozycja szlifowania, w której końcówka igły ledwo dotyka szlifierza; (E) igła opuszczona zbyt nisko i wyginająca się podczas procesu szlifowania; (F) idealnie oszlifowana końcówka igły do iniekcji do jam płucnych (AC) w stadium E7,5. (G) Oszlifowana końcówka igły pokazująca światło o średnicy wewnętrznej ~15 µm i średnicy zewnętrznej ~35 µm, co jest odpowiednie do iniekcji AC E7,5. Światło igły zaznaczono liniami przerywanymi. Średnica zewnętrzna jest oznaczona czerwonymi grotami strzałek; średnica wewnętrzna jest oznaczona niebieskimi grotami strzałek. (H) Przechowywanie igieł: szalka Petriego wypełniona wyciągniętymi i oszlifowanymi igłami. Dwa rzędy plasteliny służą jako uchwyty. UWAGA: Dla mikrometru okularowego w punktach C, F, G, 1 cm jest podzielony na 100 kresek; obiektyw ma powiększenie 3x; zatem 1 kreska = 10 000 µm/(100 × 3) ≈ 33,4 µm. Skróty: AC = jama płucna; ID = średnica wewnętrzna; OD = średnica zewnętrzna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Dzień przed iniekcją: przygotowanie stanowiska do weryfikacji ciąży za pomocą USG

UWAGA: Wszystkie prace przy użyciu lentiwirusów powinny być wykonywane w wentylowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 (BSL 2). Weryfikacja ciąży za pomocą ultradźwięków może być przeprowadzona na wentylowanym blacie.

  1. Włącz aparat do ultrasonografii, stół grzewczy oraz zasilanie O2 dla pompy izofluranu (może się to różnić w zależności od sprzętu).
    UWAGA: Sprawdź system podawania izofluranu, aby upewnić się, że nie dochodzi do jego wycieku do powietrza.
  2. Wewnątrz stanowiska BSL 2 umieść pusty worek na odpady (przyklejony taśmą do wewnętrznej ścianki dla łatwego dostępu), krem do depilacji, sterylne zapakowane patyczki bawełniane, wodę, ręczniki papierowe oraz taśmę chirurgiczną.
  3. Przygotuj cztery kawałki taśmy chirurgicznej (o długości ok. 7 cm), aby unieruchomić kończyny myszy podczas badania ciąży metodą USG.

3. Badanie ultrasonograficzne w celu potwierdzenia ciąży

UWAGA: Ten etap można przeprowadzić dzień przed wstrzyknięciami w dniu E7.5, czyli w dniu E6.5. Szczegóły dotyczące weryfikacji wieku ciążowego znajdują się w sekcji dyskusji.

  1. Umieść samicę myszy po zapłodnieniu w komorze indukcyjnej.
  2. Włącz przepływ gazu z przepływem tlenu ok. 2,1 LPM i początkową dawką izofluranu 3-4% w celu zniesienia czujności i wprowadzenia w stan anestezji.
  3. Zweryfikuj, czy samica jest całkowicie znieczulona, sprawdzając odruch łapowy. Jeśli odruch łapowy jest nieobecny, obniż stężenie izofluranu do 1,5-2%.
    UWAGA: Indukcja anestezji trwa około 3 min.
  4. Przełącz przepływ gazu z komory indukcyjnej na stożek nosowy stołu grzewczego.
  5. Umieść znieczuloną samicę w pozycji grzbietnej (brzuchem do góry) na stole grzewczym i umieść pysk w przymocowanym stożku nosowym, aby zapewnić utrzymanie anestezji podczas kontroli ciąży za pomocą ultradźwięków.
  6. Przymocuj wszystkie cztery łapy do stołu za pomocą przygotowanych kawałków taśmy chirurgicznej, nie naciągając ciała samicy i nie przytracając wibrysów.
  7. Nanieś niewielką ilość kremu do depilacji (wielkości ziarnka grochu) na dolną część brzucha. Za pomocą patyczka higienicznego rozprowadź krem na dolnej części brzucha (pole o wymiarach ok. 3 x 3 cm) i delikatnie wmasuj go, przesuwając patyczek w przód i w tył.
  8. Gdy futro zacznie oddzielać się od skóry, zwilż ręcznik papierowy i usuń krem wraz z futrem. Oczyść pozbawiony futra obszar wilgotnym ręcznikiem papierowym, aż do całkowitego usunięcia kremu i włosów. Osusz skórę.
  9. Nanieś ilość żelu ultradźwiękowego wielkości śliwki na ogolony obszar i przystąp do identyfikacji macicy za pomocą ultradźwięków, stosując jedną z trzech poniższych metod.
    1. W przypadku metody manualnej trzymaj głowicę ultradźwiękową w żelu ultradźwiękowym i przesuwaj ją, aby zlokalizować macicę.
    2. W przypadku metody półmanualnej nr 1 ustaw głowicę ultradźwiękową (przymocowaną do systemu szynowego) nad brzuchem samicy, poluzowując i przesuwając część szyny wzdłuż płaszczyzny x. Opuść głowicę ultradźwiękową do żelu (płaszczyzna z) i skanuj dolną część brzucha (płaszczyzna y) (Rycina 2A).
    3. W przypadku metody półmanualnej nr 2 opuść głowicę ultradźwiękową (przymocowaną do systemu szynowego) do żelu, aby obrazować dolną część brzucha. Utrzymuj głowicę ultradźwiękową w bezruchu podczas procesu i przesuwaj stół grzewczy na kółkach wzdłuż płaszczyzn x i/lub y (Rycina 2B).
      UWAGA: Na tych wczesnych etapach embrionalnych narządy wewnętrzne, np. jelita, mogą wyglądać w obrazowaniu ultradźwiękowym podobnie do macicy. Jednak podczas gdy embriony i decidua jawią się jako sekwencja sfer (przypominająca koraliki na sznurze), jelita mają wygląd ciągłej rurki. Połączenie przestrzeni świetlnych (oddzielne sfery kontra ciągła rurka) można ocenić, skanując strukturę w przód i w tył, aby ustalić, czy struktura jest dyskretną sferą (embrion/decidua) (Rycina 2C), czy ciągłą rurką (jelita) (Rycina 2D). Na tym etapie nie jest konieczne liczenie embrionów; wystarczy potwierdzić ich obecność lub brak.
  10. Po ustaleniu stanu ciąży unieś głowicę ultradźwiękową znad brzucha i przemyj dolną część brzucha wilgotnym ręcznikiem papierowym, aby usunąć żel ultradźwiękowy.
  11. Wyłącz pompę do izofluranu i usuń taśmę chirurgiczną, aby zwolnić łapy.
  12. Umieść samicę w pozycji brzusznej (brzuchem do dołu) w czystej klatce na płycie grzewczej o temperaturze 40 °C. Obserwuj samicę uważnie aż do odzyskania przez nią przytomności, co trwa od 2 do 6 min.
    UWAGA: Należy dopilnować, aby kontrola ultradźwiękowa jednej samicy trwała <10 min w celu zminimalizowania ekspozycji na izofluran.
  13. Usuń wszystkie materiały i odpady oraz oczyść wszystkie powierzchnie 70% etanolem. Usuń pozostałości żelu ultradźwiękowego z głowicy ultradźwiękowej za pomocą suchego, miękkiego i beztkaninowego ręcznika papierowego. Wyłącz aparat ultradźwiękowy, komorę z przepływem powietrza/komorę BSL2, stół grzewczy oraz zasilanie O2.

