Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63162

⸱

6 kwietnia 2022

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Streszczenie

Kaspazy zapalne obejmują kaspazy-1, -4, -5, -11 i -12 i należą do podgrupy kaspaz inicjujących. Kaspaza-1 jest niezbędna do zapewnienia prawidłowej regulacji sygnalizacji zapalnej i jest aktywowana przez dimeryzację indukowaną bliskością po rekrutacji do inflamasomów. Kaspaza-1 występuje obficie w linii komórek monocytowych i indukuje dojrzewanie cytokin prozapalnych interleukiny (IL)-1β i IL-18 do aktywnych wydzielanych cząsteczek. Inne zapalne kaspazy, kaspaza-4 i -5 (oraz ich mysi homolog kaspaza-11) promują uwalnianie IL-1β poprzez indukowanie piroptozy. Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji kaspazy (BiFC) jest narzędziem używanym do pomiaru bliskości indukowanej zapalną kaspazą jako odczytu aktywacji kaspazy. Prodomena kaspazy-1, -4 lub -5, która zawiera region wiążący się z inflamasomem, jest połączona z niefluorescencyjnymi fragmentami żółtego białka fluorescencyjnego Wenus (Venus-N [VN] lub Venus-C [VC]), które łączą się w celu zreformowania fluorescencyjnego kompleksu Wenus, gdy kaspazy ulegają indukowanej bliskości. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić te reportery do pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) za pomocą nukleofekcji, leczyć komórki w celu wywołania aktywacji zapalnej kaspazy i mierzyć aktywację kaspazy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej. Zaletą tego podejścia jest to, że można je wykorzystać do identyfikacji składników, wymagań i lokalizacji kompleksu aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach. Należy jednak rozważyć staranne kontrole, aby uniknąć pogorszenia żywotności i zachowania komórek. Technika ta jest potężnym narzędziem do analizy dynamicznych interakcji kaspazy na poziomie inflamasomów, a także do badania kaskad sygnalizacji zapalnej w żywych MDM i monocytach pochodzących z próbek krwi ludzkiej.

Wprowadzenie

Kaspazy to rodzina cysteinowych proteaz aspartatowych, które można podzielić na kaspazy inicjujące i kaspazy wykonawcze. Kaspazy wykonawcze obejmują kaspazę-3, -6 i -7. Występują one naturalnie w komórkach jako dimery i są rozszczepiane przez kaspazy inicjujące w celu przeprowadzenia apoptozy1. Do kaspaz inicjujących należą ludzkie kaspazy-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 i -12. Występują one w formie nieaktywnych zymogenów (prokaspaz), które są aktywowane poprzez indukowaną bliskością dimeryzację i stabilizowane przez autoproteolityczne rozszczepienie2,3. Kaspazy zapalne stanowią podgrupę kaspaz inicjujących2 i obejmują kaspazy-1, -4, -5 i -12 u ludzi oraz kaspazy-1, -11 i -12 u myszy4,5. Zamiast roli apoptotycznej, pełnią one centralną rolę w procesach zapalnych. Mediują one proteolityczne przetwarzanie i sekrecję prointerleukiny (IL)-1β oraz pro-IL-186,7, które są pierwszymi cytokinami uwalnianymi w odpowiedzi na patogeny8,9. Kaspaza-1 jest aktywowana po rekrutacji do swojej platformy aktywacyjnej; wielkocząsteczkowego kompleksu białkowego zwanego inflamasomem (Ryc. 1A)10. Dimeryzacja kaspazy-4, -5 i -11 zachodzi niezależnie od tych platform poprzez niekanoniczną drogę inflamasomu11,12.

Kanoniczne inflamasomy są cytozolowymi multimerycznymi kompleksami białkowymi, które składają się z białka sensora inflamasomu, białka adaptorowego ASC (białko apoptozy-związane, przypominające plamkę, zawierające domenę CARD) oraz białka efektorowego kaspazy-110. Najlepiej przebadanymi kanonicznymi inflamasomami są białka z rodziny receptorów NOD-podobnych zawierające domenę pyrynową (NLRP), mianowicie NLRP1 i NLRP3, białka z rodziny NLR zawierające domenę CARD (NLRC), czyli NLRC4, oraz białko AIM2 (absent in melanoma 2). Każde z nich zawiera domenę pyrynową, domenę CARD lub obie te domeny. Domena CARD pośredniczy w oddziaływaniu pomiędzy kaspazami zawierającymi domenę CARD a ich aktywatorami znajdującymi się powyżej w kaskadzie sygnałowej. W związku z tym cząsteczka rusztowania ASC, składająca się z N-końcowej domeny pyrynowej (PYD) i C-końcowego motywu CARD13,14, jest niezbędna do rekrutacji kaspazy-1 do inflamasomów NLRP110, NLRP315 oraz AIM216.

Każdy inflamasom jest nazwany od swojego unikalnego białka sensorowego, które rozpoznaje odrębne bodźce prozapalne (Rycina 1B). Aktywatory tej ścieżki określa się mianem bodźców kanonicznych. Inflamasomy służą jako sensory komponentów mikrobiologicznych oraz stresu tkankowego i montują się, aby wywołać silną odpowiedź zapalną poprzez aktywację kaspaz zapalnych17. Montaż inflamasomu inicjuje aktywację kaspazy-1, która pośredniczy w dojrzewaniu i sekrecji jej głównych substratów: pro-IL-1β oraz pro-IL-18. Proces ten zachodzi w ramach dwuetapowego mechanizmu. Najpierw bodziec inicjujący (priming) zwiększa ekspresję określonych białek inflamasomu oraz pro-IL-1β poprzez aktywację ścieżki NF-κB. Następnie wewnątrzkomórkowy (kanoniczny) bodziec indukuje montaż inflamasomu i rekrutację prokaspazy-16,7.

