Artykuł metodologiczny

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

DOI:

10.3791/63186

⸱

8 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerzuty to złożony proces, wymagający od komórek pokonywania barier, które tylko nie są w pełni modelowane przez testy in vitro. Stworzono systematyczny przepływ pracy przy użyciu solidnych, powtarzalnych modeli in vivo i ustandaryzowanych metod w celu identyfikacji nowych czynników powodujących przerzuty czerniaka. Takie podejście pozwala na wnioskowanie o danych na określonych etapach eksperymentalnych w celu precyzyjnego scharakteryzowania roli genu w przerzutach. Modele są tworzone poprzez wprowadzenie genetycznie zmodyfikowanych komórek czerniaka za pomocą wstrzyknięć dosercowych, śródskórnych lub podskórnych u myszy, a następnie monitorowanie za pomocą seryjnego obrazowania in vivo. Po osiągnięciu wcześniej ustalonych punktów końcowych pobiera się guzy pierwotne i/lub narządy z przerzutami i przetwarza je w celu przeprowadzenia różnych analiz. Komórki nowotworowe mogą być sortowane i poddawane dowolnej z kilku platform "omicznych", w tym sekwencjonowaniu RNA pojedynczych komórek. Narządy poddawane są obrazowaniu i analizom immunohistopatologicznym w celu ilościowego określenia ogólnego obciążenia przerzutami i odwzorowania ich specyficznej lokalizacji anatomicznej. Ten zoptymalizowany potok, w tym ustandaryzowane protokoły wszczepiania, monitorowania, pobierania tkanek, przetwarzania i analizy, może być zaadaptowany do krótkoterminowych hodowli pochodzących od pacjentów oraz ustalonych ludzkich i mysich linii komórkowych różnych typów raka litego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysoka śmiertelność związana z przerzutowym czerniakiem w połączeniu z rosnącą częstością występowania czerniaka na całym świecie1 (szacowany wzrost o 7,86% do 2025 roku) wymaga nowych metod leczenia. Postępy w odkrywaniu celów opierają się na odtwarzalnych modelach przerzutów, które są bardzo złożonym procesem. Na wszystkich etapach kaskady przerzutów komórki czerniaka muszą pokonać niezliczone bariery, aby osiągnąć unik układu odpornościowego i kolonizację odległych tkanek2. Odporność i zdolności adaptacyjne komórek czerniaka wynikają z wielu czynników, w tym z ich wysokiego obciążenia mutacjami genetycznymi3 i ich pochodzenia grzebienia nerwowego, które nadają kluczową plastyczność fenotypową3,4,5. Na każdym etapie programy transkrypcyjne umożliwiają komórkom czerniaka z przerzutami przejście z jednego stanu w drugi w oparciu o wskazówki z przesłuchu z mikrośrodowiskiem, obejmującym układ odpornościowy6, środowisko zewnątrzkomórkowe7,8 oraz komórkową architekturę barier fizycznych9 z którymi się stykają. Na przykład komórki czerniaka unikają nadzoru immunologicznego poprzez obniżenie ekspresji ważnych czynników wydzielanych przez nowotwór 6.

Badania opisują "niszę premetastatyczną", w której komórki czerniaka wydzielają chemokiny i cytokiny, aby przygotować odległy "docelowy" narząd do przerzutów10. Odkrycia te rodzą ważne pytania dotyczące tropizmu narządowego komórek czerniaka z przerzutami i anatomicznej drogi, jaką pokonują, aby uzyskać dostęp do odległych tkanek. Wiadomo, że po wewnątrznaczynieniu komórki czerniaka dają przerzuty przez układ limfatyczny (rozprzestrzenianie się limfatyczne) i naczynia krwionośne (rozprzestrzenianie się krwiopochodne)2,11. Podczas gdy większość pacjentów ma zlokalizowaną chorobę, niewielka podgrupa przypadków objawia się odległą chorobą przerzutową i brakiem rozsiewu limfatycznego (ujemne zajęcie węzłów chłonnych)11, co sugeruje istnienie alternatywnych ścieżek przerzutów dla czerniaka.

Gdy komórki czerniaka kolonizują miejsce przerzutów, przechodzą adaptacje epigenetyczne i metaboliczne12,13. Aby uzyskać dostęp do nowych przedziałów i zaatakować je, komórki czerniaka wykorzystują proteazy14 i modyfikacje cytoszkieletu11,15, które umożliwiają im przejście do nowego miejsca i wzrost w nim. Trudność w celowaniu w komórki czerniaka polega na złożoności i liczbie takich adaptacji; W związku z tym dziedzina powinna dołożyć starań, aby eksperymentalnie odtworzyć jak najwięcej kroków i adaptacji. Pomimo licznych postępów w testach in vitro, takich jak organoidy i hodowle 3D16,17, modele te tylko nie w pełni podsumowują kaskadę przerzutów in vivo.

Mysie modele wykazały wartość, osiągając równowagę między odtwarzalnością, techniczną wykonalnością i symulacją ludzkiej choroby. Wewnątrznaczyniowe, ortotopowo i heterotopowo wszczepione komórki czerniaka z ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów lub krótkoterminowych hodowli myszom z obniżoną odpornością lub humanizowanym stanowią podstawę odkrycia celu w przerzutowym czerniaku. Jednak systemy te często nie mają kluczowego biologicznego ograniczenia przerzutów: układu odpornościowego. Modele przerzutów czerniaka syngenicznego, które mają to ograniczenie, są stosunkowo rzadkie w tej dziedzinie. Systemy te, opracowane u myszy immunokompetentnych, w tym B16-F1018, rodzina linii komórkowych YUMM19, SM120, D4M321, RIM322 lub ostatnio RMS23 i M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 linie komórkowe czerniaka, ułatwiają badanie złożonej roli odpowiedzi immunologicznej gospodarza w czerniaku postęp.

Tutaj przedstawiono proces identyfikacji celu przerzutów czerniaka. Wraz z rosnącą liczbą i większymi zbiorami danych "omicznych" generowanymi z kohort pacjentów z czerniakiem, postulujemy, że badania o największej potencjalności klinicznej to te, które wynikają z integracji dużych zbiorów danych, prowadząc do skrupulatnych funkcjonalnych i mechanistycznych przesłuchań25,26,27,28. Wykorzystując modele mysie do badania potencjalnych celów w procesie przerzutowym, można uwzględnić zdarzenia specyficzne dla in vivo i interakcje tkankowe, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo translacji klinicznej. Przedstawiono wiele metod ilościowego określania obciążenia przerzutami, dostarczając uzupełniających się danych na temat wyników danego eksperymentu. Opisano protokół izolacji pojedynczych komórek z guzów w różnych narządach, aby pomóc w bezstronnej charakterystyce ekspresji genów w komórkach przerzutowych, które mogą poprzedzać sekwencjonowanie pojedynczej komórki lub masowego RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Procedury dotyczące zwierząt zawarte w poniższym protokole zostały zatwierdzone przez New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Wszystkie zabiegi przeprowadzane są w placówkach zatwierdzonych przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Rysunek 1 przedstawia ogólne podejście eksperymentalne.

