Artykuł metodologiczny

Stymulowanie i analiza neurogenezy dorosłych w centralnym mózgu Drosophila

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63182

⸱

8 października 2021

 ,  , 
1Genetics Graduate Training Program, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health, 2Science and Medicine Graduate Research Scholars Program, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health, 3Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera szczegółowe protokoły zadawania penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu (PTBI) dorosłym Drosophila i badania wynikającej z tego neurogenezy.

Streszczenie

Molekularne i komórkowe mechanizmy leżące u podstaw neurogenezy w odpowiedzi na chorobę lub uraz nie są dobrze poznane. Jednak zrozumienie tych mechanizmów ma kluczowe znaczenie dla opracowania neuronowych terapii regeneracyjnych. Drosophila melanogaster jest wiodącym modelem w badaniach nad rozwojem neuronalnym, ale historycznie nie był wykorzystywany do badania regeneracji mózgu dorosłych. Dzieje się tak przede wszystkim dlatego, że dorosły mózg wykazuje bardzo niską aktywność mitotyczną. Niemniej jednak, penetrujące urazowe uszkodzenie mózgu (PTBI) w centralnym mózgu dorosłego Drosophila wyzwala generowanie nowych neuronów i nowego gleju. Potężne narzędzia genetyczne dostępne u Drosophila w połączeniu z opisanym tutaj prostym, ale rygorystycznym protokołem urazów sprawiają, że mózg dorosłego Drosophila jest solidnym modelem do badań nad regeneracją neuronów. Znajdują się tu szczegółowe instrukcje dotyczące (1) penetrujących urazów centralnego mózgu dorosłego oraz (2) sekcji, immunohistochemii i obrazowania po urazie. Protokoły te dają wysoce powtarzalne wyniki i ułatwią dodatkowe badania w celu przeanalizowania mechanizmów leżących u podstaw regeneracji neuronów.

Wprowadzenie

Uszkodzenie mózgu i układu nerwowego jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie. Około 1,5 miliona Amerykanów cierpi na urazowe uszkodzenia mózgu (TBI) każdego roku1, podczas gdy około 6 milionów osób w samych Stanach Zjednoczonych cierpi na choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona i Alzheimera2. Zarówno choroba, jak i uraz mózgu mogą powodować zwyrodnienie neuronów, prowadząc do wad sensorycznych, poznawczych i motorycznych3. Opracowanie strategii terapeutycznych naprawy ludzkiego mózgu było trudne ze względu na złożoną fizjologię mózgu. Organizmy modelowe, takie jak Drosophila melanogaster, zapewniają prosty system identyfikacji podstawowych mechanizmów leżących u podstaw neurodegeneracji i potencjalnych celów terapeutycznych4.

Muszka owocowa Drosophila melanogaster od ponad stu lat jest potężnym organizmem modelowym, rozwijając dziedziny genetyki, biologii rozwojowej i neuronauki5,6. Mózg Drosophila składa się tylko z ~90 000 neuronów7, milion razy mniej niż przeciętny ludzki mózg8, a mimo to mają wiele podobieństw. Zarówno mózgi ludzkie, jak i muchy wykorzystują neuroprzekaźniki GABA, glutaminian, acetylocholinę oraz aminy biogenne dopaminę i serotoninę9. Neurony Drosophila i ludzkie również funkcjonują podobnie, ze wspólną architekturą synaptyczną i analogicznymi typami komórek nerwowych10. Mniejszy rozmiar mózgu Drosophila i dostępność zaawansowanych technik genetycznych, w połączeniu z zachowaniem mechanizmów molekularnych, komórkowych i fizjologicznych między Drosophila a ssakami, pozwala badaczom Drosophila zadawać pytania, które są niepraktyczne lub trudne do odpowiedzi w modelach ssaków.

Nasze obecne zrozumienie neurogenezy u dorosłych u Drosophila, zarówno podczas homeostazy, jak i po urazie, pozostaje ograniczone. Więcej wiadomo na temat neurogenezy podczas normalnego rozwoju. Na przykład neurony i komórki glejowe są tworzone podczas rozwoju z komórek prekursorowych, zwanych neuroblastami10,11. W centralnej części mózgu wyróżniono co najmniej trzy różne typy neuroblastów. Zarówno neuroblasty linii typu I, jak i typu II opuszczają cykl komórkowy ~20-30 godzin po utworzeniu poczwarki12. W przeciwieństwie do tego, neuroblasty w ciele grzyba są ostatnimi, które kończą podział komórek i robią to poprzez apoptozę zależną od Żniwiarzy ~85-90 godzin po utworzeniu poczwarki13. Po eclosion mózg dorosłej Drosophila ma niewiele dzielących się komórek (~1 komórka/mózg), głównie glia14. Dorosłe płaty wzrokowe posiadają wolno pracujące neuroblasty zdolne do neurogenezy15, podczas gdy dorosły centralny mózg nie ma znanych neuroblastów. Niedobór neuronalnych komórek progenitorowych i ograniczona proliferacja komórek bardzo przypomina sytuację w mózgu dorosłych ssaków, co podkreśla potencjalne znaczenie mechanizmów neurogenezy dorosłego osobnika u Drosophila dla ludzi.

Odkrycie niskiego poziomu neurogenezy u dorosłych płatów wzrokowych Drosophila po urazie15 doprowadziło do hipotezy, że centralny mózg dorosłego Drosophila również może być zdolny do neurogenezy u dorosłych16. Protokół ten opisuje stworzenie rygorystycznego, powtarzalnego modelu centralnego uszkodzenia mózgu u dorosłego Drosophila, który może być wykorzystany do zbadania neurogenezy w dorosłym centralnym mózgu. Biorąc pod uwagę podobieństwa między architekturą i funkcją mózgu człowieka i Drosophila, odkrycia te mogą prowadzić do identyfikacji krytycznych celów neurogenezy terapeutycznej w uszkodzonych i chorych mózgach ludzkich.

