Ten protokół opisuje test immunoenzymatyczny do wykrywania sporozoitów gruczołów ślinowych u komarów. Wykorzystując łatwo dostępne przeciwciała monoklonalne, metoda umożliwia ekonomiczne, wysokoprzepustowe wykrywanie komarów przenoszących Plasmodium falciparum lub Plasmodium vivax. Metoda ta nadaje się do badań nad przenoszeniem malarii, w tym do badań wektorowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie sporozoitów Plasmodium u komarów Anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sporozoity Plasmodium to zakaźne stadium pasożytów malarii, które infekują ludzi. Sporozoity znajdujące się w gruczołach ślinowych samic komarów Anopheles są przenoszone na ludzi poprzez ukąszenia komarów podczas karmienia krwią. Obecność sporozoitów w gruczołach ślinowych komarów określa zatem zakaźność komarów. Aby ustalić, czy komar Anopheles jest nosicielem sporozoitów Plasmodium, metoda testu immunoenzymatycznego (ELISA) jest standardowym narzędziem do wykrywania białka okołosporozoitowego Plasmodium (CSP), głównego białka powierzchniowego sporozoitów. W tej metodzie głowa wraz z klatką piersiową każdego komara jest oddzielana od brzucha, homogenizowana i poddawana kanapkowemu testowi ELISA w celu wykrycia obecności CSP specyficznego dla Plasmodium falciparum i każdego z dwóch podtypów, VK210 i VK247, Plasmodium vivax. Metoda ta została wykorzystana do zbadania przenoszenia malarii, w tym sezonowej dynamiki zakażeń komarami i gatunków głównych wektorów malarii w badanych miejscach.
Wprowadzenie
Sporozoity Plasmodium są zakaźnym stadium pasożytów malarii u komarów. Sporozoity są dostarczane ludziom poprzez ukąszenia komarów. U komara sporozoity najpierw tworzą się wewnątrz oocyst na ścianie jelita środkowego. Gdy są gotowe, są uwalniane do hemofelu i wędrują do gruczołów ślinowych komarów. Tam dojrzewają i stają się gotowe do przeniesienia na ludzi podczas karmienia krwią. U ludzi sporozoity odkładają się w skórze właściwej. Następnie dostają się do naczynia krwionośnego i przemieszczają się wzdłuż krążenia krwi, aby dotrzeć do wątroby w celu wywołania infekcji w hepatocytach1,2.
Trzy różne metody zostały użyte do określenia infekcji gruczołów ślinowych komarów. Pierwszą metodą jest wypreparowanie gruczołów ślinowych, a następnie bezpośrednie badanie sporozoitów pod mikroskopem świetlnym. Metoda ta jest złotym standardem w wykrywaniu i ilościowym oznaczaniu sporozoitów w gruczołach ślinowych komarów Anopheles3. Wymaga to jednak technika dobrze wyszkolonego zarówno w sekcji, jak i badaniu mikroskopowym. Co więcej, nie można go użyć do określenia gatunku Plasmodium i podtypu CSP (dla P. vivax)4,5. Druga metoda wykorzystuje reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) do wykrywania DNA Plasmodium w górnej części ciała komara6. Biorąc pod uwagę specyfikę PCR, możliwe są zarówno gatunki, jak i podtypy pasożyta7,8,9,10. Chociaż PCR jest coraz częściej stosowany, wymaga stosunkowo drogiego sprzętu i dobrze wyszkolonego personelu. Ostatnia metoda, ELISA do wykrywania białka okołosporozoitowego specyficznego dla Plasmodium (CSP), jest podstawą od trzech dekad11,12,13. CSP jest obecny zarówno w sporozoitach oocyst, jak i w sporozoitach gruczołów ślinowych12,14. Wykorzystując specyficzne przeciwciała, metoda ta umożliwia identyfikację gatunków Plasmodium i podtypowanie CSP sporozoitów P. vivax. Uzasadnieniem dla tego testu jest wymóg prostego, wysokoprzepustowego testu do zbadania dużej liczby dzikich komarów w celu zrozumienia przenoszenia malarii (tj. określenia wskaźnika infekcji sporozoitem).
