Artykuł metodologiczny

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

DOI:

10.3791/63162

⸱

6 kwietnia 2022

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaspazy zapalne obejmują kaspazy-1, -4, -5, -11 i -12 i należą do podgrupy kaspaz inicjujących. Kaspaza-1 jest niezbędna do zapewnienia prawidłowej regulacji sygnalizacji zapalnej i jest aktywowana przez dimeryzację indukowaną bliskością po rekrutacji do inflamasomów. Kaspaza-1 występuje obficie w linii komórek monocytowych i indukuje dojrzewanie cytokin prozapalnych interleukiny (IL)-1β i IL-18 do aktywnych wydzielanych cząsteczek. Inne zapalne kaspazy, kaspaza-4 i -5 (oraz ich mysi homolog kaspaza-11) promują uwalnianie IL-1β poprzez indukowanie piroptozy. Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji kaspazy (BiFC) jest narzędziem używanym do pomiaru bliskości indukowanej zapalną kaspazą jako odczytu aktywacji kaspazy. Prodomena kaspazy-1, -4 lub -5, która zawiera region wiążący się z inflamasomem, jest połączona z niefluorescencyjnymi fragmentami żółtego białka fluorescencyjnego Wenus (Venus-N [VN] lub Venus-C [VC]), które łączą się w celu zreformowania fluorescencyjnego kompleksu Wenus, gdy kaspazy ulegają indukowanej bliskości. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić te reportery do pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) za pomocą nukleofekcji, leczyć komórki w celu wywołania aktywacji zapalnej kaspazy i mierzyć aktywację kaspazy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej. Zaletą tego podejścia jest to, że można je wykorzystać do identyfikacji składników, wymagań i lokalizacji kompleksu aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach. Należy jednak rozważyć staranne kontrole, aby uniknąć pogorszenia żywotności i zachowania komórek. Technika ta jest potężnym narzędziem do analizy dynamicznych interakcji kaspazy na poziomie inflamasomów, a także do badania kaskad sygnalizacji zapalnej w żywych MDM i monocytach pochodzących z próbek krwi ludzkiej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaspazy to rodzina proteaz asparaginianu cysteiny, które można podzielić na kaspazy inicjujące i katestowe. Kaspazy egzekucyjne składają się z kaspazy-3, -6 i -7. Naturalnie występują w komórkach jako dimery i są rozszczepiane przez kaspazy inicjatora w celu wykonania apoptozy1. Kaspazy inicjujące obejmują ludzką kaspazę-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 i -12. Występują jako nieaktywne zymogeny (pro-kaspazy), które są aktywowane przez dimeryzację indukowaną bliskością i stabilizowane przez autoproteolityczne rozszczepienie2,3. Kaspazy zapalne są podzbiorem kaspaz inicjujących2 i obejmują kaspazę-1, -4, -5 i -12 u ludzi oraz kaspazę-1, -11 i -12 u mouse4,5. Zamiast odgrywać rolę apoptozy, odgrywają one kluczową rolę w zapaleniu. Pośredniczą one w przetwarzaniu proteolitycznym i wydzielaniu pro-interleukiny (IL)-1β i pro-IL-186,7, które są pierwszymi cytokinami uwalnianymi w odpowiedzi na chorobotwórczych najeźdźców8,9. Kaspaza-1 jest aktywowana po rekrutacji do swojej platformy aktywacyjnej; kompleks białkowy o dużej masie cząsteczkowej określany jako inflamasom ( Rysunek 1A) < klasa sup = "xref">10. Dimeryzacja kaspazy-4, -5 i -11 zachodzi niezależnie od tych platform poprzez niekanoniczny szlak inflamasomu11,12.

Canonical inflammasomy to cytozolowe kompleksy białek multimerycznych, które składają się z białka czujnika inflamasomów, białka adaptorowego ASC (białko podobne do plamki związanej z apoptozą zawierające CARD) oraz białka efektorowego caspase-110. Najlepiej zbadanymi inflamasomami kanonicznymi są rodzina receptorów podobnych do NOD zawierająca domenę piryny (NLRP), NLRP1 i NLRP3, rodzina NLR zawierająca CARD (NLRC), NLRC4 i nieobecna w czerniaku 2 (AIM2). Każda z nich zawiera domenę pyryny, domenę CARD lub obie domeny. Domena CARD pośredniczy w interakcji między kaspazami zawierającymi CARD a ich aktywatorami. Dlatego cząsteczka rusztowania ASC, która składa się z N-końcowej domeny pyryny (PYD) i C-końcowej CARD motif13,14, jest wymagana do rekrutacji kaspazy-1 do NLRP110, NLRP315 i AIM216 inflamasomów.