Protokół

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi UW-Madison dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Generowanie dorosłej Drosophila dla PTBI

  1. W przypadku standardowego krzyża umieść 20 dziewiczych y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP; OK107-GAL417 dorosłych samic i 10 lat[1] w[1]17 dorosłych samców muchuje razem w fiolkach (patrz Tabela Materiałów) zawierających pokarm. Aby mieć dużą liczbę synchronicznego potomstwa, ustaw 10-20 krzyżówek w tym samym czasie. Z krzyżówki standardowej powstaje potomstwo F1 o genotypie: y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+; OK107-GAL4/+.
    1. Umieścić fiolki w temperaturze 25 °C w celu krycia i składania jaj. Aby zmaksymalizować liczbę potomstwa, należy przenosić rodziców do nowych fiolek co 2-4 dni, utrzymując wcześniejsze fiolki w temperaturze 25 °C. Wyrzuć każdą fiolkę 18 dni po pierwszym umieszczeniu w niej rodziców, aby upewnić się, że nie ma w niej potomstwa F2.
      UWAGA: Z każdej pary rodziców można wygenerować 3 zestawy potomstwa ("lęgi").
    2. Sprawdź po ~10 dniach, kiedy potomstwo F1 zacznie się zamykać.
  2. Do badań nad linią należy użyć F1 perma-twin males15 o genotypie: w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; wanna-GAL80ts/act-GAL4 UAS-flp. Aby zachować spójność, za każdym razem rób to w tym samym kierunku.
    1. Aby wygenerować trwałe bliźnięta samce, umieść 20 dziewiczych w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir; wanna-GAL80ts/TM6B żeńskie i 10 w; FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; act-GAL4 UAS-flp/TM6B15 dorosłych samców razem w fiolkach z jedzeniem.
    2. Umieścić fiolki w temperaturze 17 °C w celu krycia i składania jaj. Przenieść rodziców do fiolek z nowym pokarmem co 7 dni, utrzymując wszystkie fiolki w temperaturze 17 °C. Wyrzucić każdą fiolkę 35 dni po pierwszym umieszczeniu w niej rodziców, aby upewnić się, że nie ma w niej potomstwa F2.
    3. Sprawdź po ~21 dniach, kiedy potomstwo F1 zacznie się zamykać.

2. Penetrujące urazowe uszkodzenie mózgu (PTBI; Rysunek 1)

  1. Sortuj nowo zamknięte muchy F1. Młode samce należy wybierać w ciągu 6 godzin po eklozji. Umieścić te samce w czystych fiolkach zawierających pokarm, z 40 lub mniej muchami w każdej fiolce.
    UWAGA: Najłatwiej to osiągnąć w godzinach porannych, znieczulając muchy na podkładzie CO2 i identyfikując dorosłe samce, które nadal mają smółkę (widoczną jako ciemnozielonkawa plama przez ścianę brzucha) w jelitach.
  2. Wstępnie podawać 5-etynylo-2'-deoksyurydynę (EdU) (patrz tabela materiałów) przez 6 godzin przed urazem, jeśli planowane jest znakowanie dzielących się komórek EdU. Zobacz krok 3, aby uzyskać szczegółowe informacje.
  3. Odkażaj szpilki Minutien (patrz Tabela materiałów) przez co najmniej 5 minut, umieszczając ~100 szpilek w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 70% etanolem.
  4. Zdezynfekuj podkładkę CO2 i pędzel, rozpylając 70% etanolu i wytrzyj do sucha czystą, niestrzępiącą się chusteczką. Gdy narzędzia są czyste i suche, przenieś 40 lub mniej posortowanych samców F1 z powrotem na czystą podkładkę.
  5. Podziel samce F1 na 2 grupy na podkładce muchowej. Jedna grupa będzie służyć jako kontrola, nieranne muchy. Druga grupa eksperymentalna zostanie poddana PTBI.
  6. Za pomocą kleszczy wyciągnij 4-5 nowych kołków Minutien z probówki mikrowirówki i umieść je w pobliżu krawędzi podkładki CO2 . Pod lunetą sekcyjną wybierz prostą szpilkę Minutien z ostrym końcem.
    UWAGA: Użycie pojedynczego pinu Minutien w eksperymencie zmniejszy zmienność. Ponownie użyj ostrych szpilek. Umieść uszkodzone lub kołki w osobnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 70% etanolu w celu bezpiecznej utylizacji.
  7. W przypadku pracy z muchami ze standardowego krzyża należy włączyć lampę z diodą elektroluminescencyjną (LED) mikroskopu stereoskopowego wyposażoną w odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji białka zielonej fluorescencji (GFP). Pozwala to na wzbudzenie przy 440-460 nM i umożliwia wizualizację 500-560 nM.
    UWAGA: Dzięki tej lampie i zestawowi filtrów, ciała komórkowe ciała grzyba będą fluoryzować na zielono przez naskórek głowy (Rysunek 1C). Dla much perma-twin lub much o innych genotypach, standardowy oświetlacz światła białego do mikroskopu stereoskopowego może być użyty do wizualizacji punktów orientacyjnych na naskórku głowy w celu ukierunkowania urazu ciała grzyba (Rysunek 1C).
  8. Za pomocą kleszczy podnieś i przytrzymaj wybraną przypinkę Minutien w jednej ręce (dla osób praworęcznych jest to zwykle prawa ręka), a pędzel w drugiej (zwykle lewej) ręce. Wybierz muchę z grupy eksperymentalnej i ustaw muchę tak, aby mieć widok grzbietowy torebki głowy z głową muchy po prawej stronie. Umieść szczoteczkę na przedniej stronie grzbietowej klatki piersiowej i delikatnie dociśnij, aby ustabilizować muchę.
  9. Wyceluj końcówką szpilki Minutien w korpusy komórkowe ciała grzyba po prawej stronie głowy i przebij torebkę głowy. Jeśli używasz punktów orientacyjnych, celuj w naskórek głowy grzbietowej między oczkami a grzbietową krawędzią oka (Ryc. 1).
  10. Po zakończeniu urazu za pomocą pędzla delikatnie odepchnij główkę od kołka Minutien.
  11. Jeśli używasz mózgu do RNA-Seq lub qRT-PCR, wykonaj drugi uraz po lewej stronie głowy.
  12. Powtórz kroki 2.8-2.10, aby zranić wszystkie muchy w grupie eksperymentalnej.
  13. Gdy wszystkie muchy zostaną zranione, umieść kontrolę i zranione muchy w oznakowanych, oddzielnych fiolkach zawierających pokarm. Połóż fiolki poziomo (tj. na bokach), podczas gdy muszki dochodzą do siebie po znieczuleniu i podczas późniejszego leżakowania, aby zapobiec złapaniu much w pokarm.
  14. Standardowe muchy krzyżowe należy umieszczać w temperaturze 25 °C, a muchy perma-twin w temperaturze 30 °C, aby się zestarzały.
  15. W przypadku much w wieku dłuższym niż 24 godziny należy umieszczać je na czystym pokarmie co 1-2 dni.

