Test rekombinowanych kończyn kurczaka w celu zrozumienia morfogenezy, wzorca i wczesnych etapów różnicowania komórek

Podsumowanie

Rekombinowane kończyny to potężny model eksperymentalny, który pozwala badać proces różnicowania komórek i generowania wzorców pod wpływem sygnałów embrionalnych. Protokół ten przedstawia szczegółową metodę generowania rekombinowanych kończyn z komórkami mezodermalnymi kończyn kurczaka, które można dostosować do innych typów komórek uzyskanych z różnych organizmów.

Streszczenie

Różnicowanie komórek to precyzyjnie dostrojony proces angażowania komórek, prowadzący do powstania różnych wyspecjalizowanych typów komórek podczas tworzenia rozwijających się tkanek i organów. Proces ten jest aktywnie podtrzymywany w wieku dorosłym. Różnicowanie komórek to proces ciągły podczas rozwoju i homeostazy narządów. Zrozumienie wczesnych etapów różnicowania komórek jest niezbędne do poznania innych złożonych procesów, takich jak morfogeneza. Tak więc rekombinowane kończyny kurczaka są modelem eksperymentalnym, który umożliwia badanie różnicowania komórek i generowania wzorców pod wpływem embrionalnych sygnałów wzorcowych. Ten eksperymentalny model imituje środowisko in vivo; Składa ponownie zagregowane komórki w ektodermalną osłonę uzyskaną z wczesnego pąka kończyny. Później ektodermy są przenoszone i wszczepiane do receptora zarodka pisklęcia, aby umożliwić jego rozwój. Test ten był używany głównie do oceny mezodermalnych komórek pączków kończyn; Można go jednak zastosować do innych komórek macierzystych lub progenitorowych innych organizmów.

Wprowadzenie

Kończyna kręgowca jest potężnym modelem do badania różnicowania komórek, proliferacji komórek, śmierci komórek, tworzenia wzorców i morfogenezy^1,2. Podczas rozwoju kończyny wyłaniają się jako wybrzuszenia z komórek pochodzących z płytki bocznej mezoderm¹. Zawiązki kończyn składają się z centralnego rdzenia komórek mezodermalnych pokrytych ektodermą. Z tej wczesnej struktury wyłania się cała i dobrze uformowana kończyna. Po powstaniu zawiązka kończyny rozpoznawane są trzy osie: (1) oś bliższej-dystalna ([PD] ramię do palców), (2) oś grzbietowo-brzuszna ([DV] od grzbietu dłoni do dłoni) i (3) przednio-tylna ([AP] kciuk do palca). Oś proksymalno-dystalna zależy od wierzchołkowego grzbietu ektodermalnego (AER), wyspecjalizowanej ektodermy znajdującej się na dystalnym końcu zawiązka kończyny. AER jest wymagany do wzrostu, utrzymania przetrwania, proliferacji i niezróżnicowanego stanu komórek odbierających sygnały^2,3. Z drugiej strony, strefa aktywności polaryzacyjnej (ZPA) kontroluje wzorzec przednio-tylny⁴, podczas gdy grzbiet i ektoderma kontrolują wzorzec grzbietowo-brzuszny^7,8. Integracja trójwymiarowych wzorców implikuje złożone przesłuchy między tymi trzema osiami⁵. Pomimo zrozumienia szlaku molekularnego podczas rozwoju kończyny, otwarte pytania dotyczące mechanizmów, które kontrolują wzorzec i prawidłowy wzrost w celu utworzenia całej kończyny, pozostają bez odpowiedzi.

Edgar Zwilling opracował system rekombinacji kończyn (RL) w 1964 roku, aby badać interakcje między komórkami mezenchymalnymi kończyn kończyn a ektodermą w rozwijających się kończynach⁶. System RL składa zdysocjowano-reagregowaną mezodermę zawiązka kończyny do ektodermy kończyny embrionalnej, aby wszczepić ją do grzbietowej części zarodka pisklęcia dawcy. Sygnały dostarczane przez ektodermę indukują ekspresję genów różnicujących i genów wzorcujących w sposób przestrzenno-czasowy, indukując w ten sposób tworzenie struktury przypominającej kończynę, która może podsumować programy komórkowe zachodzące podczas rozwoju kończyny^7,8,9.