Kaspaza-4 i kaspaza-5 są ludzkimi ortologami mysiej kaspazy-1111. Są one aktywowane w sposób niezależny od inflamasomu przez wewnątrzkomórkowy lipopolisaryd (LPS), cząsteczkę występującą w zewnętrznej błonie bakterii Gram-ujemnych18,19,20, oraz przez zewnątrzkomórkowy hem, produkt hemolizy erytrocytów21. Przypuszcza się, że LPS wiąże się bezpośrednio z motywem CARD tych białek i indukuje ich oligomeryzację20. Aktywacja kaspazy-4 lub kaspazy-5 promuje uwalnianie IL-1β poprzez indukcję zapalnej formy śmierci komórkowej nazywanej piroptozą, co następuje poprzez rozszczepienie białka tworzącego pory, gasderminy D (GSDMD)18,19. Ponadto odpływ jonów potasu wynikający z piroptotycznej śmierci zależnej od kaspazy-4 i GSDMD indukuje aktywację inflamasomu NLRP3 i następującą po niej aktywację kaspazy-122,23. Zatem kaspazy-4, -5 i -11 są uważane za wewnątrzkomórkowe sensory LPS, które są zdolne do indukowania piroptozy i aktywacji kaspazy-1 w odpowiedzi na specyficzne bodźce11,24.

Bimolekularna komplementacja fluorescencji kaspazy, receptory inflamasomu, schemat oddziaływań białkowych.
Rysunek 1: Kaspazy zapalne i test bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kaspazy. (A) Schemat przedstawiający system kaspazy-BiFC, w którym dwie prodomeny kaspazy-1 (C1-pro) połączone z każdym z niefluorescencyjnych fragmentów białka Venus (Venus-C lub Venus-N) są rekrutowane do platformy aktywacji NLRP3, co wymusza ponowne sfałdowanie i fluorescencję białka Venus. Kompleks ten pojawia się jako zielona plamka pod mikroskopem i służy jako odczyt bliskości indukowanej przez kaspazy zapalne, co stanowi pierwszy etap aktywacji kaspazy inicjującej. (B) Schemat przedstawiający organizację domen komponentów inflamasomu i kaspaz zapalnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Pomiar aktywacji specyficznych kaspaz inicjatorowych jest trudny, a dostępnych jest niewiele metod umożliwiających jego przeprowadzenie za pomocą technik obrazowania. Metoda bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kaspaz może być wykorzystana do bezpośredniej wizualizacji aktywacji kaspaz zapalnych w żywych komórkach (Rysunek 1A)25. Technika ta została niedawno dostosowana do zastosowania w makrofagach pochodzących z ludzkich monocytów (MDM)21. Caspase BiFC mierzy pierwszy etap aktywacji kaspaz zapalnych, polegający na indukowanym zbliżeniu w celu ułatwienia dimeryzacji. Wykorzystuje się ekspresję plazmidów kodujących prodomenę kaspazy zawierającą domenę CARD, połączoną z niefluorescencyjnymi fragmentami fotostabilnego żółtego białka fluorescencyjnego Venus (Venus-C [VC] oraz Venus-N [VN]). Gdy dwie prodomeny kaspaz zostaną przyciągnięte do swojej platformy aktywacyjnej lub ulegną indukowanemu zbliżeniu, dwie połowy białka Venus zostają sprowadzone w bliskie sąsiedztwo, co wymusza ich ponowne sfałdowanie i emisję fluorescencji (patrz Rysunek 1A,B). Pozwala to na odczyt aktywacji specyficznych kaspaz zapalnych w czasie rzeczywistym.

Ludzkie MDM obficie wykazują ekspresję genów inflamasomu oraz receptorów rozpoznawania wzorców, które identyfikują sygnały zagrożenia i produkty patogenów. Stanowi to idealny typ komórek do badania szlaków zapalnych kaspaz. Dodatkowo mogą być one pozyskiwane z krwi obwodowej, a nawet z próbek pobranych od pacjentów, aby ocenić aktywację zapalnych kaspaz w konkretnym stanie chorobowym. Niniejszy protokół opisuje sposób wprowadzania reporterów kaspaz BiFC do MDM za pomocą nukleofekcji, czyli metody transfekcji opartej na elektroporacji, sposób traktowania komórek w celu indukcji aktywacji zapalnych kaspaz oraz sposób wizualizacji aktywnych kompleksów kaspaz przy użyciu metod mikroskopowych. Ponadto metodologia ta może zostać dostosowana do określenia składu molekularnego tych kompleksów, ich lokalizacji subkomórkowej, kinetyki oraz rozmiaru tych wysoko uporządkowanych struktur25,26,27.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi komitetu etyki badań nad ludźmi Baylor College of Medicine w zakresie manipulacji próbkami pochodzenia ludzkiego. Próbki krwi są przetwarzane zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi bezpieczeństwa dotyczącymi próbek ludzkich. Próbki krwi pozyskiwano z regionalnego banku krwi, gdzie zostały pobrane z zastosowaniem roztworu cytrynian-fosforan-deksytronu (CPD). Do realizacji niniejszego protokołu można jednak wykorzystać również krew pobraną z użyciem innych przeciwkrzepliwych środków, takich jak heparyna sodu, heparyna litu lub EDTA28,29.

