System hodowli narządowej do oceny toksyczności substancji pomocniczych i farmaceutyków stosowanych w leczeniu wewnątrzgałkowym

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest ocena zmian w aktywności metabolicznej i funkcji refrakcyjnej soczewki w odpowiedzi na eksperymentalne leczenie.

Streszczenie

Jako główna przyczyna ślepoty, zaćma stanowi znaczne obciążenie dla dziesiątek milionów ludzi na całym świecie dotkniętych tym schorzeniem. Narażenie na chemikalia, wśród innych czynników środowiskowych, jest ustaloną przyczyną zaćmy. Badanie toksyczności ocznej może ocenić, czy farmaceutyki i ich składniki mogą przyczyniać się do uszkodzenia soczewki, które może prowadzić do zaćmy lub wspomagać leczenie zaćmy.

Badania in vitro i testy na zwierzętach in vivo mogą być używane do oceny bezpieczeństwa chemikaliów przed badaniami klinicznymi. Test Draize'a – obecny standard in vivo dla badań toksyczności ocznej i drażliwości – był krytykowany za brak czułości i obiektywnych pomiarów określających toksyczność oczną. Testy in vitro oparte na komórkach są ograniczone, ponieważ hodowle komórkowe nie mogą odpowiednio modelować nienaruszonej funkcjonalnej soczewki.

Opisana tutaj metoda jest czułą alternatywą dla testów na zwierzętach in vitro, zaprojektowaną w celu oceny reakcji nienaruszonej soczewki bydlęcej na leczenie zarówno na poziomie aktywności komórkowej, jak i dla ogólnej wydajności refrakcji. Nietoksyczny odczynnik rezazuryna jest metabolizowany proporcjonalnie do poziomu aktywności komórek. Test laserowo-skanerowy obiektywu mierzy zdolność soczewki do załamywania padających wiązek światła do jednego punktu z minimalnym błędem, bezpośrednio związanym z jej naturalną funkcją. Metoda ta może być stosowana do określania zarówno ostrych, jak i opóźnionych zmian w soczewce, a także regeneracji soczewki po ekspozycji chemicznej lub środowiskowej.

Wprowadzenie

Zaćma, dotykająca ponad 20 milionów ludzi, jest najczęstszą przyczyną ślepoty na całym świecie^1,2. Zaćma jest najczęściej spowodowana zmianami w soczewce związanymi z wiekiem, ale jest również wywoływana przez uraz, warunki genetyczne, chorobę lub ekspozycję na toksyny². Obecnie leczenie polega na interwencji chirurgicznej w celu wymiany soczewki, co jest kosztowną i inwazyjną procedurą dostępną głównie dla osób w krajach rozwiniętych. Ogromne obciążenie zaćmą skierowało dziesięciolecia badań w kierunku zapobiegania zaćmie i rozwoju leczenia niechirurgicznego. W obu przypadkach znaczenie badań przedklinicznych dla toksyczności, skuteczności i farmakokinetyki leków okulistycznych jest najważniejsze. Ten proces opracowywania leków opiera się w dużej mierze na informacjach dostarczonych w badaniach przeprowadzonych na zwierzętach.

Obecnym standardem dla badań toksyczności ocznej in vivo jest test Draize'a, polegający na dostarczeniu badanego związku do worka spojówkowego żywego zwierzęcia. Test został znacząco skrytykowany, szczególnie w odniesieniu do etyki zwierząt, subiektywizmu, słabej powtarzalności i zmienności³. Ponadto nie ma komponentu testu Draize'a, który bezpośrednio monitorowałby wpływ badanych substancji na soczewkę. Dużo wysiłku włożono w opracowanie alternatywnych modeli in vitro⁴. Jednak żaden z nich nie został wystarczająco zweryfikowany, aby zastąpić test Draize'a⁵. Podobnie, wiele z tych modeli napotyka ograniczenia w odniesieniu do bezpośredniego zastosowania do zaćmy i innych złożonych patologii⁶. Na przykład metody klasyfikujące przezroczystość obiektywu po umieszczeniu nad siatką są z natury subiektywne⁷. Badania nad hodowlami komórkowymi są wiarygodne i szeroko wykorzystywane, chociaż charakterystyka monowarstwy komórki może różnić się od podstawowej hodowli tkankowej⁸.