4. Badanie ultrasonograficzne w celu określenia stadium rozwoju zarodka

UWAGA: Ten krok jest wykonywany przed operacją i służy do stratyfikacji ciężarnych samic według wielkości ich AC. Krok ten jest kluczowy w dniu E7.5, gdy celem jest celowanie w rozwijający się OUN. Na tym wczesnym etapie rozwoju różnica zaledwie kilku godzin w rozwoju znacząco wpływa na wielkość AC oraz postęp neurulacji.

  1. Zapewnij znieczulenie pierwszej ciężarnej myszy, postępując zgodnie z krokami 3.1-3.5.
  2. Umieść i unieruchom samicę na stole zgodnie z opisem w kroku 3.6.
  3. Nanieś niewielką ilość żelu do USG (wielkości śliwki) na ogoloną okolicę brzucha i opuść głowicę USG, aby obrazować dolną część brzucha samicy.
    UWAGA: Ten krok zakłada, że samica została poddana badaniu USG w celu potwierdzenia ciąży w dniu poprzednim i że sierść z brzucha została już usunięta. Jeśli tak nie było, należy usunąć sierść przed nałożeniem żelu do USG, postępując zgodnie z krokami 3.7-3.8. W dniu E7.5 macica i decidua są większe i łatwiejsze do odróżnienia od organów wewnętrznych. Ponadto AC jest większa i można ją odróżnić od jamy egzocelomicznej (ExC).
  4. Przeskanuj lewy i prawy róg macicy tak dokładnie, jak to możliwe.
    UWAGA: Niektóre zarodki znajdują się głębiej w ciele samicy i mogą zostać pominięte.
  5. Zapisz liczbę i stadia rozwoju zarodków. Odnotuj liczbę jam owodniowych o idealnym rozmiarze, jam akceptowalnych oraz decidu bez jamy (Rysunek 2E-G).
  6. Określ stadium wszystkich ciąż i odpowiednio je sklasyfikuj.
  7. Wstrzyknij preparat samicom z przewagą jam AC o idealnym rozmiarze natychmiast po badaniu USG (krok 4.4), zgodnie z instrukcjami w krokach 4.5-4.7.
  8. W przypadku samic z przewagą jam akceptowalnych (w których jama egzocelomiczna i owodniowa nie są jeszcze wyraźnie podzielone na dwie jamy) lub brakiem jam, odłóż iniekcję i ponownie określ stadium po kilku godzinach. Jeśli większość jam nadal jest zbyt mała, odłóż iniekcje o 10-12 h.

Schemat systemu wstrzykiwania pod kontrolą ultradźwięków z szyną i układem grzewczym; analiza jam owodniowych w dniach E6.5-E7.5.
Rysunek 2: Inspekcja i ocena stopnia rozwoju jam owodniowych podczas kontroli ultradźwiękowej. (A) Przegląd systemu szynowego z przymocowaną głowicą ultradźwiękową, nanowtryskiwaczem i stołem grzewczym. Głowicę ultradźwiękową można przesuwać w płaszczyznach x, y i z, aby uzyskać optymalne ustawienie względem brzucha samicy lub jam owodniowych (AC). (B) Stół grzewczy można przesuwać za pomocą dwóch kół w płaszczyznach x i/lub y, co pozwala na precyzyjne skanowanie i ocenę jam owodniowych, podczas gdy głowica ultradźwiękowa może pozostać nieruchoma. (C) Reprezentatywne obrazy ultradźwiękowe decidua w dniu E6.5 wewnątrz brzucha samicy podczas kontroli ultradźwiękowej w celu potwierdzenia ciąży (białe przerywane kontury). Na tym etapie jamy nie są jeszcze uformowane; jednak czasami widoczny jest stożek ektoplacentalny (białe gwiazdki). Decidua można rozpoznać po kulistym kształcie i odróżnić od jelita, które wygląda jak jedna ciągła rurka. (D) Reprezentatywna sekwencja obrazów jelita cienkiego (białe przerywane kontury), które jest ciągłe podczas skanowania dolnej części brzucha. (E-G) Reprezentatywne obrazy ultradźwiękowe podczas oceny stadiów jam przed wstrzyknięciami w dniu E7.5. Jama owodniowa i jama egzocelomiczna są już uformowane i oddzielone przez błonę owodniową (amnion). Stożek ektoplacentalny służy jako główne źródło dopływu krwi i pojawia się jako jasny punkt w obrazie ultradźwiękowym. Jama owodniowa znajduje się najdalej od stożka ektoplacentalnego. (E) Jamy owodniowe o idealnym rozmiarze wydają się większe od jamy egzocelomicznej, podczas gdy jamy o średnim rozmiarze wydają się mniejsze (F). Jeśli żadne jamy nie są widoczne (G), oznacza to, że zarodek został resorbowany lub nie osiągnął jeszcze stadium E7.5. Paski skali = 1 mm. Skróty: A = amnion; AC = jama owodniowa; ExC = jama egzocelomiczna; EC = stożek ektoplacentalny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Dzień wstrzyknięcia: przygotowanie stanowiska BSL2 do operacji

  1. Przyklej fragment elastycznej membrany do okrągłego, centralnego otworu w dostępnej komercyjnie, zmodyfikowanej płytce Petriego. Upewnij się, że membrana jest szczelnie przymocowana do płytki, aby zapobiec wyciekom.
    UWAGA: Jeśli płytka stanie się nieszczelna lub nie jest dobrze przyklejona, krawędzie elastycznej membrany można dodatkowo zabezpieczyć taśmą klejącą.
  2. Wykonaj nacięcie o długości 1-1,5 cm w centrum elastycznej membrany.
  3. Włącz urządzenie do ultradźwięków, komorę BSL2, płytę grzewczą, zasilanie O2 dla pompy izofluranu oraz sterylizator szklanymi kuleczkami (ustawiony na 300 °C).
  4. Wewnątrz komory BSL2 umieść: jeden pusty worek na odpady (przyklejony taśmą do wewnętrznej ścianki dla łatwego dostępu); sterylne, zapakowane patyczki bawełniane (używaj nowego dla każdego zabiegu/każdej samicy); narzędzia chirurgiczne (nożyczki, pęsety, klipsy, szew) oraz taśmę chirurgiczną; jedną pełną butelkę soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej (PBS), jedną pustą butelkę do zbierania odpadów oraz pipetę 25 mL; jedną płytkę Petriego z elastyczną membraną do zabiegu; pokrywkę do płytki Petriego z kawałkiem parafilmu o wymiarach 2 x 2-3 x 3 cm przymocowanym do pokrywki kroplą wody; plastelinę: 4 większe kule lub sześciany (~3 x 3 x 3 cm3) oraz jeden element cylindryczny (~4 x 1 cm); strzykawkę z lekiem przeciwbólowym (np. buprenorfina, 0,05-0,1 mg/kg masy ciała) oraz żel do oczu. UWAGA: Kule (lub sześciany) plasteliny będą służyć jako „nóżki” lub podstawki/uchwyty dla płytki Petriego po umieszczeniu płytki na brzuchu samicy. Cylindryczny element z plasteliny zabezpiecza embriony wewnątrz płytki. Jeśli wstrzykiwanych jest więcej niż jeden roztwór lub igła wymaga ponownego napełnienia podczas iniekcji, ten sam kawałek parafilmu można wykorzystać, o ile roztwory zostaną rozmieszczone w odstępach.