1. Izolacja ludzkich monocytów i różnicowanie ich w makrofagi

  1. Pozyskać krew z antykoagulantem od zanonimizowanych zdrowych dawców z regionalnego banku krwi i wyizolować mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) zgodnie z poniższymi instrukcjami.
    UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzić w laminarnym dygestorium do hodowli tkankowych. Należy używać wyłącznie sterylnych probówek i nosić rękawiczki. Podczas utylizacji do wszystkich produktów związanych z krwią należy dodać 10% roztworu wybielacza. Sterylny PBS (1x) lub DPBS (bez Ca2+ i Mg2+) można stosować zamiennie.
    1. Przygotować bufor do rozcieńczania: uzupełnić sterylny PBS (1x) o 2% FBS i 0,5 mM EDTA.
    2. Przygotować pożywkę hodowlaną: uzupełnić pożywkę RPMI-1640 o FBS (10% (v/v)), glutamax (2 mM) oraz penicylinę/streptomycynę (50 I.U./50 µg/mL).
    3. Schłodzić bufor do prowadzenia (Tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
    4. Rozcieńczyć krew pełną dwiema objętościami buforu do rozcieńczania. Za pomocą pipety serologicznej przenieść 15 mL krwi z antykoagulantem do probówki 50 mL zawierającej 30 mL buforu do rozcieńczania. Mieszać delikatnie poprzez odwracanie.
    5. Na każde 10 mL krwi pełnej lub 30 mL krwi rozcieńczonej dodać 15 mL medium do gradientu gęstości do pustej probówki 50 mL.
    6. Na medium do gradientu gęstości z kroku 1.1.5 powoli i miarowo nanieść 30 mL rozcieńczonej krwi, używając pipety serologicznej 25 mL. Trzymać końcówkę pipety przy ściance probówki, a probówkę pod kątem.
    7. Ostrożnie przenieść probówki do wirówki z koszyczkami wahadłowymi. Unikać zaburzania dwóch faz. Wirować probówki przy 400 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 25 min, ustawiając przyspieszenie i hamowanie na wartości minimalne.
    8. Ostrożnie usunąć górną (przezroczystą) warstwę osocza za pomocą pipety 10 mL i zutylizować w pojemniku z wybielaczem (10%).
    9. Zebrać interfazową (białą) warstwę mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMCs, Rycina 2) za pomocą pipety 10 mL i przenieść do nowej probówki 50 mL. Łączyć białe warstwy z różnych probówek tego samego dawcy w probówce 50 mL do objętości 30 mL.
    10. Uzupełnić każdą probówkę buforem do rozcieńczania z kroku 1.1.1 do całkowitej objętości 50 mL i wirować przy 300 x g i 4 °C przez 10 min. Usunąć nadsącz pipetą 10 mL i zutylizować w pojemniku z wybielaczem (10%).
    11. Resuspendować każdy osad komórkowy w 1 mL schłodzonego buforu do prowadzenia z kroku 1.1.3 za pomocą mikropipety p1000. Łączyć zawiesiny komórkowe od tego samego dawcy w nowej probówce 15 mL. Doprowadzić objętość w każdej probówce do 15 mL za pomocą schłodzonego buforu do prowadzenia i dobrze wymieszać poprzez odwracanie.
    12. Pobrać 20 µL alikwot zawiesiny komórkowej z kroku 1.1.11 i przygotować rozcieńczenie 1:100 w sterylnym PBS (1x). Określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
    13. Wirować zawiesinę komórkową z kroku 1.1.11 przy 300 x g i 4 °C przez 10 min i usunąć nadsącz pipetą 10 mL. W razie potrzeby użyć mikropipety p200, aby całkowicie usunąć nadsącz.
    14. Resuspendować wyizolowane PBMCs w 80 µL schłodzonego buforu do prowadzenia MACS na każde 1 x 107 komórek, dodając maksymalnie 800 µL buforu.
    15. Dodać 20 µL MicroBeads anty-CD14 dla ludzi na każde 1 x 107 komórek lub do 100 µL na próbkę krwi (~100 mL krwi nierozcieńczonej). Dobrze wymieszać poprzez odwracanie i inkubować na rotatorze do probówek przez 20 min przy ciągłym mieszaniu w 4 °C.
    16. Zdjąć próbki z rotatora, dodać 10 mL schłodzonego buforu do prowadzenia do każdej probówki i wirować przy 300 x g (przyspieszenie = 5, hamowanie = 5) i 4 °C przez 10 min.
    17. Usunąć nadsącz pipetą 10 mL i resuspendować do 1 x 108 komórek w 500 µL schłodzonego buforu do prowadzenia (2 x 108/mL).
    18. Przeprowadzić izolację komórek CD14-dodatnich metodą magnetycznej separacji komórek za pomocą systemu ręcznego lub zautomatyzowanego (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    19. Pobrać 20 µL alikwot zawiesiny komórkowej z kroku 1.1.18 po selekcji komórek CD14-dodatnich i przygotować rozcieńczenie 1:100 w sterylnym PBS (1x). Określić liczbę komórek poprzez ich zliczenie na hemocytometrze.
    20. Wirować komórki CD14-dodatnie przy 300 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 min. Usunąć nadsącz za pomocą pipety 10 mL lub systemu próżniowego.
    21. Resuspendować osad komórkowy z kroku 1.1.20 w podgrzanej pożywce hodowlanej z kroku 1.1.2 do końcowej gęstości komórek 1 x 107 komórek/mL.
  2. Wysiać wyizolowane monocyty CD14-dodatnie przy gęstości 5 x 106 komórek.
    1. Na szalkę do hodowli tkankowych 10 cm nalać 10 mL pożywki hodowlanej z kroku 1.1.2 uzupełnionej o 50 ng/mL czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF).
    2. Do pożywki hodowlanej dodać kroplami 0,5 mL zawiesiny komórkowej z kroku 1.1.2 i delikatnie zakręcić szalką. Inkubować komórki w nawilżanym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2) przez noc.
    3. Następnego dnia odessać pożywkę za pomocą systemu próżniowego, aby usunąć komórki, które nie przytwierdziły się w ciągu nocy. Dodać 10 mL świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej o GM-CSF (50 ng/mL) i inkubować komórki w nawilżanym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2) przez 7 dni, aby umożliwić pełne różnicowanie (wygląd monocytów CD14+ na różnych etapach różnicowania w GM-CSF przedstawiono na Rycina 3A). Wymieniać pożywkę hodowlaną co 2-3 dni, za każdym razem uzupełniając ją świeżym GM-CSF (50 ng/mL).

