Ten protokół opisuje test immunoenzymatyczny do wykrywania sporozoitów gruczołów ślinowych u komarów. Wykorzystując łatwo dostępne przeciwciała monoklonalne, metoda umożliwia ekonomiczne, wysokoprzepustowe wykrywanie komarów przenoszących Plasmodium falciparum lub Plasmodium vivax. Metoda ta nadaje się do badań nad przenoszeniem malarii, w tym do badań wektorowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie sporozoitów Plasmodium u komarów Anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sporozoity Plasmodium to zakaźne stadium pasożytów malarii, które infekują ludzi. Sporozoity znajdujące się w gruczołach ślinowych samic komarów Anopheles są przenoszone na ludzi poprzez ukąszenia komarów podczas karmienia krwią. Obecność sporozoitów w gruczołach ślinowych komarów określa zatem zakaźność komarów. Aby ustalić, czy komar Anopheles jest nosicielem sporozoitów Plasmodium, metoda testu immunoenzymatycznego (ELISA) jest standardowym narzędziem do wykrywania białka okołosporozoitowego Plasmodium (CSP), głównego białka powierzchniowego sporozoitów. W tej metodzie głowa wraz z klatką piersiową każdego komara jest oddzielana od brzucha, homogenizowana i poddawana kanapkowemu testowi ELISA w celu wykrycia obecności CSP specyficznego dla Plasmodium falciparum i każdego z dwóch podtypów, VK210 i VK247, Plasmodium vivax. Metoda ta została wykorzystana do zbadania przenoszenia malarii, w tym sezonowej dynamiki zakażeń komarami i gatunków głównych wektorów malarii w badanych miejscach.
Wprowadzenie
Sporozoity Plasmodium są zakaźnym stadium pasożytów malarii u komarów. Sporozoity są dostarczane ludziom poprzez ukąszenia komarów. U komara sporozoity najpierw tworzą się wewnątrz oocyst na ścianie jelita środkowego. Gdy są gotowe, są uwalniane do hemofelu i wędrują do gruczołów ślinowych komarów. Tam dojrzewają i stają się gotowe do przeniesienia na ludzi podczas karmienia krwią. U ludzi sporozoity odkładają się w skórze właściwej. Następnie dostają się do naczynia krwionośnego i przemieszczają się wzdłuż krążenia krwi, aby dotrzeć do wątroby w celu wywołania infekcji w hepatocytach1,2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników
UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać listę sprzętu, odczynników i innych materiałów eksploatacyjnych używanych w tym protokole oraz do Tabeli 1, aby zapoznać się z listą roztworów i ich składem.
- Wychwytywanie i sprzężone z peroksydazą przeciwciała monoklonalne
- Aby rozpuść mAb, ponownie wywieść liofilizowany mAb w mieszaninie 1:1 wody destylowanej: glicerol w stężeniu 0,5 mg/ml. Przygotować porcje w razie potrzeby, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne wyniki testu ELISA przedstawiono na Rysunku 2. W tym doświadczeniu test ELISA na P. falciparum wykazał zakażenie sporozoitami w studzience A7. Dodatnia studzienka była możliwa do wizualnego zidentyfikowania po słabej zielonej barwie (Rysunek 2A). Wartość absorbancji tej studzienki przekraczała próg odcięcia (dwukrotność średniej wartości z czterech studzienek kontroli ujemnej) (Rysunek 2B). Rozkład wartości .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
CSP-ELISA zapewnia wysoce specyficzną i opłacalną metodę wykrywania Plasmodium CSP. Pozwala to na rozróżnienie sporozoitów P. falciparum i P. vivax, a także między dwoma podtypami, VK210 i VK247, P vivax 11,13,14,15. W celu uzyskania wiarygodnych i odtwarzalnych wyników należy wziąć pod uwagę pewne punkty krytyczne. Wszystkie roztwory należy przechowywać w lo.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Panu Kirakorn Kiatibutr, MVRU, za szkolenie i wskazówki. Dziękujemy również Pani Pinyapat Kongngen, MVRU, za pomoc techniczną w przygotowaniu Rysunek 2. Prace te zostały wsparte grantem z Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych oraz Narodowego Instytutu Zdrowia (U19 AI089672).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| ELISA czytnik płytek | BioTek Instrument, Inc. | Synergy H1 | Absorbancja jest mierzona w trybie detekcji absorbancji UV-VIS |
