Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przerzuty to złożony proces, wymagający od komórek pokonywania barier, które tylko nie są w pełni modelowane przez testy in vitro. Stworzono systematyczny przepływ pracy przy użyciu solidnych, powtarzalnych modeli in vivo i ustandaryzowanych metod w celu identyfikacji nowych czynników powodujących przerzuty czerniaka. Takie podejście pozwala na wnioskowanie o danych na określonych etapach eksperymentalnych w celu precyzyjnego scharakteryzowania roli genu w przerzutach. Modele są tworzone poprzez wprowadzenie genetycznie zmodyfikowanych komórek czerniaka za pomocą wstrzyknięć dosercowych, śródskórnych lub podskórnych u myszy, a następnie monitorowanie za pomocą seryjnego obrazowania in vivo. Po osiągnięciu wcześniej ustalonych punktów końcowych pobiera się guzy pierwotne i/lub narządy z przerzutami i przetwarza je w celu przeprowadzenia różnych analiz. Komórki nowotworowe mogą być sortowane i poddawane dowolnej z kilku platform "omicznych", w tym sekwencjonowaniu RNA pojedynczych komórek. Narządy poddawane są obrazowaniu i analizom immunohistopatologicznym w celu ilościowego określenia ogólnego obciążenia przerzutami i odwzorowania ich specyficznej lokalizacji anatomicznej. Ten zoptymalizowany potok, w tym ustandaryzowane protokoły wszczepiania, monitorowania, pobierania tkanek, przetwarzania i analizy, może być zaadaptowany do krótkoterminowych hodowli pochodzących od pacjentów oraz ustalonych ludzkich i mysich linii komórkowych różnych typów raka litego.
Wprowadzenie
Wysoka śmiertelność związana z przerzutowym czerniakiem w połączeniu z rosnącą częstością występowania czerniaka na całym świecie1 (szacowany wzrost o 7,86% do 2025 roku) wymaga nowych metod leczenia. Postępy w odkrywaniu celów opierają się na odtwarzalnych modelach przerzutów, które są bardzo złożonym procesem. Na wszystkich etapach kaskady przerzutów komórki czerniaka muszą pokonać niezliczone bariery, aby osiągnąć unik układu odpornościowego i kolonizację odległych tkanek2. Odporność i zdolności adaptacyjne komórek czerniaka wynikają z wielu czynników, w tym z ich wysokiego obciążenia mutacjami genetycznymi
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Procedury dotyczące zwierząt zawarte w poniższym protokole zostały zatwierdzone przez New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Wszystkie zabiegi przeprowadzane są w placówkach zatwierdzonych przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Rysunek 1 przedstawia ogólne podejście eksperymentalne.
1. Krótkoterminowe posiewy czerniaka pochodzące od pacjenta (STC)
- Umieść tkankę na szalce Petriego o średnicy 60 mm z 1 ml kompletnego RPMI (RPMI 1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 m....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Poniższe rysunki ilustrują, w jaki sposób opisany przepływ pracy został zastosowany do identyfikacji nowych czynników powodujących przerzuty czerniaka. Rysunek 2 podsumowuje wyniki opublikowanego badania, w którym badano efekty wyciszenia fukozylotransferazy FUT8 w przerzutach czerniaka in vivo26. Krótko mówiąc, analiza danych glikomicznych (uzyskanych za pomocą macierzy lektynowych) i profilowanie transkryptomiczne wykazały zwiększone poziomy alfa-1,6-fukozy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem tego raportu technicznego jest zaoferowanie ustandaryzowanego, kompleksowego przepływu pracy do badania potencjalnych aktorów w przerzutach czerniaka. Ponieważ eksperymenty in vivo mogą być kosztowne i czasochłonne, kluczowe znaczenie mają strategie maksymalizacji wydajności i zwiększenia wartości uzyskanych informacji.