Metoda ELISA ma dwie kluczowe zalety w porównaniu z badaniem mikroskopowym. Po pierwsze, pozwala naukowcom przechowywać próbki komarów do czasu, gdy będą gotowe do przetworzenia próbki. Po drugie, metoda ELISA może być stosowana do różnicowania gatunków Plasmodium za pomocą specyficznych dla gatunku przeciwciał monoklonalnych. Ponadto test ELISA może pomieścić większą liczbę próbek komarów, co pozwala na znacznie większą przepustowość15. W porównaniu do PCR, który wykrywa DNA sporozoitu, procedura ELISA zajmuje więcej czasu, ale kosztuje mniej16. Opisany tutaj test ELISA został opracowany w celu określenia zakaźności komarów i oddzielnego wykrywania CSP P. falciparum i każdego z dwóch wariantów CSP P. vivax, VK210 i VK247. Ta metoda ELISA została wykorzystana w wielu badaniach w celu określenia sezonowej dynamiki infekcji komarami i identyfikacji gatunków głównych wektorów malarii w terenie12,13,17,18. Do wykonania tego testu wystarczy standardowe laboratorium wyposażone w czytnik płytek ELISA.
Ogólne podejście jest podsumowane w Rysunek 1. W tym teście ELISA typu sandwich pierwszorzędowe (wychwytujące) przeciwciało monoklonalne (mAb) specyficzne dla każdego gatunku/podtypu Plasmodium jest najpierw używane do pokrycia płytki ELISA. Każda płytka jest pokryta pojedynczym mAb do wychwytywania. Funkcją mAb jest wychwytywanie odpowiedniego antygenu CSP w homogenatach komarów. Po wychwyceniu antygenu i umyciu płytki, drugie przeciwciało specyficzne dla CSP znakowane peroksydazą jest używane do wykrycia obecności CSP związanego z wychwytywanym mAb. Reakcja chemiczna katalizowana przez peroksydazę powoduje rozwój koloru w studzienkach dodatni dla CSP.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników
UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać listę sprzętu, odczynników i innych materiałów eksploatacyjnych używanych w tym protokole oraz do Tabeli 1, aby zapoznać się z listą roztworów i ich składem.
- Wychwytywanie i sprzężone z peroksydazą przeciwciała monoklonalne
- Aby rozpuść mAb, ponownie wywieść liofilizowany mAb w mieszaninie 1:1 wody destylowanej: glicerol w stężeniu 0,5 mg/ml. Przygotować porcje w razie potrzeby, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
- Bufor blokujący (BB)
- Przygotować bufor blokujący, rozpuszczając 5 g kazeiny klasy ELISA w 100 ml 0,1 N NaOH. Dodać 900 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (patrz tabela 1), aby uzyskać ostateczną objętość do 1,0 l.
- Dodać 0,02 g czerwieni fenolowej jako wskaźnik i dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl. Przechowywać BB w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia lub podwielokrotność w 50 ml do długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C.
- Kontrole dodatnie
- Aby odtworzyć kontrole pozytywne, należy ponownie uwodnić liofilizowane białka, dodając 1,000 μl BB. W razie potrzeby należy przygotować podwielokrotności podstawowych roztworów kontroli dodatniej i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
- W przypadku rozcieńczania seryjnego, dodatkowo rozcieńczyć każdą kontrolę dodatnią do końcowego stężenia roboczego w BB w następujący sposób: Pf, 2 pg/μl; Pv (VK210), 182 (pg/μL); Pv (VK247), 89 pg/μL.
UWAGA: Dokładne stężenia kontroli dodatnich mogą się różnić w zależności od partii. Zapoznaj się z kartą informacyjną produktu, aby uzyskać dokładne wymagane stężenie. Stężenia kontroli dodatniej, począwszy od powyższego stężenia roboczego, wynoszą 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 pg/μL dla Pf; 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 pg/μL dla PV210; oraz 89, 45, 22, 11, 5,6, 2,8 pg/μL PV247.
