Artykuł metodologiczny

Mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek

DOI:

10.3791/63168

⸱

4 listopada 2021

 ,  ,  , 
1Division of Biomedical Sciences, School of Medicine, University of California, Riverside, 2Microscopy and Imaging Core Facility, University of California, Riverside

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono metodę mikrodysekcji jajowodu myszy, która pozwala na pobranie poszczególnych segmentów przy zachowaniu integralności RNA. Ponadto opisano nieenzymatyczną procedurę dysocjacji komórek jajowodowych. Metody te są odpowiednie do późniejszej analizy genów i białek funkcjonalnie różnych segmentów jajowodów i zdysocjowanych komórek jajowodowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy modeli mysich nie mają sobie równych w analizie procesów chorobowych ze względu na ich genetyczną podatność na manipulację i niski koszt eksperymentalnych terapii. Jednak ze względu na ich mały rozmiar ciała, niektóre struktury, takie jak jajowód o średnicy 200-400 μm, okazały się stosunkowo trudne do zbadania z wyjątkiem immunohistochemii. Ostatnio badania immunohistochemiczne ujawniły bardziej złożone różnice w segmentach jajowodów, niż wcześniej sądzono; W ten sposób jajowód jest podzielony na cztery funkcjonalne segmenty o różnych proporcjach siedmiu różnych typów komórek nabłonkowych. Różne pochodzenie embriologiczne i proporcje typów komórek nabłonkowych prawdopodobnie sprawiają, że te cztery regiony funkcjonalne są w różny sposób podatne na choroby. Na przykład zmiany prekursorowe surowiczych raków śródnabłonkowych powstają z lejka w modelach mysich i z odpowiedniego regionu fimbrialnego w ludzkim jajowodzie. Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje metodę mikrodysekcji w celu podzielenia jajowodu w taki sposób, aby uzyskać wystarczającą ilość i czystość RNA niezbędną do dalszej analizy, takiej jak PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) i sekwencjonowanie RNA (RNAseq). Opisano również w większości nieenzymatyczną metodę dysocjacji tkanek odpowiednią do cytometrii przepływowej lub analizy RNAseq pojedynczej komórki w pełni zróżnicowanych komórek jajowodowych. Opisane metody ułatwią dalsze badania z wykorzystaniem mysiego jajowodu w dziedzinie rozrodu, płodności, nowotworów i immunologii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysi jajowód jest podobny pod względem funkcji i morfologii do ludzkiego jajowodu1. Oba składają się z pseudostratyfikowanego nabłonka rzęskowego, składającego się z dwóch historycznie opisanych komórek rezydujących w nabłonku: komórek rzęskowych i komórek wydzielniczych1,2. Jajowód ma trzy klasycznie rozpoznane segmenty: lejek, bańkę i przesmyk. W niedawnym badaniu Harwalkar i wsp.3 badał morfologię jajowodów i ekspresję genów, co doprowadziło do rozszerzenia kategoryzacji rezydentnych komórek nabłonkowych na siedem odrębnych populacji. Ponadto ustalili połączenie ampułkowo-przesmykowe jako odrębny segment oviduct3. Opisana tutaj metoda, która koncentruje się na lejku, bańce i przesmyku, może być łatwo rozszerzona o połączenie ampułkowo-przesmykowe2,3. Obszar lejkowy zawiera ujście lub otwór jajowodu i obejmuje obszar fimbrialny, a także bliższą łodygę. Poruszając się w kierunku macicy, następnie jest bańka, a następnie przesmyk. Komórki rzęskowe są najbardziej widoczne na dystalnym końcu regionu, proksymalnym do jajnika lub lejka, podczas gdy komórki wydzielnicze są najbardziej widoczne w bliższym końcu lub segmencie przesmyku1. W przeciwieństwie do ludzkiego jajowodu, mysi jajowód jest zwiniętą strukturą podtrzymywaną przez mesosalpinx, przedłużenie szerokiego więzadła otrzewnej1,4. Ponadto jajowód myszy jest zamknięty w worku kaletkowym, który zwiększa prawdopodobieństwo transferu oocytów do jajowodu4. Bańka jest identyfikowana jako miejsce zapłodnienia, z którego rozwijające się zarodki przechodzą do przesmyku przed wejściem do macicy5. Segmenty jajowodów mają średnicę 200-400 μm, a dłuższe obszary ampułki i przesmyku mają około 0,5-1,0 cm długości4. Janowód rozszerza się podczas cyklu rujowego, a bańka i lejek są bardziej rozciągliwe niż przesmyk1.