Izolacja i różnicowanie monocytów CD14+; proces nukleofekcji; obrazowanie fluorescencyjne.
Rysunek 2: Schematyczny przegląd przebiegu eksperymentu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie komponentów do elektroporacji

UWAGA: Niniejszy protokół jest przeznaczony dla końcówki do systemu Neon o pojemności 10 µL (Tabela materiałów). Do każdej transfekcji należy użyć 1-2 x 105 komórek. Zaleca się wysiewanie transfekowanych komórek na płytkę 48-dołkową lub do naczynia z 8 komorami (10 µL transfekowanych komórek na dołek). Zamiast PBS można zastosować 1x sterylni DPBS (bez Ca2+ i Mg2+).

  1. W dniu 7. przygotować pożywkę bez antybiotyków, uzupełniając pożywkę RPMI-1640 o FBS (10 % (v/v)) oraz glutamax (2 mM).
  2. Umieścić pożywkę RPMI-1640 bez surowicy, roztwór trypsyny-EDTA (0,25%), 1x sterylny PBS (bez Ca2+ i Mg2+) oraz kompletną pożywkę hodowlaną z kroku 1.1.2 w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. W przypadku użycia naczyń z szklanym dnem (do mikroskopii konfokalnej) pokryć naczynia poli-D-lizyną hydrobromidową.
    1. Pokryć naczynie 8-komorowe 200 µL poli-D-lizyny hydrobromidowej (0,1 mg/mL w 1x sterylnym PBS) i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    2. Odssać roztwór poli-D-lizyny i jednokrotnie przemyć szkło 1x sterylnym PBS. Odssać PBS i przejść do kroku 2.4.
  4. Dodać 200 µL pożywki bez antybiotyków do każdego dołka płytki 48-dołkowej lub naczynia 8-komorowego i inkubować w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkanek (37 °C, 5% CO2) do momentu wysiewania transfekowanych komórek.

3. Przygotowanie komórek do elektroporacji

UWAGA: Wydajność MDM z płytki 10 cm pod koniec 7-dniowego okresu różnicowania wynosi w przybliżeniu 1,5 x 106 komórek. Zamiast PBS można zastosować 1x sterylny DPBS (bez Ca2+ i Mg2+). Protokół ten został zoptymalizowany tak, aby większość makrofagów została oddzielona od płytki przy zachowaniu żywotności i integralności komórek. MDM są trudne do oddzielenia od płytek hodowlanych. W związku z tym może być konieczne dwukrotne przeprowadzenie kroków 3.2 i 3.3 w celu dysocjacji komórek. Należy upewnić się, że każdy czas inkubacji z trypsyną-EDTA (0,25%) nie przekracza 5 min.

  1. Odssać pożywkę od w pełni zróżnicowanych makrofagów w szalkach 10 cm i przemyć monowarstwę komórek ciepłym, bezzserwatkowym pożywką RPMI-1640. Należy upewnić się, że pożywka została całkowicie usunięta.
  2. Zebrać komórki, dodając 2 mL ciepłego roztworu trypsyny-EDTA (0,25%) na każdą szalkę 10 cm, a następnie inkubować w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkanek (37 °C, 5% CO2) przez 5 min.
  3. Dokończyć odrywanie komórek, delikatnie pipetując roztwór trypsyny-EDTA (0,25%) w górę i w dół na całej powierzchni szalki za pomocą mikropipety p1000. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki stożkowej 15 mL zawierającej 5 mL ciepłej, pełnej pożywki hodowlanej z kroku 1.1.2.
  4. Umieścić szalkę pod mikroskopem w polu jasnym i sprawdzić stopień odrywania komórek w różnych polach widzenia. Jeśli znaczna liczba komórek pozostaje przytwierdzona, powtórzyć kroki 3.2-3.3.
  5. Wirować zawiesinę komórkową przy 250 x g przez 5 min w RT.
  6. Odssać pożywkę i resuspendować komórki w 10 mL 1x sterylnego PBS wstępnie ogrzanego do 37 °C. Pobrać alikwot 20 µL w celu oznaczenia liczby komórek za pomocą hemocytometru.
  7. Odmierzyć 1-2 x 105 komórek na każdą planowaną transfekcję i umieścić w probówce 15 mL. Uzupełnić do końcowej objętości 15 mL wstępnie ogrzanym 1x sterylnym PBS. Wirować przy 250 x g przez 5 min w RT.
  8. Odssać PBS i wirować jeszcze raz przez 1 min przy 250 x g. Usunąć resztki PBS z osadu komórkowego za pomocą mikropipety p200.