Całe soczewki mogą być wypreparowane z oczu zwierząt i hodowane, aby zachować ich pierwotną strukturę i funkcję. Jednym z testów, który jest przydatny do oceny funkcji soczewki przy jednoczesnym utrzymaniu stanu narządu, jest test laserowo-skanerowy z użyciem skanera z udziałem skanera opracowanego na Uniwersytecie Waterloo w Kanadzie. Test jest systemem skanującym, który wykorzystuje serię projekcji laserowych do pomiaru jakości optycznej lub wydajności refrakcyjnej soczewki. Soczewki są skanowane w niestandardowych dwusegmentowych komorach hodowlanych, dzięki czemu wiązki przechodzą od dołu przez soczewkę (Rysunek 1A). Kamera zamontowana wewnątrz skanera rejestruje obraz lasera przechodzącego przez soczewkę w wielu punktach. Oprogramowanie skanera oblicza odległość za soczewką, w której przecina się ona z osią centralną (odległość wierzchołka tylnego, BVD), tworząc serię pomiarów, które wskazują, jak konsekwentnie soczewka skupia światło w jednym punkcie (Rysunek 1).

Właściwości komórkowe soczewki, takie jak ciasne i uporządkowane rozmieszczenie komórek, pomagają utrzymać przezroczystość i zminimalizować rozproszenie, dzięki czemu soczewka może funkcjonalnie skupiać światło⁹. Miara ta może być wykorzystana do interpretacji, jak bardzo substancja chemiczna zaburza podstawową strukturę soczewki, taką jak gradientowy współczynnik załamania światła, oraz jak bardzo funkcja jest zagrożona z powodu indukowanych zmętnień. Inne badania, które śledziły reakcję hodowanych soczewek i pęcherzyków soczewkowych, sugerują, że rozpraszanie światła jest produktem zmian strukturalnych, w porównaniu ze zmianami metabolicznymi, oraz że zakłócenia lipidów i białek soczewki mogą wpływać na współczynnik załamania światła, a w konsekwencji zwiększać rozproszenie^10,11.

Laserowy skaner soczewkowy może być używany w połączeniu z odczynnikami metabolicznymi w testach do określania biochemicznych miar toksyczności komórek. Rezazuryna jest nietoksycznym odczynnikiem chemicznym metabolizowanym przez aktywne komórki, wytwarzającym zredukowany produkt (rezorufinę) o mierzalnej fluorescencji¹². Soczewka jest w dużej mierze pozbawiona organelli, z wyjątkiem metabolicznie aktywnych mitochondriów skoncentrowanych w przednim nabłonku i powierzchownych komórkach włókien korowych, spełniających wymagania dotyczące energii soczewki^13,14. Uszkodzenie soczewki na poziomie komórkowym może zaburzyć metabolizm i często poprzedza wystąpienie patogennych zmian strukturalnych i zaćmy¹⁵.

Celem tej metody jest ocena wpływu ekspozycji na ksenobiotyki i środowiska na soczewkę, co może przyczynić się do rozwoju zaćmy. Protokół obejmuje dwa testy w celu oceny efektu leczenia z wykorzystaniem soczewki bydlęcej z hodowli. Zaletą tego podejścia jest to, że zapewnia ono zarówno komórkową, jak i funkcjonalną ocenę tego, jak soczewka jako tkanka pierwotna reaguje na leczenie. Jest to czuła i obiektywna ocena obiektywu w porównaniu z innymi popularnymi metodami^16,17,18.