6. Napełnianie igły

  1. Zetrzyj nadmiar oleju mineralnego za pomocą chusteczki papierowej, aby uzyskać lepszy chwyt.
    UWAGA: Zawsze czyść w kierunku oddalonym od końcówki, aby zapobiec uszkodzeniom lub obrażeniom.
  2. Upewnij się, że wszystkie komponenty (jeden pierścień uszczelniający O-ring, jeden dystansor i jedna przednia uszczelka – wszystkie znajdują się pod tuleją, Rysunek 3A) są zainstalowane w prawidłowej orientacji (Rysunek 3B, tuleja zdjęta w celu wizualizacji), aby utrzymać igłę kapilarną na miejscu i stworzyć szczelne połączenie, zapobiegając tworzeniu się pęcherzyków powietrza podczas wysuwania lub cofania metalowego tłoka wewnątrz igły.
  3. Upewnij się, że metalowy tłok nanowtryskiwacza jest całkowicie cofnięty. Zweryfikuj to, naciskając Fill i poczekaj na podwójny sygnał dźwiękowy, który wskazuje, że tłok został całkowicie cofnięty.
  4. Przy zamocowanej, ale lekko poluzowanej tulei (odkręcona o 45-90 stopni), nasuń szklaną igłę na metalowy tłok i przesuń igłę kapilarną wraz z metalowym tłokiem przez przednią uszczelkę, aż dotrze ona do dystansora (Rysunek 3C,D, tuleja zdjęta w celu wizualizacji).
    UWAGA: Podczas przechodzenia tłoka przez uszczelkę pojawi się pewien opór, który zmaleje po dotarciu do dystansora. Upewnij się, że igła kapilarna została mocno włożona do dystansora, aby stworzyć szczelne połączenie (Rysunek 3D).
  5. Zabeziecz igłę, dokręcając tuleję nanowtryskiwacza (dokręć ją mocno).
    UWAGA: Nie dokręcaj zbyt mocno, ponieważ może to zmiażdżyć igłę.
  6. Naciśnij Empty , aby wysunąć tłok do igły i usunąć olej z końcówki igły. Jeśli szklana igła się przesuwa, cofnij tłok, wyjmij igłę i załaduj ją ponownie. Jeśli spowoduje to powstanie pęcherzyków powietrza, wyjmij igłę i ponownie napełnij ją olejem mineralnym.
    UWAGA: Prawidłowo zabezpieczona igła nie powinna przesuwać się wraz z tłokiem.
  7. Umieść kroplę wirusa (~ 6 µL) lub innego roztworu do wstrzykiwania na kawałku parafilmu1 (Rysunek 3E; do celów wizualizacji użyto barwnika błękitu Evansa).
    UWAGA: Maksymalna objętość nanowtryskiwacza wynosi ~5 µL.
  8. Naciśnij Fill , aby stworzyć pęcherzyk powietrza, który będzie służył jako separator między olejem a roztworem (Rysunek 3F).
    UWAGA: Służy to również jako znacznik pozycjonujący podczas napełniania lub opróżniania igły.
  9. Obniż igłę, zanurz końcówkę w roztworze i naciśnij Fill (Rysunek 3F,G).
  10. Obserwuj poziom cieczy podczas ładowania roztworu za pęcherzykiem powietrza. Naciśnij Empty , aby usunąć zator, a następnie ponownie załaduj, naciskając Fill , jeśli pęcherzyk powietrza wydłuży się bez wniknięcia cieczy do igły. Jeśli to nie rozwiąże problemu, wymień igłę.
  11. Gdy igła zostanie całkowicie załadowana (Rysunek 3H), unieś igłę w płaszczyźnie z i zaspiruj niewielką objętość powietrza na końcówce, aby zapobiec odparowaniu roztworu z końcówki igły oraz jej zapchaniu.
  12. Odwróć nanowtryskiwacz z zamocowaną igłą w stronę przeciwną do operatora, w kierunku tyłu blatu, aby zapobiec przypadkowym uszkodzeniom lub obrażeniom.

Metoda montażu strzykawki w stanie równowagi statycznej do pobierania roztworu, przedstawiona na opisanym schemacie krok po kroku.
Rysunek 3: Mocowanie igły do nanowtryskiwacza i pobieranie roztworu. (A) Pozycja początkowa przed zamontowaniem igły na nanowtryskiwaczu: metalowy tłok całkowicie cofnięty, tuleja zaciskowa zamocowana. (B) Pod tuleją zaciskową pokazano wszystkie trzy komponenty do trzymania i zabezpieczania igły w prawidłowej kolejności (od lewej do prawej): uszczelniający O-ring (cienki i czarny), podkładka (biała), O-ring (czarny) z dużym otworem (przez który musi przejść igła). Aby zapewnić szczelne połączenie, szklana igła jest nasuwana na metalowy tłok (C) i wpychana przez otwór przedniego O-ringu, aż dotrze do podkładki (D). (E-H) Pobieranie roztworu do igły. (E) Jedną kroplę roztworu umieszcza się na kawałku parafilmu na pokrywce płytki. (F) Przed pobraniem roztworu należy utworzyć pęcherzyk powietrza, naciskając Fill, a następnie zanurzyć końcówkę igły w roztworze. (G) Roztwór jest pobierany do igły. (H) Roztwór został pobrany do igły. UWAGA: Tuleja zaciskowa została usunięta w punktach (B-D) w celu wizualizacji, ale powinna pozostać zamocowana podczas eksperymentów. Ostatnim krokiem zabezpieczenia igły jest dokręcenie tulei zaciskowej. Do wizualizacji w punktach E-H użyto barwnika błękitu Evansa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

7. Iniekcje

UWAGA: Wszystkie instrumenty użyte w tej procedurze są sterylizowane przed operacją oraz pomiędzy kolejnymi myszami.