3. Etykietowanie EdU

  1. Przygotować zapas 10 mM 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) w dimetylosulfotlenku (DMSO). Można go przechowywać w temperaturze -20 °C do 12 miesięcy.
  2. Przygotować 200 μl 50 μM EdU w 10% sacharozy. Wstępne karmienie leci z EdU przez 6 godzin przed PTBI.
  3. Umieścić 200 μl 50 μM EdU w 10% sacharozie na okrągłej bibule filtracyjnej klasy 3 o średnicy 23 mm (patrz Tabela materiałów) w pustej fiolce.
  4. Umieścić muchy w fiolce. Następnie zamknąć fiolkę bawełnianym zatyczką.
  5. Umieścić fiolkę poziomo w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 25 °C przez 6 godzin.
  6. Wykonaj PTBI zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.10.
  7. Umieścić muchy z powrotem w fiolce zawierającej EdU. Szczelnie zamknąć fiolkę bawełnianym zatyczką.
  8. Umieścić fiolkę poziomo w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 25 °C na okres do 24 godzin. Postępować zgodnie z jednym z kroków opisanych poniżej (kroki 3.8.1-3.8.3).
    1. Wypreparuj i napraw mózgi zgodnie z opisem w kroku 4 przy użyciu utrwalacza, buforu płuczącego i buforu blokującego bez azydku oraz z reakcją wykrywania EdU przeprowadzoną przed barwieniem przeciwciał.
    2. Przenieść muchy do czystej fiolki zawierającej nową bibułę filtracyjną i 200 μl 50 μM EdU w 10% sacharozy. Umieścić fiolkę poziomo w inkubatorze o temperaturze 25 °C. Powtarzać co 24 godziny w czasie trwania etykietowania. Następnie wypreparuj i napraw mózgi zgodnie z opisem w kroku 4 przy użyciu bez azydku z reakcją wykrywania EdU przeprowadzoną przed barwieniem przeciwciał.
    3. Aby oznaczyć impulsowo za pomocą EdU, podawaj EdU przez okres impulsu, przenieś muchy co 24 godziny do czystej fiolki zawierającej nową bibułę filtracyjną i 200 μL 50 μM w 10% sacharozy. Po okresie tętna (np. 4 dni) przenieś muchy do fiolki zawierającej standardowy pokarm dla Drosophila. Umieścić fiolkę na boku w inkubatorze w temperaturze 25 °C na dodatkowe 3 dni. Następnie wypreparuj i napraw mózgi zgodnie z opisem w kroku 4 przy użyciu bez azydku z reakcją wykrywania EdU przeprowadzoną przed barwieniem przeciwciał.

4. Preparacja, immunohistochemia i montaż

  1. Przygotować 1,5 ml probówek do mikrowirówek ze 100 μl utrwalacza: 4% formaldehydu w PEM (100 mM piperazyno-N,N'-bis(kwas 2-etanosulfonowy) [RURY], 1 mM EGTA, 1 mMMgSO4, pH 7,0) (patrz Tabela Materiałów) i umieścić na lodzie.
    UWAGA: W jednej probówce można przetworzyć nawet 20 mózgów o jednym genotypie i stanie.
  2. Przygotować płytkę preparacyjną z jedną małą kałużą (~100 μL) 70% etanolu i trzema małymi kałużami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 100 mMK2HPO4, 140 mM NaCl, pH 7,0).
  3. Znieczulenie ~10 much kontrolnych lub eksperymentalnych na podkładce CO2, która została zdezynfekowana 70% etanolem.
  4. Oddziel głowę od tułowia każdej muchy za pomocą skalpela.
  5. Zebrać głowice pędzlem zwilżonym 70% etanolem i umieścić głowice na 2-5 minut w basenie etanolu na płycie rozwarstwiającej.
    UWAGA: To nieznacznie odwadnia mózg i ułatwia jego wypreparowanie z dala od naskórka głowy.
  6. Przenieś głowy do puli PBS o pojemności ~100 μl i wypreparuj mózgi, przenosząc każdy mózg do czystej puli PBS o pojemności ~100 μl. Wykonaj to za pomocą dwóch par kleszczyków zegarmistrzowskich, aby otworzyć tył naskórka głowy i przytrzymując naskórek jedną parą kleszczy, jednocześnie delikatnie podważając mózg z naskórka za pomocą zamkniętej końcówki drugiej pary kleszczy.
  7. Przenieść wypreparowane mózgi do probówki mikrowirówkowej zawierającej 100 μl roztworu utrwalającego za pomocą pipetora P200 wyposażonego w plastikową końcówkę, która została przycięta i skośna, aby umożliwić wejście mózgów.
  8. Fix na 20-25 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń utrwalenie za pomocą pipety P200 lub szklanej.
  9. Umyj utrwalone mózgi czterokrotnie 1 ml "PT" (PBS plus 0,1% Triton X-100), pozwalając mózgom ustabilizować się na kilka minut między każdym myciem.
    UWAGA: Jeśli mózgi nie osiądą szybko między praniami, prawdopodobnie nadal będą miały przyczepione ciało tłuszczowe i/lub tchawicę.
  10. Blokuj próbki w 1 ml PBS plus 0,1% Triton X-100 i 2% albuminy surowicy bydlęcej (PBT) przez ~1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  11. Usunąć roztwór blokujący i inkubować próbki ze 100 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C w PBT. Pierwszorzędowymi przeciwciałami stosowanymi w tym badaniu są królicze przeciwciało anty-PH3 (1:500) i mysie przeciwciała anty-Fasilina II (1:20) (patrz tabela materiałów).
  12. Przemyj próbki pięć razy 1 ml PT, pozwalając mózgom uspokoić się na kilka minut między każdym myciem.
  13. Usunąć końcowe płukanie i inkubować w 100 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C. Stosowane tutaj przeciwciała drugorzędowe to anty-królik 568 (1:400) i anty-mysz Cy5 (1:100) (patrz Tabela materiałów).
  14. Przemyj próbki pięć razy 1 ml PT, pozwalając mózgom uspokoić się na kilka minut między każdym myciem. Podczas końcowego płukania dodać dichlorowodorek 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI; 1:100 roztworu 10 μM) przez 10 minut w celu zabarwienia jąder. Usuń pranie, pozostawiając 50-100 μl w każdej tubce.
  15. Przygotuj szkiełka mikroskopowe, umieszczając pojedynczą, samoprzylepną etykietę wzmacniającą na środku każdego szkiełka i kroplę 50 μl środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na środku każdej etykiety (patrz Tabela materiałów). Etykieta wzmacniająca utrzymuje szkiełko nakrywkowe nieco powyżej szkiełek i zapobiega nadmiernemu spłaszczeniu zamontowanych mózgów.
  16. Ostrożnie przenieś mózgi z każdej probówki mikrowirówki do przygotowanego szkiełka z jak najmniejszą ilością buforu do płukania za pomocą P200 wyposażonego w wyciętą i ukośną plastikową końcówkę. Na jednym zjeżdżalni można zamontować nawet 10 mózgów.
  17. Użyj kleszczy, aby delikatnie zmienić położenie mózgów przed umieszczeniem szkiełka nakrywkowego na każdym szkiełku i uszczelnieniem szkiełka lakierem do paznokci. Ustaw mózgi tylną stroną do góry lub przednią stroną do góry, ale nie powinny się stykać.
    UWAGA: Ponieważ trudno jest uzyskać wysokiej jakości obrazy konfokalne przez cały mózg, niektóre mózgi powinny być zamontowane w każdej orientacji.
  18. Przygotowane szkiełka należy przechowywać płasko i w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania. W przypadku dłuższego przechowywania (do 1 roku) szkiełka mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

5. Obrazowanie konfokalne

UWAGA: Obrazuj mózgi za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego z laserami wzbudzającymi i kostkami filtrów emisyjnych odpowiednich dla DAPI i fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych (tj. odpowiednio 405 nm, 488 nm i 568 nm, 633 nm).