Model został z powodzeniem wykorzystany do oceny skutków różnych ekspozycji, w tym środków powierzchniowo czynnych, produktów konsumenckich, alkoholi i promieniowania ultrafioletowego^17,19,20. Zmiany w jakości optycznej są stale obecne w soczewkach hodowlanych jako odpowiedź na toksyczne narażenie²¹. Zdolność tej metody do utrzymania długotrwałego posiewu soczewek doskonale nadaje się do monitorowania potencjalnie opóźnionego działania związku i odzyskiwania soczewki po indukowanym uszkodzeniu lub zaćmie^22,23. Wyniki uzyskane w wyniku zastosowania tego protokołu mogą być wykorzystane do zmniejszenia zależności od testów na zwierzętach przy opracowywaniu produktów okulistycznych.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami etycznymi Uniwersytetu Waterloo dotyczącymi badań z wykorzystaniem tkanek zwierzęcych. Oczy bydlęce do obecnego badania zostały dostarczone z rzeźni, uzyskane od krów niemlecznych w ciągu kilku godzin od śmierci i natychmiast poddane sekcji, przy czym proces ten trwa do 8 godzin od uzyskania oczu. Oczy należy natychmiast wypreparować, aby zachować sterylność i jakość sekcji. Pożywka hodowlana jest przygotowywana do pH 7,4 i sterylnie filtrowana przed suplementacją FBS²¹. Wszystkie zabiegi przeprowadzane są w sterylnych warunkach, z wykorzystaniem źródeł materiałów i sprzętu wymienionych w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla soczewek bydlęcych

1. Wypreparuj soczewki, usuwając mięśnie i tkanki zewnątrzgałkowe z twardówki, usuwając tylną połowę gałki ocznej i ciała szklistego, usuwając tęczówkę i ciało rzęskowe wraz z soczewką, a następnie odcinając przyczepy strefowe, z ostatecznym cięciem umieszczonym tak, aby soczewka wpadła do komory hodowlanej wypełnionej podłożem.
2. Wyhodować wypreparowane soczewki w niestandardowych komorach z podstawą dostosowaną do systemu skanowania laserowego, z 21 ml sterylnie przefiltrowanego podłoża, w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Stosować 3% pożywkę hodowlaną z płodowej surowicy bydlęcej (FBS) z 1% penicyliną-streptomycyną, 9,4 g/L M-199, 0,1 g/L L-glutaminy, 5,96 g/L HEPES, 2,2 g/l wodorowęglanu sodu i 7 mL/L NaOH. Niewykorzystaną pożywkę hodowlaną należy przechowywać w lodówce do 7 dni.
3. Pożywkę należy wymieniać co 1-2 dni. Przed użyciem ogrzewać pożywkę hodowlaną przez godzinę w temperaturze 37 °C. Za pomocą sterylnej pipety Pasteura podłączonej do ssania odessać pożywkę z indywidualnej komory hodowlanej i natychmiast uzupełnić uzupełnioną pożywką.
4. Posiew soczewek przez 48 godzin po sekcji, aby dać czas na ujawnienie się fizycznego uszkodzenia. Sprawdź i zeskanuj soczewki pod kątem jakości optycznej zgodnie z sekcją 4 przed włączeniem do eksperymentu.
   UWAGA: Soczewki są skierowane do dołu w ramach przygotowań do testu skanera laserowego.

2. Procedura kontrolna

1. Przygotować roztwór o pożądanym stężeniu środka solubilizującego, który jest zgodny ze związkiem chemicznym i pożywką hodowlaną.
2. Przygotować roztwór kontrolny nośnika, dodając środek rozpuszczający do uzupełnionego podłoża. Przed rozpoczęciem eksperymentów ogrzewać roztwór kontrolny przez godzinę w temperaturze 37 °C.
3. Użyj pipety Pasteura podłączonej do ssania, aby zassać pożywkę hodowlaną z komór soczewek kontrolnych. Uzupełnij komory roztworem kontrolnym. W razie potrzeby wykonaj ten krok z próbkami w trzech egzemplarzach.
   UWAGA: Minimalna objętość 7 ml jest wymagana do całkowitego zakrycia soczewki w przedniej pozycji skierowanej do góry. Warunki dla kontroli w obecnym badaniu to 21 ml nietraktowanej pożywki kontrolnej, 21 ml pożywki kontrolnej nośnika i 7 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
4. Hodować soczewki w pożywce kontrolnej przez 2 dni, a następnie wymienić na nową pożywkę kontrolną zgodnie z sekcją 1. W przypadku krótkotrwałych ekspozycji, odessać roztwór kontrolny z komór i przeprowadzić płukanie co najmniej trzy razy nieuzupełnioną pożywką hodowlaną przed wznowieniem protokołu hodowli soczewek, jak opisano w sekcji 1.0.
5. Pozostawić soczewki do aklimatyzacji w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez co najmniej 3,5 godziny przed oceną jakości optycznej.