Model RL jest cenny dla zrozumienia właściwości komponentów kończyn i interakcji między komórkami mezodermalnymi i ektodermalnymi⁶. RL można zdefiniować jako strukturę podobną do kończyny utworzoną przez eksperymentalnie składane lub rekombinowane komórki mezodermalne pąków kończyn wewnątrz ektodermalnej pokrywy⁶. Morfogeneza RL zależy od charakterystyki komórek mezodermalnych (lub innych typów), które będą reagować na sygnały wzorca ektodermalnego. Jedną z zalet tego eksperymentalnego systemu jest jego wszechstronność. Ta cecha pozwala na tworzenie wielu kombinacji poprzez różnicowanie źródła komórek mezodermalnych, takich jak komórki z różnych etapów rozwoju, z różnych pozycji wzdłuż kończyny lub całe (niezdysocjowane) lub ponownie zagregowane komórki^7,8,9,10. Innym przykładem jest możliwość uzyskania ektodermy embrionalnej od gatunków innych niż kurczak, na przykład turtle¹¹, quail lub mouse¹².

W tym sensie, technika RL pomaga badać rozwój kończyn i interakcje między komórkami mezenchymalnymi i ektodermalnymi kończyn z ewolucyjnego punktu widzenia. Technika ta ma również ogromny potencjał do analizy zdolności różnych źródeł komórek progenitorowych do różnicowania się w strukturę przypominającą kończynę, wykorzystując sygnały dostarczane przez embrionalną ektodermę^12,13,14. W przeciwieństwie do hodowli in vitro, RL pozwala na ocenę różnicowania i potencjału morfogenetycznego populacji komórek poprzez interpretację sygnałów embrionalnych z rozwijającej się kończyny^9,15.

W tym protokole znajduje się przewodnik krok po kroku, jak przeprowadzić udany RL z ponownie zagregowanymi komórkami mezodermalnych pąków kończyn, otwierając w ten sposób możliwość adaptacji tego protokołu z różnymi źródłami reagregowanych komórek lub nawet różnymi źródłami ektodermy.

Protokół

To badanie zostało zrecenzowane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Miasto Meksyk, Meksyk). Schematyczny schemat ogólnych kroków tego protokołu jest pokazany na Rysunek 1A.

1. Inkubacja zarodków i określenie żywotności

1. Inkubuj zapłodnione jaja kurze w temperaturze 38 °C i wilgotności względnej 60% przez około trzy i pół dnia, aż osiągną etap 22 HH (według Hamilton i Hamburger, 1951)¹⁶.
   UWAGA: Świeżo nawożone jaja kurze można przechowywać w temperaturze 15 °C przez okres do jednego tygodnia.
   1. Aby wysiadywać zapłodnione jaja, umieść je pionowo spiczastą stroną do dołu w nawilżanym inkubatorze. Podczas inkubacji należy obracać jaja, ponieważ jest to konieczne, aby zapobiec przyleganiu rozwijającego się zarodka do błony skorupy.
      UWAGA: Zapłodnione jaja kurze można uzyskać z lokalnych gospodarstw. Zapłodnione jaja kurze White Leghorn są zwykle używane w celu uniknięcia pigmentacji piór u późnych zarodków. Rozważ osobną inkubację wystarczającej liczby jaj, aby uzyskać trzy struktury: (1) komórki mezodermalne kończyn, (2) ektodermy kończyn i (3) zarodki dawcy do przeszczepienia RL.
2. Po trzech i pół dniach inkubacji wyjmij jaja z inkubatora, przetrzyj 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
3. Zidentyfikuj rozwijające się zarodki świecujące komórkę jajową, aby obserwować naczynia krwionośne i zlokalizować zarodek. Wyrzuć jaja, które nie mają zarodka.
   UWAGA: W tym momencie rozprowadź jaja, aby uzyskać komórki mezodermalne, ektodermy i gospodarzy dla RL.