Konieczne jest stosowanie uzupełniających się podejść w celu walidacji krzyżowej wyników w ramach tego samego eksperymentu. Na przykład zarówno barwienie immunoh.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Wydziałowi Zaawansowanych Technologii Badawczych (DART) w NYU Langone Health, a w szczególności Laboratorium Badań nad Patologią Eksperymentalną, Centrum Technologii Genomu, Laboratorium Cytometrii i Sortowania Komórek, Rdzeniu Obrazowania Przedklinicznego, które są częściowo wspierane przez Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087. Dziękujemy NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) za zapewnienie dostępu do krótkoterminowych hodowli czerniaka pochodzących od pacjentów+ (10-230BM i 12-273BM), które zostały uzyskane za pomocą zatwierdzonych przez IRB protokołów (badanie Universal Consent #s16-00122 ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| #15 Ostrze Scapel | WPI | 500242 | Do zabiegów chirurgicznych |
| #3 Uchwyt Scapel | WPI | 500236 | Do zabiegów chirurgicznych |
| 1 ml strzykawka tuberkulinowa, końcówka wsuwana | Strzykawka | do wstrzykiwań BD | 309626 |
| 10 ml, końcówka ślizgowa | BD | 301029 | Perfuzja |
| 10% Formalina Bufor Sodu | EK Industries | 4499-20L | Do perfuzji / utrwalacza tkankowego |
| 15 ml Stożkowe | Corning | 430052 | Hodowla komórkowa |
| 15 ml Stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu | Falcon | 352196 | Hodowla komórkowa |
| 200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histologia |
| Igła 22G i ndash; 22mm | BD | 305156 | Perfuzja |
| 4-0 Vicryl Szew | Ethicon | J464G | Szew |
| 4% buforowany fosforanem Carsona paraformaldehyd | EMS | 15733-10 | Do perfuzji/utrwalacza tkankowego |
| 40µ m | Corning | 431750 | Przetwarzanie tkanek |
| 5-0 Szew wchłanialny | Ethicon | 6542000 | Zamknięcie |
| 50 ml stożkowe | Corning | 430828 | Hodowla komórkowa |
| 50 ml stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu | Falcon | 352070 | Hodowla komórkowa |
| 7-0 Szew jedwabny | FST | 18020-70 | Ligatura |
| 70&mikro; m | Corning | 431751 | Przetwarzanie tkanek |
| Antyblaknięcie mediów montażowych | Vector Labs | H-1000-10 | Aproksymator immunofluorescencyjny |
| z kleszczami, 10cm | WPI | 14189 | Do zabiegów mikrochirurgicznych |
| Konsola Avance | Bruker | 3 HD | NMR |
| Specyfikacja biologiczna 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
| BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
| Kleszcze do szycia Castroviejo, proste końcówki platforma do wiązania 5,5 mm, 11cm | WPI | WP5025501 | Do zabiegów mikrochirurgicznych |
| Słoik do barwienia Coplin | Bel-Art | F44208-1000 | Histologia |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescencja |
| dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Manipulacja genetyczna |
| DNaza I | NEB | M0303L | Przetwarzanie tkanek |
| DPBS | Corning | 21-030-CM | Przetwarzanie tkanek |
| Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Przetwarzanie tkanek |
| Podłoże macierzy zewnątrzkomórkowej | Corning | 354234 | rozważyć zredukowany czynnik wzrostu ( jako alternatywę |
| FBS | Cytiva | SH30910.03 | Hodowla komórkowa |
| Fidżi Obraz J | Fidżi Obraz J | Oprogramowanie | Immunofluorescencja |
| Koza anty-królik HRP sprzężony multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Barwienie |
| Koziej Surowicy | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescencja |
| HBSS | Corning | 21-020-CV | Przetwarzanie tkanek |
| Hematoksylina | Richard-Allan Naukowy | 7231 | |
| Histologia Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
