Zadanie behawioralne modelujące "codzienną pamięć" na arenie wydarzeń w celu wspierania allocentrycznych reprezentacji gryzoni

Podsumowanie

Celem tego zoptymalizowanego protokołu 'codziennej pamięci' na arenie wydarzeń było wykorzystanie stabilnej bazy domowej, która zachęca do korzystania z allocentrycznych reprezentacji przestrzennych. Ten model zwierzęcy stanowi skuteczne środowisko testowe dla przyszłych badań nad tworzeniem i przechowywaniem wspomnień o wydarzeniach przy użyciu technik behawioralnych i fizjologicznych.

Streszczenie

Arena wydarzeń stanowi optymalną platformę do badania uczenia się i pamięci. Opisane w tym artykule zadanie pamięci codziennej zapewnia solidny protokół do badania pamięci epizodycznej i przestrzennej u gryzoni, który w szczególności sprzyja allocentrycznej reprezentacji pamięci. Szczury są szkolone do znajdowania i kopania pożywienia podczas fazy kodowania, a po pewnym czasie szczury mają wybór, aby znaleźć granulkę pokarmu z nagrodą we właściwym miejscu. Istnieją dwa kluczowe elementy, które promują stosowanie strategii allocentrycznej w tym protokole: 1) szczury startują z różnych miejsc startowych w trakcie sesji i między sesjami, 2) rozmieszczana jest stabilna baza domowa, w której szczury muszą nosić swoje pożywienie. Za pomocą tych modyfikacji skutecznie zachęcamy gryzonie do korzystania z allocentrycznych reprezentacji przestrzennych do wykonania zadania. Ponadto zadanie zapewnia dobry paradygmat dla projektowania eksperymentów wewnątrzobiektowych i pozwala eksperymentatorom manipulować różnymi warunkami w celu zmniejszenia zmienności. Uzyskany model gryzoni, stosowany w połączeniu z technikami behawioralnymi i fizjologicznymi, stanowi skuteczne poligon doświadczalny dla przyszłych badań nad tworzeniem i zapamiętywaniem.

Wprowadzenie

Aby zbadać neurobiologię uczenia się i pamięci, wymagane są techniki inwazyjne, które zazwyczaj nie są możliwe do zastosowania u ludzi. Dlatego od ponad wieku opracowywano protokoły behawioralne dla zwierząt laboratoryjnych, aby modelować różne formy ludzkiej pamięci. Projekt i wybór zarówno zadania, jak i aparatury są kluczowe dla sukcesu skutecznych modeli ludzkiej pamięci. Opracowano liczne paradygmaty o różnym stopniu złożoności, od prostych protokołów warunkowania klasycznego i instrumentalnego^1,2,3 po labirynty, takie jak labirynt T⁴, labirynt promienisty⁵, labirynt Barnesa⁶, labirynt wodny⁷ oraz labirynt szachownicy⁸. Jednak mimo że zadania te obejmują aspekty uczenia się asocjacyjnego i nawigacji przestrzennej, nie mogą być one jednoznacznie wykorzystane do badania reprezentacji pamięciowej zdarzeń chwilowych (tj. pamięci epizodycznej). Ponadto, choć rozpoznawanie nowych obiektów⁹ oraz permutacje tego zadania pamięci spontanicznej, takie jak pamięć obiekt-miejsce¹⁰, dostarczyły cennych informacji na temat pamięci rozpoznawczej, nie testują one jawnego przypominania sobie zdarzeń. Aby odpowiedzieć na te potrzeby, opracowano specjalnie arenę zdarzeń, a jej zastosowanie umożliwiło badania nad kodowaniem i przypominaniem długoterminowej pamięci asocjacyjnej par^11,12,13, a także nad kodowaniem i przypominaniem dyskretnych zdarzeń występujących w znanej przestrzeni^{14,15,16,17,18}. Ten drugi temat jest przedmiotem niniejszej pracy.

Arena zdarzeń to duży, kwadratowy, otwarty obszar, w którym odbywają się zdarzenia dla gryzoni. Rozmiar areny można dostosować do szczurów lub myszy, a zwierzęta są zachęcane do wejścia i eksploracji. Typowym przykładem zdarzenia odbywającego się w arenie jest odnalezienie i wydobycie pożywienia z piaskownicy w określonym miejscu. Arena zdarzeń została zaprojektowana dla takich zadań apetycznych, w których szczury lub myszy są szkolone w poszukiwaniu, lokalizowaniu i odkopywaniu pożywienia. Wykorzystuje ona ich naturalną tendencję do przenoszenia pokarmu z powrotem do ciemnego środowiska, które w tym przypadku znajduje się obok areny i gdzie następnie go spożywają. Po minimalnym treningu w odkopywaniu pożywienia gryzonie naturalnie przyswajają to zadanie i radzą sobie dobrze w próbie kodowania, a następnie w próbie wyboru podczas przypominania, która następuje po próbach kodowania po krótkiej, 30-min przerwie. W próbie wyboru dostępnych jest kilka piaskownic (tj. miejsc do kopania), ale tylko jedna z nich jest nagradzana.

W obrębie areny zdarzeń można przeprowadzać różne zadania (np. badanie pamięci przestrzennej, pamięci epizodycznej oraz uczenia się par skojarzonych). Ze względu na zainteresowanie opracowaniem skutecznych modeli pamięci epizodycznej, opracowano następujący protokół, w którym miejsce znalezienia pokarmu ulega codziennej zmianie. W tym zadaniu gryzonie muszą zapamiętać, gdzie w arenie zdarzeń ostatnio miało miejsce zdarzenie polegające na kopaniu w piasku i skutecznym wydobyciu nagrody pokarmowej. Opisany poniżej protokół obejmuje próbę kodowania, w której szczury każdego dnia szukają dołka z piaskiem w nowym miejscu, a następnie, po pewnym odstępie czasu, próbę wyboru w celu przypomnienia, w której niedawno zakodowana lokalizacja dołka z piaskiem jest nagradzana, podczas gdy inne, alternatywne dołki w różnych lokalizacjach nie zawierają dostępnego pokarmu. Pamiętanie miejsca, w którym znajdował się pokarm w poprzednim dniu, nie jest pomocne: właściwa lokalizacja musi zostać zakodowana i zapamiętana, przynajmniej przez pewien czas, każdego dnia. W związku z tym wprowadziliśmy termin „pamięć codzienna” (everyday memory), aby opisać formę pamięci modelowaną w tym zadaniu, z której my, ludzie, korzystamy na co dzień. Ludzkim przykładem pamięci codziennej jest zapamiętanie miejsca, w którym zaparkowano samochód na centrum handlowym (Rycina 1A) lub miejsca, w którym odłożono okulary w domu. W tym protokole wszystkie wskazówki wewnątrz i na zewnątrz areny są stałe, tak jak w warunkach naszego codziennego życia (np. w domach, biurach, na parkingach itp.). Zatem gryzonie muszą zapamiętać, gdzie ostatnio wydarzyło się coś w znanym im środowisku (Rycina 1B). Zadanie to jest analogiczne do zadania opóźnionego dopasowania do miejsca (DMP) w labiryncie wodnym¹⁹, lecz stanowi jego udoskonalenie. Jako zadanie apetytywne, wykorzystuje ono naturalne zachowania żerowania gryzoni w poszukiwaniu pokarmu²⁰, zamiast ich chęci ucieczki z wody. Jednak podobnie jak w labiryncie wodnym⁷, nie ma lokalnych wskazówek odróżniających lokalizacje poprawne od błędnych; zwierzęta muszą korzystać z przypominania, a nie z rozpoznawania, aby zlokalizować właściwy dołek z piaskiem po różnych okresach opóźnienia pamięciowego.