2. Pozyskiwanie komórek mezodermalnych kończyn do wypełnienia ektoderm

UWAGA: Przed rozpoczęciem manipulacji, zaleca się zdezynfekowanie obszaru roboczego, mikroskopów i wszystkich urządzeń poprzez pobranie wymazu z 70% roztworem etanolu.

1. Postukaj w koniec skorupki jajka końcem kleszczy, aby otworzyć okno i usuń około 1 cm x 1 cm skorupki za pomocą kleszczy.
2. Przenieś jaja do plastikowego lub kartonowego uchwytu i umieść je pojedynczo pod mikroskopem stereoskopowym. Zidentyfikuj membranę powietrzną, a następnie usuń ją, wybierając mały otwór, w którym nie znaleziono żadnych naczyń. Pociągnij ten obszar za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych.
   UWAGA: Błonę powietrzną można zidentyfikować jako białą i nieprzezroczystą błonę obserwowaną natychmiast po zamknięciu jaja.
   1. Usuń wszelkie małe kawałki skorupki jaja, które mogą mieć kontakt z zarodkiem.
      UWAGA: Sprawdź, czy zarodki są w fazie 22 HH przed rozpoczęciem protokołu. Zarodki we wcześniejszych stadiach można zwrócić do inkubatora po uszczelnieniu okienka skorupki jaja taśmą.
3. Całkowicie otworzyć worek owodniowy, rozrywając owodnię za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Owodnię można zidentyfikować jako przezroczystą błonę, która ściśle pokrywa zarodek i jest wypełniona płynem owodniowym.
4. Ostrożnie wyjmij zarodek z komórki jajowej za pomocą kleszczy, a następnie przenieś na sterylną szalkę Petriego zawierającą lodowaty roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (1x PBS). Powtórz ten krok dla pozostałych jaj. Weź pod uwagę, że tylko ~8-10 zarodków wystarcza do uzyskania komórek mezodermalnych.
5. Umyj zarodki raz w lodowatym 1x PBS i za pomocą mikroskopu stereoskopowego (patrz Tabela materiałów) usuń wszelkie pozostałe błony. Zlokalizuj pąki kończyn tylnych.
   UWAGA: Zawiązki kończyn to zaokrąglone struktury położone wzdłuż osi przednio-tylnej zarodka jako wypukłości od boku. Kończyny tylne są położone bardziej z tyłu niż kończyny przednie.
6. Utrzymuj zarodki w czystości 1x PBS i za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych odetnij każdy pączek kończyny tylnej wzdłużnie. Przetnij pączek bardzo blisko boku zarodka, aby wyciąć całe pąki kończyn tylnych. Powtórz ten krok z pozostałymi zarodkami.
7. Użyj plastikowej pipety do przenoszenia, aby przenieść pąki kończyn do pustej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
8. Użyj końcówki pipety, aby usunąć nadmiar 1x PBS i zastąp PBS 500 μl 0,5% roztworu trypsyny (patrz Tabela materiałów). Inkubować pąki kończyn w termobloku przez 7 minut w temperaturze 37 °C.
9. Usunąć roztwór trypsyny i zastąpić go 500 μl kolagenazy typu IV w stężeniu 2 mg/ml w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (patrz tabela materiałów), a następnie inkubować go w termobloku w temperaturze 37 °C przez 8 min.
   UWAGA: Inkubacja trypsyny nieznacznie odrywa ektodermy, podczas gdy kolagenaza dezagreguje komórki mezodermalne.
10. Po inkubacji usuń jak najwięcej kolagenazy i zastąp ją 1 ml zimnej pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM-HG) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w celu dezaktywacji enzymów. Delikatnie odpipetować mieszaninę ~10 razy.
11. Przefiltrować zawiesinę zawierającą komórki za pomocą sitka do komórek o wielkości 70 μm, aby pozostawić ektodermy.
    UWAGA: Filtracja usunie również wszelkie niestrawione pąki kończyn, pozostawiając zawiesinę pojedynczych komórek.
12. Po przefiltrowaniu ponownie odpipetować zawiesinę 5-10 razy i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyrzucić supernatant.
13. Użyj 1 ml DMEM-HG uzupełnionego 10% FBS, aby zmyć nadmiar kolagenazy. Odwirować zawiesinę o sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
14. Ostrożnie odrzucić pożywkę przez pipetowanie, a następnie zastąpić ją 1 ml świeżego DMEM-HG uzupełnionego 10% FBS, nie naruszając komórek na dnie probówki.
15. Pozostawić komórki do uformowania zwartego osadu (reagregacji) po inkubacji przez 1-1,5 godziny w temperaturze 37 °C w termobloku.
    UWAGA: Podczas gdy komórki mezodermalne tworzą osad, wygodnie jest uzyskać ektodermę kończyny.