Nadmierna proliferacja komórek, zwłaszcza komórek wydzielniczych, charakteryzuje zmiany prekursorowe do surowiczych guzów znajdujących się w jamie miednicy6. Te prekursorowe surowicze zmiany śródnabłonkowe powstają w nabłonku jajowodu wyłącznie w okolicy fimbulicznej; Nie wiadomo, dlaczego tworzenie zmian jest ograniczone do tego regionu, w którym zwykle dominującym typem komórek jest orzęsiony, a nie wydzielniczy2,7,8. Regionalność pod względem prawidłowych funkcji fizjologicznych, a także zwiększone zainteresowanie jajowodowym pochodzeniem raka jajnika9,10,11,12,13, podkreśla znaczenie oddzielnej oceny segmentów jajowodu.

Opisana tutaj metoda szczegółowo opisuje zbiór oddzielnych segmentów jajowodów do późniejszych analiz ekspresji genów specyficznych dla segmentu i funkcji zdysocjowanych komórek. Tradycyjnie, wiele tkanek jest przetwarzanych w celu ekstrakcji całego RNA metodą fenolu: chloroformu lub metodą pełnej ekstrakcji na kolumnie; Stwierdziliśmy jednak, że jakość RNA została utrzymana przy jednoczesnym uzyskaniu wystarczającej wydajności przy użyciu opisanej metody łączenia. Korzystając z tej metody, bardzo małe funkcjonalne segmenty jajowodu mogą być przetwarzane do dalszych analiz, zamiast badać jajowód jako całość, co może maskować wyniki reprezentatywne dla różnych segmentów14.

Zdysocjowane mysie komórki jajowodowe rzadko były badane za pomocą cytometrii przepływowej, najprawdopodobniej z powodu ograniczenia wydajności komórek z tej tkanki. Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu była dysocjacja komórek, hodowanie ich w hodowli, a następnie stymulowanie ponownego różnicowania in vitro w celu uzyskania odpowiedniej liczby komórek do dalszej analizy komórek15,16,17,18. Ograniczeniem tego podejścia jest czas ex vivo i zmienione mikrośrodowisko w hodowli, które prawdopodobnie zmieniają ekspresję genów. Istnieje również założenie, że redyferencjacja morfologiczna ma taką samą sygnaturę transkrypcyjną i proteomiczną, jaka była obecna u nienaruszonego zwierzęcia. Obecna metoda dysocjacji została zaprojektowana w celu uzyskania jak największej liczby komórek nabłonkowych w heterogenicznej populacji komórek jajowodowych przy zachowaniu różnicowania pojedynczych komórek. Co więcej, podejście w większości nieenzymatyczne prawdopodobnie ogranicza utratę białek powierzchniowych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury postępowania ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski, Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytucjonalnymi Riverside i były zgodne z wytycznymi Amerykańskiego Stowarzyszenia Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych oraz Narodowych Instytutów Zdrowia. W opisanej metodzie wykorzystano dorosłe samice myszy C57BL/6. Wszystkie zwierzęta zostały poddane eutanazji przez ścięcie głowy przed pobraniem tkanek.

UWAGA: Przegląd protokołu, który wykorzystuje niebieski barwnik do wspomagania efektywnego rozwarstwiania i rozwijania jajowodu, jest pokazany na pierwszym rysunku (Rysunek 1).

Struktura jajowodu: nienaruszona, barwiona, usunięcie po jajniku; rozwinięty z lejkiem, bańką, schematem przesmyku.
Rysunek 1: Przegląd metody mikrodysekcji. (A) Lewy panel pokazuje nienaruszoną strukturę, z której usunięto większość poduszeczki tłuszczowej jajnika i resztki tkanki łącznej otaczającej jajowód. Następnie dodatek błękitu toluidynowego pomaga odróżnić cewki jajowodu (środkowy panel). Prawy panel pokazuje struktury po usunięciu jajnika. (B) Rozwinięty jajowód z wewnętrznymi zwojami do określania, gdzie zaczyna się i kończy każdy segment. (C) Karykatura przedstawiająca zastosowaną segmentację (nie narysowaną w skali). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie powierzchni do rozwarstwienia

  1. Przymocuj kawałek wosku dentystycznego do szalki Petriego za pomocą kleju i pozwól mu wyschnąć (Rysunek 2A). Zdezynfekuj naczynie 70% etanolem. Powierzchnia jest gotowa do rozwarstwienia.