Rysunek 1: Pamięć codzienna. (A) Codzienna pamięć u ludzi. Schemat przedstawiający zielony samochód zaparkowany na parkingu. Po pewnym czasie kierowca próbuje przypomnieć sobie, gdzie dokładnie zaparkowała samochód. (B) Codzienna pamięć u zwierząt. Schemat przedstawiający szczura kopiącego i wydobywającego pellet z dołka z piaskiem w określonej lokalizacji wewnątrz areny zdarzeń. Po pewnym czasie szczurowi przeprowadza się próbę wyboru z wieloma błędnymi dołkami z piaskiem (szare) i jednym poprawnym dołkiem z piaskiem (zielony). Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Arena zdarzeń została już z sukcesem wykorzystana w badaniach nad „pamięcią codzienną”. Są to wspomnienia, które są automatycznie kodowane każdego dnia i przechowywane w pamięci długotrwałej, lecz często zapominane po stosunkowo krótkich okresach czasu. Bast i wsp.¹⁴ wykazali monotoniczną, zależną od opóźnienia pamięć zdarzeń, która zmienia się od doskonałej pamięci po krótkich odstępach czasu do poziomu przypadkowego po 24 h. Retencję pamięci można jednak skutecznie zwiększyć poprzez wprowadzenie nowości po kodowaniu lub, w przypadku wielokrotnych prób kodowania, poprzez wydłużenie odstępów między próbami^15,17.

Arena zdarzeń (event arena) jest wszechstronna i stosunkowo bezstresowa; nie stosuje się w niej bodźców awersyjnych. Rozmiar areny oraz zadania, które w niej realizowane są, można dostosować zarówno dla szczurów^14,15, jak i myszy¹⁶. Ponadto, jako zadanie lądowe, umożliwia ona rejestrację fizjologiczną i badania obrazowania wapnia, w przeciwieństwie do labiryntu wodnego²¹. Co więcej, zgodnie z zasadami 3R (reduction, refinement, replacement), badania z wykorzystaniem areny zdarzeń wymagają mniejszej liczby zwierząt do uzyskania mocy statystycznej, ponieważ możliwe jest zastosowanie schematów eksperymentalnych wewnątrzobiektowych (w których każde zwierzę służy jako własna kontrola dla interwencji farmakologicznych, stymulacji optogenetycznej itp.) i nie jest wymagana stymulacja awersyjna w celu motywacji. Chociaż wstępny trening wymaga więcej czasu i odbywa się w większej liczbie sesji niż np. w zadaniach rozpoznawania nowości, to po osiągnięciu przez zwierzęta stabilnego, asymptotycznego poziomu wykonania zadania, manipulacje takie jak podanie leku, kontroli nośnika lub stymulacja optogenetyczna mogą być przeplatane stosunkowo niewielką liczbą dodatkowych sesji treningowych¹⁷. Ponadto w arenie zdarzeń bezpośredniej kontroli eksperymentalnej podlegają różne aspekty reprezentacji, takie jak charakter reprezentacji przestrzennej wykorzystywanej podczas rozwiązywania zadania.

Kwestia reprezentacji dotyczy ram poznawczych wykorzystywanych przez szczury podczas zapamiętywania miejsc, w których miały miejsce niedawne zdarzenia¹⁸. Czy pamiętają one lokalizację pokarmu, czy jedynie sposób dotarcia do niego? Szczury mogą wykorzystywać alocentryczne (przypominające mapę) lub egocentryczne (skoncentrowane na ciele) reprezentacje przestrzenne w celu rozwiązania zadania apetytywnego w obrębie areny¹⁸. Aby jednak kontrolować i zidentyfikować strategię przestrzenną stosowaną przez każdy obiekt doświadczalny podczas wykonywania zadania, stosuje się odrębne protokoły treningowe, które pozwalają selektywnie promować wykorzystanie tylko jednej reprezentacji przestrzennej. Zazwyczaj reprezentacja oparta na układzie egocentrycznym jest stosowana, gdy szczury zanoszą nagrodę pokarmową z powrotem w to samo miejsce, z którego rozpoczęły dzisiejszą próbę, co daje wiele okazji do zapamiętania lokalizacji nagrody podczas biegów w obie strony. Strategia przestrzenna ta może być stosowana niezależnie od tego, czy miejsce startu jest zmieniane każdego dnia, czy pozostaje stałe. Z kolei reprezentacja alocentryczna jest preferowana, gdy od szczurów wymaga się przeniesienia nagrody pokarmowej do stałej bazy domowej znajdującej się z boku areny, która różni się od zmiennych miejsc startowych. Reprezentacje alocentryczne oferują liczne zalety w odniesieniu do pojemności pamięciowej mózgu.

W niniejszej pracy przedstawiliśmy protokół „bazy domowej”, który sprzyja wykorzystaniu wyłącznie reprezentacji allocentrycznej. Przedstawiliśmy reprezentatywne wyniki dla tego zadania, które wyraźnie ilustrują zalety stosowania tego gryzoni modelu „pamięci codziennej” w badaniach nad uczeniem się i pamięcią oraz podkreślają, w jaki sposób można promować allocentryczne reprezentacje epizodycznej pamięci przestrzennej.

Protokół

Metody opisane w niniejszej pracy zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Uniwersytetu w Edynburgu; są one zgodne z brytyjską ustawą Animals (Scientific Procedures) Act 1986 oraz dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 24 listopada 1986 r. (86/609/EEC) regulującą utrzymanie zwierząt laboratoryjnych i ich wykorzystanie w eksperymentach naukowych.

UWAGA: Przedmiotem eksperymentalnym w poniższym protokole są szczury linii Lister-hooded, jednak można go dostosować do innych szczepów gryzoni.

1. Obsługa, zakwaterowanie i kontrola żywienia zwierząt

1. Pozostawić samce szczurów linii Lister-hooded na tydzień w celu aklimatyzacji po dostarczeniu. W tym czasie należy z nimi wchodzić w codzienny kontakt, delikatnie głaszcząc i łaskocząc je w klatkach. Po okresie aklimatyzacji należy rozpocząć codzienne wyjmowanie zwierząt z klatek na około 5 min.
2. Należy zapisywać masę każdego szczura po przyjeździe oraz co 2-3 dni w tygodniu. Należy dostosować ilość podawanego pokarmu w taki sposób, aby masa każdego szczura była stopniowo redukowana do około 85%–90% masy ciała osiąganej przy swobodnym dostępie do pokarmu; można to oszacować, korzystając z ustalonej krzywej wzrostu dla szczurów karmionych swobodnie. Przez cały czas trwania eksperymentu należy utrzymywać szczury w tym zakresie masy ciała wynikającym z ograniczenia pokarmowego.
3. Utrzymuj szczury w 12-godzinnym cyklu światła (światło włączone) i 12-godzinnym cyklu ciemności (światło wyłączone), a wszystkie eksperymenty przeprowadzaj w fazie światła (7:00–19:00).