1. Krótkoterminowe posiewy czerniaka pochodzące od pacjenta (STC)

  1. Umieść tkankę na szalce Petriego o średnicy 60 mm z 1 ml kompletnego RPMI (RPMI 1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 1x roztworem aminokwasów endogennych MEM i penicyliną (100 IU/ml)/streptomycyną (100 μg/ml)).
    UWAGA: Aby zwiększyć stosunek komórek nowotworowych, w razie potrzeby wypreparuj i usuń tkankę otaczającą guz na szalce Petriego, pod mikroskopem, używając sterylnych narzędzi chirurgicznych.
  2. Świeżą tkankę drobno pokrój za pomocą wysterylizowanych żyletek w kostkę o średnicy 1-2 mm. Dodać 4 ml kompletnego RPMI i odpipetować zawartość płytki w górę i w dół 5-10 razy pipetą serologiczną o pojemności 10 ml.
  3. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml i odwirować komórki (180 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C). Odessać supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml świeżej pożywki i przenieść zawiesinę do kolby do hodowli tkankowycho średnicy 25 cm2.
  4. Aby ułatwić przyczepienie się fragmentów tkanek do dna, należy ustawić kolbę przechyloną pod kątem 20°-30° w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 20 minut.
  5. Położyć kolbę płasko, aby pożywka pokryła tkankę, i codziennie sprawdzać stan hodowli. Podziel komórki, gdy osiągną 90-100% zbieżności. Utrzymuj krótkotrwałe kultury na "niskiej" liczbie pasaży.
    UWAGA: STC zostaną ustanowione około 2 miesiące po izolacji i hodowli komórek, chociaż rzeczywisty czas różni się w zależności od próbek i typów guza. Po 10 do 14 pasażach linie komórkowe osiągają 100% czystości, zawierając tylko komórki czerniaka29. Próg liczby pasaży jest określany empirycznie przez obserwację zmian w morfologii komórki, czasie podwojenia i zachowaniu in vivo. Aby zachować heterogeniczność i inne cechy guza rodzicielskiego, nie należy dzielić komórek więcej niż 1:5.
  6. Po ustaleniu STC i z dowolnym modelem linii komórkowej, który ma być wstrzyknięty zwierzętom, zgodnie z opisem w kolejnych krokach, transdukuj komórki za pomocą reportera.
    UWAGA: Znacznik fluorescencyjny (np. białko czerwonej fluorescencji (RFP), białko zielonej fluorescencji (GFP)), na przykład, umożliwia obrazowanie immunofluorescencyjne ex vivo i sortowanie komórek nowotworowych za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Lucyferazy umożliwiają obrazowanie bioluminescencyjne in vivo, które jest użytecznym narzędziem do monitorowania postępu eksperymentu (sekcja 4).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat ilustrujący opisany przebieg pracy, od integracji danych pacjenta do generowania i analizy danych in vivo od myszy. Skróty: LOF = utrata funkcji; GOF = wzmocnienie funkcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Implantacja ksenoprzeszczepu

UWAGA: Opisane tutaj procedury eksperymentalne są przeprowadzane na myszach, które mają upośledzony adaptacyjny i wrodzony układ odpornościowy, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG); lub u myszy, które nie mają tylko odporności adaptacyjnej, takich jak myszy z niedoborem limfocytów T arytmiczne/nagie (NU/J). Zwierzęta są płci męskiej, w wieku od 8 do 10 tygodni. Samice często wykazują dużą częstość występowania przerzutów gonad po wstrzyknięciu dosercowym komórek nowotworowych, co skraca ich przeżycie.

