Method Article

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

DOI:

10.3791/63186

⸱

March 8th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerzuty to złożony proces, wymagający od komórek pokonywania barier, które tylko nie są w pełni modelowane przez testy in vitro. Stworzono systematyczny przepływ pracy przy użyciu solidnych, powtarzalnych modeli in vivo i ustandaryzowanych metod w celu identyfikacji nowych czynników powodujących przerzuty czerniaka. Takie podejście pozwala na wnioskowanie o danych na określonych etapach eksperymentalnych w celu precyzyjnego scharakteryzowania roli genu w przerzutach. Modele są tworzone poprzez wprowadzenie genetycznie zmodyfikowanych komórek czerniaka za pomocą wstrzyknięć dosercowych, śródskórnych lub podskórnych u myszy, a następnie monitorowanie za pomocą seryjnego obrazowania in vivo. Po osiągnięciu wcześniej ustalonych punktów końcowych pobiera się guzy pierwotne i/lub narządy z przerzutami i przetwarza je w celu przeprowadzenia różnych analiz. Komórki nowotworowe mogą być sortowane i poddawane dowolnej z kilku platform "omicznych", w tym sekwencjonowaniu RNA pojedynczych komórek. Narządy poddawane są obrazowaniu i analizom immunohistopatologicznym w celu ilościowego określenia ogólnego obciążenia przerzutami i odwzorowania ich specyficznej lokalizacji anatomicznej. Ten zoptymalizowany potok, w tym ustandaryzowane protokoły wszczepiania, monitorowania, pobierania tkanek, przetwarzania i analizy, może być zaadaptowany do krótkoterminowych hodowli pochodzących od pacjentów oraz ustalonych ludzkich i mysich linii komórkowych różnych typów raka litego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysoka śmiertelność związana z przerzutowym czerniakiem w połączeniu z rosnącą częstością występowania czerniaka na całym świecie1 (szacowany wzrost o 7,86% do 2025 roku) wymaga nowych metod leczenia. Postępy w odkrywaniu celów opierają się na odtwarzalnych modelach przerzutów, które są bardzo złożonym procesem. Na wszystkich etapach kaskady przerzutów komórki czerniaka muszą pokonać niezliczone bariery, aby osiągnąć unik układu odpornościowego i kolonizację odległych tkanek2. Odporność i zdolności adaptacyjne komórek czerniaka wynikają z wielu czynników, w tym z ich wysokiego obciążenia mutacjami genetycznymi

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Procedury dotyczące zwierząt zawarte w poniższym protokole zostały zatwierdzone przez New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Wszystkie zabiegi przeprowadzane są w placówkach zatwierdzonych przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Rysunek 1 przedstawia ogólne podejście eksperymentalne.

1. Krótkoterminowe posiewy czerniaka pochodzące od pacjenta (STC)

  1. Umieść tkankę na szalce Petriego o średnicy 60 mm z 1 ml kompletnego RPMI (RPMI 1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 m....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższe rysunki ilustrują, w jaki sposób opisany przepływ pracy został zastosowany do identyfikacji nowych czynników powodujących przerzuty czerniaka. Rysunek 2 podsumowuje wyniki opublikowanego badania, w którym badano efekty wyciszenia fukozylotransferazy FUT8 w przerzutach czerniaka in vivo26. Krótko mówiąc, analiza danych glikomicznych (uzyskanych za pomocą macierzy lektynowych) i profilowanie transkryptomiczne wykazały zwiększone poziomy alfa-1,6-fukozy.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego raportu technicznego jest zaoferowanie ustandaryzowanego, kompleksowego przepływu pracy do badania potencjalnych aktorów w przerzutach czerniaka. Ponieważ eksperymenty in vivo mogą być kosztowne i czasochłonne, kluczowe znaczenie mają strategie maksymalizacji wydajności i zwiększenia wartości uzyskanych informacji.