4. Nukleofekcja komponentów BiFC dla kaspazy do makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów

UWAGA: Ta część protokołu jest wykonywana przy użyciu systemu transfekcji Neon (Tabela materiałów). Niniejszy protokół opisuje kroki niezbędne do transfekcji 1-2 x 105 komórek przy użyciu końcówki Neon 10 µL (Tabela materiałów). W przypadku użycia końcówki Neon 100 µL, należy odpowiednio zwiększyć skalę. Należy unikać wystawiania komórek na działanie buforu resuspensyjnego R przez więcej niż 15 min, ponieważ może to obniżyć żywotność komórek i wydajność transfekcji.

  1. Rozcieńczyć plazmid reporterowy (tj. mCherry lub dsRedmito w stężeniu 100 ng/µL) w wodzie wolnej od nukleaz lub w buforze TE 0,5x w celu wizualizacji transfekowanych komórek.
  2. Rozcień plazmidy BiFC dla kaspazy do odpowiedniego stężenia w wodzie wolnej od nukleaz lub buforze TE 0,5x w taki sposób, aby całkowita objętość plazmidów nie przekroczyła 30% całkowitej objętości transfekcji 10 µL (tj. 300 ng/µL C1 Pro-VC i 300 ng/µL z C1 Pro-VN).
  3. Przygotować sterylną mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml na każdą planowaną transfekcję i dodać odpowiednią ilość plazmidu reporterowego (tj. 50 ng lub 0.5 µL) oraz plazmidy BiFC dla kaspazy (tj. 300 ng lub 1 µL C1 Pro-VC oraz 300 ng lub 1 µL fragmentu C1 Pro-VN). Przechowywać mikroprobówki przez cały czas w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
  4. Umieść stanowisko pipetujące, urządzenie, końcówki, probówki do elektroporacji oraz pipetę w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    UWAGA: Stacja pipetująca, urządzenie, końcówki, probówki do elektroporacji oraz pipeta są wliczone w skład systemu Neon Transfection System.
  5. Podłącz przewód wysokiego napięcia oraz złącze czujnika stacji pipetującej do portów z tyłu urządzenia zgodnie z instrukcjami producenta. Stację pipetującą należy umieścić w bliskiej odległości od urządzenia.
  6. Podłącz kabel zasilający do tylnego gniazda zasilania AC, a następnie podłącz urządzenie do gniazdka elektrycznego. Naciśnij przełącznik zasilania, aby włączyć urządzenie.
  7. Wprowadź parametry transfekcji w ekranie startowym, który wyświetla się po włączeniu urządzenia i jego prawidłowym podłączeniu. Naciśnij przycisk Napięcie elektrycznewprowadź 1000 i naciśnij on Gotowe aby ustawić napięcie na 1000 V. Naciśnij Szerokość, wprowadź 40 i naciśnij on Gotowe aby ustawić czas trwania impulsu na 40 ms. Na koniec naciśnij # Pulsywprowadź 2 i naciśnij on Gotowe następnie należy ustawić liczbę impulsów elektrycznych na 2.
  8. Należy wziąć jedną z probówek do elektroporacji (dołączonych do zestawu) i napełnić ją 3 ml buforu elektrolitycznego E (do 10 µL końcówki dostarczone w zestawie) w temperaturze pokojowej. Włóż probówkę do elektroporacji do uchwytu na pipetę w stacji pipetującej. Upewnij się, że elektroda znajdująca się z boku probówki jest skierowana do wewnątrz i że podczas wkładania probówki słychać charakterystyczne kliknięcie.
  9. Należy pobrać osad komórkowy z etapu 3.8 i dodać 10 µL podgrzanego buforu resuspensyjnego R (zawartego w zestawie) na każde 1-2 x 105 komórki. Wymieszać delikatnie za pomocą mikropipety p20. Dodać 10 µL zawiesiny komórkowej do każdej probówki przygotowanej w kroku 4.3 i delikatnie wymieszać za pomocą mikropipety p20.
  10. Należy wziąć pipetę i założyć końcówkę, dociskając ją do Naciśnij przycisk do drugiego stopnia. Upewnij się, że zacisk całkowicie objął trzpień montażowy tłoka w końcówce i że w górnej części pipety nie widać żadnej szczeliny.