  1. Włącz zasilanie mikroskopu, laserów, kontrolera i komputera.
  2. Otwórz oprogramowanie do akwizycji.
  3. W trybie Akwizycja wybierz do czterech kanałów i ustaw parametr sekwencyjnego skanowania żądanych kanałów. Zwiększ moc lasera dla każdego kanału do 5-10%.
  4. Umieść szkiełko na mikroskopie.
  5. Wybierz mózg, który ma być obrazowany za pomocą nasadki epifluorescencyjnej (patrz Tabela materiałów).
  6. W trybie Akwizycja wybierz 1024 x 1024 piksele jako wymiar ramki.
  7. W trybie Akwizycja wybierz opcję Z-stack, wskaż, że Z-stack powinien być wykonany w sekcjach 2 μm i skoncentruj się na próbce, wybierając górną i dolną płaszczyznę ogniskową do obrazowania.
  8. Zbieraj obrazy Z-stack całych mózgów za pomocą obiektywu 20x i określonych obszarów mózgu, takich jak ciało grzyba, za pomocą obiektywu 60x.

6. Analiza danych

  1. Określ ilościowo proliferujące komórki i liczbę klonów perma-twin ręcznie i/lub za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów). Podczas korzystania z oprogramowania należy wybrać obszary zainteresowania (ROI) o obszarach co najmniej 10 μm.

Wyniki

PTBI stymuluje proliferację komórek
Aby określić zakres neurogenezy po PTBI mózgu centralnego, zmierzono odpowiedź proliferacyjną u młodych dorosłych samców, które zebrano i poddano urazowi w ciągu 6 h od wyklucia. Znaczący wzrost proliferacji zaobserwowano 24 h po urazie, wykorzystując przeciwciało anty-fosfohistona 3 (PH3), będące markerem komórek znajdujących się w fazie aktywnej mitozy. W 24 h po PTBI zaobserwowano około 3 komórek PH3+ w kontrolnych mózgach centralnych oraz 11 komórek PH3+ w uszkodzonych mózgach centralnych (Ryc. 2A-D). Większość dzielących się komórek znajduje się w pobliżu miejsca urazu. Drugi test podziałów komórkowych został wykorzystany do ilościowego oznaczenia skumulowanej proliferacji komórek po pojedynczym urazie oraz do oceny stopnia przeżywalności nowo powstałych komórek. 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU) jest analogiem tymidyny, który może być włączany do nowo syntetyzowanego DNA, trwale znakując komórki, które przeszły syntezę DNA. Muchy poddano 4-dniowej impulsowej podaży EdU, po której nastąpił 3-dniowy okres prześledzenia (chase). Wykazano w ten sposób, że znakowane komórki były żywotne i przeżyły co najmniej 3 dni po proliferacji. Do 7. dnia w kontrolnych mózgach centralnych znajdowało się średnio 2 komórki EdU+, natomiast w uszkodzonych mózgach centralnych średnio 11 komórek EdU+ (Ryc. 2E). Jest to wynik zbliżony do uzyskanych 24 h po urazie przy użyciu przeciwciała PH3. Gdy proliferację komórek zmierzono po 14 dniach, w nieuszkodzonych kontrolach średnio występowała 1 komórka EdU+ na mózg centralny, podczas gdy w uszkodzonych mózgach średnio 29 komórek EdU+ (Ryc. 2E), co dowodzi, że proliferacja komórek trwa co najmniej do drugiego tygodnia po PTBI.

Proliferacja komórek jest zależna od wieku
Najsilniejszą odpowiedź proliferacyjną w centralnej części mózgu zaobserwowano w ciągu pierwszych 24 h po wyjściu z poczwarki (Rysunek 3). W 7. dniu po wyjściu z poczwarki uraz penetrujący nadal wywołuje istotny wzrost proliferacji, średnio 6 komórek PH3+ na centralną część mózgu. Niemniej jednak do 14. dnia po wyjściu z poczwarki zdolność komórek do podziału po PTBI znacząco spada do 1 dzielącej się komórki, co jest wynikiem zbliżonym do mózgów kontrolnych (Rysunek 3). Zatem potencjał do proliferacji komórek po PTBI jest zależny od wieku.

Nowo powstałe neurony mogą rzutować do odpowiednich obszarów docelowych
W celu oceny regeneracji neuronalnej po PTBI zastosowano system znakowania perma-twin15. Śledzenie linii perma-twin trwale znakuje dzielące się komórki i ich potomstwo zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) lub czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP)15. W próbkach uszkodzonych, w 2. dniu i po 2 tygodniach, wykryto więcej klonów perma-twin niż w kontrolnych (Rysunek 4A-E). Co istotne, w około 50% mózgów po PTBI 2 tygodnie po urazie pojawiły się nowe neurony ciał grzybnych (Rysunek 4N). Nowe neurony te rzutowały swoje dendryty prawidłowo do kielicha ciał grzybnych, a aksony prawidłowo do płatów ciał grzybnych (Rysunek 4D,F,G). Wskazuje to, że nowo powstałe komórki mogą być funkcjonalnymi neuronami biorącymi udział w naprawie uszkodzonych ciał grzybnych. Inne obszary mózgu, które wydawały się regenerować, to ciało elipsoidalne (EB) (Rysunek 4H,I), płaty antenalne (AL) (Rysunek 4J,K) oraz róg boczny (LH) (Rysunek 4L,M), w których duże klony występowały odpowiednio w około 26%, 26% i 20% przypadków (Rysunek 4N). Wyniki te podkreślają użyteczność tego systemu w badaniach nad neurogenezą u osobników dorosłych. Proponowany model sekwencji zdarzeń następujących po PTBI i prowadzących do generowania nowych neuronów przedstawiono na Rysunku 5.