Konieczne jest stosowanie uzupełniających się podejść w celu walidacji krzyżowej wyników w ramach tego samego eksperymentu. Na przykład zarówno barwienie immunoh.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Wydziałowi Zaawansowanych Technologii Badawczych (DART) w NYU Langone Health, a w szczególności Laboratorium Badań nad Patologią Eksperymentalną, Centrum Technologii Genomu, Laboratorium Cytometrii i Sortowania Komórek, Rdzeniu Obrazowania Przedklinicznego, które są częściowo wspierane przez Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087. Dziękujemy NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) za zapewnienie dostępu do krótkoterminowych hodowli czerniaka pochodzących od pacjentów+ (10-230BM i 12-273BM), które zostały uzyskane za pomocą zatwierdzonych przez IRB protokołów (badanie Universal Consent #s16-00122 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#15 Ostrze Scapel WPI500242Do zabiegów chirurgicznych
#3 Uchwyt ScapelWPI500236Do zabiegów chirurgicznych
1 ml strzykawka tuberkulinowa, końcówka wsuwana Strzykawkado wstrzykiwań BD309626
10 ml, końcówka ślizgowa BD301029Perfuzja
10% Formalina Bufor SoduEK Industries4499-20LDo perfuzji / utrwalacza tkankowego
15 ml StożkoweCorning 430052Hodowla komórkowa
15 ml Stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenuFalcon352196Hodowla komórkowa
200 Proof EthanolDeacon Labs04-355-223Histologia
Igła 22G i ndash; 22mmBD305156Perfuzja
4-0 Vicryl SzewEthiconJ464GSzew
4% buforowany fosforanem Carsona paraformaldehyd EMS15733-10Do perfuzji/utrwalacza tkankowego
40µ mCorning431750Przetwarzanie tkanek
5-0 Szew wchłanialny Ethicon6542000Zamknięcie
50 ml stożkowe Corning 430828Hodowla komórkowa
50 ml stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenuFalcon352070Hodowla komórkowa
7-0 Szew jedwabny FST18020-70Ligatura
70&mikro; mCorning431751Przetwarzanie tkanek
Antyblaknięcie mediów montażowych   Vector LabsH-1000-10Aproksymator immunofluorescencyjny
z kleszczami, 10cm WPI14189Do zabiegów mikrochirurgicznych
Konsola AvanceBruker3 HDNMR 
Specyfikacja biologiczna 7030 Bruker7030Micro MRI
BSABioregA941NuMA Staining
Kleszcze do szycia Castroviejo, proste końcówki platforma do wiązania 5,5 mm, 11cm WPIWP5025501Do zabiegów mikrochirurgicznych
Słoik do barwienia CoplinBel-Art F44208-1000Histologia
DAPISigma-AldrichD9542-1MGImmunofluorescencja
dCas9-KRABAddgene110820Manipulacja genetyczna
DNaza INEBM0303LPrzetwarzanie tkanek
DPBSCorning21-030-CMPrzetwarzanie tkanek
Extra Sharp Uncoated Single Edge BladeGEM62-0167Przetwarzanie tkanek
Podłoże macierzy zewnątrzkomórkowej Corning354234rozważyć zredukowany czynnik wzrostu ( jako alternatywę 
FBSCytivaSH30910.03Hodowla komórkowa
Fidżi Obraz JFidżi Obraz JOprogramowanieImmunofluorescencja
Koza anty-królik HRP sprzężony multimer Thermo FisherA16104NuMA Barwienie
Koziej SurowicyGibcoPCN5000Immunofluorescencja
HBSSCorning21-020-CVPrzetwarzanie tkanek
Hematoksylina Richard-Allan Naukowy 7231
Histologia Illumina III PerkinElmerCLS136334BLI Instrument
Strzykawka insulinowa 28G - igła 8mmBD329424Zastrzyki