3. Uzyskanie ektodermy kończyn

1. Powtórzyć kroki 1-6 z sekcji 2 oddzielnie z pozostałymi 22 zarodkami kurcząt HH wybranymi do uzyskania ektoderm.
   UWAGA: Liczba zarodków do tego celu jest proporcjonalna do ostatecznej liczby pożądanego RL. Odpowiedni jest stosunek ektoderm-RL 2:1.
2. Po uzyskaniu pąków kończyn tylnych użyj plastikowej pipety, aby przenieść je do pustej probówki do mikrowirówki. Usuń nadmiar 1x PBS i zastąp go 500 μL 0,5% trypsyny w sterylnym 1x PBS. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w termobloku.
3. Po trawieniu enzymatycznym przenieś roztwór trypsyny zawierający pąki kończyn na sterylną szalkę Petriego.
4. Usuń nadmiar trypsyny tak bardzo, jak to możliwe, za pomocą mikropipety; zalej szalkę Petriego lodowatym 1x PBS uzupełnionym 10% FBS, aż wszystkie pąki kończyn zostaną pokryte.
   UWAGA: FBS można zastąpić surowicą końską.
5. Zidentyfikuj zawiązki kończyn pod mikroskopem stereoskopowym; zidentyfikuj ektodermę jako lekko oderwaną przezroczystą błonę od komórek mezodermalnych kończyn (Rysunek 1B).
6. Przytrzymaj najbardziej proksymalny koniec zawiązka kończyny za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych, jednocześnie ostrożnie odłączając i oddzielając warstwę ektodermy za pomocą innych kleszczy.
   UWAGA: Uzyskanie ektodermy może być trudne ze względu na zlepianie się komórek mezodermalnych i przyczepianie się do ektoderm, powodując w ten sposób ich lepkość. Zaleca się ciągłe odrzucanie komórek mezodermalnych, aby utrzymać tylko ektodermę na szalce Petriego.
7. Utrzymuj ektodermę w lodowatym roztworze 1x PBS-10% FBS.
   UWAGA: Ektodermy mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w przypadku, gdy zreagregowana mezoderma nie jest gotowa. Zaleca się jednak skoordynowanie czasu inkubacji osadu z uzyskaniem ektodermalnym.

4. Składanie komórek mezodermalnych wewnątrz pokrywy ektodermalnej

UWAGA: W tym celu konieczne jest umieszczenie pustych ektoderm na szalce Petriego z sterylnym roztworem 1x PBS-10% FBS zawierającym uformowaną osadę komórek mezodermalnych.

1. Po uformowaniu się osadu (patrz punkt 2) wyrzucić ~600 μl pożywki z probówki przez pipetowanie.
2. Ostrożnie oderwij granulkę od dna za pomocą końcówki pipety i nie rozbijając jej ani nie niszcząc.
3. Gdy osad zostanie całkowicie odłączony od dna probówki, odwróć probówkę do góry nogami, aby przenieść osad na szalkę Petriego zawierającą puste ektodermy (Rysunek 1C).
4. Wytnij mały kawałek granulki za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych i umieść go jak najbliżej ektodermy.
5. Jakby to była torba, otwórz ektodermę kleszczami chirurgicznymi i umieść kawałek granulki tak ciasno, jak to możliwe, w osłonie ektodermalnej. Powtórz ten krok dla tylu RL, ile jest potrzebne (Rysunek 1D).
   UWAGA: Pokrój kawałki granulatu jeden po drugim i napełnij ektodermy, aby utrzymać w czystości 1x PBS-10% roztwór FBS. Wielkość granulki musi odpowiadać każdej ektodermie.
6. Pozwól ektodermie i mezodermie zagoić się razem przez ~ 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przeszczep je do zarodka gospodarza. Wyrzuć niewykorzystaną ektodermę i mezodermę.