- Kontrole negatywne
UWAGA: Idealną kontrolą ujemną jest homogenat głowa-tułów samic komarów Anopheles przygotowany identycznie jak próbki do badań. Jednak BB może być również stosowany jako kontrola negatywna.- W przypadku BB jako kontroli ujemnej należy użyć 2-krotnego progu absorbancji, aby uzyskać wiarygodne odczyty dodatnie.
2. Przygotowanie próbki komara
- Oddziel głowę i klatkę piersiową każdego zebranego dorosłego komara od brzucha za pomocą sterylnej żyletki. Umieść głowę i klatkę piersiową w wstępnie oznaczonej probówce do mielenia wirówki o pojemności 1.5 ml. W razie potrzeby główki basenu i tułowia do 10 komarów.
UWAGA: W celu przygotowania próbki, zazwyczaj gruczoł ślinowy zakażonego komara jest preparowany i poddawany CS-ELISA. Jednak głowa i klatka piersiowa pobranych komarów mogą być również wykorzystane do bezpośredniego wykonania testu CS-ELISA (bez preparowania gruczołów ślinowych)12,13,19. - Dodać 50 μl buforu do mielenia (GB) do każdej probówki i homogenizować próbkę za pomocą czystego tłuczka (umytego mydłem). Wypłucz zużyty tłuczek z 250 μl GB do probówki zawierającej homogenizowane komary do końcowej objętości ~300 μl.
- Próbkę należy przechowywać w zamrażarce (-20 °C) do czasu użycia lub natychmiast przystąpić do testu ELISA.
3. ELISA sporozoitu
- Wypełnij arkusz sporozoitowy ELISA (patrz Materiał uzupełniający 1). Przygotuj jedną płytkę ELISA dla każdego CSP (Pf, Pv-210 lub Pv-247).
- Przygotować wychwytywalny roztwór roboczy mAb, rozpuszczając przeciwciało w PBS: 4 μg/ml Pf; 2 μg/ml Pv-210; 2 μg/ml Pv-247. Obliczyć wymagane objętości na podstawie dodania 5 ml na płytkę. Delikatnie rozprowadź roztwór.
- Odpipetować 50 μl każdego roboczego roztworu mAb z kroku 3.2 do każdego dołka płytki ELISA. Przykryj płytkę plastikową pokrywką i inkubuj przez 30 minut lub przez noc w temperaturze pokojowej.
- Zassać zawartość studzienki i postukać talerzem do góry nogami o ręczniki papierowe co najmniej 5 razy, aby usunąć cały płyn.
UWAGA: Jeśli system aspiracji (wielokanałowe ssanie próżniowe podłączone do czystych końcówek) nie jest dostępny, wylej przeciwciała do zlewu, a następnie postukaj talerzem o ręczniki papierowe. - Dodaj 200 μl BB, aby wypełnić wszystkie dołki w talerzu. Przykryj talerz plastikową pokrywką. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać lub wylać zawartość studzienki. Postukaj talerzem do góry nogami o ręczniki papierowe 5 razy, aby usunąć cały płyn.
- Załadować homogenat komara i kontrolę na płytkę w następujący sposób.
- Dodać 50 μl kontroli dodatniej do studzienek H1 i H2.
- Dodać 50 μl BB do studzienek w kolumnach 1 i 2 od rzędu C do G. Następnie dodać 50 μl kontroli pozytywnej do studzienek G1 i G2. Przeprowadzić seryjne rozcieńczenie kontroli dodatniej, zaczynając od G1 i G2, a następnie F1 i F2 aż do C1 i C2.
UWAGA: Wszystkie studzienki kontroli dodatniej powinny zawierać 50 μl. - Dodać 50 μl BB (kontrola ujemna) do studzienek A1, A2, B1 i B2.
- Dodać 50 μl każdej próbki homogenatu do dołka Unknown (Unk).
- Przykryć płytkę i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Po około 2 godzinach przystępujemy do przygotowania podłoży. W przypadku zestawu 2-składnikowego do podłoża ABTS należy wymieszać podłoże A i podłoże B w stosunku 1:1.