2. Przygotowanie aparatury

1. Pomieszczenia eksperymentalne, pomieszczenia sterowania i arena wydarzeń
   1. Do przeprowadzenia tego eksperymentu wymagane są pomieszczenia eksperymentalne i kontrolne, które mogą stanowić jedno pomieszczenie podzielone na dwie części lub dwa sąsiadujące pomieszczenia oddzielone kurtyną lub drzwiami.
      UWAGA: Taka separacja zapobiegnie wywieraniu wpływu na zwierzęta lub zakłócaniu ich pracy przez eksperymentatorów podczas wykonywania i uczenia się tego złożonego zadania behawioralnego.
   2. Jedno pomieszczenie należy przeznaczyć na arenę zdarzeń, statyczne wskazówki środowiskowe oraz procedury eksperymentalne (tj. pomieszczenie eksperymentalne), natomiast drugiego pomieszczenia należy użyć do rejestrowania wyników szczurów przez eksperymentatorów (tj. pomieszczenie kontrolne).
      UWAGA: Arena zdarzeń to obszar otwartego pola w kształcie kwadratu, w którym można badać asocjacje miejscowe zdarzeń (Rycina 2A).Nazwa „arena zdarzeń” (event arena) wywodzi się z faktu, że aparat ten jest areną (tj. otwartą, lecz ograniczoną przestrzenią), w której dochodzi do „zdarzeń” (np. odkopywania zakopanych granulek pokarmu w piaskowych dołkach; Rysunek 2B)^17,18Aby zapobiec nadmiernemu obciążeniu i urazom (np. przeciążeniu pleców) eksperymentatora, arena jest wyniesiona ponad poziom podłogi (~1 m).
   3. Z przezroczystego pleksiglasu zbuduj kwadratową arenę (160 cm x 160 cm). Podłoga areny składa się z siatki 7 x 7, zawierającej 49 przesuwnych białych płytek z pleksiglasu (20 cm x 20 cm; Rycina 2A,B). Zmodyfikuj pięć dodatkowych płytek, wykonując w nich centralny otwór (o średnicy 6 cm): będą one służyć do utrzymania studni z piaskiem wewnątrz areny. Położenie tych pięciu zmodyfikowanych płytek jest zgodne z konfiguracją przedstawioną na mapie studni z piaskiem dla każdej sesji.
      UWAGA: Konfiguracja pięciu lokalizacji studni obserwacyjnych (sandwell) zmienia się przy każdej nowej sesji (patrz krok 4.2).
   4. Umieść arenę zdarzeń w wyznaczonym pomieszczeniu eksperymentalnym. Ustaw wskazówki wewnątrz areny: w dwóch lokalizacjach wewnątrz areny – w wierszu 4, kolumnie 2 oraz w wierszu 4, kolumnie 6 – umieść dwa charakterystyczne punkty orientacyjne o odmiennych powierzchniach dotykowych (np. sklejony stos piłeczek golfowych (30 cm (wys.) x 11 cm (szer.) x 11 cm (dł.)) oraz czarną butelkę na wodę (22 cm (wys.) x 9 cm (śr.))).Rysunek 2C).
   5. Przedmioty wykorzystywane jako wskazówki wewnątrz areny oraz ich położenie należy utrzymać w stałej konfiguracji przez cały czas trwania eksperymentu, oczyszczając je codziennie 70% etanolem.
   6. Ustaw trójwymiarowe sygnały poza areną: rozmieść charakterystyczne punkty orientacyjne (np. wzorzystą sferyczną latarnię (40 cm (śr.)); czerwoną latarnię w kształcie gwiazdy (60 cm (s.)); niebieską latarnię (70 cm (w) x 35 cm (s.))) oraz wzory wokół obwodu areny testowej, która znajduje się w centrum pomieszczenia doświadczalnego (Rysunek 2D).
   7. Przedmioty wykorzystywane jako sygnały pozaarenowe oraz ich położenie muszą pozostać stałe przez cały czas trwania eksperymentu.
2. Czarne skrzynki
   1. Aby umożliwić zwierzętom dostęp do areny, należy zbudować cztery identyczne czarne pudełka z czarnego pleksiglasu (długość: 30 cm, szerokość: 25 cm, wysokość: 35 cm na pudełko; Rycina 2E). Każde czarne pudełko powinno posiadać zdalnie sterowane przesuwne drzwiczki na jednej z dłuższych ścianek. Pozwoli to eksperymentatorowi kontrolować moment wejścia szczurów na arenę.
      UWAGA: Czarny pleksiglas tworzy ciemne wnętrze, które jest preferowane przez szczury w stosunku do jasnego otoczenia areny testu otwartego pola.
   2. Umieść te czarne pudełka w połowie długości każdej z czterech ścian areny. Pudełka te będą identyfikowane na podstawie ich położenia względem górnej krawędzi obrazu z transmisji wideo na żywo – rejestrowanego przez kamerę i odbieranego przez komputery w sterowni – z wykorzystaniem kierunków świata: północ (góra), wschód (prawo), południe (dół) i zachód (lewo) areny zdarzeń.
   3. Pozwól szczurom wejść do areny z jednego z trzech czarnych pudełek, nazywanego pudełkiem startowym (np. wschodnim, południowym i zachodnim; Rycina 2A, pomarańczowe prostokąty). Użyj pozostałego czarnego pola (np. północ; Rycina 2A, niebieski prostokąt) jako bazę, do której szczury będą wchodzić, aby zjeść nagrodę pokarmową (tj. pelet) przyniesioną z areny.
      UWAGA: Dowolna lokalizacja czarnej skrzynki (np. północ, wschód, południe, zachód) może zostać wyznaczona jako baza macierzysta, jednak musi ona pozostać niezmienna przez cały czas trwania eksperymentu: stabilność jej położenia jest kluczowa dla skutecznego wykształcenia alocentrycznych reprezentacji przestrzennych.
   4. W pudełkach startowych oraz w bazie domowej należy umieścić dwie małe, przezroczyste studzienki o płaskim dnie – jedną na wodę i jedną na pelety pokarmowe (w przypadku bazy domowej służy ona do nagradzania wyłącznie w fazie habituacji), a następnie wysypać trociny do każdego pudełka startowego oraz do bazy domowej.
3. Sandwells
   1. Do wykonania studni z piaskiem, w których ukrywa się nagrodę pokarmową odzyskiwaną przez szczury (tj. lokalizowaną, odkopywaną i przenoszoną do bazy w celu spożycia), należy użyć przezroczystego tworzywa akrylowego o średnicy wewnętrznej (d) 6 cm i całkowitej głębokości (h) 6 cm. W odległości 4 cm od górnej krawędzi należy umieścić sferyczną, perforowaną miseczkę z tworzywa sztucznego. Studnie z piaskiem należy włożyć w dostosowane płytki wewnątrz areny.
      UWAGA: Plastikowa miseczka tworzy część dostępną (6 cm (śr.) x 4 cm (wys.)) z peletem będącym nagrodą, do której szczury mają dostęp, oraz sekcję niedostępną (6 cm (śr.) x 2 cm (wys.)), do której szczury nie mają dostępu (Rysunek 3A,B).
   2. W nagradzanych studniach z piaskiem, zarówno podczas prób wyboru w fazie kodowania, jak i w fazie przypominania, należy umieścić cztery pelety o masie 0,5 g w sekcji dostępnej oraz osiem peletów pokarmowych w sekcji niedostępnej (Rysunek 3C). W nienagradzanych studniach z piaskiem umieść dwanaście peletek w sekcji niedostępnej (Rycina 3C).
      UWAGA: Zarówno studnie z nagrodą, jak i studnie bez nagrody zawierają łącznie 12 peletów i są wypełnione specjalnie przygotowanym piaskiem, który maskuje pelety wewnątrz studni.
   3. Wypełnij dołki z piaskiem mieszanką piasku i proszku masala (2,5 g masala/2,5 kg piasku), aby zamaskować wszelki zapach wydzielany przez pellety pokarmowe. Świeżą mieszaninę piasku i masala przygotuj na początku każdej sesji (Rysunek 3D).
      UWAGA: Kroki 2.3.2 i 2.3.3 mają na celu zamaskowanie wszelkich artefaktów zapachowych pochodzących z dołków z piaskiem podczas prób kodowania i wyboru. Zapewni to, że poszukiwanie przez szczury właściwej lokalizacji dołka z piaskiem, a w konsekwencji ich wyniki w zadaniu, będą kierowane wyłącznie pamięcią o miejscu, w którym wydobyto pokarm, a nie żadną wskazówką zapachową pochodzącą z nagrodzonego dołka, która mogłaby zdradzić obecność nagrody pokarmowej.
   4. Podczas próby sondującej, służącej do zbadania pamięci szczurów w zakresie lokalizacji pojedynczego, wcześniej nagradzanego dołka z piaskiem (tj. zawierającego pelety pokarmowe), wszystkie pięć dołków z piaskiem znajdujących się w arenie należy uczynić nienagradzanymi (tj. w dostępnej sekcji nie mogą znajdować się pelety pokarmowe), wliczając w to lokalizację właściwego dołka.
      UWAGA: Wszystkie studnie z piaskiem znajdujące się w arenie zawierają taką samą liczbę peletów (n = 12) w swojej niedostępnej sekcji.
4. Ogólna konfiguracja i oprogramowanie
   1. Utrzymuj oświetlenie pomieszczenia eksperymentalnego na umiarkowanym poziomie jasności, używając zamontowanych na ścianach lamp halogenowych (115–125 luksów), oraz utrzymuj temperaturę w pomieszczeniu w przedziale od 19 do 23 °C.
   2. Zainstaluj kamerę CCD (charge-coupled device) nad areną zdarzeń w pomieszczeniu doświadczalnym, aby rejestrować i monitorować ruchy oraz zachowanie szczurów (Rycina 4A). Kamera przesyła obraz na żywo do sąsiedniego pokoju sterowniczego, co umożliwia zarówno niestandardowy zapis wideo, jak i pracę z dedykowanym oprogramowaniem komputerowym (opracowanym przez P. A. Spoonera z University of Edinburgh).
   3. Monitoruj ruchy szczurów za pomocą specjalistycznego oprogramowania komputerowego wykorzystywanego do pomiaru czasu szczurów (Rysunek 4B). Program ten steruje drzwiami każdego czarnego boksu, umożliwiając eksperymentatorom zdalne zarządzanie dostępem szczurów do areny i z niej, z znajdującego się obok pomieszczenia sterowniczego. Należy zarejestrować czas utajenia każdego zwierzęcia do zlokalizowania właściwej studni z piaskiem oraz czas spędzony na kopaniu w każdej studni podczas próby wyboru oraz próby sondującej.