Każda nazwa inflamasomu pochodzi od unikalnego białka sensorycznego, które rozpoznaje różne bodźce prozapalne (Rysunek 1B). Aktywatory tego szlaku nazywane są bodźcami kanonicznymi. Inflamasomy służą jako czujniki składników mikrobiologicznych i stresu tkankowego i łączą się, aby wywołać silną reakcję zapalną poprzez aktywację kaspaz zapalnych17. Montaż inflamasomu inicjuje aktywację kaspazy-1 w celu pośredniczenia w dojrzewaniu i wydzielaniu jej głównych substratów pro-IL-1β i pro-IL-18. Proces ten odbywa się za pomocą mechanizmu dwuetapowego. Po pierwsze, bodziec priming zwiększa ekspresję niektórych białek inflamasomowych i pro-IL-1β poprzez aktywację szlaku NF-κB. Po drugie, bodziec wewnątrzkomórkowy (kanoniczny) indukuje składanie inflamasomu i rekrutację prokaspazy-16,7.

Kaspaza-4 i kaspaza-5 to ludzkie ortologi mysiej kaspazy-1111. Są one aktywowane w sposób niezależny od inflamasomu przez wewnątrzkomórkowy lipopolisacharyd (LPS), cząsteczkę znajdującą się w zewnętrznej błonie bakterii Gram-ujemnych18,19,20, oraz przez hem zewnątrzkomórkowy, produkt hemolizy czerwonych krwinek21. Zaproponowano, że LPS wiąże się bezpośrednio z motywem CARD tych białek i indukuje ich oligomeryzację20. Aktywacja kaspazy-4 lub kaspazy-5 sprzyja uwalnianiu IL-1β poprzez indukowanie zapalnej formy śmierci komórki zwanej piroptozą poprzez rozszczepienie białka tworzącego pory gasderminy D (GSDMD)18,19. Ponadto wypływ jonów potasu wynikający z kaspazy-4 i śmierci piroptotycznej za pośrednictwem GSDMD indukuje aktywację inflamasomu NLRP3, a następnie aktywację kaspazy-122,23. Dlatego kaspaza-4, -5 i -11 są uważane za wewnątrzkomórkowe czujniki LPS, które są w stanie indukować pyroptozę i aktywację kaspazy-1 w odpowiedzi na określone bodźce11,24.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Test kaspaz zapalnych i komplementacji fluorescencji kaspazowo-dwucząsteczkowej (BiFC). (A) Diagram przedstawiający system kaspazy-BiFC, w którym dwie prodomeny kaspazy-1 (C1-pro) połączone z każdym niefluorescencyjnym fragmentem Wenus (Wenus-C lub Wenus-N) są rekrutowane do platformy aktywacji NLRP3, zmuszając Wenus do ponownego złożenia i fluorescencji. Kompleks ten pojawia się jako zielona plamka pod mikroskopem i służy jako odczyt bliskości wywołanej zapalną kaspazą, co jest pierwszym krokiem w inicjującej aktywacji kaspazy. (B) Schemat przedstawiający organizację domen składników inflamasomów i kaspaz zapalnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pomiar aktywacji konkretnych kaspaz inicjatora jest trudny i nie ma wielu dostępnych metod, aby to zrobić za pomocą metod obrazowania. Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji kaspazy (BiFC) może być wykorzystana do wizualizacji aktywacji zapalnej kaspazy bezpośrednio w żywych komórkach ( Rysunek 1A) < klasa sup = "xref">25. Technika ta została niedawno zaadaptowana do stosowania w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów (MDM)21. Kaspaza BiFC mierzy pierwszy krok w zapalnej aktywacji kaspazy, indukowanej bliskości w celu ułatwienia dimeryzacji. Wykorzystuje się ekspresję plazmidów kodujących prodomenę kaspazy zawierającą CARD, połączoną z niefluorescencyjnymi fragmentami fotostabilnego żółtego białka fluorescencyjnego Venus (Venus-C [VC]) i Venus-N [VN]). Kiedy dwie prodomeny kaspazy są rekrutowane do swojej platformy aktywacyjnej lub ulegają indukowanej bliskości, dwie połówki Wenus zbliżają się do siebie i są zmuszane do ponownego złożenia i fluorescencji (patrz Rysunek 1A,B). Zapewnia to odczyt w czasie rzeczywistym aktywacji specyficznej kaspazy zapalnej.

Ludzkie MDM obficie wyrażają geny inflamasomu i receptory rozpoznające wzorce, które identyfikują sygnały zagrożenia i produkty chorobotwórcze. Zapewnia to idealny typ komórek do badania szlaków zapalnych kaspazy. Ponadto można je uzyskać z krwi obwodowej, a nawet z próbek pobranych od pacjentów, aby ocenić aktywację kaspazy zapalnej w określonym stanie chorobowym. Protokół ten opisuje, jak wprowadzić reportery kaspazy BiFC do MDM za pomocą nukleofekcji, metody transfekcji opartej na elektroporacji, jak leczyć komórki w celu wywołania aktywacji kaspazy zapalnej oraz jak wizualizować aktywne kompleksy kaspazy za pomocą podejść mikroskopowych. Ponadto metodologia ta może być dostosowana do określenia składu molekularnego tych kompleksów, lokalizacji subkomórkowej, kinetyki i rozmiaru tych wysoce uporządkowanych struktur25,26,27.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etyki badań na ludziach Baylor College of Medicine dotyczącej manipulacji próbkami ludzkimi. Z próbkami krwi postępuje się zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa dla próbek pobranych od ludzi. Próbki krwi pobiera się w regionalnym banku krwi, gdzie pobiera się je za pomocą roztworu dekstrozy fosforanu cytrynianu (CPD). Jednak krew pobrana z innymi antykoagulantami, takimi jak heparyna sodowa, heparyna litowa lub EDTA, może być również wykorzystana w tym protokole28,29.