Anatomia mózgu owada; schemat widoków zewnętrznych/wewnętrznych oraz obraz mikroskopowy w widoku grzbietowym.
Rysunek 1: Przebijający uraz czaszkowo-mózgowy (PTBI) w obrębie centralnego mózgu dorosłej Drosophila. (A) Schemat zewnętrznej strony głowy dorosłej muchy. Jest to widok z przodu, zatem prawa strona zwierzęcia znajduje się po lewej stronie widza. (B) Schemat wnętrza głowy dorosłej Drosophila z zaznaczoną na szaro trajektorią urazu. Jest to widok z tyłu, zatem na tym obrazie oraz na kolejnych rysunkach prawa strona mózgu znajduje się po prawej stronie. PTBI centralnego mózgu wpływa na wiele struktur mózgu, w tym na ciało grzybkowate (zielone) oraz tkanki poza mózgiem, w tym ciało tłuszczowe (niebieskie) i hemocyty (czerwone). CB = obszar centralny mózgu. OL = obszar płata optycznego. (C) Widok grzbietowy żywej głowy dorosłego osobnika, w której ciała grzybkowate (groty strzałek) są znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Jest to „standardowy genotyp” (szczegóły w tekście). Protokół PTBI w sposób powtarzalny prowadzi do uszkodzenia ciał grzybkowatych. Rysunek ten został zaadaptowany z publikacji16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Odpowiedź na uraz mózgu: barwienie PH3 (C-D), schemat (A-B), wykres liczby komórek (E) analiza po TBI.
Rysunek 2: PTBI stymuluje proliferację komórek. Schematy grupy kontrolnej bez urazu (A) oraz grupy PTBI (B). Niebieskie ramki w prawych górnych rogach wskazują obszary mózgu przedstawione w większym powiększeniu na panelach (C) i (D). (C,D) Do oceny proliferacji komórek 24 h po urazie użyto przeciwciała PH3 (kolor czerwony). W mózgach kontrolnych (C) występuje niewiele komórek PH3+, a żadna nie znajduje się w pobliżu MB. Jednak w mózgach po PTBI (D) komórki PH3+ występują w pobliżu MB. (E) Ilościowe oznaczenie proliferujących komórek. Liczby odzwierciedlają proliferujące komórki w całym mózgu, a nie tylko w okolicy ciała grzybobocznego. Po 24 h w mózgach kontrolnych bez urazu średnia liczba wynosiła 3 komórki PH3+/mózg (n = 11 mózgów, 28 komórek), natomiast 24 h po PTBI w mózgach średnia liczba wynosiła 11 komórek PH3+/mózg (n = 17 mózgów, 181 komórek). Po 7 dniach w kontroli bez urazu stwierdzono niewiele komórek EdU+, ze średnią 2 komórki EdU+/mózg (n = 15 mózgów, 24 komórki), podczas gdy w mózgach 7 dni po PTBI średnia liczba wynosiła 11 komórek EdU+/mózg (n = 22 mózgi, 238 komórek). Po 14 dniach w kontroli bez urazu średnia liczba wynosi 1 komórka EdU+/mózg (n = 8 mózgów, 11 komórek), natomiast w mózgach 14 dni po PTBI średnia liczba wynosi 29 komórek EdU+/mózg (n = 14 mózgów, 400 komórek). W tym zestawie eksperymentów wykorzystano młode dorosłe samce w ciągu 6 h od wyklucia. Nieparzyste testy t dla próbek kontrolnych i PTBI w trzech punktach czasowych dały odpowiednio wartości p<0.0001, p<0.0001 i p<0.0002. Słupki błędów odzwierciedlają odchylenie standardowe (SD). Ten rysunek został zaadaptowany z literatury16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres wpływu wieku w momencie urazu; komórki pH3+ vs. czas od urazu; analiza statystyczna punktów czasowych urazu.
Rycina 3: Odpowiedź proliferacyjna na PTBI maleje wraz z wiekiem. Aby zbadać, czy wiek wpływa na stopień proliferacji komórek następującej po urazie, porównano nowo wyklute dorosłe samce z osobnikami w wieku 7 dni, 14 dni i 28 dni przed PTBI, stosując przeciwciała anty-PH3 do oceny proliferacji komórek 24 h po urazie. Muchy z urazem w ciągu 6 h od wyklucia miały średnio 11 komórek PH3+/mózg (n = 17 mózgów, 182 komórki) w porównaniu do średnio 3 komórek PH3+/mózg w grupie kontrolnej w tym samym wieku (n = 11 mózgów, 28 komórek). Muchy w wieku 7 dni, które poddano PTBI, miały średnio 6 komórek PH3+/mózg (n = 11 mózgów, 65 komórek) w porównaniu do grupy kontrolnej w tym samym wieku ze średnią 2 komórek PH3+/mózg (n = 5 mózgów, 12 komórek). Gdy muchy osiągnęły wiek 14 dni przed PTBI i poddano je ocenie 24 h później, stwierdzono średnio 1 komórkę PH3+/mózg (n = 8 mózgów, 11 komórek), co było podobne do grupy kontrolnej w tym samym wieku, która również wykazywała średnio 1 komórkę PH3+/mózg (n = 4 mózgi, 2 komórki). W przypadku much w wieku 28 dni, zarówno grupa kontrolna bez urazu (n = 4, 1 komórka), jak i grupa PTBI (n = 3, 1 komórka) wykazywały średnio 0 komórek PH3+/mózg. Nieparzyste testy t dla porównań PTBI z grupą kontrolną w tych 4 punktach czasowych wyniosły odpowiednio p<0,0001, p<0,04, p<0,07 i p<0,84. Rycina została opracowana na podstawie źródła16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Badanie urazów mózgu: analiza rozkładu klonów; obrazy konfokalne, wykresy; skupienie na ciałach grzybowych.