3. Procedura ekspozycji

1. Przygotować roztwór o pożądanym stężeniu środka solubilizującego, który jest zgodny ze związkiem chemicznym i pożywką hodowlaną. Połącz substancję chemiczną ze środkiem solubilizującym, dając odpowiedni czas na interakcję, jeśli jest to wymagane.
   UWAGA: 2-hydroksypropylo-β-cyklodekstryna została użyta w obecnym badaniu w celu zwiększenia rozpuszczalności lanosterolu (0,033 g/l) w pożywce. Roztwór chlorku benzalkoniowego (BAK 0,0075%) przygotowano przy użyciu PBS.
2. Włączyć rozpuszczoną substancję chemiczną do pożywki hodowlanej. Przygotować całkowitą objętość wystarczającą do dostarczenia 21 ml pożywki do wszystkich próbek soczewek. Przed rozpoczęciem eksperymentu ogrzewać pożywkę doświadczalną przez godzinę w temperaturze 37 °C.
3. Użyj pipety Pasteura podłączonej do ssania, aby zassać pożywkę hodowlaną z komór soczewek. Natychmiast uzupełnić komory roztworem testowym. Po upływie okresu ekspozycji zastąp je uzupełnioną pożywką hodowlaną, w razie potrzeby najpierw wykonując płukanie. W razie potrzeby wykonaj ten krok z próbkami w trzech egzemplarzach.
   UWAGA: W obecnym badaniu warunki testowe to 21 ml pożywki uzupełnionej lanosterolem i 7 ml roztworu BAK 0,0075%. Do całkowitego zakrycia soczewki wymagana jest minimalna objętość 7 ml. W takim przypadku soczewki muszą być najpierw zorientowane przodem do góry. Pipeta Pasteura może być użyta do wytworzenia prądu w komorze hodowlanej z częścią otaczającej pożywki hodowlanej w celu zmiany położenia soczewki.
4. Umieść soczewki z powrotem w inkubatorze na co najmniej 3,5 godziny, aby się zaaklimatyzować przed oceną jakości optycznej.
   UWAGA: Soczewki są skierowane do dołu w ramach przygotowań do testu skanera laserowego.

4. Test jakości optycznej (skaner laserowy z obiektywem)

1. Upewnij się, że soczewki są zorientowane przednią stroną skierowaną w dół i wizualnie poziomo w komorze hodowlanej, stosując technikę z kroku 3.3, aby w razie potrzeby dostosować położenie soczewki.
   UWAGA: Ta pozycja zapewnia, że wiązka padająca zostanie odbita w górę przez dno komory i przejdzie przez soczewkę od przedniej do tylnej powierzchni.
2. Umieść komorę hodowli soczewek w skanerze laserowym w taki sposób, aby sworzeń wózka komory pasował do szczeliny w podstawie komory.
3. Wybierz obiektyw i punkt skanowania, dla których chcesz wykonać skanowanie, kliknij prawym przyciskiem myszy soczewkę skanowania i poczekaj, aż skaner wyświetli monity o znalezienie i wyrównanie wiązki. Wybierz dobrze oddalony początek i koniec wiązki za soczewką. Upewnij się, że wiązka środkowa jest wyrównana za pomocą przycisków regulacji brutto i precyzyjnej w oprogramowaniu skanera oraz pokrętła regulacji na skanerze. Gdy belka jest wyrównana, kliknij przycisk kalibruj i wprowadź odpowiedni wybór kroków promieniowych i separacji wiązki.
   UWAGA: W tym badaniu z użyciem soczewki bydlęcej ustawienia kroków promieniowych i separacji wiązki ustawiono odpowiednio na 10 kroków i 0,5 mm. Pierwsze skanowanie wykonywane przez skaner służy do kalibracji skanera laserowego. Jest to wymagane jednorazowo, a wszystkie dodatkowe skany obiektywu można wykonać bezpośrednio po wyrównaniu.
4. Po skalibrowaniu skanera kliknij przycisk Skanuj. Poczekaj na wygenerowanie wartości średniej BVD, odchylenia standardowego i błędu wzdłuż jednej osi po zakończeniu skanowania obiektywu i ustawieniu zakresu wiązki. Ustaw lunetę od miejsca, w którym wiązki wychodzą z obiektywu, do żądanego punktu końcowego, wybierając maksymalną odległość za soczewką, wykluczając wszelkie widoczne zakłócenia.
5. Użyj wygenerowanego wykresu, aby wyświetlić indywidualne odległości wierzchołków tylnych dla każdej belki.
   UWAGA: Wyklucz wiązki przechodzące przez szwy soczewek. Aby wykluczyć belkę, użyj legendy na ekranie, kliknij prawym przyciskiem myszy pojedynczą belkę i wybierz opcję wyklucz.
6. Ręcznie obróć położenie podstawy komory hodowlanej wewnątrz skanera o 90°, tak aby drugi skan wzdłuż przedniej powierzchni soczewki był prostopadły do poprzedniego skanowania. Upewnij się, że środkowa wiązka jest wyrównana zgodnie z opisem w kroku 4.3, a następnie zeskanuj soczewkę.