  11. Aby pobrać próbkę, należy nacisnąć Wciśnij docisnąć tłok pipety do pierwszego stopnia i zanurzyć końcówkę w pierwszej probówce zawierającej mieszaninę komórek i DNA plazmidowego. Powoli odessać mieszaninę do końcówki pipety.
    UWAGA: Należy unikać pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one powodować powstawanie łuków elektrycznych podczas elektroporacji, a w przypadku wykrycia przez urządzenie mogą uniemożliwić podanie impulsu elektrycznego. Jeśli zauważone zostaną pęcherzyki powietrza, należy wypuścić zawartość do probówki i spróbować ponownie przeprowadzić aspirację.
  12. Bardzo ostrożnie włóż pipetę z próbką do uchwytu na pipety. Upewnij się, że pipeta wskoczyła na miejsce z charakterystycznym kliknięciem i została prawidłowo osadzona.
  13. Naciśnij Start na ekranie dotykowym i należy poczekać do momentu podania impulsów elektrycznych. Komunikat na ekranie wskaże zakończenie procesu.
  14. Powoli wyjmij pipetę ze statywu i niezwłocznie dodaj zawiesinę transfektowanych komórek do odpowiedniego dołka zawierającego uprzednio ogrzane pożywkę bez antybiotyków z kroku 2.4, powoli naciskając tłok do pierwszego stopnia.
    UWAGA: Końcówkę tę można wykorzystać do trzech razy dla tego samego plazmidu; w przeciwnym razie należy ją wyrzucić do pojemnika na odpady biologiczne, naciskając Naciśnij przycisk do drugiego stopnia.
  15. Powtórz kroki 4.10–4.14 dla każdej probówki zawierającej mieszaninę komórek i plazmidowego DNA.
  16. Delikatnie potrząsnij płytką z transfektowanymi komórkami i inkubuj przez 1–3 h w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkanek (37 °C, 5% CO22).
  17. Dodać do każdej studzienki 200 µL podgrzanej pożywki hodowlanej (pożywki kompletnej) z kroku 1.1.2. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych z nawilżaniem (37 °C, 5% CO22) ponownie. Odczekać co najmniej 24 h w celu uzyskania ekspresji genów.
  18. Następnego dnia należy ocenić żywotność komórek oraz wydajność transfekcji za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.
    1. Włącz mikroskop epifluorescencyjny oraz pudło z źródłem światła fluorescencyjnego zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie umieść szalkę hodowlaną na stole mikroskopu.
    2. Wybierz obiektyw 10x lub 20x oraz filtr 568 nm (RFP).
    3. Aby oszacować żywotność komórek, należy nacisnąć LED do oświetlenia przechodzącego (TL) przycisk do wizualizacji wszystkich komórek w wybranym polu. Patrząc przez okular mikroskopu, obracaj pokrętło ostrości do momentu zaobserwowania komórek i sprawdź, czy komórki przywarły do powierzchni w wybranym polu.
      UWAGA: W pełni przytwierdzone komórki reprezentują komórki żywe, natomiast komórki pływające reprezentują komórki nieżywe. Jeśli konfluencja w studzience jest wysoka, obecność nieprzytwierdzonych komórek może być wynikiem przeszacowania liczby komórek, a nie niskiej żywotności. Jednakże niska konfluencja połączona z wysoką zawartością komórek pływających oznacza niską żywotność, która może wynikać z powstania łuku elektrycznego podczas elektroporacji, toksyczności plazmidu lub nadmiernej ekspozycji na bufor R do resuspensji. Nie należy używać studzinek wykazujących powyższe zjawisko.
    4. Aby oszacować wydajność transfekcji, należy skupić się na komórkach w wybranym polu widzenia w świetle przechodzącym, zgodnie z powyższym opisem. Należy policzyć całkowitą liczbę komórek w wybranym polu. Za pomocą Dioda LED światła przechodzącego (TL) wyłączony, nacisnąć Przycisk diody LED światła odbitego (RL) aby włączyć.
    5. Ustaw precyzyjną ostrość na fluorescencję genu reporterowego (czerwone komórki) i policz całkowitą liczbę czerwonych komórek fluorescencyjnych. Powtórz te kroki (4.18.4-4.18.5) dla co najmniej dwóch kolejnych pól w każdej studzince.