  1. Do wstrzykiwań podskórnych i śródskórnych należy przygotować zawiesinę komórkową w stosunku 1:1, mieszając jedną część komórek zawieszoną w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco z jedną częścią rozmrożonego substratu macierzy zewnątrzkomórkowej (EMS) i przechowywać na lodzie w temperaturze 4 °C. W przypadku wstrzyknięć donaczyniowych (dosercowych, szyjnych, zaoczodołowych, do żyły ogonowej lub śledziony) należy zawiesić komórki tylko w DPBS.
    UWAGA: Objętość odpowiednia do wstrzyknięć śródskórnych powinna być utrzymywana na jak najniższym poziomie (30 μl). W przypadku wstrzyknięć podskórnych objętość wstrzykniętego leku może wzrosnąć do 150 μl, a w przypadku wstrzyknięć donaczyniowych do 250 μl (w zależności od masy ciała zwierzęcia). Dodać do końcowej zawiesiny komórek 10-30% dodatkowej objętości wstrzykniętego wstrzykiwacza, w zależności od ilości wstrzykniętej i użytej strzykawki do obliczenia martwej objętości wewnątrz końcówki poślizgu i igły (np. strzykawka tuberkulinowa o pojemności 1 ml z igłą 30 G, 25 mm ma objętość martwą 100 μl).
  2. Przeprowadź pilotaż, aby scharakteryzować zachowanie używanych linii komórkowych i oś czasu progresji guza in vivo. W przypadku wstrzyknięć śródskórnych należy rozpocząć od wstrzyknięcia od 1 000 do 50 000 komórek/30 μl. W przypadku wstrzyknięć podskórnych należy rozpocząć od wstrzyknięcia 10 000 do 2 × 106 komórek/150 μl. W przypadku wstrzyknięć donaczyniowych (dosercowych, szyjnych, zaoczodołowych i śledzionowych) należy zacząć od wstrzyknięcia 50 000 komórek/150 μl.
    UWAGA: Wstrzyknięcia wewnątrznaczyniowe predysponują zwierzęta do zdarzeń zatorowych, albo poprzez wprowadzenie powietrza do układu krążenia, albo poprzez użycie nadmiernej liczby komórek, które zamykają małe naczynia. Dobrze wymieszaj zawiesinę komórkową, aby uniknąć zbrylania. Zalać strzykawkę przed załadowaniem zawiesiny komórek. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z wnętrza strzykawki. Zawiesinę/strzykawki z komórek należy przechowywać na lodzie do czasu naładowania i wstrzyknięcia.
  3. Podawać znieczulenie wziewnie. Ustawić regulator poziomu tlenu w zakresie 1-2 l/min. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej z parownikiem izofluranu ustawionym na 2,5-5% do indukcji i 1,5-3% do konserwacji.
    UWAGA: Monitoruj oddech i tętno zwierzęcia w fazie indukcji znieczulenia. Nie zostawiaj zwierzęcia bez opieki. Nie monitoruj więcej niż jednego zwierzęcia jednocześnie. Miano środka znieczulającego zależy od masy ciała zwierzęcia.
  4. Przenieś zwierzę z komory indukcyjnej do stożka nosowego. Nałóż sterylną maść okulistyczną wazeliny na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.
  5. Ogolić miejsce zabiegu prostą żyletką nachyloną pod kątem 30°. Oczyść skórę obszaru zabiegowego wacikami nasączonymi 70% alkoholem izopropylowym. Przed podjęciem jakichkolwiek dalszych kroków oceń, czy poziom znieczulenia jest wystarczający za pomocą odruchu pedałowania.
  6. W przypadku wstrzyknięć śródskórnych całą procedurę należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować warunki aseptyki.
    1. Znieczulić i ogolić zwierzę zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.5.
    2. Chwyć i cofnij skórę do tyłu w kierunku trajektorii ukłucia igłą. Za pomocą igły do strzykawki insulinowej 31 G o długości 6 mm, trzymanej pod ostrym kątem, delikatnie nakłuć skórę skosem skierowanym do góry.
    3. Poczuj zwolnienie nacisku na końcówce igły. Przesuwaj się delikatnie, aby pozostać w komorze śródskórnej i nie przechodzić przez całą głębokość skóry do tkanki podskórnej. Kluczowe objawy: W przypadku wsunięcia się do przestrzeni podskórnej należy usunąć igłę, zmienić miejsce wstrzyknięcia i ponownie wprowadzić igłę. Powoli wstrzykiwać całą objętość (30 μl) zawiesiny komórek, aż do zaobserwowania bąbla w kształcie kopuły.
      UWAGA: Małe objętości wstrzyknięć spowodują mniejsze rozwarstwienie warstw skóry i mniejsze zniekształcenia architektoniczne.
    4. Trzymaj igłę w środku i policz do 5,
      UWAGA: EMS staje się lepki w temperaturze ciała, co pomaga uniknąć cofania się przez ranę po wkłuciu igły.
    5. Usuń igłę i umieść zwierzę w klatce na ciepłej podkładce, aby mogło dojść do siebie. Po odzyskaniu przytomności zwierzę należy umieścić w klatce wiwarium, gdy jest w stanie mostka i w ruchu.
      UWAGA: Monitoruj zwierzę w sposób ciągły podczas wszystkich procedur opisanych w niniejszym protokole. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki ani nie monitoruj więcej niż jednego zwierzęcia jednocześnie.
    6. Monitoruj postęp wzrostu guza, utratę masy ciała i ogólny stan zdrowia we współpracy z personelem weterynaryjnym codziennie w początkowej fazie wzrostu i intensywniej, jeśli to konieczne, po tym, jak zwierzęta zaczną tracić na wadze. Podczas tych sesji monitorujących: zważ zwierzęta i narysuj wykres, aby monitorować utratę masy ciała i sprawdzić, czy nie ma oznak owrzodzenia guza, objawów neurologicznych, lokomotorycznych i / lub behawioralnych (letarg, brak pielęgnacji, niskie spożycie pokarmu lub wody).
      UWAGA: Poddaj zwierzęta eutanazji natychmiast po zaobserwowaniu oznak zaawansowanej choroby (utrata masy ciała o ponad 20%, ocena kondycji ciała <2, skrajnie obniżony poziom aktywności, paraliż lub drgawki). Należy zastosować metodę eutanazji zatwierdzoną przez IACUC instytucji (np. zautomatyzowana komora stołowa CO2 jest używana do wystawiania zwierząt na działanie CO2 przez 15 minut, a następnie stosuje się wtórną metodę eutanazji, zwichnięcie szyjki macicy, dekapitację lub odmę opłucnową wywołaną obustronnie przez nacięcie klatki piersiowej).
    7. Wykonaj pomiary suwmiarką i użyj wymiarów długości (L) i szerokości (W) guza, aby obliczyć objętość (V) za pomocą wzoru:
      figure-protocol-2
  7. Do wstrzykiwań podskórnych:
    1. Wykonaj całą procedurę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać warunki aseptyki26,27.
    2. Znieczulić i ogolić zwierzę zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.5.
    3. Za pomocą igły do strzykawki insulinowej o strzykawce insulinowej o długości od 28 G do 31 G o długości 6 mm, trzymanej pod ostrym kątem, delikatnie nakłuć skórę skosem skierowanym do góry. Poczuj dwukrotne zwolnienie nacisku na końcówce igły podczas przechodzenia przez naskórek, skórę właściwą i tkankę podskórną.
      UWAGA: Drugi raz wyczuwalne jest zwolnienie ciśnienia na końcu igły, co oznacza, że osiągnięto komorę podskórną.
    4. Powoli wstrzykiwać całą objętość (30-150 μl) zawiesiny komórek, aż do zaobserwowania wydłużonego bąbla w kształcie elipsy. Trzymaj igłę w środku i policz do 5. Policz do 10 dla większych objętości (powyżej 50 μl).
      UWAGA: EMS staje się lepki w temperaturze ciała, co pomaga uniknąć cofania się przez ranę po wkłuciu igły.
    5. Usuń igłę i umieść zwierzę w klatce na ciepłej podkładce, aby mogło dojść do siebie. Po odzyskaniu przytomności zwierzę należy umieścić z powrotem w klatce wiwarium, gdy jest w stanie mostka i chodzenia.
      UWAGA: Podczas monitorowania pozabiegowego należy obserwować, czy nie ma żadnych oznak powikłań (niska częstość oddechów, krwawienie, powolny powrót do zdrowia) i odpowiednio się nimi zająć. Jeśli nie obserwuje się poprawy, należy przejść do procedur humanitarnej eutanazji opisanych w UWAGA do kroku 2.6.6.
    6. Monitoruj zwierzę pod kątem wzrostu guza, utraty masy ciała i ogólnego stanu zdrowia, jak opisano w krokach 2.6.6-2.6.7.
  8. Do wstrzyknięć dosercowych:
    1. Wykonaj całą procedurę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać warunki aseptyki26,30.
    2. Znieczulić zwierzę zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.4.
    3. Przenieś zwierzę na podgrzewaną platformę aparatu USG i przymocuj je hipoalergiczną taśmą do stożka nosowego.
    4. Ogol klatkę piersiową prostą żyletką nachyloną pod kątem 30°. Oczyść skórę obszaru zabiegowego 3 aplikacjami 10% jodowidonu na przemian z 3 aplikacjami alkoholu izopropylowego.
    5. Przed podjęciem jakichkolwiek dalszych kroków oceń, czy poziom znieczulenia jest wystarczający za pomocą odruchu pedałowania. Nałóż żel ultradźwiękowy na miejsce zabiegu.
    6. Uchwyć okno serca za pomocą sondy ultradźwiękowej. Umieść sondę ultrasonograficzną na środku klatki piersiowej po lewej stronie zwierzęcia, aby uchwycić poziome okno zorientowane w celu uzyskania widoku przekroju poprzecznego (krótka oś) lewej komory. Upewniając się, że długa oś sondy jest skierowana do góry, zamocuj sondę pod kątem 50°, a podgrzewaną platformę pod kątem 20°. Zablokuj sondę i ramę nośną na miejscu.
    7. Podczas pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego należy pobrać zawiesinę komórek w strzykawce tuberkulinowej o pojemności 1 ml z igłą 30 G, 25 mm. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki.
      UWAGA: Ważne jest, aby stworzyć i utrzymać zawiesinę jednokomórkową podczas przetwarzania i wstrzykiwania komórek. Usunięcie pęcherzyków powietrza jest ważnym krokiem w celu uniknięcia zatoru powietrznego. Dobrze przygotowany system strzykawka-igła zapobiegnie możliwym do uniknięcia zgonom w grupie eksperymentalnej. Do strzykawki należy zawsze pobrać większą objętość niż zostanie wstrzyknięta. Dodatkowa objętość pomoże usunąć powietrze poprzez wstrzyknięcie części zawiesiny komórek z powrotem do probówki o pojemności 1,5 ml.
    8. Zablokować strzykawkę w wstrzykiwaczu stereotaktycznym. Pod kontrolą USG wsuń igłę przez ścianę klatki piersiowej do lewej komory serca. Powoli wstrzyknąć całą objętość (100-250 μl) zawiesiny komórek.
    9. Usuń igłę i umieść zwierzę w klatce na ciepłej podkładce, aby mogło dojść do siebie. Po odzyskaniu przytomności zwierzę należy umieścić w klatce wiwarium, gdy jest w stanie mostka i w ruchu. Monitoruj zwierzę pod kątem wzrostu guza, utraty masy ciała i ogólnego stanu zdrowia, jak opisano w kroku 2.6.6.
  9. Do wstrzykiwań do tętnicy szyjnej:
    1. Całą procedurę należy wykonać na odpowiednio zdezynfekowanej powierzchni, aby pomóc w utrzymaniu warunków aseptycznych30.
    2. Znieczulić zwierzę koktajlem ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe za pomocą strzykawki insulinowej, igły 28 G. Nałóż sterylną maść okulistyczną wazeliny na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.
    3. Ogol obszar zabiegowy prostą żyletką nachyloną pod kątem 30°. Przed podjęciem jakichkolwiek dalszych kroków oceń, czy poziom znieczulenia jest wystarczający za pomocą odruchu pedałowania.
    4. Umieść zwierzę pod mikroskopem stereoskopowym na podkładce rozgrzewającej. Oczyść skórę obszaru zabiegowego 3 aplikacjami 10% jodowidonu na przemian z 3 aplikacjami alkoholu izopropylowego.
    5. Zakładaj sterylne środki ochrony osobistej (PPE) i sterylne rękawice. Przygotuj sterylne pole, kładąc sterylną serwetę na ciele zwierzęcia.
      UWAGA: Jeśli sterylna serweta nie ma otworu odpowiedniego do wielkości i miejsca nacięcia, złóż serwetkę na pół i za pomocą nożyczek Metzenbaum wyciąć otwór o odpowiednim rozmiarze na środku sterylnej serwety.
    6. Użyj skalpela lub nożyczek do tęczówki, aby naciąć skórę od połowy szyi do mostka. Za pomocą dwóch kleszczy mikrochirurgicznych tępo rozetnij 2 gruczoły ślinowe podżuchwowe w płaszczyźnie linii środkowej. W razie potrzeby użyj kauteryzacji elektrycznej do hemostazy.
    7. Rozetnij powięź otaczającą tętnicę szyjną wspólną (CCA) od manubracji w kierunku rozwidlenia i kontynuuj przyśrodkowo, aby uwolnić tylną ścianę tętnicy szyjnej zewnętrznej. Tymczasowo przyciąć tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) przed wstrzyknięciem.
      UWAGA: Podczas preparacji na obwodzie CCA należy uważać, aby nie uszkodzić nerwu błędnego (leży bocznie do tętnicy).
    8. Zawiesinę komórek należy umieścić w strzykawce o pojemności 1 ml z igłą 33 g i średnicy 15 mm.
    9. Przełóż dwie ligatury 7-0 pod CCA i wykonaj luźny węzeł instrumentu dla każdej z dwóch ligatur. Użyj zacisku do zbiornika ciśnieniowego o pojemności 5 mm i 10 G i tymczasowo przypnij ECA. Zawiąż bliższą ligaturę; następnie luźno zawiąż dystalną ligaturę (obok rozwidlenia CCA). Pętlę dystalną należy zastosować później, aby zatamować krwawienie po wstrzyknięciu.
    10. Za pomocą strzykawki z igłą 33 G, 15 mm delikatnie nakłuć CCA skosem igły skierowanym do góry i pod ostrym kątem. Powoli wstrzykiwać całą objętość (50-150 μl) zawiesiny komórek.
    11. Chwyć dystalną pętlę kleszczami i unieś ją, jednocześnie wyjmując igłę, aby zamknąć światło CCA i zatrzymać krwawienie. Wymień strzykawkę na kleszcze jubilerskie #7 i zawiąż dystalną pętlę.
    12. Zarzuć kolejny węzeł instrumentu na dystalną ligaturę i zdejmij zacisk naczynia z ECA. Kontroluj pole operacyjne pod kątem krwawienia i kauteryzuj wszelkie krwawiące naczynia przed zamknięciem. Użyj zszywki o średnicy 9 mm, aby zamknąć skórę zwierzęcia i umieść zwierzę na ciepłej podkładce, aby wyzdrowiało.
      UWAGA: Usuń zszywki 7-10 dni po zabiegu.
    13. Podawać podskórnie leki przeciwbólowe - buprenorfinę (0,3 mg/ml) co 12 godzin przez 72 godziny po operacji w stężeniu 0,1 mg / kg.
      UWAGA: Alternatywnie rozważ zastosowanie leku przeciwbólowego o przedłużonym uwalnianiu, który wymaga 1 dawki co 72 godziny.
    14. Po odzyskaniu przytomności zwierzę należy umieścić w klatce wiwarium, gdy jest w stanie mostka i w ruchu. Codziennie monitoruj zwierzęta po operacji pod kątem oznak zakażenia lub bólu miejsca operowanego, ogólnego stanu zdrowia i powikłań.
      UWAGA: Zwierzęta, które nie wracają dobrze do zdrowia po operacji przeżycia, mogą otrzymać dodatkowe dawki leków przeciwbólowych i zostaną uśpione w sposób humanitarny, jeśli nie zostaną w pełni wyleczone do 72 godzin po operacji.
    15. Monitoruj zwierzę pod kątem wzrostu guza, utraty masy ciała i ogólnego stanu zdrowia, jak opisano w kroku 2.6.6.
  10. Do iniekcji zaoczodołowych:
    UWAGA: Technikę tę należy stosować jako alternatywę dla iniekcji do żył ogonowych, gdy operator jest przeszkolony i biegły w tej technice oraz gdy istnieje silne uzasadnienie naukowe. Zawiesiny komórkowe dostarczane tą drogą mogą indukować wzrost guza w przestrzeni zaoczodołowej; Dlatego przy wyborze tej techniki należy dokładnie rozważyć ryzyko i korzyści. Na przykład, aby skorzystać z bezpośredniego połączenia krążenia zatoki żylnej zaoczodołowej z żyłami śródmózgowymi za pomocą zespoleń, wybierz tę metodę, gdy tworzenie guza mózgu nie powiodło się przy użyciu innych dróg wstrzyknięcia.
    1. Całą procedurę należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować warunki aseptyki. Załóż sterylne środki ochrony osobistej i rękawiczki.
    2. Znieczulić zwierzę zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.4.
      UWAGA: W przypadku tej procedury nie należy nakładać sterylnej maści okulistycznej z wazeliną na oczy zwierzęcia, ponieważ utrudni to wstrzyknięcie; Stosuj tylko krople znieczulające miejscowo.
    3. Załadować zawiesinę komórkową do strzykawki insulinowej za pomocą igły 28-31 G, 6 mm.
    4. Gdy zwierzę znajduje się w pozycji leżącej, cofnij powieki, aż oko wysunie się. Nanieść 1 kroplę znieczulenia miejscowego do oka po stronie poddawanej zabiegowi.
    5. Wbić igłę pod kątem 30-45° między okiem a przyśrodkowym nabłonkiem skosem skierowanym w dół. Wstrzykiwać zawiesinę komórkową (10-150 μl) powoli.
      UWAGA: Wolniejsze ruchy zapobiegają uszkodzeniu oka i cofaniu się wstrzykniętego środka.
    6. Wykonaj czynności opisane w pkt 2.7.5-2.7.6.
  11. Do wstrzykiwań do śledziony:
    1. Wykonaj całą procedurę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać warunki aseptyki31. Załóż sterylne środki ochrony osobistej i sterylne rękawice.
    2. Znieczulić i ogolić zwierzę zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.5.
    3. Ułóż zwierzę w prawej bocznej pozycji leżącej. Oczyść skórę obszaru zabiegowego 3 aplikacjami 10% jodowidonu na przemian z 3 aplikacjami alkoholu izopropylowego i przygotuj pole operacyjne zgodnie z opisem w kroku 2.9.5.
    4. Za pomocą nożyczek Metzenbaum lub skalpela wykonaj 1 cm nacięcie w lewym boku ściany brzucha, a następnie nacięcie w otrzewnej.
      UWAGA: Śledziona będzie widoczna przez przezroczystą ścianę brzucha po wykonaniu nacięcia skóry. Wykonaj nacięcie otrzewnej dokładnie w tym miejscu.
    5. Odsłoń śledzionę i wnękę śledziony przez nacięcie. Za pomocą igły do strzykawki insulinowej o strzykawce insulinowej 28-31 G o długości 6 mm delikatnie nakłuć śledzionę skosem igły skierowanym do góry i pod ostrym kątem.
      UWAGA: Jeśli rana kłuta krwawi, należy kauteryzować to miejsce, aby ograniczyć krwawienie i cofanie się.
    6. Powoli wstrzykiwać całą objętość (50-100 μl) zawiesiny komórek. Wyjąć igłę. Umieść małą gazę na śledzionie i uciskaj kleszczami. Lekko zacisnąć śledzionę między gazą za pomocą cienkich kleszczyków do komarów i odczekać 15 minut.
    7. Wykonaj splenektomię, wiążąc wnękę śledziony jedwabnym szwem 3-0 lub 4-0, w razie potrzeby kauteryzując naczynia. Zamknij otrzewną szwem wchłanialnym 5-0 polidioksanonu (PDS) lub kwasu poliglikolowego.
    8. Wykonaj czynności opisane w krokach 2.7.5-2.7.6.
      UWAGA: Zwierzęta, u których występują powikłania krwotoczne lub które nie wyzdrowiały w pełni 72 godziny po operacji, powinny zostać humanitarnie poddane eutanazji. Pamiętaj, że dobre samopoczucie myszy jest zawsze priorytetem.