  1. Znieczul pierwszą samicę z jamami o optymalnym rozmiarze (patrz sekcja 4).
  2. Umieść i unieruchom samicę na stole, zgodnie z opisem w krokach 3.1-3.6.
  3. Nałóż żel do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki, i podaj przeciwbólowo lek podskórnie.
    UWAGA: Zalecane leki przeciwbólowe: buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg masy ciała) lub fluniksyn (2,5 mg/kg) lub podobne, zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Wielomodalna analiza przeciwbólowa w okresie okooperacyjnym jest utrzymywana za pomocą wstrzykniętych leków przeciwbólowych oraz izofluranu.
  4. W sposób aseptyczny przygotuj dolną część brzucha, przecierając ją ściereczką nasączoną 0,5 mg/mL roztworem chlorheksydyny (lub podobnym), a następnie osusz skórę. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać pionowe nacięcie skóry w linii środkowej o długości 1,5-2,0 cm w dolnej części brzucha.
    UWAGA: Przygotuj obszar operacyjny zgodnie z lokalnie zatwierdzonymi procedurami dezynfekcji.
  5. Delikatnie unieś skórę i oddziel ją od leżącej pod nią warstwy mięśniowej, mniej więcej na 1 cm wokół punktu nacięcia, aby ułatwić zszycie po operacji.
  6. Wykonaj pionowe nacięcie w linii środkowej o długości 1 cm w warstwie mięśniowej.
  7. Za pomocą jednej pary pęsety unieś jedną stronę skóry i warstwy mięśniowej, a drugą parą wyszukaj rogi macicy.
    UWAGA: Decidua są ułożone jak koraliki na naszyjniku, podczas gdy jelito stanowi jedną długą, ciągłą rurkę (Rysunek 4A).
  8. Za pomocą pęsety ostrożnie wyciągnij z brzucha oba rogi macicy. Trzymaj tkankę pomiędzy embrionami; nie ściskaj ich bezpośrednio (Rysunek 4B).
    UWAGA: Macica jest przyczepiona do ciała w obrębie szyjki, a dwa jajowody/jajniki są przyczepione za pomocą więzadeł. Nie ciągnij i nie odrywaj macicy od tych punktów zakotwiczenia.
  9. Policz i zanotuj liczbę embrionów po lewej i prawej stronie.
  10. Ponumeruj embriony albo od jajnika do szyjki macicy, albo od szyjki macicy do jajnika.
    UWAGA: Jest to szczególnie istotne, jeśli wstrzyknięte embriony mają być pobrane na etapach embrionalnych.
  11. Za pomocą wilgotnego patyczka bawełnianego delikatnie wepchnij wszystkie embriony z powrotem do jamy brzusznej, z wyjątkiem pierwszych trzech, które mają zostać poddane iniekcji.
  12. Nałóż kroplę PBS na elastyczną membranę w naczyniu Petriego i utrzymaj ją bezpośrednio nad embrionami.
  13. Wprowadź zamkniętą pęsetę w nacięcie membrany i rozewrzyj pęsetę, aby otworzyć nacięcie, tak aby ciecz skapała na embriony.
    UWAGA: Zapewnia to rehydratację embrionów oraz sprawia, że elastyczna membrana przylega do wilgotnej skóry samicy, zapobiegając wyciekowi PBS w kolejnych krokach.
  14. Przeciągnij pęsetą odcinek macicy odpowiadający trzem embrionom przez membranę i delikatnie oprzyj naczynie Petriego na brzuchu samicy.
  15. Za pomocą pęsety i wilgotnego patyczka bawełnianego skoryguj położenie macicy i membrany, aby upewnić się, że membrana jest szczelnie przylegająca do skóry samicy, co zapobiegnie wyciekowi PBS.
  16. Użyj czterech glinianych nóżek, aby zabezpieczyć i przymocować naczynie Petriego bezpośrednio nad brzuchem, co zmniejszy nacisk na samicę oraz wrażliwość obrazowania na oddech i bicie serca zwierzęcia.
  17. Dociśnij cylinder z modeliny po prawej stronie embrionów/macicy, aby unieruchomić macicę (Rysunek 4C).
    UWAGA: Ta instrukcja orientacji zakłada, że igła znajduje się po lewej stronie samicy i że wyeksponowane są embriony z lewego rogu macicy. Strona macicy (lewy lub prawy róg) jest kluczowa, ponieważ AC jest skierowana albo w stronę igły (lewy róg; Rysunek 4D), albo w stronę stabilizującego cylindra z modeliny (prawy róg; Rysunek 4E).
  18. Aby wstrzyknąć substancję do embrionów z prawego rogu macicy, umieść cylinder z modeliny po lewej stronie embrionów (Rysunek 4F) i obróć stół grzewczy o 180° (Rysunek 4G), aby uzyskać właściwą orientację. Jeśli zamiast tego można przemieścić igłę, dostosuj ustawienia do odpowiedniego zestawu.
  19. Dolewaj PBS do naczynia Petriego, aż embriony i macica zostaną nim przykryte.
  20. Zanurz sondę ultradźwiękową w PBS i dostosuj stół chirurgiczny/mysi, tak aby pierwszy embrion był wyrównany z sondą ultradźwiękową, co ułatwi rejestrację iniekcji.
    UWAGA: Słowo „pierwszy” odnosi się do numeracji embrionów od jajnika do szyjki macicy.
  21. Przeskanuj wszystkie trzy embriony i obejrzyj AC. Określ objętość iniekcji w następujący sposób:
    1. Zmierz średnicę AC za pomocą urządzenia ultradźwiękowego. Wstrzyknij 69 nL, jeśli średnica AC wynosi ≤0,2 mm; wstrzyknij 2 x 69 nL (= 138 nL), jeśli średnica AC wynosi >0,2 mm i ≤0,29 mm; oraz wstrzyknij 3 x 69 nL (= 207 nL), jeśli średnica AC wynosi > 0,29 mm (Rysunek 4H).
      UWAGA: Poprzednie eksperymenty wykazały, że objętości iniekcji do 207 nL są dobrze tolerowane w stadium E7.515. Udane iniekcje z minimalnym wpływem na przeżywalność uzyskuje się, gdy względny wzrost objętości AC nie przekracza 90%15. Zróżnicowanie wielkości AC między rodzeństwem lub szczepami myszy jest powszechne i może wymagać dalszej optymalizacji.
  22. Ustaw objętości iniekcji za pomocą kontrolera iniekcji.
  23. Ustaw prędkość iniekcji na slow (wolna) z szybkością iniekcji 23 nL/s.
    UWAGA: Różne modele urządzeń mogą skutkować różnymi siłami iniekcji.
  24. Opuść igłę do PBS, korzystając z głównych kół systemu szynowego (płaszczyzny x i z, Rysunek 4I), i naciskaj przycisk Empty na kontrolerze nanoiniektora, aż ciecz dotrze do końcówki igły.
    UWAGA: Jeśli igła została zapchana, naciśnięcie Empty może rozpuścić lub usunąć zator.
  25. Unieś igłę z PBS i naciśnij Inject. Sprawdź, czy wydzielona została kropla o objętości zbliżonej do pożądanej.
  26. Opuść igłę do PBS i wyrównaj ją z sondą ultradźwiękową i embrionem, przesuwając nanoiniektor za pomocą koła płaszczyzny y na mikromanipulatorze (Rysunek 4J).
    UWAGA: Końcówka igły jest idealnie wyrównana, gdy pojawia się jako jasny punkt na obrazie ultradźwiękowym (Rysunek 4K,L). Igłę można przesuwać we wszystkich trzech płaszczyznach za pomocą mikromanipulatora.
  27. Dostosuj kąt igły za pomocą koła inject angle, aby zapewnić kąt iniekcji niemal prostopadły do ściany macicy. Wprowadź igłę do AC jednym ruchem, używając koła inject na mikromanipulatorze (Rysunek 4J-M). Obserwuj jasność końcówki igły. Jeśli końcówka igły zniknie z obrazu ultradźwiękowego, przesuń sondę ultradźwiękową do przodu lub do tyłu, aby przywrócić ostrość igły.
    ​UWAGA: Gdy igła znajduje się wewnątrz AC, można wprowadzić niewielkie korekty pozycji igły i ostrości bez narażania embrionu na szkodę (korekty w zakresie ~0,3 mm). Nie koryguj pozycji igły bardziej niż w tym zakresie.
  28. Naciśnij Inject (dla 207 nL ustaw objętość na 69 nL i wstrzyknij trzy razy). Po iniekcji odczekaj dodatkowe 5-10 s przed wycofaniem igły jednym delikatnym ruchem.