5. Test aktywności metabolicznej (resazuryna)

1. Przygotuj podłoże bez FBS. Ogrzewać pożywkę przez godzinę w temperaturze 37 °C. Przygotować 50 ml 8% odczynnika rezazurynowego w nieuzupełnionej pożywce.
   UWAGA: Wystarczy przygotować 50 ml, aby napełnić wszystkie studzienki na płytce 12-dołkowej. Roztwór należy przygotować w sterylnych warunkach w ciemnych warunkach w nieprzezroczystym pojemniku, ponieważ rezazuryna jest wrażliwa na światło.
2. Dodaj 3,8 ml 8% roztworu rezazuryny do każdego dołka w sterylnej 12-dołkowej płytce z przezroczystym dnem, aby zakryć soczewkę.
3. Za pomocą sterylnych metalowych miarek ostrożnie wyjmij soczewki spod tylnej powierzchni i przepłucz soczewkę za pomocą pipety Pasteura, aby umyć soczewkę niewielką ilością nieuzupełnionej pożywki hodowlanej. Umieść soczewki indywidualnie w każdym dołku.
4. Inkubować płytkę studzienki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 5 godzin. Po inkubacji wyjmij soczewki z metalowymi czerpakami ze studzienek i umieść je w pojemniku na odpady zwierzęce. Przenieść próbkę o objętości 100 μl z każdego dołka do sterylnej, klarownej, 96-dołkowej płytki.
   UWAGA: Soczewki mogą być oceniane wielokrotnie za pomocą testu aktywności metabolicznej. W takim przypadku należy umieścić soczewki z powrotem w komorach hodowlanych ze świeżą pożywką w celu inkubacji. Test aktywności metabolicznej najlepiej przeprowadzić po zakończeniu wszystkich skanów, ponieważ barwnik może wpływać na pomiary BVD.
5. Zmierzyć fluorescencję końcową próbek o objętości 100 μl za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych, przy długościach fal wzbudzenia i emisji ustawionych odpowiednio na 560 nm i 590 nm.

6. Analiza danych

1. W przypadku testu jakości optycznej oblicz średnią wartości obliczonych przez oprogramowanie dla BVD error²⁴ z dwóch skanów wykonanych w każdym punkcie czasowym. Wykonaj to obliczenie dla wszystkich soczewek i wszystkich punktów skanowania.
2. W przypadku testu aktywności metabolicznej należy zebrać względne wartości fluorescencji punktu końcowego wygenerowane przez czytnik płytek. Znormalizuj dane, ustawiając średnią wszystkich wartości kontrolnych w punkcie skanowania na 100%. Oblicz aktywność każdej soczewki jako procent średniej wartości kontrolnej dla tego punktu skanowania.
3. Wykonaj test normalności dla wszystkich grup eksperymentalnych. Zakładając, że dane są normalne, przeanalizuj różnice błędów BVD między soczewkami kontrolnymi i eksperymentalnymi za pomocą dwukierunkowej ANOVA. Dodatkowo wykonaj test wielokrotnych porównań post-hoc Tukeya. Wykonaj jednoczynnikową ANOVA i test post-hoc Dunnetta dla danych dotyczących aktywności metabolicznej.