Rycina 4: Śledzenie linii komórkowych perma-twin wykazuje regenerację mózgu i prawidłowe kierowanie aksonów po PTBI. System śledzenia linii komórkowych perma-twin15 został wykorzystany do analizy neurogenezy po PTBI. System ten trwale znakuje dzielące się komórki i ich potomstwo zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) lub czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP). Muchy hodowano w temperaturze 17 °C, aby system pozostawał nieaktywny podczas rozwoju. Samce F1 niosące transgene perma-twin zbierano po wykluciu, następnie poddawano urazowi i przeniesiono do temperatury 30 °C w celu rekonwalescencji przez 2 lub 14 dni. (A) W nieurazionych kontrolach 2-dniowych w całym mózgu rozproszone są niektóre komórki GFP+. (B) W 14. dniu w kontrolnym centralnym mózgu obecnych jest stosunkowo mało komórek GFP+. (C) W porównaniu z nimi, w mózgach urazowanych w 2. dniu znajduje się więcej komórek GFP+, które mają tendencję do skupiania się w pobliżu miejsca urazu (grot strzałki). (D) W 14. dniu po urazie w pobliżu miejsca urazu widoczne są duże klony. Niektóre z tych klonów mają aksony biegnące wzdłuż traktów ciał grzybowych (grot strzałki). Przedstawiono tutaj tylko kanał GFP; w próbkach PTBI występowały podobne klony RFP+. (E) Liczba klonów zwiększa się w czasie po PTBI. Kontrolne mózgi nieurazowane (n = 13) mają średnio 10 klonów w 2. dniu, podczas gdy mózgi PTBI w 2. dniu (n = 20) mają średnio 23 klony (p<0,00002). W 7. dniu mózgi kontrolne miały średnio 9 klonów na mózg (n = 18), podczas gdy mózgi PTBI w 7. dniu miały średnio 39 klonów na mózg (n = 16) (wartość p<0,00000002). Jest to znacznie więcej niż liczba klonów obserwowana w 2. dniu po urazie (wartość p<0,0009). W 14-dniowych mózgach kontrolnych średnio występuje 10 klonów na mózg, co nie różni się znacząco od kontroli 2- i 7-dniowych. Jednak w 14. dniu po PTBI występuje średnio 66 klonów GFP+, co jest wartością znacząco wyższą niż w przypadku kontroli o tym samym wieku (p<0,0000003) lub mózgów 2 dni po PTBI (wartość p<0,0001). Słupki błędów reprezentują SD. (F-M) PTBI stymuluje tworzenie klonów w wielu obszarach mózgu. Panele po lewej stronie to schematy obszarów mózgu, w których 14 dni po PTBI znaleziono duże klony (A, H, J, L). Panele po prawej pokazują duże powiększenia reprezentatywnych mózgów (G, I, K, M). W wielu 14-dniowych mózgach występowały klony rzutujące na konkretne obszary docelowe. Były to: ciało grzybowe (MB) (F,G), ciało elipsoidalne (EB) (H,I), płat antenowy (AL) (J,K) oraz róg boczny (LH) (L,M). (N) Zarówno liczba, jak i rozmiar klonów zwiększają się z czasem po PTBI. Proporcje obszarów mózgu z dużymi klonami obliczono w 2., 7. i 14. dniu w mózgach kontrolnych i urazowanych. W 2. dniu ~8% mózgów kontrolnych (n = 13) wykazywało klony AL, podczas gdy w 2-dniowych mózgach urazowanych (n = 20) nie stwierdzono klonów AL. W 7-dniowych mózgach kontrolnych (n = 18) 6% miało klony AL i 6% miało klony EB. W 7. dniu po PTBI (n = 16) 6% mózgów również miało klony AL, 6% miało klony EB, a 19% miało duże klony MB. W 14. dniu mózgi kontrolne (n = 9) nie wykazywały żadnych specyficznych obszarów z klonami, podczas gdy 47% mózgów PTBI (n = 15) miało klony MB, 20% mózgów PTBI miało klony AL, 27% mózgów PTBI miało klony EB i 27% miało klony LH. Rycina została zaadaptowana z publikacji16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat osi czasu neurogenezy; od urazu do regeneracji, w tym typy komórek i etapy proliferacji.
Rycina 5: Model podsumowujący regenerację po penetrującym urazowym uszkodzeniu mózgu (PTBI). U młodych dorosłych osobników Drosophila w obrębie centralnego mózgu znajdują się spoczynkowe komórki podobne do neuroblastów, w których brakuje ekspresji kanonicznych genów neuroblastów. Do 24 h po PTBI spoczynkowe komórki podobne do neuroblastów zostają aktywowane, wykazują ekspresję genów neuroblastów i zaczynają proliferować. Zarówno w 4 h, jak i w 24 h po PTBI występuje fala śmierci komórkowej16. W 7. dniu tempo proliferacji nadal pozostaje wysokie, a wiele z nowych komórek przyjęło tożsamość dojrzałych komórek, stając się neuronami lub glejem. W 14. dniu po PTBI powstają duże klony nowych neuronów z aksonami i dendrytami prawidłowo skierowanymi do odpowiednich obszarów docelowych. Deficyty lokomocyjne zostają również zniesione do 14. dnia, co sugeruje, że dorosłe Drosophila potrafią regenerować się funkcjonalnie i strukturalnie. Rycina ta została zaadaptowana z Referencji16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Chociaż urazy penetrujące mózg dorosłego Drosophila zostały opisane wcześniej 15,17,18, urazy te koncentrowały się na płatach wzrokowych, a nie na centralnym mózgu. Do tej pory brakuje również szczegółowych instrukcji, jak postępować w przypadku urazów. Protokół ten opisuje model penetrującego uszkodzenia centralnego mózgu dorosłego Drosophila, który odtwarza statystycznie istotne dowody na neurogenezę u dorosłych po PTBI.