3. Etapowa operacja przetrwania (SSS)

  1. Na podstawie wniosków eksperymentalnych z kroku 2.2 określ właściwy czas do przeżycia operacji. W zależności od linii komórkowej i hipotezy eksperymentalnej wybierz wcześniejszy punkt czasowy do resekcji guza (przy objętości guza = 150 mm3) lub późniejszy punkt czasowy (przy objętości guza = 500 mm3)26.
    UWAGA: Limit objętości guza wynosi 1,500 mm3 , gdy obciążenie guza jest na tyle wysokie, że jest szkodliwe dla dobrostanu zwierzęcia i predysponuje do powikłań.
  2. Znieczulić i ogolić zwierzę zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.5.
    UWAGA: Cała procedura wykonywana jest w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Oczyść skórę obszaru zabiegowego 3 aplikacjami 10% jodowidonu na przemian z 3 aplikacjami alkoholu izopropylowego i przygotuj pole operacyjne zgodnie z opisem w kroku 2.9.5.
  4. Za pomocą nożyczek do tęczówki lub skalpela naciąć skórę, zachowując 5-7 mm margines resekcji od krawędzi guza.
    UWAGA: Margines do resekcji zależy od zdolności guza do miejscowego rozprzestrzeniania się. W przypadku agresywnych guzów należy zwiększyć margines resekcji, upewniając się, że pozostała wystarczająca ilość skóry do zamknięcia rany.
  5. W przypadku guzów śródskórnych należy wyciąć guz wraz z obwodem skóry.
  6. W przypadku guzów podskórnych należy wyciąć i usunąć guz pod skórą.
    UWAGA: Jeśli guz zaatakuje otrzewną i/lub skórę, należy go wyciąć en bloc z guzem i zamknąć otrzewną szwami 5-0/4-0 PDS lub wchłanialnymi szwami kwasu poliglikolowego.
  7. Zamknąć ranę za pomocą zszywacza 9 mm.
    UWAGA: Usuń zszywki 7-10 dni po zabiegu. Podaj leki przeciwbólowe i umieść zwierzę na ciepłej podkładce, aby wyzdrowiało. Kontynuuj podawanie leków przeciwbólowych przez 72 godziny po zabiegu, raz na 12 godzin zgodnie z krokiem 2.9.13. Zwierzęta z powikłaniami krwotocznymi lub które nie odzyskały pełnej przytomności po operacji, powinny zostać humanitarnie poddane eutanazji.
  8. Zwierzę należy trzymać pojedynczo w klatce, na ciepłej podkładce, aby mogło dojść do siebie. Po odzyskaniu przytomności zwierzę należy umieścić w klatce wiwarium, gdy jest w stanie mostka i chodzenia.
  9. Kontynuuj monitorowanie zwierzęcia po operacji pod kątem miejscowych nawrotów, utraty masy ciała, objawów neurologicznych, lokomotorycznych i/lub behawioralnych (letarg, brak pielęgnacji, niskie spożycie pokarmu lub wody) oraz ogólnego stanu zdrowia.