UWAGA: Pełna 96-dołkowa płytka wymaga 5 ml substratu A i 5 ml substratu B. - Przygotować roztwory robocze mAb znakowanych peroksydazą dla Pf, Pv-210 i Pv-247, dodając BB do odtworzonego sprzężonego mAb w celu uzyskania stężenia roboczego 1 μg/ml.
- Obliczyć wymagane objętości na podstawie dodania 5 ml roboczego sprzężonego roztworu mAb na płytkę.
- Zbadać aktywność peroksydazy, mieszając 5 μl znakowanego peroksydazą mAb wykonanego w kroku 3.8 ze 100 μl substratu wykonanego w kroku 3.7 w oddzielnej probówce o pojemności 1,5 ml. Wiruj delikatnie.
UWAGA: Powinna nastąpić szybka zmiana koloru z przezroczystego na zielony, co wskazuje, że enzym peroksydazy i substraty działają.
- Zassaj lub wylej zawartość studzienki i postukaj talerzem do góry nogami o ręczniki papierowe 5 razy, aby usunąć cały płyn.
- Umyj studzienki dwukrotnie 200 μl PBS-Tween, odessać zawartość studzienki i postukać w płytkę po 5 razy.
- Dodać 50 μl znakowanego peroksydazą mAb wykonanego w kroku 3.8 do każdego dołka. Przykryj płytkę i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Zassaj lub wylej zawartość studzienki i postukaj talerzem do góry nogami o ręcznik papierowy 5 razy.
- Umyj studzienki 3 razy 200 μl PBS-Tween, odessać zawartość studzienki i postukać w płytkę 5 razy każdy.
- Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworu substratu przygotowanego w kroku 3.7. Przykryj płytkę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Po 30 minutach odczytać absorbancję przy 405-414 nm za pomocą czytnika płytek ELISA.
UWAGA: Postępuj zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dotyczącymi używanego czytnika płytek ELISA. Szczegółowe informacje na temat instrukcji dotyczących oprogramowania używanego w tym protokole można znaleźć w materiałach uzupełniających S2. W studzienkach kontroli pozytywnej powinna być zauważalna zmiana koloru z przezroczystego na zielony.
4. Analiza
- Wykrywanie próbek dodatnich.
- Próbki o wartościach absorbancji powyżej wartości odcięcia (dwukrotność średniej wartości absorbancji próbek ujemnych) należy oznaczyć jako dodatnie.
- Kwantyfikacja CSP
- Oszacować stężenie CSP w próbce, stosując krzywą wzorcową skonstruowaną z serii rozcieńczeń kontrolnych w następujący sposób.
- Utwórz krzywą wzorcową, wykreślając wartości absorbancji (oś y) seryjnie rozcieńczonych kontrolek w stosunku do ich stężeń (oś x).
- Wykonaj regresję liniową, aby określić najlepsze dopasowanie przy użyciu y = A + Bx, gdzie A i B są parametrami dowolnymi.
- Określić stężenie CSP dla każdej próbki dodatniej, rozwiązując równanie dla danej wartości absorbancji.