Powtarzalność tego protokołu PTBI wynika częściowo z korpusu grzyba jako obszaru docelowego urazu. Ciało grzyba jest duże, składa się z ~ 2200 neuronów ze złożonymi trzpieniami dendrytowymi i aksonowymi w dużych i wysoce stereotypowych układach18. Ciała komórkowe neuronów ciała grzyba leżą blisko powierzchni mózgu i mogą być wizualizowane przez naskórek głowy za pomocą ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) (Figura 1C). Prekursory ciała grzyba są ostatnimi nerwowymi komórkami macierzystymi, które ulegają apoptozie podczas rozwoju 13,12,19. Tak więc, wiele neuronów ciała grzyba jest dość młodych w momencie ekleksji. Doprowadziło to do hipotezy, że ciało grzyba może mieć większy potencjał mitotyczny niż inne regionymózgu16. Ponadto ciało grzyba ma kluczowe znaczenie dla uczenia się i zapamiętywania18. To pozwala zapytać, czy neurogeneza wywołana przez PTBI prowadzi do powrotu do sprawności.

Inne czynniki, które przyczyniają się do powtarzalności wyników, obejmują wykorzystanie krzyżowanych much o spójnych genotypach, wykonywanie krzyżówek w tym samym kierunku za każdym razem, precyzyjną kontrolę temperatur odchowu i starzenia się oraz analizę samców i samic osobno. Użycie much F1 z krzyżówki zmniejsza prawdopodobieństwo analizy mózgów homozygotycznych pod względem spontanicznych mutacji. Standardowy krzyż y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP; OK107-GAL4 dorosłe samice do y[1] w[1] dorosłego samca muchy daje potomstwo F1 o genotypie y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 ulega ekspresji we wszystkich wewnętrznych neuronach ciała grzyba i napędza ekspresję reportera związanego z błoną UAS-mCD8-GFP , umożliwiając wizualizację ciał grzybów i ich projekcji. W przypadku krzyżówek perma-twin, krzyżówki muszą pozostawać w temperaturze 17 °C przez cały czas, aby system śledzenia linii był wyłączony. Gwarantuje to, że żadne dzielące się komórki nie są znakowane podczas rozwoju, a znakowane są tylko dorosłe neurony i glej. W tym celu pomieszczenie dla much może być również utrzymywane w temperaturze 17 °C. Chociaż początkowy opis systemu perma-twin15 zalecał hodowlę much w temperaturze 18 °C, może to prowadzić do znacznego oznakowania tła.

Aby zapewnić spójność, zaleca się również, aby muchy kontrolne nie zostały uszkodzone na podkładce CO2 podczas wykonywania PTBI. Gwarantuje to, że oba zestawy much mają identyczną ekspozycję na środek znieczulający. Ponadto pożądane jest, aby odtwarzalność całkowicie penetrowała głowę. Należy jednak uważać, aby nie zginać końcówki szpilki o podkładkę, co uniemożliwiłoby jej wykorzystanie w przypadku przyszłych obrażeń. Dla wykwalifikowanych praktyków muchy PTBI nie mają zbyt wielu niezamierzonych szkód. Niemniej jednak zbyt mocne naciskanie na klatkę piersiową, aby ustabilizować muchę podczas kontuzji, może być śmiertelne. Jednym ze sposobów oceny zakresu niezamierzonego urazu jest ilościowe określenie śmiertelności much PTBI 24 godziny po urazie. W przypadku jednostronnie zranionych much może to być 50% lub więcej dla początkujących. Dlatego, aby upewnić się, że obserwowane wyniki są spowodowane PTBI, a nie niezamierzonymi urazami, zaleca się, aby początkujący ćwiczyli podawanie PTBI na ~20 muchach dziennie przez kilka tygodni i nie analizowali powstałych mózgów, dopóki śmiertelność w ciągu 24 godzin nie będzie stale <10%.

Aby określić ilościowo ilość proliferacji stymulowanej przez centralny PTBI w mózgu, można zastosować zarówno barwienie immunologiczne antyfosfohistonu H3 (PH3), jak i inkorporację 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU). Anty-PH3 znakuje komórki przed i w trakcie metafazy, ograniczając wykrywanie tylko do ułamka aktywnie dzielących się komórek. Tak więc barwienie anty-PH3 zapewnia tylko częściowy wgląd w proliferację. EdU jest analogiem tymidyny, który może być włączony do nowo zsyntetyzowanego DNA. Karmiąc muszki EdU przed i po urazie, można uzyskać pełniejszy obraz komórek, które dzielą się lub podzieliły po urazie. Fakt, że wszystkie dzielące się komórki są trwale oznaczone, jest pomocny zarówno w identyfikacji komórek o powolnych cyklach, jak i w badaniu przetrwania komórek po początkowej proliferacji. Z niejasnych powodów, ale być może z powodu ograniczonej przepuszczalności bariery krew-mózg, znakowanie EdU jest nieefektywne i zaniża proliferację komórek w dorosłym mózgu. Dowodzi tego podobna liczba komórek PH3 + i EdU + zarówno w mózgach kontrolnych, jak i eksperymentalnych po 24 godzinach od PTBI oraz obserwacja, że tylko podzbiór nowych komórek w klonach bliźniaków zawiera EdU16. Aby uzyskać maksymalne oznakowanie, konieczne jest wstępne karmienie much EdU, ponieważ ranne muchy nie wznawiają żerowania przez kilka godzin po PTBI. Karmienie oceniano, dodając barwnik spożywczy do roztworu EdU i monitorując ilość barwnika w jelitach przez naskórek brzucha16.