4. Obrazowanie in vivo (Rysunek 2A)

  1. Substrat D-lucyferyny (150 mg/kg) należy podawać zwierzętom we wstrzyknięciu dootrzewnowym za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml, igły 28 G.
    UWAGA: Komórki nowotworowe muszą być stabilnie transdukowane za pomocą cDNA lucyferazy.
  2. Wywołaj znieczulenie zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.4, 6 minut po wstrzyknięciu substratu D-lucyferyny.
  3. Wykonaj obrazowanie za pomocą skanera do obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) (system obrazowania in vivo)26.
  4. Przenieś zwierzę do wnętrza komory obrazowania i do stożka nosowego. Obrazowanie do 5 zwierząt jednocześnie, w zależności od pojemności systemu obrazowania.
  5. Uruchom instrument, naciskając przycisk inicjalizuj. Ustaw czas ekspozycji na automatyczny (1-120 s).
  6. Uchwyć pusty obraz, aby w razie potrzeby odjąć dowolne tło. Kliknij przycisk Pobierz i zapisz obraz po zakończeniu sekwencji akwizycji.
  7. Umieść zwierzę z powrotem w klatce, która znajduje się w 50% na podkładce rozgrzewającej, aby dojść do siebie po znieczuleniu. Po odzyskaniu przytomności zwierzę należy umieścić w klatce wiwarium, gdy jest w stanie mostka i chodzenia.
  8. W celu analizy danych w tym samym oprogramowaniu do obrazowania in vivo, za pomocą którego przechwycono obrazy, przejdź do folderu, w którym obrazy są zapisywane, i otwórz jednocześnie obrazy wszystkich myszy biorących udział w eksperymencie.
    UWAGA: Analiza jednego obrazu na raz nie pozwoli na normalizację między grupami.
  9. Ustaw jednostki na radiancję (nie liczy). Upewnij się, że pole wyboru wskazujące osobę nie jest zaznaczone, ponieważ uniemożliwi to normalizację sygnału w grupach.
  10. Korzystając z narzędzia do rysowania obszaru zainteresowania (ROI), narysuj okrągłe ROI dla obszaru mózgu i prostokątne ROI dla ciała. Uważaj, aby wykluczyć uszy i nos z ROI mózgu, ponieważ mają one tendencję do emitowania niespecyficznej luminescencji. Aby zminimalizować odchylenia w tym procesie, narysuj ROI tylko na zdjęciach myszy, bez nałożenia sygnału luminescencyjnego.
  11. Wybierz opcję Zmierz zwrot z inwestycji, aby określić ilościowo sygnał i wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego. Analizuj różnice między grupami, wykreślając całkowity strumień luminescencyjny (p/s/cm2/sr) w obszarach ciała będących przedmiotem zainteresowania.
    UWAGA: Aby ocenić różnice między grupami w tropizmie mózgu, oblicz stosunek między sygnałem mózgowym a sygnałem ciała dla każdej myszy. Kontroluje to zmienność między myszami w ogólnym obciążeniu guzem i różnice w poziomach ekspresji lucyferazy między grupami eksperymentalnymi.

5. Rezonans magnetyczny ex vivo

  1. Wykonać rezonans magnetyczny ex vivo natychmiast po eutanazji. Alternatywnie, pobierz interesujące Cię narządy, utrwal je w formalinie na okres do 72 godzin i wykonaj obrazowanie w późniejszym czasie.
  2. Obrazy należy uzyskać za pomocą systemu mikrorezonansu magnetycznego o mocy 7 Tesli (7 T) (300 MHz) wyposażonego w konsolę NMR i magnes z otworem poziomym o zerowym odparowaniu lub podobny sprzęt.
    UWAGA: Kluczowe znaczenie ma potrzeba aktywnie ekranowanej wkładki cewki gradientowej z odpowiednim kompromisem w zakresie wydajności. Musi on zapewniać liniowość gradientu wynoszącą co najmniej 50 mm dynamicznej objętości sferycznej (DSV), aby pokryć zestaw próbek badanych jednocześnie bez zniekształceń geometrycznych. Połączenie wytrzymałości gradientu (w zakresie od 440 do 750 mT/m) i cyklu pracy umożliwiającego maksymalne jednoczesne prądy stałe w zakresie od 3 x 30 A do 3 x 87 A zapewni odpowiednią wydajność obrazowania. Zastosowana wkładka cewki gradientowej (patrz tabela materiałów) umożliwia następujące parametry: 660 mT/m, czas narastania 130 μs, 3 x 87 A i DSV = 80 mm.
  3. Wykonaj skany za pomocą komercyjnej, spolaryzowanej kołowo cewki o częstotliwości radiowej całego ciała myszy (OD = 59 mm, ID = 38 mm, L = 40 mm) dostrojonej do 300,16 MHz, 1 H proton Larmor częstotliwość.
    UWAGA: Ta sonda RF umożliwia pozyskiwanie zestawów danych 3D z submilimetryczną rozdzielczością izotropową (<150 μm) podczas nocnych skanów trwających 8-12 godzin.
  4. Wykryj obciążenie guzem za pomocą wielu sekwencji30.
    UWAGA: Hiperintensywny sygnał wykryty przez sekwencję T2-zależnego, szybkiego obrazowania z ponownie skoncentrowanym echem (RARE) rozpoznaje obrzęk otaczający guzy.
  5. Wykonaj sekwencję 3D RARE z następującymi parametrami akwizycji: [120 μm]3 rozdzielczość izotropowa; czas akwizycji 5 h, 27 min; czas powtórki (TR) = 500 ms; odstęp echa (ES) = 12,7 min; Współczynnik turbo TFx = 12; efektywny czas echa (TEeff) = 76,2 ms; szerokość pasma (BW) = 75 KHz; Rozmiar matrycy = 2843; pole widzenia (FOV) = [4,0 mm]3; liczba średnich (Nav) = 6.
  6. Wykryj przerzuty przy użyciu następujących parametrów.
    1. W przypadku przerzutów barwnikowych z rozjaśnieniem sygnału należy zastosować sekwencję echa gradientowego 3D T1-ważoną o następujących parametrach: rozdzielczość izotropowa [120 μm]3; czas akwizycji 2 h, 41 min; TR = 20 ms; czas echa (TE) = 4,0 ms; kąt odwrócenia (FA) = 18°; BW = 75 KHz; Rozmiar matrycy = 2843; Pole widzenia = [34,0 mm]3; Wartość nawigacji = 6.
    2. W przypadku przerzutów niepigmentowanych i/lub krwotocznych należy użyć sygnału hipointensywnego podczas pozyskiwania pod sekwencją echa wielogradientowego (MGE) ważoną przez T2*, (3D MGE, rozdzielczość izotropowa [120 μm]3; czas akwizycji 3 h, 35 min; TR = 40 ms; TE = 3,6 ms; ES = 3,2 ms; 4 echa; FA = 20°; BW = 100 kHz; Rozmiar matrycy = 2843; Pole widzenia = (34,0 mm)3; Wartość nawigacji = 4.
  7. Użyj wszystkich 3 sekwencji, aby określić ilościowo obciążenie nowotworem.
  8. Porównaj obszary guza zidentyfikowane podczas analizy z sekcjami histologicznymi, aby zapewnić dokładność. Patrz punkty 7 i 8.