2. Makrodysekcja jajnika, jajowodu i macicy

  1. Unieruchomić szalkę Petriego zawierającą wosk dentystyczny na zimnej platformie do wyboru (np. okład z lodu utrzymywany w temperaturze -20 °C przed użyciem) pod mikroskopem preparacyjnym, gdy jest gotowa do sekcji (Rysunek 2A).
  2. Zdezynfekuj powierzchnię brzuszną zwierzęcia 70% etanolem. Otwórz jamę brzuszną i miednicę sterylnymi nożyczkami do preparowania i przesuń przewód pokarmowy na bok, aby zlokalizować grzbietową macicę dwurogową. Podążaj za każdym rogiem macicy rostralnie, aby zlokalizować każdy jajowód i jajnik otoczony poduszeczką tłuszczową macicy, znajdującą się tuż pod nerką (Rysunek 2B, C).
  3. Za pomocą nożyczek do rozwarstwiania należy wyciąć oba boczne jajowody z jajnikami oraz część dystalnego rogu macicy, która jest nadal przyczepiona. Przetnij każdy boczny róg macicy z około 1-2 cm rogiem nadal przymocowanym do zwiniętego jajowodu i jajnika (Ryc. 2D). Natychmiast zanurzyć tkankę w 2 ml zimnego podłoża preparacyjnego (patrz Tabela materiałów).

Ustawienie zimnej platformy w procedurze IVF; igła, schemat szalki Petriego; ilustracja budowy jajnika.
Rysunek 2: Makrodysekcja jajnika i konfiguracja sekcji. Jajowód znajduje się grzbietowo w jamie miednicy u podstawy nerki w obrębie poduszeczki tłuszczowej jajnika (B). Zlokalizuj rozwidlenie macicy w jamie miednicy (C) i podążaj za bocznym rogiem macicy, aby zlokalizować kontinuum macica-jajowód-jajnik (B). Usuń te struktury, przecinając jeden róg macicy i grubo rozwarstwiając je. Umieścić na platformie preparacyjnej (A) i przymocować część macicy do wosku dentystycznego za pomocą igły (A i D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Pozostaw wystarczająco dużo rogu macicy nienaruszonego i przymocowanego do jajowodu, aby umożliwić przymocowanie do platformy preparacyjnej (Rysunek 2D).

  1. Przymocuj tkankę macicy do wosku dentystycznego za pomocą sterylnej igły 25 G, aby zabezpieczyć tkankę do wycięcia (Rysunek 2A, D i Figura 3A). Pracując pod mikroskopem preparacyjnym, oczyść i wypreparuj poduszeczkę tłuszczową jajnika i tkankę łączną, aby umożliwić wyraźną wizualizację jajowodu (Rysunek 3B).

Schemat procesu rozwarstwiania jajowodu; Obejmuje identyfikację jajnika, rogu macicy, lejka, bańki.
Rysunek 3: Mikrodysekcja jajowodu krok po kroku. Po usunięciu resztek tłuszczu i tkanki łącznej (A,B) dodaj błękit toluidynowy do tkanki (C), a następnie zmyj, aby ułatwić wizualizację, a następnie usunięcie jajnika i rozwinięcie rurki (DH). Lejek znajduje się obok bliższego przesmyku i połączenia maciczno-jajowodowego (UTJ). Lekko pociągnij dystalny koniec podczas cięcia w mezoalpinxie, aby rozwinąć i odsłonić endogenne zwoje jajowodu (H), aby zorientować się w celu odpowiedniej segmentacji. Rysunek A-C podziałka liniowa = 500 μm, podziałka D-H = 400 μm (I) Kreskówka różnych segmentów (nie narysowana w skali). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml dozować i inkubować jajowód umieszczony na macicy w 1-2 kroplach sterylnego 1% roztworu niebieskiego barwnika toluidyny przez 30 s-1 min. Spłucz zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco (DPBS) i usuń cały płyn (Rysunek 3C).
  2. Lekko wyciągnij jajnik ze zwiniętego jajowodu i odetnij błonę kaletki i więzadło szerokie, aby usunąć jajnik z jajowodu bez naruszania tkanki jajowodu (Rysunek 3D, E).
    UWAGA: Jajnik nie jest przymocowany do jajowodu, ale otoczony błoną kaletki z jajowódem (Rysunek 2D) i połączony z boczną stroną macicy za pomocą więzadła szerokiego.