Strzykawka insulinowa 31G - igła 6mm BD326730Kleszcze do iniekcji
tęczówki, 10,2 cm, pełna krzywa, ząbkowaneWPI504478Do zabiegów perfuzji i zabiegów chirurgicznych
Isoflurane USPCovetrus11695067772Anesthesia
Jewelers #7 Kleszcze Tytan 11 cm 0,07 x 0,01 mm KońcówkaWPIWP6570Do zabiegów mikrochirurgicznych
Ketamina HCl 100mg/mLMylan Ind.1049007Anesthesia
lentiCRISPRv2Addgene98290Manipulacja genetyczna
Lycopersicon Esculentum (Pomidor) Lectin, DyLight 649InvitrogenL32472Marker komórek śródbłonka naczyń krwionośnych
MEM endogenne aminokwasy X 100Corning25-025-CIHodowla komórkowa
Metzenbaum NożyczkiWPI503269Do chirurgii procedury
Jednostka do mikroiniekcjiKOPF5000Iniekcje dosercowe
NaClFisherS25877 Barwienie NuMA
Igła 30G x 25mmBD305128Igła do iniekcji dosercowych
33G x 15mmHamilton7747-01iniekcji doszyjnej
, Castroviejo, 14cm, z zamkiem, szczęki ząbkowane 1,2mmWPI14137-GDo zabiegów mikrochirurgicznych
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJMyszy Laboratorium Jacksona005557Myszy
model mysi NU/JLaboratorium Jacksonamodelmysi
002019 Jądrowy aparat mitotyczny Białko poliklonalny królik anty-ludzki Abcam97585NuMA Barwienie
penicyliny-streptomycyny 10000U / mlGibco15140122Hodowla komórkowa
PercollGE0891-01roztwór do separacji gęstości 
PI Klasyczne rękawice chirurgiczneCardinal Health2D72PT75XChirurgia
pLKO Tet-OnAddgene21915Manipulacja genetyczna
Powidon-jod 10% roztwór MedlineMDS093943Surgery Krople
proparakainy 0,5%Akorn PharmaAX0501Okulistyczne znieczulenie miejscowe
Puralube Wazelina Maść okulistycznaDechra83592anestezjologiczna
Ostrza o podwójnej krawędzi EMS72000Golenie i wibrotomowe krojenie mózgu 
Klips Reflex 9mm EZ Drzewo mózgoweEZC-  ZESTAWZamykanie ran
RPMI 1640 Corning10-040-CMNożyczki do hodowli komórkowych
, sprężyna 10,5 cm Str, ostrza 8 mmWPI501235Do zabiegów mikrochirurgicznych
Półautomatyczne wibrujące ostrze MikrotomLeicaVT1200Brain Slice Immunofluorescencyjny
jednokanałowy system waporyzacji anestezjologicznejKent ScientificVetFlo-1210S znieczulenie
System komór stołowych Smartbox i dmuchawa wyciągowaEZ SystemsTT4000CO2 Eutanazja
Sterylna ozdobna jednorazowa serwetaMedlineNON21002Surgery
Sterylne niewzmocnione fartuchy chirurgiczne Aurora z wszytymi rękawamiMedlineDYNJP2715
Surgery T25 FlaskCorning 430639Hodowla komórkowa
TrisCorning46-031-CMNuMA Barwienie
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500MLImmunofluorescencyjne
kleszcze do wiązania Troutman, 10 cm, zakrzywiony wzór G, końcówka 0,52 mm z platformą do wiązaniaWPIWP505210Do zabiegów mikrochirurgicznych
Klipsy do naczyń 10G Ciśnienie 5x 0,8 mm Szczęki, 5 / sztWPI15911Do zabiegi mikrochirurgiczne
VisiopharmVisiopharmVisiopharm NuMAOprogramowanie do barwienia
Ksylazyna 100 mg / mlAkorn Pharma59399-111-50Znieczulenie
KsylenFisherX3P-1GALHistologia
Uchwyt igły do , , , Żyletka .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Melanoma MetastasisIn Vivo ModelsIntracardiac InjectionIntradermal InjectionSubcutaneous InjectionBioluminescence ImagingTumor Cell SortingSingle Cell RNA SequencingImmunohistopathologyMetastasis Suppressor

Related Articles