6. Przetwarzanie tkanek do sekwencjonowania pojedynczych komórek lub masowego RNA

  1. Poddać zwierzę eutanazji przy użyciu dowolnej metody zatwierdzonej przez IACUC instytucji. Patrz jedna z procedur opisanych w UWAGA do kroku 2.6.6.
  2. Wypreparuj interesujące nas narządy i umieść je w oddzielnych studzienkach płytki zawierającej zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) na lodzie. Pracuj szybko i utrzymuj tkankę na lodzie przez cały czas, aby zmaksymalizować żywotność komórek.
    UWAGA: Poniższe kroki są specyficzne dla przetwarzania mózgu. Dostosuj rodzaj kolagenazy do konkretnej tkanki, w zależności od potrzeb.
  3. Przygotuj 6-dołkową płytkę z 3 ml HBSS w każdym dołku.
  4. Aby uwidocznić i dalej pomóc w prowadzeniu sekcji, użyj mikroskopu fluorescencyjnego i zidentyfikuj oznaczone obszary.
  5. Wypreparuj obszary fluorescencyjne i umieść fragmenty tkanki na płytce 6-dołkowej (1 fragment na studzienkę, jeśli mają być analizowane pojedyncze ogniska przerzutowe lub wiele fragmentów z jednego narządu, jeśli mają być analizowane wielokrotne przerzuty w tym samym narządzie). Użyj sterylnych żyletek, aby zmielić tkankę na jak najmniejsze fragmenty (nie poświęcając więcej niż 1-2 minuty na ten etap dla każdej próbki).
    UWAGA: Ograniczenie czasu przetwarzania nowotworów pomaga zachować żywotność komórek.
  6. Odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, aby ułatwić przenoszenie większych fragmentów.
  7. Dodać 1 ml HBSS do studzienki i upewnić się, że pozostałe fragmenty/komórki tkanki zostały przeniesione do probówki o pojemności 15 ml, która będzie zawierała końcową objętość 4 ml. Do każdej probówki dodać 50 μl kolagenazy typu I (40 mg/ml) i 12,5 μl DNazy I (2000 jednostek/ml).
  8. Umieścić stożkowe rurki w łaźni wodnej podgrzanej do 37 °C na 45 minut. Krótko obracać stożkowe rurki co 5 minut.
  9. Zwilż sitko o średnicy 70 μm za pomocą HBSS. Użyj zaślepionego końca wysterylizowanej probówki do mikrowirówki lub plastikowej części tłoka strzykawki i zmiel homogenaty tkanek przez sitko o średnicy 70 μm do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Wstępne zwilżanie filtrów buforem HBSS lub FACS ułatwia odcedzanie.
  10. Umyj sitko 1 ml HBSS. Wstępnie zwilżyć sitko o średnicy 40 μm za pomocą HBSS. Przefiltruj każdą próbkę ponownie przez sitko 40 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj 1 ml FBS do sitka 40 μm, aby je umyć. Trzymaj stożkowe rurki na lodzie przez cały czas.
  11. Napełnij stożkową probówkę do 50 ml lodowatym DPBS. Odwirować komórki (180 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C). Wyrzucić supernatant, uważając, aby nie stracić osadu komórkowego.
    UWAGA: W przypadku próbek mózgu należy ponownie zawiesić komórki w 2,5 ml roztworu do separacji o gęstości 38% (rozcieńczyć w HBSS i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT)). Przenieść do probówek FACS o pojemności 5 ml. Wirować przez 20 minut w temperaturze 800 × g. Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 000 μl i usuń wierzchnią warstwę tłuszczu. Nie pozostawiaj tłuszczu na ściankach rurek. Jeśli pozostał jakiś tłuszcz, ponownie odkręć i powtórz proces. Jest to kluczowy krok. Usuń resztę fazy ciekłej (osad będzie półprzezroczysty i trudny do wizualizacji).
  12. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) i inkubować przez 60 s w temperaturze pokojowej. Ugasić roztwór do lizy, dodając 20 ml DPBS.
  13. Odwirować komórki w temperaturze 180 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml buforu FACS (5% FBS w DPBS).
  14. Kontynuuj sortowanie znakowanych komórek i/lub przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania RNA zbiorczego lub pojedynczego komórki.
    UWAGA: Komórki można odwirować, zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C przed izolacją RNA w celu masowego sekwencjonowania RNA.

7. Perfuzja tkanek zwierzęcych i przygotowanie do analiz immunohistologicznych

  1. Znieczulić zwierzę przedawkowaniem ketaminy (300 mg/kg) i koktajlu ksylazyny (30 mg/kg) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe za pomocą strzykawki insulinowej i igły 28 G.
  2. Odsłoń serce przez grube rozcięcie i wykonaj nacięcie w prawym przedsionku. Delikatnie trzymaj serce na miejscu za pomocą długich, zakrzywionych kleszczy skierowanych do przodu.
    UWAGA: Formalina i paraformaldehyd (PFA) są substancjami rakotwórczymi. Przeczytaj kartę charakterystyki (SDS), unikaj narażenia na opary i noś odpowiednie środki ochrony osobistej.
  3. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o długości 22 g i średnicy 22 mm wstrzyknąć 10 ml DPBS, a następnie 10 ml 4% PFA do lewej komory.
  4. Przystąp do pobierania narządów i ładowania ich do wstępnie oznakowanych kaset histologicznych. Umieść kasety w pojemniku o odpowiedniej wielkości, który pomieści wystarczającą ilość utrwalacza (formaliny), aby pokryć tkanki.
    UWAGA: Idealnie, objętość utrwalacza powinna być 5-10 razy większa od objętości tkanek.
  5. Zamocuj narządy wewnątrz kaset histologicznych w 10% formalinie przez 48-72 godzin. Wyrzuć 10% formalinę i umyj kasety dwukrotnie 1x DPBS.
  6. Proces odwadniania należy rozpocząć od zanurzenia kaset w 70% etanolu na 2 godziny. Kontynuuj zanurzanie kaset sukcesywnie w rosnących stężeniach etanolu: 80%, 95%, 100% na 1 godzinę każda. Zmień 100% roztwór dwukrotnie po 1,5 godziny. Zanurz kasety w ksylenie na 1,5 godziny i wykonaj trzy zmiany roztworu.
  7. Zanurzyć kasety w wosku parafinowym w temperaturze 58-60 °C. Podzielić bloki parafiny na sekcje. Przejdź do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) lub immunohistochemią.
  8. Aby zidentyfikować komórki czerniaka, użyj jednego z tych markerów lub panelu: S100, Melan-A, HMB-45, Tyrozynaza, MITF. Jeśli to możliwe, należy stosować barwienie białkiem jądrowego aparatu mitotycznego (NuMA), ponieważ jest to wysoce specyficzny marker komórek ludzkich.
    UWAGA: Barwienie NuMA zapewnia ostre rozgraniczenie między komórkami gospodarza (myszy) a przeszczepionymi komórkami (człowiekiem), co pomaga w przetwarzaniu obrazu i kolejnych etapach kwantyfikacji guza.

figure-protocol-3
Rysunek 2: Przykłady obrazów BLI, jasnego pola, fluorescencji ex vivo i barwienia H&E ilustrujące wielotorowe podejście do analizy wpływu genów kandydujących na przerzuty czerniaka. (A) BLI, (B) BF, (C) fluorescencja ex vivo i (D) obrazy barwienia H&E. Obrazy użyte do zilustrowania odpowiadają eksperymentowi, w którym komórki czerniaka 131 / 6-4L transdukowane niedocelowym kontrolnym shRNA (shNTC) lub shRNA ukierunkowanym na FUT8 zostały wstrzyknięte myszom z niedoborem odporności (NSG). Wyciszanie FUT8 upośledzało przerzutowe rozprzestrzenianie się komórek czerniaka. Podziałka i kolorowy pasek = p/s/cm2/sr × 106 (A), 100 mm (B, C), 100 μm (D). Skróty: BLI = obrazowanie bioluminescencyjne; H&E = hematoksylina i eozyna; shRNA = RNA z krótką spinką do włosów; shNTC = nieukierunkowane kontrolne shRNA; NSG = nieotyły cukrzycowy ciężki złożony niedobór odporności gamma; FUT8 = fukozylotransferaza 8; BF = jasne pole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Barwienie białka jądrowego aparatu mitotycznego (NuMA) (Rysunek 3)