1. Izolacja ludzkich monocytów i różnicowanie do makrofagów

  1. Pobrać antykoagulowaną krew od pozbawionych cech identyfikacyjnych zdrowych osób w regionalnym banku krwi i wyizolować komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), jak wskazano poniżej.
    UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych. Używaj tylko sterylnych probówek i noś rękawiczki. Dodaj 10% wybielacza do wszystkich produktów związanych z krwią podczas wyrzucania. Sterylny PBS (1x) lub DPBS (bez Ca2+ i Mg2+) mogą być stosowane zamiennie.
    1. Przygotować bufor rozcieńczający: Uzupełnij 1x sterylny PBS z 2% FBS i 0,5 mM EDTA.
    2. Przygotuj pożywkę hodowlaną: Uzupełnij pożywkę RPMI-1640 o FBS (10% (v/v)), glutamax (2 mM) i penicylinę/streptomycynę (50 I.U./50 μg/ml)
    3. Wstępnie schłodzić uruchomiony bufor (tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
    4. Rozcieńczyć krew pełną dwiema objętościami buforu rozcieńczającego. Za pomocą pipety serologicznej przenieść 15 ml krwi przeciwzakrzepowej do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml buforu rozcieńczającego. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.
    5. Na każde 10 ml krwi pełnej lub 30 ml rozcieńczonej krwi dodać 15 ml pożywki o gradiencie gęstości do pustej probówki o pojemności 50 ml.
    6. Na pożywkę o gradiencie gęstości z kroku 1.1.5 nałożyć 30 ml rozcieńczonej krwi powoli i równomiernie, używając pipety serologicznej o pojemności 25 ml. Przytrzymać końcówkę pipety przy ściance probówki, a rurkę pod kątem nachylonym.
    7. Ostrożnie przenieś probówki do wirówki z wahadłowym wiadrem. Unikaj zakłócania obu faz. Odwirować probówki o sile 400 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 25 minut z przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na wartość minimalną.
    8. Ostrożnie usunąć wierzchnią (przezroczystą) warstwę osocza za pomocą pipety o pojemności 10 ml i wyrzucić do pojemnika z wybielaczem (10%).
    9. Zebrać warstwę interfazową (białą) komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs, Ryc. 2) za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieść do świeżej probówki o pojemności 50 ml. Połącz białą warstwę z różnych probówek tego samego dawcy w probówce o pojemności 50 ml do 30 ml.
    10. Doprowadzić każdą probówkę do całkowitej objętości 50 ml za pomocą buforu rozcieńczającego z kroku 1.1.1 i odwirować przy 300 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml i umieścić go w pojemniku z wybielaczem (10%).
    11. Zawiesić każdą osadkę komórkową w 1 ml wstępnie schłodzonego buforu do pracy z kroku 1.1.3 za pomocą mikropipety p1000. Połącz zawiesiny komórek od tego samego dawcy w nowej probówce o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość każdej probówki do 15 ml za pomocą wstępnie schłodzonego buforu i dobrze wymieszać przez odwrócenie.
    12. Pobrać 20 μl porcji zawiesiny komórek z kroku 1.1.11 i przygotować rozcieńczenie 1:100 przy użyciu 1x sterylnego PBS. Określ numer komórki za pomocą hemocytometru.
    13. Odwirować zawiesinę komórek z etapu 1.1.11 w temperaturze 300 x g i w temperaturze 4 °C przez 10 minut i usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml. W razie potrzeby użyj mikropipety p200, aby całkowicie usunąć supernatant.
    14. Ponownie zawiesić wyizolowane PBMC w 80 μl wstępnie schłodzonego bufora roboczego MACS dla każdej 1 x 107 komórek, dodając do maksymalnej ilości 800 μl buforu.
    15. Dodaj 20 μl anty-ludzkich mikrokulek CD14 na każdą 1 x 107 komórek lub do 100 μl na próbkę krwi (~100 ml nierozcieńczonej krwi). Dobrze wymieszać przez odwrócenie i umieścić na rotatorze rurowym na 20 minut z ciągłym mieszaniem w temperaturze 4 °C.
    16. Wyjąć próbki z rotatora probówek, dodać 10 ml wstępnie schłodzonego buforu do każdej probówki i odwirować przy 300 x g (przyspieszenie = 5, opóźnienie = 5) i temperaturze 4 °C przez 10 minut.
    17. Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml i ponownie zawiesić do 1 x 108 komórek w 500 μl wstępnie schłodzonego buforu roboczego (2 x 108/ml).
    18. Przeprowadzić izolację komórek CD14-dodatnich poprzez sortowanie komórek magnetycznych przy użyciu systemu ręcznego lub automatycznego (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    19. Pobrać 20 μl podwielokrotności zawiesiny komórek z kroku 1.1.18 po selekcji CD14-dodatniej i przygotować rozcieńczenie w stosunku 1:100 przy użyciu 1x sterylnego PBS. Określ liczbę komórek, licząc komórki na hemocytometrze.
    20. Odwirować komórki CD14-dodatnie przy 300 x g i RT przez 10 minut. Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml lub systemu próżniowego.
    21. Zawiesić osad komórkowy z etapu 1.1.20 we wstępnie podgrzanej pożywce hodowlanej z etapu 1.1.2 do końcowej gęstości komórek 1 x 10 7 komórek/ml.
  2. Wysiewaj izolowane monocyty CD14-dodatnie o gęstości komórek 5 x 106 komórek.
    1. Na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej dodać 10 ml pożywki hodowlanej z etapu 1.1.2 uzupełnionej 50 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF).
    2. Dodać kroplami 0,5 ml zawiesiny komórkowej z kroku 1.1.21 do pożywki hodowlanej i delikatnie zamieszać płytkę. Inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2) przez noc.
    3. Następnego dnia odessaj pożywkę za pomocą systemu próżniowego, aby usunąć komórki, które nie przyczepiły się przez noc. Dodać 10 ml świeżej pożywki z dodatkiem GM-CSF (50 ng / ml) i inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2) przez 7 dni, aby umożliwić pełne różnicowanie (patrz Rysunek 3A dla pojawienia się monocytów CD14 + na różnych etapach różnicowania w GM-CSF ). Wymieniaj pożywkę co 2-3 dni i za każdym razem uzupełniaj świeżym GM-CSF (50 ng / ml).