Technika wstrzykiwania do zarodka, konfiguracja nanowstrzykiwacza, prowadzenie pod kontrolą USG, stabilizator z gliny, tabela objętości.
Rycina 4: Optymalny rozmiar i orientacja jamniowej jamy dla pomyślnych wstrzyknięć. (A) Róg macicy z wieloma deciduami w stadium E7.5, ukształtowany jak sznur sfer (na dole) w porównaniu do jelita grubego (na górze). (B) Chwyć tkankę macicy (białe linie przerywane) pomiędzy deciduami. Unikaj bezpośredniego ściskania decidu (białe groty strzałek) pincetą, ponieważ decidu i rozwijające się zarodki są w tym wczesnym stadium delikatne i podatne na resorpcję pod wpływem nadmiernej siły zewnętrznej. (C) Samica w pozycji na plecach z odsłoniętymi deciduami w szalce Petriego wypełnionej PBS, zamocowanej na czterech nóżkach z gliny modelarskiej. Decidu są stabilizowane przez dodatkowy kawałek gliny modelarskiej w kształcie walca. (D, E) Orientacja AC zależy od tego, która strona rogu macicy jest odsłonięta. Jeśli użyte są decidu z lewego rogu macicy, AC będzie skierowana w stronę przeciwną do stabilizatora z gliny i będzie łatwo dostępna dla igły po lewej stronie (D). Jednak w przypadku użycia prawego rogu macicy, w stronę igły będzie skierowany stożek ektoplacentalny, co utrudni dostęp do AC (E). Dlatego przy wstrzykiwaniu do prawego rogu macicy stabilizator z gliny umieszcza się po stronie zwróconej ku igle (F), a cały stół grzewczy obraca się o 180° (G). (H) Zalecane objętości wstrzykiwania w zależności od rozmiaru AC. Generalnie, do jam o średnicy ≤ 0.2 mm można wstrzyknąć maksymalnie 69 nL. Średnice > 0.2 mm i ≤ 0.29 mm tolerują objętości do 2 x 69 nL (138 nL), a jamy > 0.29 mm mogą zostać wstrzyknięte ilością 3 x 69 nL (207 nL). Paski skali = 1 mm. (I, J) Nanowstrzykiwacz jest przymocowany do systemu szyn i może być przemieszczany w płaszczyznach x i/lub z. Kąt igły można regulować pokrętłem inject angle. (K, L) Końcówka igły (biały grot strzałki) jest wyrównana z AC, gdy wykazuje największą jasność w obrazie USG (L). (M) Obraz USG pokazujący proces wstrzykiwania, w którym końcówka igły znajduje się w AC i jest prawidłowo wyrównana (biały grot strzałki). Skróty: A = amnion; AC = jama amniotyczna; ExC = jama egzocelomiczna; EC = stożek ektoplacentalny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przesuń stoлик do następnego zarodka i powtórz kroki 7.22–7.26 dla pozostałych dwóch zarodków, jeśli ich jamła przejrzysta (AC) ma odpowiednią wielkość.
  2. Podnieś głowicę ultradźwiękową oraz igłę z PBS za pomocą mikromanipulatora. Odwróć igłę w stronę przeciwną do operatora, aby uniknąć uszkodzeń i obrażeń.
  3. Za pomocą pęsety skieruj 1st oraz 2nd zarodki z powrotem do jamy brzusznej samicy, delikatnie przepychając je przez gumkę. Ostrożnie chwyć tkankę sąsiadującą z 3rd zarodek i odciągnij macicę w kierunku górnego końca elastycznego ncięcia. Delikatnie unieś 4th-6th zarodki pęsetą i pozostawić 3rd zarodek powróci do jamy brzusznej.
    UWAGA: Ten krok można wykonać bez wymiany buforu PBS lub wyjmowania szalki Petriego.
  4. Powtarzać w razie potrzeby, aż do momentu wstrzyknięcia wszystkich embrionów z optymalnymi AC lub do osiągnięcia limitu czasowego.
  5. Ostrożnie wprowadź embriony/macicę z powrotem do jamy brzusznej samicy.
  6. Odssać PBS i wyjąć szalkę Petriego. W przypadku użycia wirusa, traktować jako odpady zakaźne.
  7. Zszyć warstwę mięśniową nicią Vicryl (USP 6-0, długość igły 13 mm, 3/8 koła), stosując szew ciągły prosty lub przerywany, a następnie zamknąć skórę za pomocą 1–2 klamer (patrz: the Tabela materiałów).
  8. Wyłącz pompę izofluranu.
  9. Usuń taśmę chirurgiczną i umieść samicę w pozycji brzusznej (na brzuchu) w czystej klatce na 40 °C płyta grzejna
    UWAGA: Przewiduje się, że samica odzyska przytomność i zdolność poruszania się w ciągu 10 min. Należy upewnić się, że procedura zostanie zakończona w ciągu 30 min. Tło genetyczne, wiek i masa ciała samicy mogą wpływać na wrażliwość na znieczulenie. Podczas operacji należy monitorować myszy pod kątem objawów spowolnionego oddechu (spowolniony oddech oznacza zbyt głębokie znieczulenie) lub ruchów (znieczulenie jest zbyt płytkie). Buprenorfina (0,05–0,1 mg/kg masy ciała), fluniksyn (2,5 mg/kg) lub podobny preparat, zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt, mogą zostać podane w razie potrzeby 8 godzin po pierwszej iniekcji.
  10. Jeśli planowane jest wstrzyknięcie preparatu kolejnej samicy, należy przygotować obszar operacyjny, monitorując jednocześnie wybudzanie się pierwszej samicy.
    1. Przetrzyj narzędzia chirurgiczne 70% etanolem, aby usunąć resztki krwi lub tkanek, a następnie wysterylizuj je w rozgrzanym sterylizatorze szklanych kulek przez 10 s. Wyrzuć patyczki bawełniane i zużyte ręczniki papierowe. Osusz szalkę Petriego oraz elementy z gliny za pomocą ręcznika papierowego.
  11. Powtarzać kroki 7.1–7.35 do momentu wstrzyknięcia preparatu wszystkim samicom.
  12. Opróżnić i wyrzucić igłę.
    1. Jeśli w igle pozostał wirus lub roztwór do iniekcji, należy nacisnąć Puste na nanoinjektorze i opróżnij zawartość igły na papieru chłonnym.
    2. Całkowicie wciągnij metalowy tłok, naciskając Wypełnić aż do momentu usłyszenia podwójnego sygnału dźwiękowego z kontrolera, który wskazuje na całkowite cofnięcie tłoka.
    3. Poluzuj tulejkę i zsuń igłę z metalowego tłoka. Wyrzuć igłę do pojemnika na odpady ostre.
  13. Oczyść blat roboczy w laboratorium klasy BSL-2.
    1. Jeśli użyto wirusa, należy spryskać całe pole operacyjne środkiem dezynfekcyjnym (patrz Tabela materiałów). Po 15 minutach wytrzeć środek dezynfekcyjny i oczyścić całe pole operacyjne 70% etanolem. Jeśli nie użyto wirusa, należy oczyścić wszystkie powierzchnie 70% etanolem.
    2. Wytrzeć pozostałości buforu PBS z głowicy ultradźwiękowej za pomocą suchej, miękkiej i niepozostawiającej kłaczków chusteczki papierowej.
  14. Utylizować odpady zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
  15. Wyłączyć urządzenie do ultrasonografii, stół grzewczy, stanowisko BSL2 oraz O2 zaopatrzenie