| Strzykawka insulinowa 28G - igła 8mm | BD | 329424 | Zastrzyki |
| Strzykawka insulinowa 31G - igła 6mm | BD | 326730 | Kleszcze do iniekcji |
| tęczówki, 10,2 cm, pełna krzywa, ząbkowane | WPI | 504478 | Do zabiegów perfuzji i zabiegów chirurgicznych |
| Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
| Jewelers #7 Kleszcze Tytan 11 cm 0,07 x 0,01 mm Końcówka | WPI | WP6570 | Do zabiegów mikrochirurgicznych |
| Ketamina HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Manipulacja genetyczna |
| Lycopersicon Esculentum (Pomidor) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Marker komórek śródbłonka naczyń krwionośnych |
| MEM endogenne aminokwasy X 100 | Corning | 25-025-CI | Hodowla komórkowa |
| Metzenbaum Nożyczki | WPI | 503269 | Do chirurgii procedury |
| Jednostka do mikroiniekcji | KOPF | 5000 | Iniekcje dosercowe |
| NaCl | Fisher | S25877 | Barwienie NuMA |
| Igła 30G x 25mm | BD | 305128 | Igła do iniekcji dosercowych |
| 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | iniekcji doszyjnej |
| , Castroviejo, 14cm, z zamkiem, szczęki ząbkowane 1,2mm | WPI | 14137-G | Do zabiegów mikrochirurgicznych |
| NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Myszy Laboratorium Jacksona | 005557 | Myszy |
| model mysi NU/J | Laboratorium Jacksona | model | mysi |
| 002019 Jądrowy aparat mitotyczny Białko poliklonalny królik anty-ludzki | Abcam | 97585 | NuMA Barwienie |
| penicyliny-streptomycyny 10000U / ml | Gibco | 15140122 | Hodowla komórkowa |
| Percoll | GE | 0891-01 | roztwór do separacji gęstości |
| PI Klasyczne rękawice chirurgiczne | Cardinal Health | 2D72PT75X | Chirurgia |
| pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Manipulacja genetyczna |
| Powidon-jod 10% roztwór Medline | MDS093943 | Surgery Krople | |
| proparakainy 0,5% | Akorn Pharma | AX0501 | Okulistyczne znieczulenie miejscowe |
| Puralube Wazelina Maść okulistyczna | Dechra | 83592 | anestezjologiczna |
| Ostrza o podwójnej krawędzi | EMS | 72000 | Golenie i wibrotomowe krojenie mózgu |
| Klips Reflex 9mm EZ | Drzewo mózgowe | EZC- ZESTAW | Zamykanie ran |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Nożyczki do hodowli komórkowych |
| , sprężyna 10,5 cm Str, ostrza 8 mm | WPI | 501235 | Do zabiegów mikrochirurgicznych |
| Półautomatyczne wibrujące ostrze Mikrotom | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescencyjny |
| jednokanałowy system waporyzacji anestezjologicznej | Kent Scientific | VetFlo-1210S | znieczulenie |
| System komór stołowych Smartbox i dmuchawa wyciągowa | EZ Systems | TT4000 | CO2 Eutanazja |
| Sterylna ozdobna jednorazowa serweta | Medline | NON21002 | Surgery |
| Sterylne niewzmocnione fartuchy chirurgiczne Aurora z wszytymi rękawami | Medline | DYNJP2715 | |
| Surgery T25 Flask | Corning | 430639 | Hodowla komórkowa |
| Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Barwienie |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescencyjne |
| kleszcze do wiązania Troutman, 10 cm, zakrzywiony wzór G, końcówka 0,52 mm z platformą do wiązania | WPI | WP505210 | Do zabiegów mikrochirurgicznych |
| Klipsy do naczyń 10G Ciśnienie 5x 0,8 mm Szczęki, 5 / szt | WPI | 15911 | Do zabiegi mikrochirurgiczne |
| Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm NuMA | Oprogramowanie do barwienia |
| Ksylazyna 100 mg / ml | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Znieczulenie |
| Ksylen | Fisher | X3P-1GAL | Histologia |
Bibliografia
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