3. Mikrodysekcja i segmentacja jajowodu

  1. Zlokalizuj dystalny, fimbrialny koniec jajowodu znajdujący się po bokach połączenia macica-jajowód (UTJ). Janowód zwija się z powrotem na sobie; stąd koniec fimbrialny może być zlokalizowany bocznie do końca bliższego i jest odpowiednim punktem wyjścia do orientacji w rozwijaniu jajowodu (Rysunek 3F,I).
    1. Delikatnie pociągając za rurkę, odetnij mesosalpinx ( Rysunek 3I) za pomocą mikronożyczek w kształcie sprężyny, aby rozwinąć jajowód (Rysunek 3G).
  2. Po rozwinięciu przetnij rurkę, aby wytworzyć obszary lejkowe, ampułkowe i przesmykowe (Rysunek 3H).
    1. Po wycięciu lejka (koniec fimbrialny i bliższa łodyga) wyciąć obszar ampułkowy, przecinając go po drugim wystającym zwoju rurki (przeciętym między zwojami drugim i trzecim, o długości około 1 cm). Na koniec odetnij pozostałą część do UTJ, który jest obszarem przesmyku (Rysunek 3H).
      UWAGA: Jajowód nie rozwinie się całkowicie w prostą strukturę. Rura zachowa swoje zwoje (Rysunek 3H)3. Na podstawie kolejnych zwojów podążających za obszarem ampułkowym, można dalej segmentować pozostałą rurkę na skrzyżowanie ampułkowo-przesmykowe i przesmyk3. Po wycięciu bańki przeciąć między zakrętami piątym i szóstym, aby uzyskać połączenie ampułkowo-przesmykowe; pozostała rura (skręt szósty do początku UTJ) to isthmus3.
  3. Natychmiast zamroź wypreparowane segmenty tkanek w ciekłym azocie w celu izolacji RNA lub utrwal i przetwórz każdy segment w celu ukierunkowanego zatopienia i analizy immunohistologicznej.
    1. Dodać 200 μl zimnego odczynnika do ekstrakcji RNA i mieszaninę kulek homogenizacyjnych w stosunku 1:1 (patrz tabela materiałów) do tkanki, jeśli przystępuje się do ekstrakcji RNA (patrz krok 5.1).

4. Dysocjacja jajowodu

  1. Ciąg dalszy od kroku 3.1.1 powyżej) Aby uzyskać optymalną dysocjację nabłonka, należy rozciąć jajowód w miejscach, w których jest to możliwe (tj. lejek i bańka), aby odsłonić nabłonek światła (Rysunek 4A).

Schemat przekroju jajowodu, ekstrakcja próbki nabłonka, ustawienie preparacji, sprzęt laboratoryjny.
Rysunek 4: Dysocjacja komórek jajowodów, część 1. Rysunek pokazujący, jak naświetlić dystalny nabłonek w celu optymalnej dysocjacji komórek (A) oraz obraz pokazujący najprostszy sposób użycia siatki 1 mm2 (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Zaczynając od okolicy fimbrialnej, używając kleszczy jako dźwigni, rozetnij rurkę wzdłużnie nożyczkami
    2. sprężynowymi.
  1. Rozdrobnić otwarte przez szczelinę części i pozostały jajowód na segmenty (o wielkości ~1-2 mm) i dodać 5 ml ciepłego, nieenzymatycznego buforu dysocjacyjnego (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C.
    1. Ponownie zawiesić fragmenty tkanek i zdysocjowane komórki za pomocą pipetora z bańką co 3 minuty przez 9-10 minut. Rozcieńczyć bufor dysocjacyjny w stosunku 1:1 zimnym podłożem preparacyjnym.
  2. Zebrać komórki przez odwirowanie (350 x g, 3 min, 4 °C). Ponownie zawiesić komórki w 2 ml buforu do lizy RBC na 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie rozcieńczyć 1:1 zimnym podłożem preparacyjnym
    3. .
  3. Zebrać komórki przez odwirowanie (350 x g, 3 min, 4 °C) i ponownie zawiesić w 5 ml zimnego roztworu pronazy.
    1. Inkubować w pożywce do wytrawiania pronazy i ponownie zawieszać grudki komórek za pomocą pipety z cebulką co 3-5 minut, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki (~25-30 min).
      UWAGA: Ten etap najlepiej wykonać na płytce lub kolbie do hodowli tkankowej, aby umożliwić ciągłą obserwację, zapobiegając niepotrzebnej nadmiernej ekspozycji na pronazę.
  4. Przepuść komórki przez sterylną makrosiatkę (siatka 1 mm x 1 mm przymocowana do stożkowej rurki z gumką (Rysunek 4B)) w celu usunięcia wszelkich pozostałych niezdysocjowanych kawałków tkanki. Zebrać komórki przez odwirowanie (350 x g, 3 min, 4 °C) i ponownie zawiesić je w zimnym podłożu odpowiednim do dalszej analizy (np. bufor FACS w przypadku barwienia do cytometrii przepływowej).