| Tłuczek do młynka | Axygen | PES-15-B-SI | Do homogenizacji głowy/klatki piersiowej komara |
| odczynniki | |||
| ABTS substrat 2-składnikowy | KPL | 50-62-00 | Do detekcji sterowanej peroksydazą |
| Bufor blokujący (BB) | Uwaga: roztwór | ||
| Wychwytywanie i sprzężone z peroksydazą przeciwciała monoklonalne (mAb) | Uwaga: mAb można uzyskać w postaci liofilizowanej jako część zestawów odczynników Sporozoite ELISA (MRA-890 dla P. falciparum i MRA-1028K dla P. vivax) z BEI Resources (https://www.beiresources.org.) | ||
| Kazeina | Sigma aldrich | 9000-71-9 | Do blokowania przygotowania buforu |
| Bufor mielący (GB) | Uwaga: roztwór | ||
| Igepal CA-630 | Sigma aldrich | 9002-93-1 | Do przygotowania buforu mielącego |
| KCl | Sigma aldrich | 7447-40-7 | Do przygotowania buforu fosforanowego |
| KH2PO4 | Sigma aldrich | 7778-77-0 | Do przygotowania soli fizjologicznej buforu fosforanowego |
| Na2HPO4Sigma | aldrich | 7558-79-4 | Do przygotowania soli buforowej fosforanowej |
| NaCl | Sigma aldrich | 7647-14-5 | Do przygotowania soli w buforze fosforanowym |
| NaOH | Sigma aldrich | 1310-73-2 | Do blokowania przygotowania buforu |
| PBS-Tween | |||
| Pf wychwyt mAb | CDC | Pf-CAP | Do wychwytywania białka okołosporozoitowego |
| Pf Peroksydaza Pf mAb | CDC | Pf-HRP | Do wykrywania białka okołosporozoitowego |
| Pf Kontrola pozytywna | Pf CDC | Pf-PC | Pf kontrola pozytywna Czerwień |
| fenolowa | Sigma aldrich | 143-74-8 | Do blokowania przygotowania buforu |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Uwaga: roztwór | ||
| Kontrole | Uwaga: roztwór | ||
| Wychwytywanie Pv210 mAb | CDC | Pv210-CAP | Do wychwytywania białka okołosporozoitowego Pv210 |
| Peroksydaza Pv210 mAb | CDC | Pv210-HRP | Do wykrywania białka okołosporozoitowego Pv210 |
| Kontrola pozytywna Pv210 | CDC | Pv210-PC | Kontrola pozytywna Pv210 |
| Wychwyt mAb Pv247 | CDC | Pv247-CAP | Do wychwytywania białka okołosporozoitowego Pv247 |
| Peroksydaza Pv247 mAb | CDC | Pv247-HRP | Do wykrywania białka okołosporozoitowego Pv247 |
| Kontrola pozytywna Pv247 | CDC | Pv247-PC | Kontrola pozytywna Pv247 |
| Tween20 | Sigma aldrich | 9005-64-5 | Do przygotowania PBS-Tween |
| Materiały eksploatacyjne | |||
| Jednorazowe zbiorniki do pipetowania | Ogólny | Do pracy z odczynnikami | |
| Płytki ELISA: 96-dołkowe przezroczyste okrągłe dno PVS | Corning Life Science | 2797 | Do rękawic ELISA |
| : rękawiczki jednorazowe i rękawice do zamrażania | Ogólne | Do ochrony osobistej | |
| Fartuch laboratoryjny | Ogólny | do ochrony indywidualnej | |
| Pipeta wielokanałowa P30-300 | Ogólna | Do przenoszenia roztworu | |
| Zestaw pipet P2, P20, P200 i P1000 | Ogólna Do | przenoszenia roztworu | |
| Końcówki do pipet 10 i mikro; L, 200 i mikro; L oraz 1000 i mikro; L | Ogólny | Do przenoszenia roztworu | |
| Pipety serologiczne 5 mL, 10 ml | Ogólny | Do przenoszenia roztworu | |
| Pipety transferowe | Ogólny Do | przenoszenia roztworu |
Bibliografia
- Bray, R. S., Garnham, P. C. The life-cycle of primate malaria parasites. British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).
- Held, J. R. Primate malaria. Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).
- World Health Organization.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