Wyniki

Zarodki wstrzyknięte w E7.5 lentiwirusem hPGK-H2B-GFP11,12 zebrano w E13.5 i zbadano pod fluorescencyjnym mikroskopem sekcyjnym (Rysunek 5A). Pomyślna transdukcja płytki neuralnej skutkuje powstaniem zarodków z silną ekspresją reportera fluorescencyjnego głównie w mózgu oraz w innych tkankach pochodzenia ektodermalnego, np. skórze (Rysunek 5A,B). Wstrzyknięcie nadmiernie dużej objętości (większej niż zalecane tutaj objętości, np. ≥500 nL) zwiększa ciśnienie w AC i może prowadzić do całkowitej resorpcji (dane niepokazane) lub wad cewy nerwowej, takich jak exencephalia (Rysunek 5A). Pomyślne wstrzyknięcia w E7.5 skutkują jednorodną transdukcją od przedmózgu do rombencephalonu (Rysunek 5C-J).

Miana lentiwirusa na poziomie około 2 × 1010 jednostek zakaźnych (IFU) osiągają ponad 95% celowania, podczas gdy miana rzędu ~1 × 109 IFU osiągają 15% wydajności targetowania15Dodatkowo, struktury, które wcześniej były trudne do ukierunkowania przy użyciu elektroporacji, takie jak splot naczyniowy17,18, są również celem (Rycina 5 E,F). Skuteczność transdukcji można modyfikować poprzez dostosowanie miana wirusa podawanego do komory przedniej (AC). Wstrzyknięcie niskiego miana prowadzi do transdukcji pojedynczych klonów komórkowych (Rysunek 5C, Rysunek 5Ei Rysunek 5G,H) podczas gdy zastosowanie wirusa o wysokim mianie transdukuje niemal 100% całego mózgu (Rysunek 5D, Rycina 5F, Rycina 5Hi Rycina 5J). W związku z tym system NEPTUNE może być wykorzystywany zarówno w podejściach opartych na transdukcji klonalnej, śledzeniu linii komórkowych oraz screeningu genetycznym, jak i do badania ogólnego wpływu nadekspresji lub wyciszania genów w całym mózgu.

Rozwój oka ssaków jest wynikiem ściśle zorganizowanej komunikacji między trzema pochodnymi embrionalnej ektodermy: siatkówka neuronowa (NR) i nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) wywodzą się z neuroepithelium brzusznej części przedmózgowia, natomiast ektoderma powierzchniowa daje początek przyszłej soczewce i nabłonkowi rogówki. Jednakże centralna tkankazrębowa oraz tylny śródbłonek, dwie pozostałe warstwy rogówki, pochodzą z komórek grzebienia neuronalnego mezenchymy okołogałębnej19,20. Przekroje wieńcowe embrionów w stadium E13.5, którym w stadium E7.5 wstrzyknięto lentiwirus o wysokim mianie, wykazały – podobnie jak w przypadku mózgu – wysoką i jednorodną transdukcję tkanki neuronalnej oka, a także soczewki, rogówki i mezenchymy (Rycina 5K). W miarę postępu neurulacji iniekcje w stadiach E8.5 i E9.5 skutkują dalszym celowaniem w soczewkę i nabłonek rogówki (Rycina 5L i Rycina 5N), podczas gdy transdukcja tkanek oka pochodzenia neuroektodermalnego jest mniej wydajna w stadium E8.5 (Rycina 5L,M) lub nie zachodzi w stadium E9.5 (Rycina 5N).

Podczas gdy większość cząsteczek wirusowych infekuje tkanki odsłonięte w momencie wstrzyknięcia, niektóre cząsteczki transdukują tkanki niepochodzące z ektodermy, które rozwijają się później (Rysunek 6A). Ślinianki i przewody ślinowe rozwijają się około E11.5 z nabłonka jamy ustnej21 i są celem NEPTUNE (Rysunek 6B). Po wstrzyknięciach w E9.5 nabłonek językowy języka jest dobrze transdukowany; jednakże leżąca pod nim mezenchyma jest negatywna (Rysunek 6C; nawiasy oznaczają komórki transdukowane; gwiazdki oznaczają sygnał autofluorescencji, a nie komórki transdukowane). Dodatkowo w obrębie nabłonka językowego występują klastry dodatnie, oddzielone sekcjami negatywnymi (Rysunek 6C, białe groty strzałek), co sugeruje transdukcję powierzchni brodawek. Komórki grzebienia neuronalnego opisano w leżącej pod spodem mezenchymie języka oraz w obrębie nabłonka językowego, gdzie uczestniczą one w rozwoju brodawek smakowych i pączków smakowych22. Rzeczywiście, wstrzyknięcia w E7.5 skutkują rozległą transdukcją mezenchymy języka w E13.5 (Rysunek 6D), co sugeruje, że wczesne wstrzyknięcia celują w komórki grzebienia neuronalnego, przyczyniając się do tworzenia mezenchymy w języku.

U kręgowców zwoje rdzeni grzbietowych (DRG) stanowią kluczowy element obwodowego układu nerwowego (OUN), ponieważ wszystkie sygnały somatosensoryczne z obwodu ciała (temperatura, ból, nacisk) są przekazywane do mózgu poprzez aktywację neuronów DRG23. Zarówno neurony, jak i komórki glejowe DRG pochodzą z komórek grzbietu neuronalnego tułowia24. Iniekcja lentiwirusowa, w której uniwersalny promotor hPGK kontroluje ekspresję fluorescencyjnego reportera, prowadzi do rozległego celowania w ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy (Rysunek 7A), transdukując zarówno neurony, jak i progenitorów w rdzeniu kręgowym (Rysunek 7B), jak również w DRG (Rysunek 7C). Zastosowanie MiniPromotora dla doublecortin25 pozwala ograniczyć ekspresję GFP wyłącznie do neuronów (15 oraz Rysunek 7D,E).