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schematyczny przegląd eksperymentalnego przepływu pracy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie komponentów do elektroporacji

UWAGA: Ten protokół jest przeznaczony dla końcówki 10 μL-Neon (Tabela Materiałów). Do każdej transfekcji użyj 1-2 x 105 komórek. Zaleca się wysiewanie transfekowanych komórek na 48-dołkowej płytce lub 8-dołkowym naczyniu komorowym (10 μL-transfekowanych komórek na studzienkę). 1x sterylny DPBS (bez Ca2+ i Mg2+) może być stosowany zamiast PBS.

  1. W dniu 7 przygotuj pożywkę wolną od antybiotyków, uzupełniając pożywkę RPMI-1640 FBS (10% (v/v)) i glutamax (2 mM).
  2. Umieść pożywkę RPMI-1640 bez surowicy, roztwór trypsyny-EDTA (0,25%), 1x sterylny PBS (bez Ca2+ i Mg2+) i kompletną pożywkę hodowlaną z kroku 1.1.2 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Jeśli używasz naczyń ze szklanym dnem (do mikroskopii konfokalnej), pokryj naczynia bromowodorkiem poli-D-lizyny.
    1. Pokryj naczynie z 8 studniami komorowymi 200 μl bromowodorku poli-D-lizyny (0,1 mg / ml w 1x sterylnym PBS) i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Odessać roztwór poli-D-lizyny i raz umyć szklankę 1x sterylnym PBS. Odessać PBS i przejść do kroku 2.4.
  4. Dodać 200 μl pożywki wolnej od antybiotyków na dołek na płytkę 48-dołkową lub naczynie z 8 dołkami i wstępnie inkubować w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ) do momentu, gdy będą gotowe do pokrycia transfekowanych komórek.

3. Przygotowanie ogniw do elektroporacji

UWAGA: Wydajność MDM z 10 cm szalki pod koniec 7-dniowego okresu różnicowania wynosi około 1,5 x 106 komórek. 1x sterylny DPBS (bez Ca2+ i Mg2+) może być użyty zamiast PBS. Protokół ten został zoptymalizowany w taki sposób, aby większość makrofagów była odłączana od płytki przy zachowaniu żywotności i integralności komórek. MDM są trudne do oddzielenia od płytek do hodowli komórkowych. Dlatego może być konieczne dwukrotne wykonanie kroków 3.2 i 3.3 w celu dysocjacji komórek. Upewnij się, że czas każdej inkubacji z trypsyną-EDTA (0,25%) nie przekracza 5 minut.

  1. Odessać pożywkę z w pełni zróżnicowanych makrofagów na 10-centymetrowych szalkach i umyć monowarstwę komórek ciepłym pożywką RPMI-1640 bez surowicy. Upewnij się, że całkowicie usunąłeś nośnik.
  2. Zebrać komórki, dodając 2 ml ciepłego roztworu trypsyny-EDTA (0,25%) na 10 cm naczynie i inkubować w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2) przez 5 minut.
  3. Zakończ odłączanie komórek, delikatnie pipetując roztwór trypsyny-EDTA (0,25%) w górę iw dół na całej powierzchni naczynia za pomocą mikropipety p1000. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml ciepłej, kompletnej pożywki hodowlanej z etapu 1.1.2.
  4. Zabierz szalkę do mikroskopu jasnego pola i sprawdź, czy komórki nie odrywają się w różnych polach view. Jeśli nadal przyczepiona jest znaczna liczba komórek, powtórz kroki 3.2-3.3.
  5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 10 ml 1x sterylnego PBS podgrzanego do temperatury 37 °C. Weź podwielokrotność 20 μl, aby określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
  7. Weź 1-2 x 105 komórek na planowaną transfekcję i umieść w probówce o pojemności 15 ml. Doprowadzić do końcowej objętości 15 ml za pomocą wstępnie podgrzanego 1x sterylnego PBS. Wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Zassać PBS i odwirować jeszcze raz przez 1 minutę przy 250 x g. Usuń wszelkie pozostałości PBS z osadu komórkowego za pomocą mikropipety p200.