5. Przeszczepienie wypełnionej ektodermy do zarodka gospodarza
 

UWAGA: Przed przeszczepieniem ektoderm ustaw dwa mikroskopy stereoskopowe obok siebie na blacie, jeden do manipulacji zarodkami i szczepienia RL. Drugi służy do utrzymywania wypełnionych ektoderm w gotowości do przeniesienia do zarodka.

1. Wybierz liczbę żądanych komórek jajowych, aby przeszczepić wypełnione ektodermy.
2. Używając końca kleszczy, dotknij skorupki jaja 22 zarodków gospodarza HH, aby otworzyć okno. Zidentyfikuj błonę powietrzną i za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych usuń ją całkowicie.
3. Otwórz worek owodniowy w pobliżu kończyny przedniej, aby odsłonić prawy bok zarodka. Otwórz tylko tyle ilości, ile jest potrzebne do wykonania procedury.
4. Kierując się ułożeniem kończyn przednich, wykonaj drapanie rany igłą wolframową (patrz Tabela Materiałów) do długości 2-3 somitów, lekko uszkadzając mezodermę, aż do krwawienia.
5. Indywidualnie przenieś wypełnioną ektodermę (RL) do zarodka pisklęcia i umieść podstawę rekombinowanej kończyny na ranie somitowej.
   UWAGA: Przenoszenie RL można wykonać za pomocą plastikowej pipety lub kątowego noża do cięcia wzdłużnego.
6. Prawidłowo zamocuj RL za pomocą dwóch kawałków drutu palladowego o średnicy 0.025 mm i długości 0.5-1 mm (patrz Tabela materiałów). Dopasuj podstawę RL do rany, aby upewnić się, że zostanie ona przymocowana do boku zarodka gospodarza i unaczyniona (Rysunek 1E).
7. Uszczelnij okno taśmą i włóż jajo z powrotem do inkubatora. Zbierz zarodki w żądanych punktach czasowych do analizy.

Wyniki

Rozpoznawanie dobrze wykonanej rekombinowanej kończyny
Po przeszczepieniu zmanipulowane zarodki zostały zwrócone do inkubatora, aby umożliwić rozwój RL. Czas inkubacji korelował z wymaganiami eksperymentu. Niemniej jednak RL można łatwo odróżnić po 12 godzinach od implantacji. Aby ustalić, czy implantacja była odpowiednia, RL zaobserwowano jako wypukłość, która była bezpiecznie przymocowana do mezodermalnej ściany zarodka dawcy (Figura 2A). Wręcz przeciwnie, niezależnie od tego, c...

Dyskusja

Ogólnie rzecz biorąc, protokół RL można podzielić na pięć etapów: (1) inkubacja zarodków, (2) uzyskanie komórek mezodermalnych kończyn w celu wypełnienia ektoderm, (3) uzyskanie ektoderm, (4) montaż komórek mezodermalnych wewnątrz pokryw ektodermalnych oraz (5) przeszczepienie wypełnionych ektoderm do zarodków gospodarza. Głównym ograniczeniem techniki RL jest długi, szczegółowy protokół, który ma wiele krytycznych punktów, które wymagają cierpliwości, aby wykonać je prawidłowo. Aby pomyślnie ukończyć protokół, należy zi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Nóż kątowy	do cięcia Alcon	2,75 mm DB
Kleszcze	Fine Science Tools	11052-10
Kolagenaza typ IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Inkubator jaj	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Surowica bydlęca	płodu Gibco	16000069
Drobne kleszcze chirurgiczne	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Zrównoważony roztwór soli	Sigma	H6648
Mikrowirówka	Eppendorf	5417R
Mikropipeta	NA	NA Drut
palladowy	GoodFellow	7440 05-3
szalka Petriego	Gniazdo	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Mikroskop stereoskopowy	Zeiss	Stemi DV4
Taśma	NA	NA
Trypsyna świnia	Merck	9002 07-7
Igła wolframowa	GoodFellow	E74-15096/01