Rycina 2: Arena zdarzeń i wskazówki. (A) Schemat przedstawiający arenę zdarzeń (Skróty: N= północ, E= wschód, S= południe, W= zachód). (B) Arena zdarzeń ze wskazówkami wewnątrz i na zewnątrz areny. (C) Dwie trójwymiarowe wskazówki wewnątrz areny (od lewej do prawej): stos piłek golfowych i cylindryczna czarna butelka. (D) Kilka trójwymiarowych wskazówek poza areną (od lewej do prawej): wzorzysta kulista lampion; czerwony lampion w kształcie gwiazdy; niebieski lampion. (E) Jedno z czterech czarnych pudełek znajduje się w połowie każdej ze ścian areny zdarzeń. Trzy z tych czarnych pudełek pełnią funkcję pudełek startowych, zapewniających szczurom pozycję wyjściową na początku każdej próby. Czwartym czarnym pudełkiem jest baza domowa, w której szczury spożywają nagrodę pokarmową zabraną z areny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Piaskownice. (A) Schemat przedstawiający pustą piaskownicę z zaznaczonymi sekcjami dostępną i niedostępną. (B) Pusta piaskownica z sekcją dostępną i sekcją niedostępną. (C) Schemat ilustrujący rozmieszczenie peletów w piaskownicy z nagrodą (po lewej) i bez nagrody (po prawej). Zarówno piaskownice z nagrodą, jak i bez nagrody zawierają łącznie 12 peletów i są wypełnione specjalnie przygotowanym piaskiem, który maskuje pelety w piaskownicach. (D) Seria zdjęć pokazująca przygotowanie piaskownicy z nagrodą, w tym prawidłowe rozmieszczenie peletów w sekcji dostępnej (kroki 1-4). Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rycina 4: Układ eksperymentalny areny zdarzeń. (A) Schemat przedstawiający układ eksperymentalny pomieszczeń badawczych i kontrolnych. (B) Zrzut ekranu pokazujący podgląd na żywo z pomieszczenia badawczego wyświetlany przez dedykowane oprogramowanie komputerowe. Dedykowane oprogramowanie komputerowe umożliwia eksperymentatorom zdalne sterowanie drzwiami skrzynki startowej i zapewnia inne pomiary. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Protokół habituacji

UWAGA: Podczas habituacji szczury są uczone poszukiwania zagłębień z piaskiem, kopania w celu zdobycia nagrody pokarmowej oraz eksploracji areny zdarzeń.