4. Jądro składników BiFC kaspazy do ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów

UWAGA: Ta sekcja protokołu jest wykonywana przy użyciu Systemu Transfekcji Neonów (Tabela Materiałów). Protokół ten określa kroki do transfekcji 1-2 x 105 komórek za pomocą 10 μl końcówki neonowej (tabela materiałów). Jeśli używasz końcówki Neon o pojemności 100 μl, odpowiednio zwiększ skalę. Należy unikać wystawiania komórek na działanie buforu R do respensji przez dłużej niż 15 minut, ponieważ może to zmniejszyć żywotność komórek i skuteczność transfekcji.

  1. Rozcieńczyć plazmid reporterowy (tj. mCherry lub dsRedmito w stężeniu 100 ng / μL) w wodzie wolnej od nukleaz lub 0,5 x buforze TE, aby uwidocznić transfekowane komórki.
  2. Rozcieńczyć plazmidy kaspazy BiFC do odpowiedniego stężenia w wodzie wolnej od nukleaz lub 0,5x buforze TE, tak aby całkowita objętość plazmidów nie przekraczała 30% całkowitej objętości transfekcji wynoszącej 10 μL (tj. 300 ng/μL C1 Pro-VC i 300 ng/μL C1 Pro-VN).
  3. Przygotować 1,5 ml sterylnej mikroprobówki na planowaną transfekcję i dodać odpowiednią ilość plazmidu reporterowego (tj. 50 ng lub 0,5 μl) i plazmidów kaspazy BiFC (tj. 300 ng lub 1 μl C1 Pro-VC i 300 ng lub 1 μl fragmentu C1 Pro-VN). Trzymaj mikroprobówki w okapie przez cały czas.
  4. Umieść stację pipetową, urządzenie, końcówki, rurki do elektroporacji i pipetę w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.
    UWAGA: Stacja pipet, urządzenie, końcówki, rurki do elektroporacji i pipeta są zawarte w systemie transfekcji neonu.
  5. Podłącz złącze wysokiego napięcia i czujnika w stacji pipetowania do tylnych portów urządzenia zgodnie z instrukcjami producenta. Stacja pipetowania powinna znajdować się blisko urządzenia.
  6. Podłącz przewód zasilający do tylnego gniazda prądu przemiennego i przystąp do podłączenia urządzenia do gniazdka elektrycznego. Naciśnij wyłącznik zasilania, aby włączyć urządzenie.
  7. Wprowadź parametry transfekcji na ekranie startowym wyświetlanym po włączeniu i odpowiednim podłączeniu urządzenia. Naciśnij Napięcie, wprowadź 1000 i naciśnij Gotowe, aby ustawić napięcie na 1000 V. Naciśnij Szerokość, wprowadź 40 i naciśnij Gotowe, aby ustawić czas trwania impulsu na 40 ms. Na koniec naciśnij # Impulsy, wprowadź 2 i naciśnij Gotowe, aby ustawić liczbę impulsów elektrycznych na 2.
  8. Weź jedną z probówek do elektroporacji (dołączoną do zestawu) i napełnij ją 3 ml buforu elektrolitycznego E (na końcówki o pojemności 10 μl i dostarczone w zestawie) w temperaturze pokojowej. Włóż rurkę do elektroporacji do uchwytu na pipety na stacji pipetowej. Upewnij się, że elektroda z boku rurki jest skierowana do wewnątrz i że po włożeniu rurki słychać kliknięcie.
  9. Pobrać osad komórkowy z kroku 3.8 i dodać 10 μl wstępnie podgrzanego buforu R do reprodukcji (dostarczonego w zestawie) na każde 1-2 x10,5 komórek. Delikatnie wymieszać za pomocą mikropipety p20. Dodać 10 μl zawiesiny komórek do każdej probówki ustawionej w kroku 4.3 i delikatnie wymieszać za pomocą mikropipety p20.
  10. Weź pipetę i włóż końcówkę, naciskając przycisk do drugiego oporu. Upewnij się, że zacisk całkowicie podnosi trzpień mocujący tłoka w końcówce i że nie obserwuje się żadnej szczeliny w górnej głowicy pipety.
  11. Aby zassać próbkę, naciśnij przycisk na pipecie do pierwszego oporu i zanurz w pierwszej probówce zawierającej mieszaninę DNA komórkowo-plazmidowego. Powoli zasysać mieszaninę do końcówki pipety.
