Artykuł metodologiczny

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

DOI:

10.3791/63162

⸱

6 kwietnia 2022

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaspazy zapalne obejmują kaspazy-1, -4, -5, -11 i -12 i należą do podgrupy kaspaz inicjujących. Kaspaza-1 jest niezbędna do zapewnienia prawidłowej regulacji sygnalizacji zapalnej i jest aktywowana przez dimeryzację indukowaną bliskością po rekrutacji do inflamasomów. Kaspaza-1 występuje obficie w linii komórek monocytowych i indukuje dojrzewanie cytokin prozapalnych interleukiny (IL)-1β i IL-18 do aktywnych wydzielanych cząsteczek. Inne zapalne kaspazy, kaspaza-4 i -5 (oraz ich mysi homolog kaspaza-11) promują uwalnianie IL-1β poprzez indukowanie piroptozy. Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji kaspazy (BiFC) jest narzędziem używanym do pomiaru bliskości indukowanej zapalną kaspazą jako odczytu aktywacji kaspazy. Prodomena kaspazy-1, -4 lub -5, która zawiera region wiążący się z inflamasomem, jest połączona z niefluorescencyjnymi fragmentami żółtego białka fluorescencyjnego Wenus (Venus-N [VN] lub Venus-C [VC]), które łączą się w celu zreformowania fluorescencyjnego kompleksu Wenus, gdy kaspazy ulegają indukowanej bliskości. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić te reportery do pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) za pomocą nukleofekcji, leczyć komórki w celu wywołania aktywacji zapalnej kaspazy i mierzyć aktywację kaspazy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej. Zaletą tego podejścia jest to, że można je wykorzystać do identyfikacji składników, wymagań i lokalizacji kompleksu aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach. Należy jednak rozważyć staranne kontrole, aby uniknąć pogorszenia żywotności i zachowania komórek. Technika ta jest potężnym narzędziem do analizy dynamicznych interakcji kaspazy na poziomie inflamasomów, a także do badania kaskad sygnalizacji zapalnej w żywych MDM i monocytach pochodzących z próbek krwi ludzkiej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaspazy to rodzina proteaz asparaginianu cysteiny, które można podzielić na kaspazy inicjujące i katestowe. Kaspazy egzekucyjne składają się z kaspazy-3, -6 i -7. Naturalnie występują w komórkach jako dimery i są rozszczepiane przez kaspazy inicjatora w celu wykonania apoptozy1. Kaspazy inicjujące obejmują ludzką kaspazę-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 i -12. Występują jako nieaktywne zymogeny (pro-kaspazy), które są aktywowane przez dimeryzację indukowaną bliskością i stabilizowane przez autoproteolityczne rozszczepienie2,3. Kaspazy zapalne są podzbiorem kaspaz inicjujących

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etyki badań na ludziach Baylor College of Medicine dotyczącej manipulacji próbkami ludzkimi. Z próbkami krwi postępuje się zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa dla próbek pobranych od ludzi. Próbki krwi pobiera się w regionalnym banku krwi, gdzie pobiera się je za pomocą roztworu dekstrozy fosforanu cytrynianu (CPD). Jednak krew pobrana z innymi antykoagulantami, takimi jak heparyna sodowa, heparyna litowa lub EDTA, może być również wykorzystana w tym protokole28,29.

1. Izolacja ludzkich monocytów i róż....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat pokazany w Rysunek 2 przedstawia przegląd sposobu uzyskania, transfekcji i zobrazowania ludzkiego MDM. Po inkubacji wybranych monocytów CD14+ z GM-CSF przez 7 dni, morfologia komórek zmienia się w trakcie okresu różnicowania (Rysunek 3A), przechodząc od kulistych komórek zawiesinowych do wrzecionowatych i w pełni przyczepionych (dni 3 i 4), i wreszcie do bardziej rozproszonych komórek, gdy są w pełni zróżnicowane (dzień 7). W pełni zróżnicowane komórki są następn.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje przebieg pracy w celu uzyskania makrofagów z monocytów wyizolowanych z próbek ludzkiej krwi oraz metodę skutecznego wprowadzania reporterów zapalnej kaspazy BiFC do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek.