Należy zauważyć, że chociaż w kroku 4 dostarczyliśmy protokół sekcji mózgu, można zastosować alternatywne techniki. Kilka z nich jest dostępnych we wcześniej opublikowanych protokołach 20,21,22. Drosophila melanogaster oferuje tani model z potężnymi narzędziami genetycznymi i molekularnymi, które można wykorzystać do badania mechanizmów leżących u podstaw regeneracji wielu tkanek, w tym jelit i składników układu nerwowego. Przedstawiono tutaj nowatorski i powtarzalny model urazu, który można wykorzystać do badania reakcji na uraz mózgu. Dane uzyskane za pomocą tych protokołów potwierdzają tezę, że centralny mózg dorosłego Drosophila zachowuje zdolność proliferacyjną, generując nowe neurony w odpowiedzi na uraz. Obserwacje te uzasadniają dalsze badania zarówno zakresu neurogenezy dorosłych, jak i leżących u jej podstaw mechanizmów molekularnych. Po zidentyfikowaniu składników zaangażowanych w regenerację neuronów w tym systemie, możemy przekształcić naszą wiedzę o neurogenezie dorosłych Drosophila na ludzi.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Stacey Rimkus i Becky Katzenberger za pomoc techniczną oraz Eduardo Moreno za udostępnienie akcji perma-twin. Chcielibyśmy podziękować Barry'emu Ganetzky'emu i Davidowi Wassarmanowi za ożywione dyskusje, które niewątpliwie przyczyniły się do rozwoju nauki, a także Kentowi Mokowi, Cayli Guerrze i Baileyowi Spiegelbergowi za ich wkład w rozwój laboratorium. Przeciwciała FasII zostały opracowane przez Coreya Goodmana i uzyskane z Developmental Studies Hybridoma Bank, utworzonego przez NICHD NIH i utrzymywanego na Uniwersytecie Iowa, Wydział Biologii, Iowa City, IA 52242. Większość szczepów Drosophila użytych w tym badaniu została uzyskana z Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; NIH P40OD018537). Prace te były wspierane przez NIH T32 GM007133 (KLC); NIH NS090190 (GBF); NIH NS102698 (GBF); Szkoła Podyplomowa Uniwersytetu Wisconsin (GBF); oraz UW-Madison Women in Science and Engineering Leadership Institute (WISELI) (GBF).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#11 Jednorazowe skalpeleSanta Cruz BiotechnologySC-395923Służy do oddzielania głów Drosophila od tułowia przed sekcją mózgu
Czarne szalki Sylgarda o średnicy 150 mmDow1696157wykonane w laboratorium z odczynnikami z Dow; używane do preparowania mózgu
Szkiełka nakrywkowe 18 mmdowolnedo montażu mózgów na szkiełkach
mikroskopowych4',6-Diamidino-2-Phenylindol, Dichlorowodorek (DAPI)ThermoFisherD1306do immunohistochemii
70% Etanolwykonany z 95% etanolu pozyskiwanego w różny sposób
anty-mysi Cy5Jackson ImmunoResearch715-175-151do immunohistochemii
anty-królik 568ThermoFisherA11036do immunohistochemii
bydła albumina surowicy (BSA)Sigma AldrichA7030do immunohistochemii
Bezbarwny lakier do paznokcidowolnydo uszczelniania szkiełek nakrywkowych
Zestaw do znakowania Click-It EdUInVitrogenC10640do wykrywania nowo zsyntetyzowanego DNA
CO2 bubblerGenesee Scientific59-181do znieczulenia
Podkładka CO2Genesee Scientific59-114do znieczulenia
Regulator CO2 i dostarczyćdowolnydo znieczulenia
Mikroskop konfokalnydowolnydo obrazowania stałych, barwionych i montowanych
zatyczek bawełnianych do mózgówGenesee Scientific51-101do znakowania EdU
fiolki DrosophilaGenesee Scientific32-109dla EdU etykietowanie
Bufor Fix (Rury, EGTA, magnez; PEM)składniki pochodzące z różnych firmdo naprawy mózgów dorosłych; 100 mM piperazyno-N,N'-bis(kwas 2-etanosulfonowy) [RURY], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7,0
FormaldehydSigmaAldrich 252549do naprawy dorosłych mózgów, dodany do PEM
Grade 3 okrągłe filtry Whatman, okrągłe 23 mmTisch Scientific1003-323do etykietowania EdU
Rurki Microfugedowolnedo utrwalania i barwienia reakcji oraz do przechowywania szpilek Minutien
Szkiełka mikroskopowedowolnedo montażu mózgów
Szpilki MinutienFine Science Tools26002-10do uszkodzeń mózgu; 12,5 μ końcówka o średnicy m i 100 μ pręt o średnicy m
mysi anty-Fasiclin IIBadania rozwojowe Bank hybrydoma1D4-sdo immunohistochemii
Mikroskop stereoskopowy NIGHTSEA adapter fluorescencyjnyMikroskopia elektronowa NaukiSFA-GRzestaw fluorescencyjny do mikroskopu preparacyjnego
pipety i końcówki P20, P200 i P1000dowolnedo roztworów
pomiarowych salina buforowana fosforanami (PBS)składniki pochodzące z różnych firmdo preparowania mózgów i wytwarzania immunohistochemicznych roztworów blokujących i myjących; 100 mM K2HPO4, 140 mM NaCl, pH 7,0
sól fizjologiczna buforowana fosforanem z 0,1% Triton X-100 (PT)pochodzące z różnych firmdo mycia wypreparowanych mózgów
sól fizjologiczna buforowana fosforanami z 0,1% Triton X-100 + 2% albumina surowicy bydlęcej (PBT)składniki pochodzące od różnych firmRoztwór blokujący do immunohistochemii i do rozcieńczania przeciwciał
królik anty-PH3Santa Cruz Biotechnology, Incsc-8656-Rdo immunohistochemii
Etykiety wzmacniająceAvery5721w celu zachowania przestrzeni między szkiełkiem mikroskopowym a szkiełkiem nakrywkowym
Rozmiar 0 pędzle dowolnedo manipulowania i stabilizacji dorosłej Drosophila podczas urazu
Triton X-100Sigma Aldrich93443
Dwie pary kleszczyków zegarmistrzowskich #5Fine Science Tools11255-20używane do przytrzymywania szpilek Minutien i do sekcji mózgu
VectashieldVector LaboratoriesH-1000medium montażowe do szkiełek mikroskopowych
składniki

Bibliografia

  1. Thurman, D., et al. Report to Congress: Traumatic brain injury in the United States. , Available from: https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/pubs/tbi_report_to_congress.html (1999).
  2. NIEHS. , Available from: https://www.nih.gov/research/supported/health/neurodegenerative/index.cfm (2021).
  3. Morton, N. V., Wehman, P. Psychosocial and emotional sequelae of individuals with traumatic brain injury: A literature review and recommendations. Brain Injury. 9 (1), 81-92 (2017).
  4. Bonini, N. M., Berger, S. L. The sustained impact of model organisms-in genetics and epigenetics. Genetics. 205, 1-4 (2017).
  5. Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Experimental Neurology. 287, Pt 3 310-317 (2017).
  6. Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Current Opinion in Genetics & Development. 44, 84-91 (2017).
  7. Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
  8. Meinertzhagen, I. A. The organisation of invertebrate brains: cells, synapses and circuits. Acta Zoologica. 91 (1), 64-71 (2010).
  9. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: A history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
  10. Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
  11. Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Developmental Neurobiology. 68 (9), 1185-1195 (2008).
  12. Ito, K., Hotta, Y. Proliferation pattern of postembryonic neuroblasts in the brain of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 149 (1), 134-148 (1992).
  13. Siegrist, S. E., Haque, N. S., Chen, C. H., Hay, B. A., Hariharan, I. K. Inactivation of both Foxo and reaper promotes long-term adult neurogenesis in Drosophila. Current Biology. 20 (7), 643-648 (2010).
  14. von Trotha, J. W., Egger, B., Brand, A. H. Cell proliferation in the Drosophila adult brain revealed by clonal analysis and bromodeoxyuridine labelling. Neural Development. 4, 9(2009).
  15. Fernandez-Hernandez, I., Rhiner, C., Moreno, E. Adult neurogenesis in Drosophila. Cell Reports. 3 (6), 1857-1865 (2013).
  16. Crocker, K. L., et al. Neurogenesis in the adult Drosophila brain. Genetics. , (2021).
  17. Plavicki, J., Mader, S., Pueschel, E., Peebles, P., Boekhoff-Falk, G. Homeobox gene distal-less is required for neuronal differentiation and neurite outgrowth in the Drosophila olfactory system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1578-1583 (2012).
  18. Aso, Y. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577(2014).
  19. Ito, K., Awano, W., Suzuki, K., Hiromi, Y., Yamamoto, D. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
  20. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A. Simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments. (118), e55128(2016).
  21. Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174(2017).
  22. Arain, U., Valentino, P., Islam, I. M., Erclik, T. Dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult Drosophila brains for optic lobe visualization. Journal of Visualized Experiments. (170), e61273(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

urazowe uszkodzenie m zguregeneracja neuronalnaprotok uszkodzenia m zguimmunohistochemiaproliferacja kom rekneurony cia grzybowychznakowanie EdUznakowanie Permatwin
Stymulowanie i analiza neurogenezy dorosłych w centralnym mózgu Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.