1. Nauka kopania w celu uzyskania nagrody pokarmowej
   1. Umieść mały pojemnik wypełniony piaskiem w indywidualnej klatce. Podczas pierwszej sesji (tj. H1) umieść trzy granulki pokarmu o masie 0,5 g tuż pod powierzchnią piasku, a jedną granulkę połóż na wierzchu. W kolejnych sesjach wszystkie cztery granulki umieść pod powierzchnią (Rycina 5).
   2. Umieść każdą szczurzą w indywidualnej klatce z jednym pojemnikiem z piaskiem, odświeżając piasek dla każdego zwierzęcia. Pozostaw szczura w indywidualnej klatce do czasu, aż wykopie i pomyślnie wydobędzie wszystkie cztery granulki z piasku.
2. Sesja habituacji 1
   1. Umieść szczura w jednej z klatek startowych (np. południowej) na 30 s i włóż granulkę (0,5 g) do małego, płaskiego otworu przeznaczonego na pokarm w bazie domowej (np. północnej). Umieszczona granulka pokarmu służy jako nagroda i zachęca szczury do udania się do bazy domowej w celu zjedzenia pokarmu.
   2. Otwórz drzwi klatki startowej (np. południowej). Zamknij drzwi, gdy szczur opuści klatkę startową, wejdzie na arenę i zacznie badać nowe otoczenie.
   3. Jeśli szczur nie opuści klatki startowej w ciągu 5 min, interweniuj w jeden z dwóch sposobów. Zachęć szczura do wejścia na arenę, trzymając pędzel tuż przed drzwiami klatki startowej. Gdy szczur wykaże zainteresowanie, przesuń pędzel dalej w głąb areny, pozwalając zwierzęciu iść za nim. Gdy szczur znajdzie się na arenie w bezpiecznej odległości od drzwi klatki startowej, zamknij je.
   4. Alternatywnie, wyjmij szczura z klatki startowej, zamknij drzwi i umieść zwierzę na arenie, bezpośrednio przed drzwiami klatki startowej, przez które normalnie by wyszło. Jeśli szczur jest nieumotywowany i nie wykonuje zadania prawidłowo (np. nie opuszcza klatki startowej bez pomocy, nie kopie efektywnie itp.), sprawdź masę ciała szczura i oblicz jego procentową masę w stosunku do masy przy swobodnym dostępie do pokarmu (%).
      UWAGA: Jeśli masa przy swobodnym dostępie do pokarmu przekracza znacznie 85%, szczur może nie być głodny; w takim przypadku może być wymagane dalsze ograniczenie całkowitej dziennej racji pokarmowej (g).
   5. Po tym, jak szczur badał arenę przez 10 min, otwórz drzwi północnej czarnej skrzynki (tj. bazy domowej). Jeśli szczur nie wejdzie do niej w ciągu 5 min od otwarcia drzwi, wyjmij go z areny, zamknij drzwi północnej czarnej skrzynki i umieść szczura w bazie domowej.
   6. Po tym, jak szczur zje granulkę umieszczoną w bazie domowej na początku sesji, przenieś go z powrotem do klatki domowej.
3. Sesja habituacji 2
   1. Umieść w arenie zdarzeń pojemnik z piaskiem, w którym wszystkie cztery granulki pokarmu (0,5 g/granulka) są zakopane pod powierzchnią piasku. W każdej kolejnej sesji zmieniaj lokalizację tego nagradzanego pojemnika z piaskiem.
      UWAGA: Ze względu na duży rozmiar granulek pokarmowych (0,5 g), szczury będą preferować przenoszenie ich do środowiska, które uznają za bezpieczne (tj. ciemnego otoczenia), aby je zjeść²².
   2. Umieść jedną granulkę sygnałową w płaskim otworze przeznaczonym na pokarm w wybranej klatce startowej (tj. wschodniej), a następnie wprowadź szczura.
   3. Gdy szczur zje granulkę sygnałową – po około 45 s – otwórz drzwi klatki startowej (np. wschodniej).
   4. Zamknij drzwi klatki startowej, gdy szczur wejdzie na arenę i znajdzie się w bezpiecznej odległości od drzwi. Jeśli szczur nie wychodzi z klatki startowej, postępuj zgodnie z krokami 3.2.3-3.2.4.
   5. Pozwól szczurowi szukać pierwszej granulki w pojemniku z piaskiem. Aby pomyślnie uzyskać nagrodę pokarmową, musi on wykopać ją z jedynego pojemnika z piaskiem znajdującego się obecnie na arenie.
   6. Gdy szczur wydobędzie pierwszą granulkę, otwórz drzwi bazy domowej (tj. północnej). Szczur powinien następnie zlokalizować bazę domową i wejść do niej, aby zjeść nagrodę. Jeśli szczur zacznie jeść granulkę na arenie, delikatnie skieruj go z powrotem do bazy domowej.
      UWAGA: Jest to kluczowe, ponieważ każdy szczur musi zostać zachęcony do jedzenia w bazie domowej; bez odpowiedniego treningu zwierzęta mają tendencję do powrotu do klatki startowej danej próby, z której weszły na arenę, aby tam zjeść.
   7. Po zjedzeniu pierwszej granulki w bazie domowej, pozwól szczurowi opuścić bazę i ponownie wejść na arenę, aby wydobyć drugą granulkę.
   8. Po wydobyciu drugiej granulki pozwól szczurowi ponownie zlokalizować bazę domową, aby zjeść nagrodę pokarmową. Gdy szczur wejdzie do bazy domowej, zamknij drzwi północnej czarnej skrzynki.
   9. Po tym, jak szczur zje drugą granulkę w bazie domowej, delikatnie wyjmij go z bazy i przenieś do klatki domowej.
4. Sesje 3-7
   1. Powtórz sesję habituacji 2 (kroki 3.3.1-3.3.9) pięciokrotnie, zakopując granulki w piasku coraz głębiej z każdą sesją (Rycina 5). Pod koniec habituacji wszystkie szczury powinny być zachęcone do szybkiego biegu do nagradzanego pojemnika z piaskiem na arenie, sukcesywnego zbierania dostępnych granulek pokarmowych i przenoszenia ich do bazy domowej w celu zjedzenia.

Rysunek 5: Projekt sesji habituacji. Od kolumny lewej do prawej: sesja habituacji (H1-H7); startbox używany w każdej sesji (np. H1: południowy startbox (SB)); miejsce, w którym szczury muszą zjeść nagrodę pokarmową (tj. północna baza domowa); pozycja dostępnych peletów w nagradzanym zagłębieniu z piaskiem (w formie pisemnej i ilustrowanej; p = pelet), które zostaną umieszczone w wyznaczonym miejscu zagłębienia z piaskiem w każdej sesji; pozycja peletów w płaskim zagłębieniu z piaskiem w pojedynczej klatce (w formie pisemnej i ilustrowanej), co ma na celu promowanie zachowań kopania i wzmocnienie skojarzenia szczurów między kopaniem w zagłębieniu z piaskiem a otrzymaniem nagrody pokarmowej. Dwie ostatnie kolumny odnoszą się do zagłębień z piaskiem w pojedynczych klatkach (poza areną). Skrót: N/A = nie dotyczy Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

4. Główny protokół treningowy

UWAGA: Każda główna sesja treningowa składa się z dwóch prób kodowania pamięci (E1, E2), po których następuje, po krótkim odstępie czasu (~30 min), jedna próba wyboru podczas przypominania (C1). Podczas wszystkich prób szczury muszą sukcesywnie wydobyć dwa granulaty z nagrodzonego otworu w piasku. Po zlokalizowaniu każdego granulatu szczury powinny odnaleźć i wejść do bazy domowej, aby zjeść tę nagrodę pokarmową. Lokalizacja prawidłowego (tj. nagrodzonego) otworu w piasku jest zrównoważona w ramach sesji dla wszystkich szczurów (Rysunek 5).