  1. Użyj przeciwciała anty-NuMA jako wysoce specyficznego dla człowieka markera wrzeciona mitotycznego do identyfikacji i kwantyfikacji obciążenia przerzutami w skrawkach tkanki. 8.1. Uzyskuje się wysoce specyficzną i czułą identyfikację komórek czerniaka.
  2. Jeśli immunohistochemia chromogenna dla NuMA jest wykonywana na automatycznym urządzeniu do barwienia immunologicznego, wykonaj następujące kroki zgodnie z opisem32:
  3. Odparafinować skrawki ksylenu i ponownie je uwodnić w kolejno malejących stężeniach etanolu. Trzymaj szkiełka zanurzone przez 15 minut w ksylenie i przenieś je do 100% etanolu na kolejne 15 minut.
    UWAGA: Pozostałe etapy hydratacji etanolu (95%, 80%, 75%) trwają od 3 do 5 minut każdy.
  4. Opłucz szkiełka w wodzie dejonizowanej.
  5. Pobranie epitopu należy przeprowadzić, zanurzając szkiełka w pojemniku (np. słoiku do barwienia kopliny) w 10 mM buforze cytrynianu sodu o pH 6,0 w kuchence mikrofalowej o mocy 1200 W przy 100% mocy na 10 minut.
  6. Do znakowania należy użyć niesprzężonego, poliklonalnego króliczego przeciwciała anty-ludzkiego NuMA, rozcieńczonego w stosunku 1:7,000 w albuminie surowicy Tris-bydlęcej (BSA) (25 mM Tris, 15 mM NaCl, 1% BSA, pH 7,2). Przeprowadzanie odpowiednich kontroli dodatnich i ujemnych równolegle z sekcjami badania.
  7. Inkubować szkiełka z pierwszorzędowym przeciwciałem przez 12 godzin. Wykryć przeciwciało pierwszorzędowe za pomocą koziego anty-króliczego multimeru sprzężonego HRP i uwidocznić kompleks za pomocą 3,3-diaminobenzydyny i wzmacniacza siarczanu miedzi.
  8. Umyj szkiełka w wodzie destylowanej, przeciwbarwić hematoksyliną, odwodnić i zamontuj za pomocą trwałego podłoża.
    UWAGA: Etapy odwadniania są odwrotne do etapów ponownego nawadniania opisanych w kroku 8.3. Zeskanuj slajdy dostępnym skanerem w powiększeniu 20x lub 40x i prześlij je do bazy danych.
  9. Za pomocą oprogramowania narysuj ROI, aby uwzględnić wszystkie komórki barwione NuMA w tkance narządu, z wyłączeniem innych miąższów narządów i pustych przestrzeni.
  10. Dostosuj ustawienia, aby skategoryzować komórki NuMA dodatnie i NuMA-ujemne, używając odpowiednich kontroli pozytywnych i ujemnych dla każdego narządu. Użyj ustalonego algorytmu oprogramowania, aby określić ilościowo całkowitą liczbę/procent komórek NuMA dodatnich dla każdej próbki.

9. Immunofluorescencja wycinka tkanki

Aby zidentyfikować stadium przerzutowe, w którym wymagany jest konkretny kandydat na gen (np. wynaczynienie vs. przeżycie po wysiewie), można określić immunofluorescencję wycinka tkanki w różnych punktach czasowych, aby śledzić postęp komórek nowotworowych od wstrzyknięcia do inwazji odległych narządów, siewu i wzrostu. Takie podejście pozwala na dodanie markerów dla sąsiednich komórek w celu uchwycenia zdarzenia wynaczynienia i zmian w mikrośrodowisku otaczającego guza33.

  1. Znieczulić zwierzę zgodnie z opisem w kroku 7.1.
  2. Wstrzyknąć 100 μg liktyny Lycopersicon Esculentum (pomidor) sprzężonej z fluoroforem do lewej komory każdego zwierzęcia, 3 minuty przed perfuzją, w celu wyznaczenia śródbłonka naczyniowego.
    UWAGA: Poczekaj, aż lektyna pomidorowa zacznie krążyć w całym systemie.
  3. Przeprowadź fuzję zwierzęcia zgodnie z opisem w krokach 7.2-7.3. Zbierz interesujące Cię narządy i przenieś je do wstępnie oznakowanych pojemników wypełnionych 4% PFA. Utrwal tkankę na 24 do 48 godzin. Za pomocą wibratomu podzielić tkankę na plastry o grubości 30-50 μm.
    UWAGA: Grubość powinna być zoptymalizowana. Zalecane są plastry o grubości od 30 μm do 50 μm, zwłaszcza podczas wykonywania obrazowania z-stack.
  4. Inkubować plastry w buforze blokującym (10% normalna surowica kozia, 2% BSA, 0,25% Triton X-100 w DPBS) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  5. Wykonaj eksperyment optymalizacji barwienia.
    UWAGA: Ponieważ czas pobierania antygenu, używane do pobierania antygenu, temperatura, różne przeciwciała/różne partie oraz rodzaj tkanki wpływają na barwienie, konieczne są eksperymenty optymalizacyjne.
  6. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe w optymalnym rozcieńczeniu i inkubować przez optymalny czas w zoptymalizowanej temperaturze (patrz przykłady w Tabeli 1).
    UWAGA: Stosować odpowiednie kontrole dla przeciwciał pierwszorzędowych/drugorzędowych i niebarwionych próbek tkanek.
  7. Umyj plastry chusteczki 3 razy przez 5 minut 0,25% Triton X-100 w DPBS.
  8. Inkubować wycinki tkanek w przeciwciałie drugorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym przez żądany czas (Tabela 1).
  9. Umyj plastry chusteczki 3 razy przez 5 minut 0,25% Triton X-100 w DPBS.
  10. Wybarwić jądra 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) rozcieńczonym w stosunku 1:1,000 w DPBS lub buforem blokującym przez 5 minut.
  11. Dodaj 2 krople pożywki do fluorescencji zapobiegającej blaknięciu do szkiełka nakrywkowego i zamontuj chusteczkę na szkiełkach podstawowych, upewniając się, że plastry są całkowicie pokryte podłożem montażowym.
    UWAGA: Upewnij się, że bezpośrednio na plastrach nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ zniekształca to mikroskopię.
  12. Rejestruj obrazy konfokalne za pomocą dostępnego mikroskopu za pomocą obiektywu z 60-krotnym zanurzeniem w olejku.
    UWAGA: Podczas uzyskiwania obrazów konfokalnych zastosuj te same parametry ustawień (napięcie, jednostki przewiewne i wzmocnienie) na wszystkich obrazach w eksperymencie.
  13. Rejestruj obrazy niekonfokalne za pomocą mikroskopu z powiększeniem 10x, 20x lub 40x.
  14. Prześlij zdjęcia do oprogramowania do analizy obrazu i przeanalizuj je, porównując wybrane parametry (tj. powierzchnię, liczbę, intensywność markerów lub kontakt z sąsiednimi komórkami).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższe rysunki ilustrują, w jaki sposób opisany przepływ pracy został zastosowany do identyfikacji nowych czynników powodujących przerzuty czerniaka. Rysunek 2 podsumowuje wyniki opublikowanego badania, w którym badano efekty wyciszenia fukozylotransferazy FUT8 w przerzutach czerniaka in vivo26. Krótko mówiąc, analiza danych glikomicznych (uzyskanych za pomocą macierzy lektynowych) i profilowanie transkryptomiczne wykazały zwiększone poziomy alfa-1,6-fukozy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego raportu technicznego jest zaoferowanie ustandaryzowanego, kompleksowego przepływu pracy do badania potencjalnych aktorów w przerzutach czerniaka. Ponieważ eksperymenty in vivo mogą być kosztowne i czasochłonne, kluczowe znaczenie mają strategie maksymalizacji wydajności i zwiększenia wartości uzyskanych informacji.