5. Inkubacja transfektowanych MDM i pozyskiwanie danych BiFC dla kaspazy

UWAGA: W przypadku planowania obrazowania komórek za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego, zaleca się inkubację z qVD-OPh (20 µM) przez 1 h przed zastosowaniem wybranego bodźca, aby zapobiec zależnej od kaspaz śmierci komórkowej (przede wszystkim apoptozie). Stosuje się to podczas obrazowania, aby zapobiec odrywaniu się komórek od podłoża w wyniku apoptozy, co utrudnia ich obrazowanie ze względu na przemieszczanie się poza płaszczyznę ogniskowania. Należy pamiętać, że rekrutacja kaspaz do platformy aktywacyjnej i powiązana z nią metoda BiFC dla kaspaz nie zależą od aktywności katalitycznej kaspazy, w związku z czym inhibicja kaspaz nie wpłynie na ten etap.

  1. Poddać działaniu wybranego bodźca około 24 h po transfekcji i inkubować przez czas wymagany dla każdego leku.
    1. Przygotować pożywkę do obrazowania, uzupełniając pożywkę hodowlaną z kroku 1.1.2 o Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) oraz 2-merkaptoetanol (55 µM).
    2. Dodać pożądaną stężenie bodźca do uprzednio ogrzanej pożywki do obrazowania i delikatnie wymieszać.
    3. Ostrożnie usunąć pożywkę z komórek za pomocą mikropipety p1000 i dodać 500 µL roztworu bodźca z kroku 5.1.2, wlewając go po ściance studzienki.
    4. W przypadku studzienek kontrolnych niepoddanych działaniu bodźca, dodać pożywkę do obrazowania bez bodźca.
    5. Inkubować komórki w uwilgotnionym inkubatorze do hodowli tkanek (37 °C, 5% CO2) przez czas wskazany dla każdego rodzaju traktowania.
  2. Zwizualizować komórki przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego.
    1. Włączyć mikroskop oraz źródło światła fluorescencyjnego zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wybrać obiektyw 10x lub 20x i umieścić naczynie z hodowlą na stole mikroskopu.
    3. Za pomocą okularu mikroskopu zlokalizować komórki przy użyciu filtra 568 nm i ustawić ostrość na komórkach wykazujących ekspresję raportora dsRedmito/mCherry (komórki czerwone).
    4. Policzyć wszystkie czerwone komórki w polu widzenia i zapisać liczbę.
    5. Pozostając w tym samym polu widzenia, przełączyć na filtr 488 lub 512 (GFP lub YFP), policzyć liczbę czerwonych komórek, które są jednocześnie zielone (Venus-dodatnie lub BiFC-dodatnie), i zapisać liczbę.
    6. Policzyć co najmniej 100 komórek dsRedmito/mCherry-dodatnich z minimum trzech oddzielnych pól widzenia.
    7. Obliczyć procent Venus-dodatnich komórek transfekowanych na pole widzenia, a następnie wyciągnąć średnią z uzyskanych procentów dla każdego traktowania (studzienki), aby wyznaczyć odchylenie standardowe.
  3. Wykonać obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego
    UWAGA: Aby uzyskać obrazy konfokalne przy użyciu obiektywu 20x lub o większym powiększeniu, komórki powinny być wysiane na szklane naczynia, chyba że mikroskop jest wyposażony w obiektyw długoprzepustowy.
    1. Postępować zgodnie z krokami 5.2.1-5.2.3. W przypadku użycia mikroskopu konfokalnego z obiektywem olejowym 40x, 60x lub 63x, nanieść kroplę oleju na obiektyw.
    2. Zwizualizować na ekranie komputera obraz na żywo z komórek rejestrowany przez kamerę. Użyć źródła światła epifluorescencyjnego dla obrazów fluorescencyjnych lub przełączyć źródło światła na lasery w przypadku obrazowania konfokalnego.
    3. Precyzyjnie ustawić ostrość i pozycję komórek za pomocą joysticka i pokrętła ostrości.
    4. Ustawić procent mocy lasera i czas ekspozycji dla laserów 512 nm lub 488 nm (YFP lub GFP) oraz 568 nm (RFP) w taki sposób, aby sygnał na obrazie był wyraźny i nie osiągnął nasycenia.
    5. Włączyć przechwytywanie na żywo i zbadać uzyskany obraz. Upewnić się, że dla każdego fluoroforu widoczny jest wyraźny piki na histogramach obu kanałów.
    6. Dostosować moc lasera i czas ekspozycji w razie potrzeby. Utrzymywać te wartości na jak najniższym poziomie, przy jednoczesnym zachowaniu możliwości detekcji obu sygnałów fluorescencyjnych (RFP i GFP/YFP).
    7. Podczas wizualizacji obrazu na żywo, wykonać kilka reprezentatywnych zdjęć pola zawierającego jedną lub więcej komórek wykazujących ekspresję raportora mCherry/dsRedmito dla każdej studzienki płytki i zapisać dane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat przedstawiony na Ryc. 2 daje przegląd sposobu pozyskiwania, transfekcji i obrazowania ludzkich MDM. Po inkubacji wybranych monocytów CD14+ z GM-CSF przez 7 dni, morfologia komórek zmienia się w trakcie okresu różnicowania (Ryc. 3A), przechodząc od sferycznych komórek w zawiesinie do wrzecionowatych i całkowicie przylegających (dni 3 i 4), a na koniec do komórek bardziej rozpostartych po pełnym zróżnicowaniu (dzień 7). W pełni zróżnicowane komórki są nast...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje przebieg pracy w celu uzyskania makrofagów z monocytów wyizolowanych z próbek ludzkiej krwi oraz metodę skutecznego wprowadzania reporterów zapalnej kaspazy BiFC do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek.