1. Środki kontrbalansowania
   1. Starannie skontrbalansuj sekwencję lokalizacji dołków z piaskiem oraz kolejność boksów startowych używanych w sesjach (Rycina 6). Przed każdą sesją przygotuj mapę lokalizacji (Rycina 6A); ustal poprawną lokalizację dołka z piaskiem dla każdego szczura, która musi ulegać zmianie między sesjami (Rycina 6B); a następnie stwórz arkusz kontrbalansowania (Rycina 6B,C) oraz arkusz rejestracji (rycina uzupełniająca 1).
   2. Przygotuj trzy zestawy dołków z piaskiem, po pięć dołków w zestawie (Rycina 6C). Każdy zestaw wymaga pięciu dołków, ponieważ w arenie podczas każdej próby wyboru z przypominaniem używa się pięciu lokalizacji dołków (jednej poprawnej i czterech błędnych), a trzy zestawy są niezbędne, aby można było naprzemiennie stosować dołki w każdej próbie w ramach jednej sesji.
   3. Podczas każdej sesji użyj jednego zestawu dołków do prób kodowania u szczura (Rycina 6B,C; Kodowanie 1: Zestaw 1, Dołek A) i innego, odrębnego zestawu dołków (Rycina 6B,C; Wybór z przypominaniem: Zestaw 2, Dołek C) do próby wyboru z przypominaniem.
   4. W ramach każdej sesji zastosuj inną kombinację zestawów dołków dla każdego szczura (Rycina 6B,C), a między sesjami zmieniaj naprzemiennie kombinacje zestawów dołków używanych dla każdego szczura.
2. Próby kodowania
   1. Umieść nagrodzony dołek z piaskiem w poprawnej lokalizacji zgodnie z mapą lokalizacji i arkuszem kontrbalansowania (Rycina 7). Nigdy nie używaj lokalizacji wskazówek wewnątrz areny, płytki centralnej ani trzech płytek znajdujących się bezpośrednio przed czterema boksami startowymi jako lokalizacji dołka z piaskiem.
   2. Włóż jedną pelletkę, a następnie szczura do boksu startowego (np. wschodniego) wyznaczonego do próby kodowania 1 (E1); pelletka będzie służyć jako sygnał do rozpoczęcia zadania. Odczekaj wystarczająco dużo czasu (~30 s), aby szczur zjadł tę pelletkę sygnałową przed rozpoczęciem próby.
   3. Naciśnij ekranowy przycisk Start, aby zarejestrować próbę w wewnętrznym systemie przechwytywania wideo.
      UWAGA: Ważne jest prowadzenie rejestru prób kodowania szczurów w celu (1) zapewnienia przejrzystości badań (tj. uzyskania surowych dowodów wykonania zadania przez każde zwierzę), (2) ponownego punktowania oraz (3) przyszłych referencji (tj. analizy i gromadzenia danych dla innych miar wydajności).
   4. Otwórz drzwi boksu startowego zdalnie za pomocą dedykowanego oprogramowania komputerowego (Rycina 4B).
   5. Uruchom stoper w dedykowanym oprogramowaniu komputerowym w momencie, gdy szczur wejdzie do areny, i zamknij drzwi boksu startowego.
   6. Daj szczurowi 200 s na znalezienie poprawnego dołka z piaskiem, wykopanie i wydobycie pierwszej pelletki. Jeśli po 200 s szczur nadal nie zlokalizował poprawnego dołka lub pierwszej pelletki, wyjmij jedną z pelletek spod piasku i połóż ją na wierzchu. Jeśli szczur nie odwiedzi poprawnego dołka i nie wydobędzie tej pelletki po kolejnych 200 s, użyj pędzla, aby delikatnie naprowadzić go do właściwego dołka.
   7. Po znalezieniu nagrody pokarmowej szczur powinien przenieść ją do bazy domowej (np. północnego czarnego boksu) i zjeść ją po wejściu do środka. Jeśli szczur nie zlokalizuje bazy domowej i nie wejdzie do niej, lecz zdecyduje się zjeść pierwszą pelletkę w arenie, szybko zabierz szczura z areny i umieść go w bazie domowej.
   8. Po zjedzeniu pierwszej pelletki w bazie domowej pozwól szczurowi wejść do areny z bazy domowej i zlokalizować drugą pelletkę w poprawnym dołku z piaskiem.
   9. Po wydobyciu drugiej pelletki pozwól szczurowi zlokalizować bazę domową, wejść do niej i zjeść nagrodę.
   10. Zamknij drzwi bazy domowej, gdy szczur znajdzie się bezpiecznie w środku i daj mu wystarczająco dużo czasu na zjedzenie drugiej pelletki.
   11. Zatrzymaj nagrywanie wideo i stoper w dedykowanym oprogramowaniu komputerowym. Naciśnij ekranowy przycisk Stop w oprogramowaniu do przechwytywania wideo, a następnie kliknij przycisk Stop na ekranowym stoperze w oprogramowaniu komputerowym.
   12. Podczas gdy szczur je, przetrzyj podłogę areny szmatką nasączoną 70% roztworem etanolu. Czynność tę należy powtarzać między każdą próbą.
   13. Przygotuj poprawny dołek z piaskiem do próby kodowania 2 (E2) i umieść go w odpowiedniej lokalizacji w arenie zdarzeń.
   14. Zabierz szczura z bazy domowej i umieść go w boksie startowym (np. zachodnim) wyznaczonym dla E2.
       UWAGA: Użycie alternatywnego boksu startowego jest kluczowe dla skutecznego zachęcenia szczurów do stosowania wyłącznie allocentrycznej strategii przestrzennej w zadaniu, ponieważ szczury nie mogą polegać na statycznym punkcie widzenia areny ani podążać swoją poprzednią ścieżką, aby pomyślnie zlokalizować poprawny dołek. Zamiast tego muszą zwracać uwagę na wskazówki wewnątrz i na zewnątrz areny, co promuje kodowanie allocentryczne.
   15. Powtórz kroki od 4.3.2 do 4.3.12, a następnie zwróć szczura do jego klatki domowej.
3. Próba wyboru z przypominaniem
   UWAGA: Próbę wyboru z przypominaniem dla każdego szczura przeprowadza się 30-40 min po drugiej próbie kodowania (E2); w arenie znajduje się wtedy pięć dołków z piaskiem.
   1. Umieść nagrodzony dołek z piaskiem w poprawnej lokalizacji przydzielonej na daną sesję, natomiast cztery nienagrodzone dołki umieść w czterech błędnych lokalizacjach wyznaczonych dla danej sesji i konkretnego szczura (Rycina 8A). Mapa lokalizacji pięciu dołków w próbie wyboru z przypominaniem jest zmieniana dla każdej sesji i kontrbalansowana między sesjami.
   2. Umieść dołek zawierający cztery dostępne pelletki w poprawnej lokalizacji. Umieść cztery dodatkowe dołki – każdy nienagrodzony i niezawierający pelletek w sekcji dostępnej – w błędnych lokalizacjach określonych przez mapę lokalizacji dołków dla danej sesji.
   3. Włóż pelletkę sygnałową i szczura do boksu startowego dla próby wyboru z przypominaniem (np. południowego). Upewnij się, że ta lokalizacja startowa (np. C1: zachodnia) różni się od tych użytych w dwóch próbach kodowania (np. E1: wschodnia, E2: południowa).
   4. Rozpocznij nagrywanie próby za pomocą wewnętrznego systemu przechwytywania wideo.
      UWAGA: Ważne jest prowadzenie rejestru prób wyboru z przypominaniem szczurów w celu (1) zapewnienia przejrzystości badań (tj. uzyskania surowych dowodów wykonania zadania przez każde zwierzę, które mogą zostać przekazane jako materiały uzupełniające do artykułu), (2) ponownego punktowania oraz (3) przyszłych referencji (tj. analizy i gromadzenia danych dla innych miar wydajności).
   5. W dedykowanym oprogramowaniu komputerowym wybierz stopery odpowiadające dołkom (stopery dołków), które będą użyte w tej konkretnej sesji (Rycina 4B).
   6. Gdy szczur zje pelletkę sygnałową (~30 s), otwórz drzwi za pomocą dedykowanego oprogramowania komputerowego. W momencie, gdy szczur opuści boks startowy, zamknij jego drzwi i uruchom stoper w oprogramowaniu komputerowym.
   7. Kiedy szczur kopie w dołku z piaskiem, klikaj ekranowe ikony dołków, aby zarejestrować czas spędzony na kopaniu w każdym dołku. Kontynuuj rejestrowanie czasu kopania w każdym odwiedzonym dołku aż do końca próby wyboru z przypominaniem.
   8. Następnie pozwól szczurowi zlokalizować bazę domową i wejść do niej, aby zjeść nagrodę pokarmową.
   9. W celu wydobycia drugiej pelletki z poprawnego dołka w próbie wyboru z przypominaniem zastosuj taką samą procedurę, jak w przypadku prób kodowania (patrz krok 4.2).
   10. Podczas poszukiwania drugiej pelletki nie klikaj i nie rejestruj czasu kopania szczura w każdym odwiedzanym dołku. Rejestruj jedynie kolejność odwiedzanych dołków (używając numerów 1-5 przypisanych do każdej lokalizacji dołka) przed momentem, w którym szczur pomyślnie zlokalizuje nagrodzony dołek i wydobędzie drugą pelletkę. Wymaga to dużego skupienia.