5. Ekstrakcja RNA segmentów jajowodowych

  1. Homogenizować zatrzaskowo zamrożone próbki w 200 μl odczynnika do ekstrakcji RNA w homogenizatorze tkankowym z mieszalnikiem kulkowym kulkowym na poziomie 12 w dwóch odstępach czasu (3 minuty każdy) w temperaturze 4 °C przy użyciu mieszanki kulek ze stali nierdzewnej.
    UWAGA: Aby zachować integralność RNA, próbki należy natychmiast przenieść ze stanu zamrożenia zatrzaskowego do odczynnika do ekstrakcji RNA i nie ważyć.
  2. Krótko odwirować homogenat przy 100-200 x g w wirówce stołowej przez około 5 s w temperaturze pokojowej, aby oddzielić ciecz od kulek. Przenieść supernatant do świeżej probówki.
  3. Dodaj kolejne 200 μl odczynnika do ekstrakcji RNA do kulek, aby odzyskać więcej próbek, a następnie odwiruj (100-200 x g, 5 s, temperatura pokojowa). Połączyć supernatanty.
    UWAGA: Użyj małej końcówki do pipety (większość końcówek p200 jest odpowiednia), aby zapobiec przenoszeniu kulki podczas wyjmowania supernatantu.
  4. Postępuj zgodnie z wytycznymi producenta, aby oddzielić fazowo i wytrącić RNA. Reprezentatywne próbki wytrącano przez noc w temperaturze -20 °C ze 100% izopropanolem (objętość około 2:1, izopropanol: odzyskana faza wodna).
  5. Przenieść cały osad RNA wraz z roztworem do kolumny wirowej wiążącej RNA i wirować przez 30 s przy 9,500 g. Oczyść RNA na kolumnie zgodnie z wytycznymi producenta, a następnie eluuj RNA w 20 μl wody wolnej od nukleaz. Ocenić jakość/ilość na spektrofotometrze mikroobjętościowym i/lub bioanalizatorze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół dysocjacji daje 100 000-120 000 komórek na mysz z pulą obu jajowodów. Metoda jest na tyle delikatna, że pozostawia nienaruszone granice komórek wielorzęskowych, co pozwala na rozróżnienie między komórkami wielorzęskowymi a komórkami wydzielniczymi oraz sprawdza, czy metoda trawienia jest wystarczająco delikatna, aby zapobiec dedyferencjacji. Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne w Rysunek 5 pokazują grudki małych komórek zgodnie z krokiem 4.2.1, utrwalone na 3 minuty w 4% par...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzy segmenty jajowodu są histologicznie, morfologicznie i funkcjonalnie odrębne 1,2,3. Nabłonek różni się znacznie od jednego końca jajowodu do drugiego. Komórki rzęskowe dominują na końcu fimbrialnym/lejkowatym, podczas gdy komórki wydzielnicze dominują w obszarze przesmyku1. Chociaż ten ogólny gradient jest znany od jakiegoś czasu, ostatnie prace ujawniły więcej różnic między segmentami jajowodów. Tak ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została częściowo wsparta przez Nagrodę Przełomową Departamentu Obrony dla AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR był częściowo wspierany przez stypendia stacjonarne: Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship i Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences oraz University of California, Riverside, nagrody stacjonarne: Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant oraz Graduate Division Dissertation Year Program Award. Autorzy dziękują Gillian M. Wright i Alyssie M. Kumari za pomoc we wczesnym rozwiązywaniu problemów związanych z tą metodą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 mm Mieszanka kulek ze stali nierdzewnejNext AdvanceSSB05Mix 1:1 z 1,4 mm SSB14B, sterylizowana
1,4 mm Mieszanka kulek ze stali nierdzewnejNext AdvanceSSB14BMix 1:1 z 0,5 mm SSB05, sterylizowana
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7,4 (DPBS)Gibco21600-010Zimna, sterylna
igła 25GBD305122
Sterylne szalki Petriego 60 mmCorning430166
70 μ m siatki komórkoweFisherbrand22-636-548
Agilent Eukariont Total RNA 6000 Pico Chip kitAgilent 2100 Bioanalyzer5067-1513
Bead Bullet Blender Homogenizator tkankowyNext AdvanceBBY24M
BioanlyzerAgilent 2100 Bioanalyzer
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA7906
Zimno talerz/opakowanie/powierzchnia do wyboruNIE DOTYCZYUtrzymywane w temperaturze -20 ° C do preparacji
Wosk dentystycznyPolysciences Inc.403
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)/ Szynka" s F12Corning10-090-CVPrzygotować podłoże preparacyjne: DMEM/ Szynka" s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Płodowa surowica bydlęcaCorning35-015CV
Kleszcze drobnoziarniste do wyboruN/AN/A
GlycineSigmaAldrich G712bImmunocytochemiczne obrazy walidacyjne