    UWAGA: Unikaj pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one powodować wyładowania łukowe podczas elektroporacji, a jeśli zostaną wykryte przez urządzenie, mogą uniemożliwić dostarczenie impulsu elektrycznego. Jeśli zaobserwuje się pęcherzyki powietrza, uwolnij zawartość do probówki i spróbuj ponownie zassać.
  12. Ostrożnie włożyć pipetę z próbką do uchwytu na pipety. Upewnij się, że pipeta klika i że jest prawidłowo umieszczona.
  13. Naciśnij Start na ekranie dotykowym i poczekaj, aż zostaną dostarczone impulsy elektryczne. Na ekranie pojawi się komunikat informujący o zakończeniu.
  14. Powoli wyjąć pipetę ze stacji i natychmiast dodać transfekowaną zawiesinę komórek do odpowiedniego dołka z wstępnie podgrzaną pożywką wolną od antybiotyków z kroku 2.4, powoli naciskając przycisk do pierwszego oporu.
    UWAGA: Ta końcówka może być ponownie użyta do trzech razy dla tego samego plazmidu; w przeciwnym razie wyrzuć go do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne, naciskając przycisk do drugiego zatrzymania.
  15. Powtórzyć kroki 4.10-4.14 dla każdej probówki zawierającej mieszaninę DNA komórka/plazmid.
  16. Delikatnie kołysać płytką z transfekowanymi komórkami i inkubować przez 1-3 godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ).
  17. Dodać do każdej studzienki 200 μl wstępnie podgrzanej pożywki (kompletnej pożywki) z kroku 1.1.2. Ponownie umieścić naczynie w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ). Odczekać co najmniej 24 godziny na ekspresję genów.
  18. Następnego dnia sprawdź żywotność komórek i wydajność transfekcji za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.
    1. Włącz mikroskop epifluorescencyjny i skrzynkę fluorescencyjnego źródła światła zgodnie z instrukcjami producenta i umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu.
    2. Wybierz obiektyw 10x lub 20x i filtr 568 nm (RFP).
    3. Aby oszacować żywotność komórki, naciśnij przycisk diody LED światła przechodzącego (TL), aby wyświetlić wszystkie komórki w wybranym polu. Patrząc w okular mikroskopu, obracaj pokrętłem ostrości, aż zaobserwujesz komórki i sprawdź, czy komórki są przyczepione w wybranym polu.
      UWAGA: W pełni przyłączone komórki reprezentują żywe komórki, podczas gdy pływające komórki reprezentują komórki nieżywotne. Jeśli konfluencja studni jest wysoka, obecność nieprzyłączonych komórek może być wynikiem przeszacowania liczby komórek, a nie wynikiem niskiej żywotności. Jednak niska konfluencja, której towarzyszy wysoka zawartość pływających komórek, oznacza niską żywotność, która może wynikać z wyładowań łukowych podczas elektroporacji, toksyczności plazmidu lub nadmiernej ekspozycji na bufor R do rezawiesiny. Nie używaj studzienek, które wykazują to drugie zachowanie.
    4. Aby oszacować wydajność transfekcji, skoncentruj się na komórkach w wybranym polu w świetle przechodzącym, jak opisano powyżej. Policz łączną liczbę komórek w zaznaczonym polu. Gdy dioda LED światła przechodzącego (TL) jest wyłączona, naciśnij przycisk LED światła odbitego (RL), aby włączyć.
    5. Dokładnie skoncentruj się na fluorescencji genu reporterowego (krwinki czerwone) i policz całkowitą liczbę komórek czerwonej fluorescencji. Powtórz te kroki (4.18.4-4.18.5) dla co najmniej dwóch dodatkowych pól na studzienkę.