Rysunek 6: Reprezentatywny kontrbalans. (A) Schemat ilustrujący, w jaki sposób mapa lokalizacji studni oraz poprawna lokalizacja studni napotykana przez szczury (np. szczur 1) zmieniają się w kolejnych sesjach. (B) Przykład tabeli kontrbalansu dla jednej sesji (np. sesja 1). Dla każdej próby w obrębie jednej sesji stosowany jest inny box startowy (np. próba kodowania 1 (E1) rozpoczęła się od południowego boxa startowego (SB)), ale kolejność ich użycia była taka sama dla każdego zwierzęcia (np. szczury 1-3). Studnie wykorzystywane jako poprawna lokalizacja (np. lokalizacja 2, 4, 3) oraz powiązane z nimi zestawy, stosowane w całości podczas próby wyboru przy przypominaniu, były kontrbalansowane pomiędzy próbami w każdej sesji (np. kodowanie 1, kodowanie 2, wybór przy przypominaniu) oraz pomiędzy zwierzętami wykonującymi zadanie (np. szczury 1-3). (C) Tabela przedstawiająca zestawy studni kontrbalansowane w obrębie i pomiędzy sesjami. Łącznie znajduje się 15 studni i trzy zestawy (zestaw 1-3) studni, z których każdy zawiera pięć studni (A-E). Każdy szczur korzysta z różnych studni w każdej próbie kodowania i próbie wyboru przy przypominaniu. Na przykład, jak wspomniano na Rysunku 6B, szczur 1 będzie korzystał ze studni 1A w pierwszej próbie kodowania, ze studni 1B w drugiej próbie kodowania oraz ze studni 2C w próbie wyboru przy przypominaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Test sondy przywołującej

1. Zastosuj taką samą konfigurację jak w przypadku próby wyboru podczas przypominania, z wyjątkiem tego, że w żadnej z pięciu piaskownic nie znajdują się dostępne pelety, w tym w wcześniej nagradzanej, prawidłowej lokalizacji piaskownicy z danej sesji (Rysunek 8A,B).
   UWAGA: Podobnie jak w próbie wyboru podczas przypominania, podczas testu sondującego wszystkie pięć piaskownic jest dostępnych, a szczury mogą swobodnie kopać w dowolnej wybranej piaskownicy; jednak żadna z nich nie zawiera dostępnej nagrody pokarmowej – zamiast tego wszystkie 12 peletów znajduje się w niedostępnej części każdej piaskownicy (Rysunek 3C).
2. Umieść pięć piaskownic niezawierających dostępnych peletów w arenie w lokalizacjach wskazanych na mapie piaskownic dla danej sesji (Rysunek 8).
3. Umieść szczura w boksie startowym wraz z peletem sygnałowym. Użyj pozycji startowej, która nie była wykorzystywana w żadnej z dwóch prób kodowania w tej samej sesji.
4. Ustaw czasomierze piaskownic w dedykowanym oprogramowaniu komputerowym tak, aby odpowiadały mapie piaskownic dla danej sesji (Rysunek 4B). Upewnij się, że czasomierze ustawione w oprogramowaniu są zgodne z mapą piaskownic sesji.
5. Rozpocznij rejestrację próby sondującej w wewnętrznym systemie przechwytywania wideo.
   UWAGA: Ważne jest prowadzenie zapisu prób sondujących przypominanie szczurów w celu (1) zapewnienia przejrzystości badań (tj. surowych dowodów wykonania zadania przez każde zwierzę, które mogą zostać przesłane jako materiały uzupełniające do publikacji), (2) ponownego punktowania oraz (3) przyszłych referencji (tj. w celu analizy i zebrania danych dla innych miar wydajności).
6. Gdy szczur zje pelet, otwórz zdalnie drzwi boksu startowego za pomocą dedykowanego oprogramowania komputerowego (Rysunek 4B).
7. Gdy szczur wejdzie do areny i znajdzie się w bezpiecznej odległości od drzwi, zamknij drzwi boksu startowego i uruchom czasomierz w dedykowanym oprogramowaniu komputerowym.
8. Zapisz czas kopania szczura oraz latencję do każdej z odwiedzonych piaskownic podczas 120 s próby sondującej, klikając w każdą odwiedzoną piaskownicę i przytrzymując przycisk tak długo, jak szczur kontynuuje kopanie. To 120 s odliczanie rozpoczyna się, gdy szczur zaczyna kopać w pierwszej piaskownicy.
9. Zapisz czasy kopania i latencje w 60 s i 120 s, wykonując zrzut ekranu z dedykowanego oprogramowania komputerowego w tych punktach czasowych.
10. Po upływie 120 s próby sondującej umieść trzy pelety w prawidłowej piaskownicy (tj. w lokalizacji nagradzanej piaskownicy z próby kodowania), aby zapobiec utracie pamięci. Szczur musi odnaleźć dwa z tych trzech peletów. Po pobraniu peletu szczur musi zlokalizować bazę domową i wejść do niej, aby go zjeść.
11. Po zakończeniu 120 s testu sondującego naciśnij ekranowy przycisk Stop w dedykowanym oprogramowaniu komputerowym. Wyczyść nazwę pliku i zanotuj jedynie latencję szczura do pobrania pierwszego i drugiego peletu umieszczonego w teraz nagradzanej, prawidłowej lokalizacji piaskownicy.
    UWAGA: Preferencyjne kopanie w prawidłowej lokalizacji jest stosowane jako wskaźnik pamięci: dobra pamięć zdarzenia codziennego, doświadczonego w próbach kodowania (tj. napotkania prawidłowej lokalizacji piaskownicy w sesji), jest wskazana przez dłuższy czas spędzony na kopaniu w prawidłowej lokalizacji niż średni czas kopania w lokalizacjach błędnych.
12. Zaplanuj test sondujący przypominanie na początku treningu, aby sprawdzić, czy wyniki są na poziomie przypadkowym. Następnie planuj testy sondujące w określonych odstępach czasu (np. co szóstą sesję) lub tylko wtedy, gdy szczury osiągną stabilny poziom wykonania zadania: aby przeprowadzić test sondujący, ich średni wskaźnik wydajności (%) musi wynosić 60% lub więcej przez trzy kolejne sesje. Średni wskaźnik wydajności zdefiniowano w kroku 7.3.1.

6. Test kontrolny bez kodowania

UWAGA: Próba bez kodowania jest miarą kontrolną służącą do ustalenia, czy szczury wykorzystują artefakty węchowe, a nie pamięć o prawidłowej lokalizacji studni z piaskiem, do wykonania zadania. Jak sugeruje nazwa, „test kontrolny bez kodowania” oznacza, że przed próbą wyboru z pamięci nie przeprowadzono żadnych prób kodowania; wykonana zostaje jedynie próba wyboru z pamięci. Oczekuje się, że bez możliwości zakodowania lokalizacji codziennego zdarzenia pamięciowego, wyniki szczurów w próbie wyboru będą na poziomie przypadkowym. Jeśli tak nie będzie i szczury osiągną dobre wyniki w teście kontrolnym bez kodowania, może być konieczna zmiana konstrukcji studni z piaskiem oraz ich przedziałów dostępnych i niedostępnych.

1. Przeprowadź próbę wyboru z pamięci zgodnie z opisem w sekcji 4.3 (kroki 4.3.1 do 4.3.10).

7. Pomiar wydajności

UWAGA: Pomiarowi podlega kilka parametrów, a Rycina uzupełniająca 1 przedstawia przykładowy arkusz danych.