- Oszacować stężenie CSP w próbce, stosując krzywą wzorcową skonstruowaną z serii rozcieńczeń kontrolnych w następujący sposób.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne wyniki testu ELISA przedstawiono na Rysunku 2. W tym doświadczeniu test ELISA na P. falciparum wykazał zakażenie sporozoitami w studzience A7. Dodatnia studzienka była możliwa do wizualnego zidentyfikowania po słabej zielonej barwie (Rysunek 2A). Wartość absorbancji tej studzienki przekraczała próg odcięcia (dwukrotność średniej wartości z czterech studzienek kontroli ujemnej) (Rysunek 2B). Rozkład wartości ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
CSP-ELISA zapewnia wysoce specyficzną i opłacalną metodę wykrywania Plasmodium CSP. Pozwala to na rozróżnienie sporozoitów P. falciparum i P. vivax, a także między dwoma podtypami, VK210 i VK247, P vivax 11,13,14,15. W celu uzyskania wiarygodnych i odtwarzalnych wyników należy wziąć pod uwagę pewne punkty krytyczne. Wszystkie roztwory należy przechowywać w lo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Panu Kirakorn Kiatibutr, MVRU, za szkolenie i wskazówki. Dziękujemy również Pani Pinyapat Kongngen, MVRU, za pomoc techniczną w przygotowaniu Rysunek 2. Prace te zostały wsparte grantem z Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych oraz Narodowego Instytutu Zdrowia (U19 AI089672).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| ELISA czytnik płytek | BioTek Instrument, Inc. | Synergy H1 | Absorbancja jest mierzona w trybie detekcji absorbancji UV-VIS |
| Tłuczek do młynka | Axygen | PES-15-B-SI | Do homogenizacji głowy/klatki piersiowej komara |
| odczynniki | |||
| ABTS substrat 2-składnikowy | KPL | 50-62-00 | Do detekcji sterowanej peroksydazą |
| Bufor blokujący (BB) | Uwaga: roztwór | ||
| Wychwytywanie i sprzężone z peroksydazą przeciwciała monoklonalne (mAb) | Uwaga: mAb można uzyskać w postaci liofilizowanej jako część zestawów odczynników Sporozoite ELISA (MRA-890 dla P. falciparum i MRA-1028K dla P. vivax) z BEI Resources (https://www.beiresources.org.) | ||
| Kazeina | Sigma aldrich | 9000-71-9 | Do blokowania przygotowania buforu |
| Bufor mielący (GB) | Uwaga: roztwór | ||
| Igepal CA-630 | Sigma aldrich | 9002-93-1 | Do przygotowania buforu mielącego |
| KCl | Sigma aldrich | 7447-40-7 | Do przygotowania buforu fosforanowego |
| KH2PO4 | Sigma aldrich | 7778-77-0 | Do przygotowania soli fizjologicznej buforu fosforanowego |
| Na2HPO4Sigma | aldrich | 7558-79-4 | Do przygotowania soli buforowej fosforanowej |
| NaCl | Sigma aldrich | 7647-14-5 | Do przygotowania soli w buforze fosforanowym |
| NaOH | Sigma aldrich | 1310-73-2 | Do blokowania przygotowania buforu |
| PBS-Tween | |||
| Pf wychwyt mAb | CDC | Pf-CAP | Do wychwytywania białka okołosporozoitowego |
| Pf Peroksydaza Pf mAb | CDC | Pf-HRP | Do wykrywania białka okołosporozoitowego |
| Pf Kontrola pozytywna | Pf CDC | Pf-PC | Pf kontrola pozytywna Czerwień |
| fenolowa | Sigma aldrich | 143-74-8 | Do blokowania przygotowania buforu |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Uwaga: roztwór | ||
| Kontrole | Uwaga: roztwór | ||
| Wychwytywanie Pv210 mAb | CDC | Pv210-CAP | Do wychwytywania białka okołosporozoitowego Pv210 |
| Peroksydaza Pv210 mAb | CDC | Pv210-HRP | Do wykrywania białka okołosporozoitowego Pv210 |
| Kontrola pozytywna Pv210 | CDC | Pv210-PC | Kontrola pozytywna Pv210 |
| Wychwyt mAb Pv247 | CDC | Pv247-CAP | Do wychwytywania białka okołosporozoitowego Pv247 |
| Peroksydaza Pv247 mAb | CDC | Pv247-HRP | Do wykrywania białka okołosporozoitowego Pv247 |
| Kontrola pozytywna Pv247 | CDC | Pv247-PC | Kontrola pozytywna Pv247 |
| Tween20 | Sigma aldrich | 9005-64-5 | Do przygotowania PBS-Tween |
| Materiały eksploatacyjne | |||
| Jednorazowe zbiorniki do pipetowania | Ogólny | Do pracy z odczynnikami | |
| Płytki ELISA: 96-dołkowe przezroczyste okrągłe dno PVS | Corning Life Science | 2797 | Do rękawic ELISA |
| : rękawiczki jednorazowe i rękawice do zamrażania | Ogólne | Do ochrony osobistej | |
| Fartuch laboratoryjny | Ogólny | do ochrony indywidualnej | |
| Pipeta wielokanałowa P30-300 | Ogólna | Do przenoszenia roztworu | |
| Zestaw pipet P2, P20, P200 i P1000 | Ogólna Do | przenoszenia roztworu | |
| Końcówki do pipet 10 i mikro; L, 200 i mikro; L oraz 1000 i mikro; L | Ogólny | Do przenoszenia roztworu | |
| Pipety serologiczne 5 mL, 10 ml | Ogólny | Do przenoszenia roztworu | |
| Pipety transferowe | Ogólny Do | przenoszenia roztworu |
Bibliografia
- Bray, R. S., Garnham, P. C. The life-cycle of primate malaria parasites. British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).