Koza anty-mysie IgG Alexa Fluor 555InvitrogenA-21422Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne
Koza anty-królicza IgG Alexa Fluor 488InvitrogenA-11001Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne
HepesSigma AldrichH-3784
Hoescht 33342Technologie sygnalizacji komórkowej4082SImmunocytochemiczne obrazy walidacyjne
Odwrócony mikroskop złożonyKeyence BZ-X700
Mysz anty-mysia OccludinInvitrogen33-1500Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne
Nieenzymatyczny bufor dysocjacyjnyN/A5 mM EDTA, 1 g/L glukozy, 0,4% BSA, 1X DPBS
Nylonowa makrosiatka 1 mm x 1 mmThomas Scientific1210U04
ParaformaldehydSigma AldrichP-6148Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne
Pen-StrepMP Biomedicals10220-718
Odczynnik przeciwblakowy ProlongGold Technologie sygnalizacji komórkowej9071SObrazy walidacji immunocytochemicznej: pożywka do montażu zapobiegającego blaknięciu
PronaseSigma Aldrich10165921001Przygotuj pożywkę do trawienia pronazy: 0,15% pronazy w DMEM / Ham's F12, sterylne
jodek propidynyRoche11 348 639 001Obrazy walidacji żywotności
Królik anty-mysi Acetylowana-tubulinaAbcamab179484Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne
Bufor do lizy RBCBD Biosciences555899
RNeasy Mini KitQiagen74134Służy do oczyszczania na kolumnie w tekście
Nożyczki do mikrodysekcji w formie sprężynyRoboz SurgicalRS-5610
Sterylne pipety gruszkowe 3 mlGlobe Scientific137135
Błękit toluidynowyAlfa AesarJ66015Przygotuj roztwór błękitu toluidynowego: 1% w 1X DPBS, sterylne
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)N/AN/AImmunocytochemiczne obrazy walidacyjne; 0,1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1% Tween 20
Triton-X-100Mallinckrodt Inc.3555Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne
Odczynnik do ekstrakcji RNA TrizolInvitrogen15596026Określany jako odczynnik do ekstrakcji RNA. Woda wolna od nucelazy, chloroform i izoproponal są wymagane jako uzupełnienie ekstrakcji Trizol zgodnie z wytycznymi producenta

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stewart, C. A., et al. Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).
  2. Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677(2021).
  3. Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
  4. Agduhr, E. Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse. Acta Zoologica. 8 (1), 1(1927).
  5. Pulkkinen, M. O. Oviductal function is critical for very early human life. Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).
  6. Kindelberger, D. W., et al. Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship. American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).
  7. Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells. Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).
  8. Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
  9. Kim, J., et al. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).
  10. Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
  11. Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
  12. Zhai, Y. L., et al. High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease. Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).
  13. Karthikeyan, S., et al. Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model. Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).
  14. Shao, R., et al. Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice. Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).
  15. Alwosaibai, K., et al. PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state. Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).
  16. Peri, L. E., et al. A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts. Biology of Reproduction. 92 (4), 102(2015).
  17. Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nature Communications. 11 (1), 2660(2020).
  18. Chen, S., et al. An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone. Scientific Reports. 7, 42298(2017).
  19. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565(2010).
  20. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  21. McGlade, E. A., et al. Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts. The FASEB Journal. 35 (5), 21563(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrodysekcja jajowodudysocjacja tkanekcytometria przep ywowasekwencjonowanie RNAkom rki nab onkowesegmenty jajowoduPCR z odwrotn transkrypcj

Powiązane artykuły