Obrazowanie mózgu GFP-DAPI w stadium E13.5, przedmózgowie, klonalna transdukcja rombencefalonu, manipulacja całym mózgiem.
Rysunek 5: Wysoka wydajność lub transdukcja klonalna za pomocą metody NEPTUNE. (A) Zarodki w stadium E13.5 pod mikroskopem sekcyjnym oświetlone standardowym oświetleniem (panel lewy) oraz te same zarodki oświetlone pod kątem GFP (panel prawy). Zarodek nieiniekcyjny po skrajnej lewej stronie, pomyślnie zainiekcyjny zarodek po skrajnej prawej stronie, wykazujący sygnał pozytywny w mózgu (zarodek najdalej po prawej). Zarodek z ekscencefalią z powodu wstrzyknięcia zbyt dużej objętości (zarodek środkowy). (B) Celowanie w skórę i mózg po iniekcji w stadium E7.5. Pasek skali = 50 µm. (C, D) Konfokalne obrazy przedmózgowia w stadium E13.5 z niską transdukcją klonalną (C) lub wysoką wydajnością transdukcji (D). (C, E, G, I) Transdukcja klonalna różnych regionów mózgu. (D, F, H, J) Wysokowydajna transdukcja różnych regionów mózgu. Paski skali = 200 µm. Różne wydajności transdukcji są reprezentatywne dla innych obszarów OUN. (E, F) Celowanie w splot naczyniowy, klonalnie (E) lub z wysoką wydajnością (F). Paski skali = 200 µm. (G, H) Celowanie klonalne (G) i wysokowydajne (H) w obrębie rombencefalonu, powiększone na (I, J). Paski skali = 200 µm. (K) Ekspresja reportera GFP w oku w stadium E13.5 po iniekcji in utero w stadium E7.5 (L, M) ekspresja reportera GFP w oku w stadium E15.5 po iniekcji in utero w stadium E8.5 (L), obszar w ramce powiększony na (M), lub w stadium E9.5 (N). Autofluorescencyjne naczynia krwionośne oznaczone są białymi gwiazdkami. Paski skali = 100 µm. Skróty: NEPTUNE = neural plate targeting with in utero nano-injection; C = rogówka; LE = nabłonek soczewki; LF = włókna soczewki; M = mezenchyma; NR = siatkówka nerwowa; ON = nerw wzrokowy; RPE = nabłonek pigmentowy siatkówki; GFP = zielone białko fluorescencyjne; CNS = ośrodkowy układ nerwowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Zarodkowy język myszy, barwienie DAPI/RFP, przewody ślinowe, analiza nabłonka, mikroskopia fluorescencyjna.
Rysunek 6: Transdukcja tkanek poznerwowych in utero. (A) Obraz konfokalny jamy ustnej w stadium E15.5. Zarodek został wstrzyknięty z lentiwirusowym reporterem fluorescencyjnym w stadium E9.5. Pasek skali = 200 µm. (B, C) (B) Powiększenie panelu wstawkowego; nabłonek przewodu ślinowego transdukowany wirusem. (C) Powiększenie panelu wstawkowego; grzbietowy nabłonek języka transdukowany wirusem z reporterem GFP (biały nawias). Podlegający mu mezenchym pochodzący z komórek grzebienia neuronalnego jest negatywny. Białe groty strzałek wskazują brodawki z negatywnymi komórkami grzebienia neuronalnego otoczonymi przez transdukowane wirusem komórki nabłonkowe (autofluorescencyjne komórki krwi/naczynia są oznaczone białymi gwiazdkami). Paski skali = 50 µm. (D) Schemat i obraz konfokalny mezenchymu języka w stadium E13.5 po wstrzyknięciu fluorescencyjnego wirusa reporterowego w stadium E7.5. Pasek skali = 50 µm. Skróty: D = grzbietowy (Dorsal); M = mezenchym (Mesenchyme); N = nosogardziel (Nasopharynx); SLD = przewód podjęzykowy (Sublingual Duct); SMD = przewód podżuchwowy (Submandibular Duct); T = język (Tongue); V = brzuszny (Ventral); GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat wstrzykiwania do zarodka myszy; różnicowanie neuronalne, rdzeń kręgowy E13.5, markery GFP, SOX2, NeuN.
Rysunek 7: Transdukcja komórek zwojów korzeni grzbietowych pochodzących z grzebienia neuronalnego. (A) Celowanie metodą NEPTUNE w stadium E7.5 pozwala na celowanie zarówno w OUN, jak i OUNW. (B) Obraz konfokalny rdzenia kręgowego i zwojów korzeni grzbietowych (DRG) w stadium E13.5, do których w stadium E7.5 wstrzyknięto lentiwirusowy reporter hPGK-H2B-GFP, wykazuje transdukcję zarówno progenitorów neuronalnych SOX2+, jak i neuronów NeuN+. Pasek skali = 100 µm. (C) Powiększenie zaznaczonego obszaru z rysunku B, pokazujące DRG z ekspresją GFP w populacjach komórek SOX2+ (białe strzałki) i NeuN+ (białe groty strzałek). Pasek skali = 20 µm. (D) Obraz konfokalny rdzenia kręgowego i DRG w stadium E13.5, do których w stadium E7.5 wstrzyknięto lentiwirus DCX-H2B-GFP, celujący wyłącznie w komórki DCX+. Pasek skali = 100 µm. (E) Powiększenie zaznaczonego obszaru z rysunku D, pokazujące DRG z ekspresją GFP ograniczoną do neuronów DCX+ (białe groty strzałek). Komórki DCX- są negatywne pod kątem GFP (białe strzałki). Pasek skali = 20 µm. Skróty: NEPTUNE = neural plate targeting with in utero nano-injection; OUN = ośrodkowy układ nerwowy; OUNW = obwodowy układ nerwowy; DRGs = zwoje korzeni grzbietowych; GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym protokole jest kilka etapów, które wpływają na przeżycie zarodka, jakość zastrzyków i odczyt. Wiek ciążowy zarodków określa się jako E0,5 w południe w dniu czopa pochwowego po nocnym kryciu. Wykonanie badania ultrasonograficznego ciąży w E6.5 późnym popołudniem/wieczorem zapewnia, że zarodki są wystarczająco rozwinięte, aby można je było zidentyfikować za pomocą ultradźwięków. Kontrola (1) pozwala na wstępne badanie przesiewowe, ile myszy z zatyczkami jest faktycznie w ciąży, (2) zapewnia, że żaden wirus nie jest niepotrzebnie rozmrażany i marnowany w przypadku, gdy myszy z zatyczkami dodatnimi nie są w ciąży, oraz (3) zmniejsza niepotrzebne interwencje na myszach (unika operacji u samic niebędących w ciąży).

W E7.5 zarodki są wrażliwe na siły zewnętrzne i należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Na przykład ciągnięcie za rogi macicy lub ściskanie decyduas może prowadzić do resorpcji zarodka. Tkanka macicy powinna być zawsze wilgotna, gdy znajduje się poza brzuchem kobiety, aby zapobiec wysuszeniu tkanki. Większość decyduów powinna pozostać w jamie brzusznej samicy, a tylko 3-4 powinny być wystawione na wstrzyknięcia. Ostrość igły jest kolejnym kluczowym czynnikiem decydującym o udanych iniekcjach. lub złamane końcówki igieł powodują wielokrotne nakłuwanie decyduami lub ściskanie plasteliny przed wejściem do AC, co może zwiększyć szybkość resorpcji. Dlatego dobrze zmielone i ostre igły należy zawsze bezpiecznie przechowywać i wymieniać po maksymalnie 2 samicach.

Protokół ten opisuje, w jaki sposób celować w płytkę nerwową za pomocą jednego wstrzyknięcia lentiwirusa. Co więcej, pokazuje, w jaki sposób skuteczność transdukcji można dostosować z klonów jednokomórkowych do całego mózgu. Jednak celem są również inne tkanki nienerwowe, w tym skóra i nabłonek jamy ustnej. Ponadto transdukowane są wszystkie typy komórek (komórki progenitorowe i zróżnicowane), co sprawia, że podejście to jest skuteczne, ale niespecyficzne. Zastosowanie MiniPromoterów w konstrukcie wirusowym prowadzi do specyficznej ekspresji transgenu w neuronach lub astrocytach15. Ma to tę zaletę, że pozwala uniknąć stosowania dedykowanych transgenicznych zwierząt Cre, a tym samym zmniejsza ilość pracy (utrzymanie szczepu i genotypowanie) oraz koszty.