Protokół ten wykorzystuje technikę BiFC35 do oznaczania zapalnych kaspaz w domenie rekrutacji kaspazy (CARD) za pomocą niefluorescencyjnych fragmentów rozszczepionego białka fluorescencyjnego Venus. Kaspazy zapalne kodują .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy byłym i obecnym członkom laboratorium LBH, którzy przyczynili się do rozwoju tej techniki. To laboratorium jest wspierane przez NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Rysunek 2 został narysowany za pomocą oprogramowania Biorender.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
48-dołkowa hodowla tkankowaPłytki 2:34Genesee Scientific25-108
10 cm Naczynia do kultur tkankowychVWR25382-166
2 Merkaptoetanol 1000xThermo Fisher Scientific21985023
8-komorowa szklana osłonowa ze szkłem nakrywkowym 1,5 HPKolumny Cellvisc8-1.5H-N
AutoMACSMiltenyi (Biotec)130-021-101Tylko do automatycznego oddzielania za pomocą separatora AutoMACS Pro AutoMACS
Pro SeparatorMiltenyi (Biotec)130-092-545Do automatycznego oddzielania tylko za pomocą separatora AutoMACS
Pro Roztwór myjący AutoMACS ProMiltenyi (Biotec)130-092-987Do automatycznego oddzielania tylko za pomocą separatora AutoMACS Pro
Roztwór płuczący AutoMACSMiltenyi (Biotec)130-091-222Tylko do automatycznego rozdzielania za pomocą separatora AutoMACS Pro
AutoMacs z buforemMiltenyi (Biotec)130-091-221Do ręcznego lub automatycznego rozdzielania za pomocą separatora QuadroMACS lub AutoMACS pro
Odwrócony mikroskop z napędem silnikowym Axio Observer Z1 wyposażony w wirujący dysk CSU-X1A 5000ZeissMożna użyć dowolnego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w moduł laserowy wyposażony w linie laserowe o długości fali 568 nm (RFP) i 488 lub 512 nm (GFP lub YFP)
AxioObserver A1, mikroskop odwrócony klasy badawczejZeissMożna zastosować dowolny mikroskop epifluorescencyjny z filtrami fluorescencyjnymi zdolnymi do wzbudzania długości fal 568 nm (RFP) i 488 lub 512 nm (GFP lub YFP)
MIKROKULKI CD14+Miltenyi (Biotec)130-050-201Do ręcznej lub automatycznej separacji za pomocą QuadroMACS lub AutoMACS pro Separator
DPBS bez chlorku wapnia i chlorku magnezuSigmaD8537-6x500ML
DsRed mito plazmidClontech632421Podobne plazmidy, które mogą być używane jako reportery fluorescencyjne, można znaleźć na Addgene
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mlSigmaGE17-1440-02
Suplement GlutaMAX (100x)Thermo Fisher Scientific35050079
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC2011
Hemin BioXtra, od świń, ≥ 96,0% (HPLC)Sigma51280-1G
HEPESThermo Fisher Scientific15630106
PlazmidyDostępne na żądanie w laboratorium LBH
LPS-EB UltrapureInvivogenTLRL-3PELPS
LS KolumnyMiltenyi (Biotec)130-042-401Tylko do ręcznej separacji za pomocą separatora QuadroMACS
MACS 15 mL Stojak na probówkiMiltenyi (Biotec)130-091-052Do ręcznej separacji tylko za pomocą separatora QuadroMACS
MACS MultiStandMiltenyi (Biotec)130-042-303Do ręcznej separacji tylko za pomocą separatora QuadroMACS
plazmid mCherryYungpeng Wang LabPodobne plazmidy, które mogą być używane jako reportery fluorescencyjne, można znaleźć w
systemie transfekcji Addgene NeonThermo Fisher ScientificMPK5000Zawiera urządzenie do elektroporacji neonów, pipetę i stację pipet
System transfekcji neonowej 10 i mikro; L KitThermo Fisher ScientificMPK1096Zawiera bufor do rezawieszania R, bufor do reszparacji T, bufor elektrolityczny E, 96 x 10 i mikro; L Neonowe końcówki i neonowe rurki do elektroporacji
Nigerycyna sól sodowa, gotowy roztwórSigmaSML1779-1ML
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140122
Bromowodorek poli-D-lizynySigmaP7280-5mg
Separator QuadroMACSMiltenyi (Biotec)130-090-976Do ręcznej separacji za pomocą Tylko separator QuadroMACS
qVD-OPhFisher (ApexBio)50-101-3172
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875119
Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific25200072
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Oprogramowanie Thermo Fisher Scientific15575020
Zeiss Zen 2.6 (edycja niebieska)ZeissDowolne oprogramowanie używane do obsługi wybranego mikroskopu konfokalnego
kaspazy zapalnej BiFC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  2. Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Caspase ActivationCaspase BiFCInflammasome VisualizationNucleofection TechniqueConfocal MicroscopyPyroptosis InductionCytokine MaturationFluorescence Microscopy

Powiązane artykuły