Protokół ten wykorzystuje technikę BiFC35 do oznaczania zapalnych kaspaz w domenie rekrutacji kaspazy (CARD) za pomocą niefluorescencyjnych fragmentów rozszczepionego białka fluorescencyjnego Venus. Kaspazy zapalne kodują ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy byłym i obecnym członkom laboratorium LBH, którzy przyczynili się do rozwoju tej techniki. To laboratorium jest wspierane przez NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Rysunek 2 został narysowany za pomocą oprogramowania Biorender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
48-dołkowa hodowla tkankowaPłytki 2:34Genesee Scientific25-108
10 cm Naczynia do kultur tkankowychVWR25382-166
2 Merkaptoetanol 1000xThermo Fisher Scientific21985023
8-komorowa szklana osłonowa ze szkłem nakrywkowym 1,5 HPKolumny Cellvisc8-1.5H-N
AutoMACSMiltenyi (Biotec)130-021-101Tylko do automatycznego oddzielania za pomocą separatora AutoMACS Pro AutoMACS
Pro SeparatorMiltenyi (Biotec)130-092-545Do automatycznego oddzielania tylko za pomocą separatora AutoMACS
Pro Roztwór myjący AutoMACS ProMiltenyi (Biotec)130-092-987Do automatycznego oddzielania tylko za pomocą separatora AutoMACS Pro
Roztwór płuczący AutoMACSMiltenyi (Biotec)130-091-222Tylko do automatycznego rozdzielania za pomocą separatora AutoMACS Pro
AutoMacs z buforemMiltenyi (Biotec)130-091-221Do ręcznego lub automatycznego rozdzielania za pomocą separatora QuadroMACS lub AutoMACS pro
Odwrócony mikroskop z napędem silnikowym Axio Observer Z1 wyposażony w wirujący dysk CSU-X1A 5000ZeissMożna użyć dowolnego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w moduł laserowy wyposażony w linie laserowe o długości fali 568 nm (RFP) i 488 lub 512 nm (GFP lub YFP)
AxioObserver A1, mikroskop odwrócony klasy badawczejZeissMożna zastosować dowolny mikroskop epifluorescencyjny z filtrami fluorescencyjnymi zdolnymi do wzbudzania długości fal 568 nm (RFP) i 488 lub 512 nm (GFP lub YFP)
MIKROKULKI CD14+Miltenyi (Biotec)130-050-201Do ręcznej lub automatycznej separacji za pomocą QuadroMACS lub AutoMACS pro Separator
DPBS bez chlorku wapnia i chlorku magnezuSigmaD8537-6x500ML
DsRed mito plazmidClontech632421Podobne plazmidy, które mogą być używane jako reportery fluorescencyjne, można znaleźć na Addgene
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mlSigmaGE17-1440-02
Suplement GlutaMAX (100x)Thermo Fisher Scientific35050079
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC2011
Hemin BioXtra, od świń, ≥ 96,0% (HPLC)Sigma51280-1G
HEPESThermo Fisher Scientific15630106
PlazmidyDostępne na żądanie w laboratorium LBH
LPS-EB UltrapureInvivogenTLRL-3PELPS
LS KolumnyMiltenyi (Biotec)130-042-401Tylko do ręcznej separacji za pomocą separatora QuadroMACS
MACS 15 mL Stojak na probówkiMiltenyi (Biotec)130-091-052Do ręcznej separacji tylko za pomocą separatora QuadroMACS
MACS MultiStandMiltenyi (Biotec)130-042-303Do ręcznej separacji tylko za pomocą separatora QuadroMACS
plazmid mCherryYungpeng Wang LabPodobne plazmidy, które mogą być używane jako reportery fluorescencyjne, można znaleźć w
systemie transfekcji Addgene NeonThermo Fisher ScientificMPK5000Zawiera urządzenie do elektroporacji neonów, pipetę i stację pipet
System transfekcji neonowej 10 i mikro; L KitThermo Fisher ScientificMPK1096Zawiera bufor do rezawieszania R, bufor do reszparacji T, bufor elektrolityczny E, 96 x 10 i mikro; L Neonowe końcówki i neonowe rurki do elektroporacji
Nigerycyna sól sodowa, gotowy roztwórSigmaSML1779-1ML
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140122
Bromowodorek poli-D-lizynySigmaP7280-5mg
Separator QuadroMACSMiltenyi (Biotec)130-090-976Do ręcznej separacji za pomocą Tylko separator QuadroMACS
qVD-OPhFisher (ApexBio)50-101-3172
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875119
Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific25200072
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Oprogramowanie Thermo Fisher Scientific15575020
Zeiss Zen 2.6 (edycja niebieska)ZeissDowolne oprogramowanie używane do obsługi wybranego mikroskopu konfokalnego
kaspazy zapalnej BiFC

Bibliografia

  1. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  2. Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
  3. Boice, A., Bouchier-Hayes, L. Targeting apoptotic caspases in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688(2020).
  4. Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease. The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).
  5. Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117 (5), 561-574 (2004).
  6. Lamkanfi, M., Vishva, M. D. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).
  7. Viganò, E., et al. Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes. Nature Communications. 6, 8761(2015).
  8. Cerretti, D. P., et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256 (5053), 97(1992).
  9. van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection. Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).
  10. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  11. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).
  12. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  13. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  14. Bertin, J., DiStefano, P. S. The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins. Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).
  15. Agostini, L., et al. NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).
  16. Bürckstümmer, T., et al. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).
  17. Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).
  18. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  19. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  20. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  21. Bolívar, B. E., et al. Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death. The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).
  22. Schmid-Burgk, J. L., et al. Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).
  23. Baker, P. J., et al. NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5. European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).
  24. Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis. Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).
  25. Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death & Disease. 6, 1813(2015).
  26. Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316(2018).
  27. Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
  28. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
  29. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).
  30. Perregaux, D., et al. IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin. The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).
  31. Cheneval, D., et al. Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing. Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).
  32. Fernandes-Alnemri, T., et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).
  33. Lu, A., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
  34. Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases. Blood. 32 (5), 811-815 (1968).
  35. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
  36. Thornberry, N. A., et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
  37. Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).
  38. Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).
  39. Bhowmik, P., et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 8 (1), 6502(2018).
  40. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).
  41. Kurokawa, M., Kornbluth, S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 138 (5), 838-854 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywacja kaspazyBiFC kaspazywizualizacja inflamasomutechnika nuklefekcjimikroskopia konfokalnaindukcja pyroptozydojrzewanie cytokinmikroskopia fluorescencyjna
Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.