- Held, J. R. Primate malaria. Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).
- World Health Organization. Division of Malaria and Other Parasitic Diseases. Manual on practical entomology in Malaria, Part I and Part II. World Health Organization. , Geneva. (1975).
- Robert, V., et al. Study of the distribution of circumsporozoite antigen in Anopheles gambiae infected with Plasmodium falciparum, using the enzyme-linked immunosorbent assay. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 82 (3), 389-391 (1988).
- Fontenille, D., Meunier, J. Y., Nkondjio, C. A., Tchuinkam, T. Use of circumsporozoite protein enzyme-linked immunosorbent assay compared with microscopic examination of salivary glands for calculation of malaria infectivity rates in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Cameroon. Journal of Medical Entomology. 38 (3), 451-454 (2001).
- Echeverry, D. F., et al. Fast and robust single PCR for Plasmodium sporozoite detection in mosquitoes using the cytochrome oxidase I gene. Malaria Journal. 16 (1), 230(2017).
- Singh, B., et al. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60 (4), 687-692 (1999).
- Snounou, G. Genotyping of Plasmodium spp. Nested PCR. Methods in Molecular Medicine. 72, 103-116 (2002).
- Snounou, G., Singh, B. Nested PCR analysis of Plasmodium parasites. Methods in Molecular Medicine. 72, 189-203 (2002).
- Snounou, G., Viriyakosol, S., Jarra, W., Thaithong, S., Brown, K. N. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Molecular and Biochemical Parasitology. 58 (2), 283-292 (1993).
- Wirtz, R. A., et al. Identification of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes using an enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 34 (6), 1048-1054 (1985).
- Wirtz, R. A., Burkot, T. R., Graves, P. M., Andre, R. G. Field evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Papua New Guinea. Journal of Medical Entomology. 24 (4), 433-437 (1987).
- Wirtz, R. A., Sattabongkot, J., Hall, T., Burkot, T. R., Rosenberg, R. Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for Plasmodium vivax-VK247 sporozoites. Journal of Medical Entomology. 29 (5), 854-857 (1992).
- Burkot, T. R., Williams, J. L., Schneider, I. Identification of Plasmodium falciparum-infected mosquitoes by a double antibody enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 33 (5), 783-788 (1984).
- Rosenberg, R., et al. Circumsporozoite protein heterogeneity in the human malaria parasite Plasmodium vivax. Science. 245 (4921), 973-976 (1989).
- Marie, A., et al. Evaluation of a real-time quantitative PCR to measure the wild Plasmodium falciparum infectivity rate in salivary glands of Anopheles gambiae. Malaria Journal. 12, 224(2013).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Immunoreactivity of sera from low to moderate malaria-eEndemic areas against Plasmodium vivax rPvs48/45 proteins produced in Escherichia coli and chinese hamster ovary systems. Frontiers in Immunology. 12, 634738(2021).
- Balkew, M., et al. An update on the distribution, bionomics, and insecticide susceptibility of Anopheles stephensi in Ethiopia, 2018-2020. Malaria Journal. 20 (1), 263(2021).
- Wirtz, R. A., Avery, M., Benedict, M., Sutcliffe, A. Plasmodium sporozoite ELISA. Methods in Anopheles Research. , 333-343 (2016).
- Durnez, L., et al. False positive circumsporozoite protein ELISA: a challenge for the estimation of the entomological inoculation rate of malaria and for vector incrimination. Malaria Journal. 10, 195(2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