Do ograniczeń NEPTUNA zalicza się jego trudności techniczne, trudności związane z pozyskiwaniem ciężarnych samic w przewidywalnym i stałym tempie oraz koszty pozyskania specjalistycznego oprzyrządowania. Co więcej, nieselektywne celowanie w komórki przez lentiwirusa może być postrzegane zarówno jako korzyść, jak i ograniczenie tej techniki. Wstrzyknięcie większych objętości do AC powoduje bezmózgowie13, chociaż w przypadku opisanych tutaj objętości unika się wad rozwojowych mózgu i egzencefalii15. Negatywny wpływ na rozwój mózgu ma zatem ryzyko związane z nanoiniekcjami in utero , którego należy ostrożnie unikać, wstrzykując odpowiednie objętości dostosowane do stadium embrionalnego i wielkości AC.

Przyszłe adaptacje tej techniki mogą koncentrować się na tropizmie wirusowym. Wirusy związane z adenowirusami (AAV) mają różne serotypy, które, jak wykazano, silnie atakują różne typy komórek w OUN 17,26. Jednak AAV nie integrują się z genomem komórki gospodarza i dlatego mogą zostać utracone w komórkach o wysokim współczynniku podziału. Chociaż istnieje kilka sposobów na zwiększenie swoistości NEPTUNA, zwierzęta transgeniczne są nadal złotym standardem, jeśli chodzi o manipulację genami in vivo. Myszy Cas9 i lentiwirus kodujący sgRNA zostały wykorzystane do genetycznych badań przesiewowych w naskórku embrionalnym27 i mogą być również przystosowane do rozwijającego się OUN.

Wstrzyknięcia do AC przy E7,5 skutecznie celują w komórki neuroektodermy przed rozpoczęciem neurulacji i celują w rozwijający się mózg skuteczniej niż elektroporacja w macicy . Pozwala to na badanie sygnałów genetycznych ważnych dla rozwoju mózgu od wcześniejszego punktu czasowego. W przeciwieństwie do klasycznych mysich modeli genetycznych, NEPTUNE oferuje elastyczne podejście do przeprowadzania funkcjonalnej analizy genów. Fenotypy po nadekspresji lub delecji genu można badać w ciągu kilku dni lub tygodni, a nie miesięcy lub lat. Wstrzyknięcia wielu konstruktów wirusowych pozwalają na manipulację kilkoma genami w obrębie jednego zarodka i pozwalają uniknąć generowania zwierząt z podwójnym lub potrójnym nokautem. Dzięki temu NEPTUNE nie tylko oszczędza czas, ale także może zmniejszyć liczbę zwierząt wykorzystywanych w badaniach.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Bettiny Semsch i Jia Sun (Infinigene) za fachową opiekę nad myszami; Florian Salomons i Göran Månsson z Biomedicum Imaging Core (BIC) za pomoc w pozyskiwaniu obrazów i konsultacje. Finansowanie: Dziękujemy następującym fundatorom za wsparcie tego projektu: Szwedzka Rada ds. Badań Naukowych, Karolinska Institutet (KI Foundations, Career Development Grant, doktorant KID funding oraz finansowanie SFO StratNeuro, Centrum Medycyny Innowacyjnej), The Ollie and Elof Ericssons Foundation, Tornspiran Foundation, Jeansssons Foundation, Sven and Ebba-Christina Hagbergs Prize and Research Grant, Grant dla Knuta i Alice Wallenbergów, Fundacja Fredrika i Ingrid Thurings, Lars Hiertas Minne, Fundacja Walki z Rakiem Dziecięcym (Barncancerfonden), Fundacja Åhlen, Fundacja Ake Wibergs, Fundacja Tore Nilssons oraz Stypendium dla Rozpoczęcia Nauki Szwedzkiej Fundacji dla ERA. Rysunek 4D,E zostały stworzone za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlBD Bioscience309628
27 G IgłaBD Bioscience300635
3,5 cala kapilaryDrummond Scientific3000203G/XByły używane do wyciągania igieł domowych
Przetwornik serii MS 70 MHzVisual SonicsMS700
Aquasonic przezroczysty żel ultradźwiękowyParker LaboratoriesMar-50
Autoclip Applier 9 mmAngthos12020-09
CD1 myszyCharles River, NiemcyCrl:CD1(ICR)Kobiety: od 8 tygodnia życia
Samce: od 12 tygodnia życia
Wacik bawełnianyOneMed Sverige AB120788
DPBSGibco14190094
Kleszczyki opatrunkowe delikatne proste 13 cmAgnthos08-032-130
EG-400 Narishige Młynek do mikropipetNarishigeNA
EZ klipsy 9 mmAngthos59027klipsy
Nożyczki do irysa, Super Cut, proste, 9 cmAgnthos307-336-090
IsofluoraneBaxter Medical ABEAN: 50085412586613Zakupione w szwedzkiej aptece
KimwipesKimberly Clarke7557
Taśma membranowaVisual SonicsSA-11053
Ściągacz do mikropipetInstrument SutterP-97
Modeling ClaySense AB10209
Stół do obsługi myszyVisual Sonics50249
Zestaw automatycznego wtryskiwacza Nanoject IIDrummond3-000-205A
ParafilmBemisHS234526C
szalka Petriego z centralnym otworem (niska ścianka)Visual SonicsSA-11620
szalka Petriego, (Ø xH): 92 x 16 mmSarstedt82.1472.001
Rely+On VirkonDuPont130000132037środek dezynfekujący
Membrana silikonowaVisual SonicsSA-11054
Steri 250, sterylizator gorących kulekAngthos31100
Taśma chirurgiczna (1,25 cm x 9,14 m)Medicarrier67034
Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) System anestezjologicznyVisual SonicsVS-12055
Vevo Imaging Station 2Visual SonicsVS-11983
Vevo2100Visual SonicsVS-20047
Vicryl 6-0; Igła C-3, 45 cm fioletowy filamentAgnthosJ384H

Bibliografia

  1. Theiler, K. The House mouse. Atlas of embryonic development. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1989).
  2. Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates Inc. Publishers. Sunderland, Massachusetts. (2016).
  3. Taylor, J. C., et al. Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders. Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).
  4. Pizzo, L., et al. Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants. Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).
  5. Sakai, Y. Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure. The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).
  6. Schoenwolf, G. C. Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses. Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).
  7. Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate. Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).
  8. Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
  9. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).
  10. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  11. Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).
  12. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047(2010).
  13. Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).
  14. Slevin, J. C., et al. High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice. BMC Developmental Biology. 6, 10(2006).
  15. Mangold, K., et al. Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE. Cell Reports Methods. 1, 100043(2021).
  16. Kameneva, P., et al. Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin. Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).
  17. Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
  18. Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101(2013).
  19. Heavner, W., Pevny, L. Eye development and retinogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391(2012).
  20. Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, 103947(2013).
  21. Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop. Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).
  22. Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds. Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).
  23. Marmigère, F., Ernfors, P. Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).
  24. Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).
  25. Portales-Casamar, E., et al. A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).
  26. Tervo, D. G. R., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
  27. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wstrzyknięcie in uterotransdukcja lentiwirusowarozwój mózgu myszywstrzyknięcie do jamniówkiobrazowanie ultradźwiękowekomórki grzebienia neuronalnegośledzenie linii komórkowychsekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek
Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.