Konieczne jest stosowanie uzupełniających się podejść w celu walidacji krzyżowej wyników w ramach tego samego eksperymentu. Na przykład zarówno barwienie immunoh...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Wydziałowi Zaawansowanych Technologii Badawczych (DART) w NYU Langone Health, a w szczególności Laboratorium Badań nad Patologią Eksperymentalną, Centrum Technologii Genomu, Laboratorium Cytometrii i Sortowania Komórek, Rdzeniu Obrazowania Przedklinicznego, które są częściowo wspierane przez Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087. Dziękujemy NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) za zapewnienie dostępu do krótkoterminowych hodowli czerniaka pochodzących od pacjentów+ (10-230BM i 12-273BM), które zostały uzyskane za pomocą zatwierdzonych przez IRB protokołów (badanie Universal Consent #s16-00122 i badanie Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group #10362). Dziękujemy dr Robertowi Kerbelowi (University of Toronto) za dostarczenie linii komórkowych czerniaka 113/6-4L i 131/4-5B1* oraz dr Meenhardowi Herlynowi (Wistar Institute) za dostarczenie krótkoterminowych hodowli czerniaka WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2**. E.H. jest wspierany przez NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award oraz NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). Rysunek 1 został utworzony za pomocą Biorender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#15 Ostrze Scapel WPI500242Do zabiegów chirurgicznych
#3 Uchwyt ScapelWPI500236Do zabiegów chirurgicznych
1 ml strzykawka tuberkulinowa, końcówka wsuwana Strzykawkado wstrzykiwań BD309626
10 ml, końcówka ślizgowa BD301029Perfuzja
10% Formalina Bufor SoduEK Industries4499-20LDo perfuzji / utrwalacza tkankowego
15 ml StożkoweCorning 430052Hodowla komórkowa
15 ml Stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenuFalcon352196Hodowla komórkowa
200 Proof EthanolDeacon Labs04-355-223Histologia
Igła 22G i ndash; 22mmBD305156Perfuzja
4-0 Vicryl SzewEthiconJ464GSzew
4% buforowany fosforanem Carsona paraformaldehyd EMS15733-10Do perfuzji/utrwalacza tkankowego
40µ mCorning431750Przetwarzanie tkanek
5-0 Szew wchłanialny Ethicon6542000Zamknięcie
50 ml stożkowe Corning 430828Hodowla komórkowa
50 ml stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenuFalcon352070Hodowla komórkowa
7-0 Szew jedwabny FST18020-70Ligatura
70&mikro; mCorning431751Przetwarzanie tkanek
Antyblaknięcie mediów montażowych   Vector LabsH-1000-10Aproksymator immunofluorescencyjny
z kleszczami, 10cm WPI14189Do zabiegów mikrochirurgicznych
Konsola AvanceBruker3 HDNMR 
Specyfikacja biologiczna 7030 Bruker7030Micro MRI
BSABioregA941NuMA Staining
Kleszcze do szycia Castroviejo, proste końcówki platforma do wiązania 5,5 mm, 11cm WPIWP5025501Do zabiegów mikrochirurgicznych
Słoik do barwienia CoplinBel-Art F44208-1000Histologia
DAPISigma-AldrichD9542-1MGImmunofluorescencja
dCas9-KRABAddgene110820Manipulacja genetyczna
DNaza INEBM0303LPrzetwarzanie tkanek
DPBSCorning21-030-CMPrzetwarzanie tkanek
Extra Sharp Uncoated Single Edge BladeGEM62-0167Przetwarzanie tkanek
Podłoże macierzy zewnątrzkomórkowej Corning354234rozważyć zredukowany czynnik wzrostu ( jako alternatywę 
FBSCytivaSH30910.03Hodowla komórkowa
Fidżi Obraz JFidżi Obraz JOprogramowanieImmunofluorescencja
Koza anty-królik HRP sprzężony multimer Thermo FisherA16104NuMA Barwienie
Koziej SurowicyGibcoPCN5000Immunofluorescencja
HBSSCorning21-020-CVPrzetwarzanie tkanek
Hematoksylina Richard-Allan Naukowy 7231
Histologia Illumina III PerkinElmerCLS136334BLI Instrument
Strzykawka insulinowa 28G - igła 8mmBD329424Zastrzyki
Strzykawka insulinowa 31G - igła 6mm BD326730Kleszcze do iniekcji
tęczówki, 10,2 cm, pełna krzywa, ząbkowaneWPI504478Do zabiegów perfuzji i zabiegów chirurgicznych
Isoflurane USPCovetrus11695067772Anesthesia
Jewelers #7 Kleszcze Tytan 11 cm 0,07 x 0,01 mm KońcówkaWPIWP6570Do zabiegów mikrochirurgicznych
Ketamina HCl 100mg/mLMylan Ind.1049007Anesthesia
lentiCRISPRv2Addgene98290Manipulacja genetyczna
Lycopersicon Esculentum (Pomidor) Lectin, DyLight 649InvitrogenL32472Marker komórek śródbłonka naczyń krwionośnych
MEM endogenne aminokwasy X 100Corning25-025-CIHodowla komórkowa
Metzenbaum NożyczkiWPI503269Do chirurgii procedury
Jednostka do mikroiniekcjiKOPF5000Iniekcje dosercowe
NaClFisherS25877 Barwienie NuMA
Igła 30G x 25mmBD305128Igła do iniekcji dosercowych
33G x 15mmHamilton7747-01iniekcji doszyjnej
, Castroviejo, 14cm, z zamkiem, szczęki ząbkowane 1,2mmWPI14137-GDo zabiegów mikrochirurgicznych
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJMyszy Laboratorium Jacksona005557Myszy
model mysi NU/JLaboratorium Jacksonamodelmysi
002019 Jądrowy aparat mitotyczny Białko poliklonalny królik anty-ludzki Abcam97585NuMA Barwienie
penicyliny-streptomycyny 10000U / mlGibco15140122Hodowla komórkowa
PercollGE0891-01roztwór do separacji gęstości 
PI Klasyczne rękawice chirurgiczneCardinal Health2D72PT75XChirurgia
pLKO Tet-OnAddgene21915Manipulacja genetyczna
Powidon-jod 10% roztwór MedlineMDS093943Surgery Krople
proparakainy 0,5%Akorn PharmaAX0501Okulistyczne znieczulenie miejscowe
Puralube Wazelina Maść okulistycznaDechra83592anestezjologiczna
Ostrza o podwójnej krawędzi EMS72000Golenie i wibrotomowe krojenie mózgu 
Klips Reflex 9mm EZ Drzewo mózgoweEZC-  ZESTAWZamykanie ran
RPMI 1640 Corning10-040-CMNożyczki do hodowli komórkowych
, sprężyna 10,5 cm Str, ostrza 8 mmWPI501235Do zabiegów mikrochirurgicznych
Półautomatyczne wibrujące ostrze MikrotomLeicaVT1200Brain Slice Immunofluorescencyjny
jednokanałowy system waporyzacji anestezjologicznejKent ScientificVetFlo-1210S znieczulenie
System komór stołowych Smartbox i dmuchawa wyciągowaEZ SystemsTT4000CO2 Eutanazja
Sterylna ozdobna jednorazowa serwetaMedlineNON21002Surgery
Sterylne niewzmocnione fartuchy chirurgiczne Aurora z wszytymi rękawamiMedlineDYNJP2715
Surgery T25 FlaskCorning 430639Hodowla komórkowa
TrisCorning46-031-CMNuMA Barwienie
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500MLImmunofluorescencyjne
kleszcze do wiązania Troutman, 10 cm, zakrzywiony wzór G, końcówka 0,52 mm z platformą do wiązaniaWPIWP505210Do zabiegów mikrochirurgicznych
Klipsy do naczyń 10G Ciśnienie 5x 0,8 mm Szczęki, 5 / sztWPI15911Do zabiegi mikrochirurgiczne
VisiopharmVisiopharmVisiopharm NuMAOprogramowanie do barwienia
Ksylazyna 100 mg / mlAkorn Pharma59399-111-50Znieczulenie
KsylenFisherX3P-1GALHistologia
Uchwyt igły do , , , Żyletka .

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).
  3. Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site. Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).
  4. Alonso, S. R., et al. A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis. Cancer Research. 67 (7), 3450-3460 (2007).
  5. Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management. Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).
  6. Plebanek, M. P., et al. Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche. Nature Communications. 8 (1), 1319(2017).
  7. Orgaz, J. L., et al. Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma. Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).
  8. Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis. Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).
  9. Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis. Frontiers in Medicine - Dermatology. 5, 307(2018).
  10. Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
  11. Meier, F., et al. Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma. British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).
  12. Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. Genetics of metastasis: melanoma and other cancers. Clinical & Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).
  13. Ubellacker, J. M., et al. Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis. Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  15. Cunningham, C. C., et al. Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion. Science. 255 (5042), 325-327 (1992).
  16. Unger, C., et al. Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).
  17. Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
  18. Nakamura, K., et al. Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model. Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).
  19. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  20. Koya, R. C., et al. BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy. Cancer Research. 72 (16), 3928-3937 (2012).
  21. Jenkins, M. H. Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032. Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).
  22. Tuncer, E., et al. SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching. The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).
  23. Schwartz, H., et al. Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation. Cancer Research. 76 (15), 4359-4371 (2016).
  24. Perez-Guijarro, E., et al. Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy. Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).
  25. Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
  26. Agrawal, P., et al. A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. Cell. 31 (6), 804-819 (2017).
  27. Hanniford, D., et al. Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis. Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).
  28. Kim, H., et al. PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity. Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).
  29. de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin. Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).
  30. Morsi, A., et al. Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis. Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).
  31. Huynh, C., et al. Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis. Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).
  32. Zou, C., et al. Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).
  33. Kleffman, K., et al. Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis. bioRxiv. , 854885(2019).
  34. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  35. Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function. Frontiers in Immunology. 9, 1376(2018).
  36. Chen, S., et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).
  37. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  38. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  39. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).
  40. Lappalainen, I., et al. The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research. Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).
  41. Cerami, E., et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
  42. Grossman, R. L., et al. Toward a shared vision for cancer genomic data. New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Melanoma MetastasisIn Vivo ModelsIntracardiac InjectionIntradermal InjectionSubcutaneous InjectionBioluminescence ImagingTumor Cell SortingSingle Cell RNA SequencingImmunohistopathologyMetastasis Suppressor

Powiązane artykuły