5. Leczenie transfekowanego MDM i akwizycji danych BiFC przez transfekowane MDM i kaspazę

UWAGA: Jeśli planujesz obrazować komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego, zaleca się leczenie qVD-OPh (20 μM) przez 1 godzinę przed leczeniem wybranym bodźcem, aby zapobiec śmierci komórek zależnej od kaspazy (głównie apoptozie). Jest to wykorzystywane w obrazowaniu, aby zapobiec unoszeniu się komórek z powodu apoptozy, co bardzo utrudnia ich obrazowanie, gdy wychodzą poza płaszczyznę ogniskową. Należy zauważyć, że rekrutacja kaspazy do platformy aktywacyjnej i związana z nią kaspaza BiFC nie jest zależna od aktywności katalitycznej kaspazy, a w konsekwencji hamowanie kaspazy nie wpłynie na ten krok.

  1. Leczyć wybranym bodźcem około 24 godziny po transfekcji i inkubować tak długo, jak jest to konieczne dla każdego leku.
    1. Przygotować pożywkę do obrazowania, uzupełniając pożywkę hodowlaną z etapu 1.1.2 Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) i 2-merkaptoetanolem (55 μM).
    2. Dodać żądane stężenie bodźca do wstępnie podgrzanego podłoża obrazowego i delikatnie wymieszać.
    3. Ostrożnie usunąć pożywkę z komórek za pomocą mikropipety p1000 i dodać 500 μl roztworu stymulującego z kroku 5.1.2 w dół po ścianie studzienki.
    4. Aby uruchomić nieoczyszczone studzienki kontrolne, dodaj pożywkę obrazową bez bodźca.
    5. Inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ) tak długo, jak jest to wskazane dla każdego zabiegu.
  2. Wizualizuj komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego.
    1. Włącz mikroskop i fluorescencyjne źródło światła, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wybierz obiektyw 10x lub 20x i umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu.
    3. Za pomocą okularu mikroskopu znajdź komórki pod filtrem 568 nm i skup się na komórkach wyrażających reporter dsRedmito/mCherry (krwinki czerwone).
    4. Policz wszystkie czerwone komórki w polu widzenia i zapisz liczbę.
    5. Będąc w tym samym polu widzenia, zmień filtr na 488 lub 512 (GFP lub YFP), przystąp do liczenia czerwonych krwinek, które są również zielone (Wenus-dodatnie lub BiFC-dodatnie) i zapisz liczbę.
    6. Policz co najmniej 100 komórek dodatnich dsRedmito/mCherry z co najmniej trzech indywidualnych pól widzenia.
    7. Oblicz procent transfekowanych komórek transfekowanych Wenus na pole widzenia i uśrednij wynikowe wartości procentowe dla każdego leczenia (dobrze), aby uzyskać odchylenie standardowe.
  3. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego
    UWAGA: Aby uzyskać obrazy konfokalne za pomocą obiektywu 20x lub większego, komórki należy pokryć szklanymi szalkami, chyba że mikroskop jest wyposażony w obiektyw długoprzepustowy.
    1. Wykonaj kroki 5.2.1-5.2.3. Jeśli używasz mikroskopu konfokalnego z obiektywem olejowym 40x, 60x lub 63x, umieść kroplę oleju na obiektywie.
    2. Wizualizuj obraz komórek na żywo na ekranie komputera uzyskany przez kamerę. Użyj epifluorescencyjnego źródła światła do obrazów fluorescencyjnych lub przełącz źródło światła na lasery, aby uzyskać obrazy konfokalne.
    3. Dostosuj ostrość i położenie komórek za pomocą joysticka sterującego i pokrętła ostrości.
    4. Ustaw procentową moc lasera i czas naświetlania dla laserów 512 nm lub 488 nm (YFP lub GFP) i 568 nm (RFP) tak, aby sygnał na obrazie wyglądał dobrze i nie osiągnął nasycenia.
    5. Włącz przechwytywanie na żywo i sprawdź wynikowy obraz. Upewnij się, że dla każdego fluoru na histogramach wyświetlacza dla obu kanałów widoczny jest wyraźny pik
      6. .
    6. W razie potrzeby dostosuj moc lasera i czas naświetlania. Utrzymuj te wartości na jak najniższym poziomie, jednocześnie będąc w stanie wykryć oba sygnały fluorescencyjne (RFP, jak i GFP/YFP).
    7. Wizualizując obraz komórek na żywo, wykonaj wiele reprezentatywnych obrazów pola, które zawiera jedną lub więcej komórek wyrażających reporter mCherry/dsRedmito dla każdego dołka płytki i zapisz dane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat pokazany w Rysunek 2 przedstawia przegląd sposobu uzyskania, transfekcji i zobrazowania ludzkiego MDM. Po inkubacji wybranych monocytów CD14+ z GM-CSF przez 7 dni, morfologia komórek zmienia się w trakcie okresu różnicowania (Rysunek 3A), przechodząc od kulistych komórek zawiesinowych do wrzecionowatych i w pełni przyczepionych (dni 3 i 4), i wreszcie do bardziej rozproszonych komórek, gdy są w pełni zróżnicowane (dzień 7). W pełni zróżnicowane komórki są następn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje przebieg pracy w celu uzyskania makrofagów z monocytów wyizolowanych z próbek ludzkiej krwi oraz metodę skutecznego wprowadzania reporterów zapalnej kaspazy BiFC do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek.