Wyniki

Rysunek 2 oraz Rysunek 3 (n = 6) przedstawiają wyniki badania oceniającego wpływ obróbki chemicznej (lanosterolu) na bydlą soczewkę. Lanosterol jest naturalnie występującym w soczewce sterolem, który wykazał obiecujące rezultaty jako potencjalna interwencja farmakologiczna w leczeniu zaćmy²⁵, choć nie zostało to jeszcze udowodnione²⁶. Projekt badania obejmował kontrolę w postaci medium oraz kontrolę nośnika dla bad...

Dyskusja

Celem tego protokołu jest bezpośrednia ocena wpływu substancji chemicznych lub ekspozycji środowiskowych na soczewkę w pierwotnej hodowli tkankowej. Najpierw soczewki są analizowane i skanowane pod kątem jakości optycznej. Zapobieganie zanieczyszczeniom i zapewnienie jakości preparacji ma kluczowe znaczenie. Soczewki są skanowane w okresowych odstępach czasu w celu ciągłego monitorowania zmian funkcji refrakcji w odniesieniu do grupy kontrolnej lub warunków przed ekspozycją. Test aktywności metabolicznej stanowi punkt ko...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
(2-hydroksypropylo)-β-cyklodekstryna	Sigma-Aldrich	H107	Proszek
1 L butelkowy system filtracji	VWR	97066-204	Pełny montaż, butelka, 0,2 μ m
100 mm szalka Petriego	VWR	89022-320	Ślizgiwana, z wygaszaczem nośnika, sterylna
płytka 12-dołkowa	Corning	353043	Sterylna, szalka Petriego z przezroczystym dnem
35 mm	VWR	25373-041	Jednorazowe szalki Petriego Falcon, sterylne, płytka Corning
96	VWR	29442-072	Sterylna, przezroczysta
Alamar niebieska (resazurin)	Sondy molekularne Fischer Scientific	DAL1100	Odczynnik żywotności komórek
Roztwór chlorku benzalkoniowego	Sigma-Aldrich	63249	50% w H20
Komora
Cytacja 5 czytnik płytek	BioTek	CYT5MPV	Czytnik wielotrybowy do obrazowania komórek
Surowica bydlęca	płodu ThermoFischer Scientific	12484028	Kwalifikowany, inaktywowany termicznie, Kanada
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Do hodowli komórkowych, inkubator
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥ 93%, proszek
L-glutamina	Sigma-Aldrich		Do hodowli komórkowych, proszek
Medium (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Modyfikowany, z Earle′ s sole, bez L-glutaminy, wodorowęglanu sodu i czerwieni fenolowej, w proszku, odpowiednie do hodowli komórkowych
Pipety Pasteura			5 3/4 '', z bawełną i bez bawełny
Penicylina-Streptomycyna	ThermoFischer Scientific	15140122	Płyn (10 000 U/ml)
Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)			płynny, sterylny, odpowiedni do hodowli komórkowych
Końcówki do pipet (100 &mikro; L, 1,000 i mikro; L, 5,000 &mikro; L)	VWR
Sterile ScanTox (skaner laserowy z obiektywem)	Specjalnie opracowany przez nas	N/A	Skanuje soczewkę laserem w celu określenia jakości optycznej soczewki
Komora hodowlana ScanTox	Specjalnie opracowana we własnym zakresie	Nie dotyczy	Utrzymuje soczewkę bydlęcą na miejscu podczas testowania i hodowli
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761	Do hodowli komórkowych, proszek
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	S2770	1,0 N, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych

płytka bezpieczeństwa biologicznego w proszku