1. Wybór dołków z piaskiem
   UWAGA: Wybór definiuje się jako liczbę dołków z piaskiem, w których szczury kopią, aż do momentu znalezienia właściwego dołka włącznie, podczas prób wyboru w fazie przypominania (recall choice) i prób sondowania w fazie przypominania (recall probe). Maksymalna możliwa wartość wyboru wynosi 5, ponieważ łącznie znajduje się pięć dołków z piaskiem.
   1. Podczas każdej próby w eksperymencie (próba wyboru w fazie przypominania i test sondowania w fazie przypominania) określ liczbę wyborów dokonanych przez szczura: czy kładzie on przednią łapę lub łapy na dołku z piaskiem lub w jego wnętrzu. Jeśli szczur przebiegł obok lub jedynie szybko powąchał okolicę dołka z piaskiem, nie uznaje się tego za wybór.
   2. W rzadkich przypadkach, gdy na podstawie monitorów wideo trudno jest określić, czy szczury dokonały wyboru (zgodnie z powyższą definicją), sprawdź pod koniec próby, czy istnieją jakiekolwiek ślady kopania, tj. czy piasek został przesunięty wokół dołka lub dołków. Jeśli istnieją dowody kopania, nawet niewielkie, uznaj to za wybór. Zatrzymanie się przy dołku bez kopania uznaje się jedynie za wizytę i nie powinno być liczone jako wybór.
2. Błędy
   UWAGA: Błąd definiuje się jako liczbę nieprawidłowych dołków z piaskiem (beznagrodą), które szczury odwiedzają przed zlokalizowaniem właściwego dołka. Wybór definiuje się jako liczbę dołków z piaskiem, w których szczury kopią, aż do momentu znalezienia właściwego dołka włącznie, podczas prób wyboru w fazie przypominania i prób sondowania w fazie przypominania. Maksymalna liczba błędów wynosi cztery, ponieważ łącznie znajduje się pięć dołków z piaskiem.
   1. Oblicz liczbę błędów, korzystając z następującego wzoru:
      Błąd = (Wybór - 1)
   2. Gdy szczur ponownie odwiedza nieprawidłowy dołek, nie licz tego jako kolejnego błędu, ponieważ maksymalna liczba błędów wynosi cztery ze względu na obecność pięciu dołków z piaskiem w sumie.
3. Wskaźnik efektywności (PI)
   UWAGA: Wskaźnik efektywności definiuje się jako liczbę błędów popełnionych przed zlokalizowaniem przez szczury właściwego dołka w próbie wyboru w fazie przypominania. Przy pięciu dołkach z piaskiem może wystąpić do czterech błędów. Poziom przypadku dla pięciu dołków wynosi zatem dwa błędy (tj. 50%).
   1. Oblicz wskaźnik efektywności, korzystając z następującego wzoru:
      
   2. Gdy szczur ponownie odwiedza nieprawidłowy dołek, nie licz tego jako kolejnego błędu, ponieważ maksymalna liczba błędów wynosi cztery ze względu na obecność pięciu dołków z piaskiem w sumie.
4. Latencja
   UWAGA: Latencję definiuje się jako czas, który upływa do momentu rozpoczęcia kopania w prawidłowym dołku lub dołkach.
   1. Zmierz latencję od momentu opuszczenia przez szczura skrzynki startowej do chwili dotarcia do właściwego dołka. Monitoruj i rejestruj latencję za pomocą dedykowanego oprogramowania komputerowego.
5. Czas kopania
   1. Zmierz czas kopania szczurów w każdym dołku (zarówno w prawidłowych, jak i nieprawidłowych) w próbie sondowania w fazie przypominania.
      UWAGA: Dobrą pamięć dotyczącą codziennego zdarzenia definiuje się jako kopanie przez szczury w prawidłowym dołku (n = 1) przez większą część 120 s próby sondowania niż średni czas spędzony na kopaniu w nieprawidłowych dołkach (n = 4).
   2. Oblicz wartości dla dołków prawidłowych i nieprawidłowych, korzystając z następujących wzorów:
      
      

8. Unikanie niezamierzonej stronniczości

UWAGA: W całym protokole zastosowano następujące środki kontrolne, aby zapewnić powtarzalność i wiarygodność tego codziennego zadania pamięciowego.

1. Zastosuj przeciwważenie lokalizacji studni z piaskiem pomiędzy sesjami. Pozwala to uniknąć powstawania stronniczości w poszukiwaniu nagrody po konkretnej stronie areny zdarzeń.
2. Zastosuj przeciwważenie zestawów studni z piaskiem, a także studni w obrębie tych zestawów używanych w prawidłowej pozycji, pomiędzy sesjami oraz pomiędzy szczurami w ramach każdej sesji. Zapobiega to próbom podążania szczurów za resztkowym zapachem pozostawionym z prób poprzedniego szczura lub szczurów.
3. Przed każdą próbą przecieraj podłogę areny zdarzeń szmatką nasączoną 70% roztworem etanolu; zapobiegnie to wpływowi ścieżki poprzedniego szczura lub szczurów na wyniki kolejnych zadań.

Wyniki

Ten stabilny protokół z bazą domową był z powodzeniem stosowany do trenowania szczurów w nauce tego codziennego zadania pamięciowego z wykorzystaniem reprezentacji alocentrycznych. Protokół ten opiera się na dwóch istotnych elementach. Po pierwsze, zwierzęta startują z różnych czarnych pudełek startowych (np. wschodniego, południowego i zachodniego) w obrębie jednej sesji oraz pomiędzy sesjami (Ryc. 7A). W każdej sesji odbywają się dwie próby kodowania oraz jedna próba wyboru z przypominanie...

Dyskusja

Ludzie automatycznie kodują pojedyncze zdarzenia w życiu codziennym. Łatwo przypominamy sobie niektóre wydarzenia i zapominamy o innych. Opisany powyżej epizodyczny protokół pamięci codziennej stanowi solidną metodę dla badaczy chcących zbadać ten typ pamięci (pamięć epizodyczną) u gryzoni. Ponieważ zadanie polega na codziennym znajdowaniu i pobieraniu granulek pokarmowych z określonego miejsca, wykorzystywany jest naturalny instynkt gryzoni do poszukiwania pożywienia. Zadanie opiera się na rozsądnym założeniu, że akt zn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kamera	CCTVFirst	N/A
Event Arena	University of Edinburgh (zaprojektowana i zbudowana we własnym	zakresie)University of Edinburgh (zaprojektowana i zbudowana we własnym zakresie)	Arena eventowa do codziennych zadań pamięciowych
Szczury z kapturem Lister,	Charles River, Wielka Brytania	603
Multitimer	Labview, University of Edinburgh (zaprojektowane i zbudowane we własnym zakresie)	Uniwersytet w Edynburgu (zaprojektowany i zbudowany we własnym zakresie)
Pneumatyka, ramy, areny imprezowej	RS Components Ltd.	Uniwersytet w Edynburgu (P. Spooner)	Narzędzia do budowy areny imprezowej
Sandwells	Adam Plastics (http://www.adamplastics.co.uk)	Uniwersytet w Edynburgu (P. Spooner)	Studnie piaskowe do areny
Startboxy	Adam Plastics (http://www.adamplastics.co.uk)	Uniwersytet w Edynburgu (P. Spooner)
Nagrywanie wideo	na komputerach z systemem Windows 10 za pomocą oprogramowania OBS, Blackmagic Decklink Mini Karty do nagrywania	Nie dotyczy

,