Protokół ten wykorzystuje technikę BiFC35 do oznaczania zapalnych kaspaz w domenie rekrutacji kaspazy (CARD) za pomocą niefluorescencyjnych fragmentów rozszczepionego białka fluorescencyjnego Venus. Kaspazy zapalne kodują ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy byłym i obecnym członkom laboratorium LBH, którzy przyczynili się do rozwoju tej techniki. To laboratorium jest wspierane przez NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Rysunek 2 został narysowany za pomocą oprogramowania Biorender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
48-dołkowa hodowla tkankowaPłytki 2:34Genesee Scientific25-108
10 cm Naczynia do kultur tkankowychVWR25382-166
2 Merkaptoetanol 1000xThermo Fisher Scientific21985023
8-komorowa szklana osłonowa ze szkłem nakrywkowym 1,5 HPKolumny Cellvisc8-1.5H-N
AutoMACSMiltenyi (Biotec)130-021-101Tylko do automatycznego oddzielania za pomocą separatora AutoMACS Pro AutoMACS
Pro SeparatorMiltenyi (Biotec)130-092-545Do automatycznego oddzielania tylko za pomocą separatora AutoMACS
Pro Roztwór myjący AutoMACS ProMiltenyi (Biotec)130-092-987Do automatycznego oddzielania tylko za pomocą separatora AutoMACS Pro
Roztwór płuczący AutoMACSMiltenyi (Biotec)130-091-222Tylko do automatycznego rozdzielania za pomocą separatora AutoMACS Pro
AutoMacs z buforemMiltenyi (Biotec)130-091-221Do ręcznego lub automatycznego rozdzielania za pomocą separatora QuadroMACS lub AutoMACS pro
Odwrócony mikroskop z napędem silnikowym Axio Observer Z1 wyposażony w wirujący dysk CSU-X1A 5000ZeissMożna użyć dowolnego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w moduł laserowy wyposażony w linie laserowe o długości fali 568 nm (RFP) i 488 lub 512 nm (GFP lub YFP)
AxioObserver A1, mikroskop odwrócony klasy badawczejZeissMożna zastosować dowolny mikroskop epifluorescencyjny z filtrami fluorescencyjnymi zdolnymi do wzbudzania długości fal 568 nm (RFP) i 488 lub 512 nm (GFP lub YFP)
MIKROKULKI CD14+Miltenyi (Biotec)130-050-201Do ręcznej lub automatycznej separacji za pomocą QuadroMACS lub AutoMACS pro Separator
DPBS bez chlorku wapnia i chlorku magnezuSigmaD8537-6x500ML
DsRed mito plazmidClontech632421Podobne plazmidy, które mogą być używane jako reportery fluorescencyjne, można znaleźć na Addgene
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mlSigmaGE17-1440-02
Suplement GlutaMAX (100x)Thermo Fisher Scientific35050079
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC2011
Hemin BioXtra, od świń, ≥ 96,0% (HPLC)Sigma51280-1G
HEPESThermo Fisher Scientific15630106
PlazmidyDostępne na żądanie w laboratorium LBH
LPS-EB UltrapureInvivogenTLRL-3PELPS
LS KolumnyMiltenyi (Biotec)130-042-401Tylko do ręcznej separacji za pomocą separatora QuadroMACS
MACS 15 mL Stojak na probówkiMiltenyi (Biotec)130-091-052Do ręcznej separacji tylko za pomocą separatora QuadroMACS
MACS MultiStandMiltenyi (Biotec)130-042-303Do ręcznej separacji tylko za pomocą separatora QuadroMACS
plazmid mCherryYungpeng Wang LabPodobne plazmidy, które mogą być używane jako reportery fluorescencyjne, można znaleźć w
systemie transfekcji Addgene NeonThermo Fisher ScientificMPK5000Zawiera urządzenie do elektroporacji neonów, pipetę i stację pipet
System transfekcji neonowej 10 i mikro; L KitThermo Fisher ScientificMPK1096Zawiera bufor do rezawieszania R, bufor do reszparacji T, bufor elektrolityczny E, 96 x 10 i mikro; L Neonowe końcówki i neonowe rurki do elektroporacji
Nigerycyna sól sodowa, gotowy roztwórSigmaSML1779-1ML
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140122
Bromowodorek poli-D-lizynySigmaP7280-5mg
Separator QuadroMACSMiltenyi (Biotec)130-090-976Do ręcznej separacji za pomocą Tylko separator QuadroMACS
qVD-OPhFisher (ApexBio)50-101-3172
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875119
Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific25200072
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Oprogramowanie Thermo Fisher Scientific15575020
Zeiss Zen 2.6 (edycja niebieska)ZeissDowolne oprogramowanie używane do obsługi wybranego mikroskopu konfokalnego
kaspazy zapalnej BiFC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  2. Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
  3. Boice, A., Bouchier-Hayes, L. Targeting apoptotic caspases in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688(2020).
  4. Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease. The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).
  5. Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117 (5), 561-574 (2004).
  6. Lamkanfi, M., Vishva, M. D. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).
  7. Viganò, E., et al. Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes. Nature Communications. 6, 8761(2015).
  8. Cerretti, D. P., et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256 (5053), 97(1992).
  9. van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection. Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).
  10. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  11. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).
  12. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  13. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  14. Bertin, J., DiStefano, P. S. The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins. Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).
  15. Agostini, L., et al. NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).
  16. Bürckstümmer, T., et al. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).
  17. Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).
  18. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  19. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  20. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  21. Bolívar, B. E., et al. Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death. The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).
  22. Schmid-Burgk, J. L., et al. Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).
  23. Baker, P. J., et al. NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5. European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).
  24. Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis. Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).
  25. Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death & Disease. 6, 1813(2015).
  26. Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316(2018).
  27. Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
  28. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
  29. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).
  30. Perregaux, D., et al. IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin. The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).
  31. Cheneval, D., et al. Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing. Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).
  32. Fernandes-Alnemri, T., et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).
  33. Lu, A., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
  34. Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases. Blood. 32 (5), 811-815 (1968).
  35. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
  36. Thornberry, N. A., et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
  37. Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).
  38. Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).
  39. Bhowmik, P., et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 8 (1), 6502(2018).
  40. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).
  41. Kurokawa, M., Kornbluth, S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 138 (5), 838-854 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywacja kaspazBiFC kaspazwizualizacja inflamasomutechnika nukleofekcjimikroskopia konfokalnaindukcja piroptozydojrzewanie cytokinmikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły