Test nasiąkniętych kulek polega na ukierunkowanym dostarczeniu odczynnika testowego w dowolnym momencie rozwoju w celu zbadania regulacji różnicowania i morfogenezy komórek. Przedstawiono szczegółowy protokół, mający zastosowanie do każdego doświadczalnego modelu zwierzęcego, dotyczący przygotowania trzech różnych rodzajów namoczonych koralików i wszczepienia ich w komórkę międzypalcową zarodka kurczaka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza różnicowania komórek, morfogenezy i wzorcowania podczas embriogenezy kurczaka przy użyciu testu z namoczonymi kulkami
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podczas rozwoju embrionalnego aktywowane jest wiele programów genetycznych, które koordynują różnicowanie komórek, aby wytworzyć zdumiewającą różnorodność komórek somatycznych, tkanek i organów. Precyzyjna aktywacja tych programów genetycznych jest regulowana przez morfogeny, dyfuzyjne cząsteczki, które kierują losem komórki na różnych progach. Zrozumienie, w jaki sposób aktywacja genetyczna koordynuje morfogenezę, wymaga zbadania lokalnych interakcji wywoływanych przez morfogeny podczas rozwoju. Wykorzystanie kulek nasączonych białkami lub leków wszczepionych w różne obszary zarodka umożliwia badanie roli określonych cząsteczek w tworzeniu palców i innych procesach rozwojowych. Ta eksperymentalna technika dostarcza informacji na temat kontroli indukcji komórki, losu komórki i tworzenia wzorca. Tak więc ten test z nasączonymi kulkami jest niezwykle potężnym i cennym narzędziem eksperymentalnym, które można zastosować do innych modeli embrionalnych.
Wprowadzenie
Przełomowe odkrycia w mechanizmach molekularnych kontrolujących ekspresję genów podczas rozwoju embrionalnego pozwoliły nam zrozumieć, jak determinowany jest los komórki. Przywiązanie do różnych linii komórkowych następuje, gdy komórki rozpoczynają molekularną ekspresję czynników transkrypcyjnych1. Ten wzorzec wyrażenia jest wysoce skoordynowany w przestrzeni i czasie, a tym samym kieruje kształtowaniem, pozycjonowaniem i wzorcowaniem komórek, tkanek i narządów1,2,3,4,5. Indukcja embrionalna to proces, w którym komórki są zaangażowane w określone linie poprzez ustanowienie hierarchii, które ograniczają potencjał komórek, które obejmują nawet generowanie podstawowego planu ciała, jak ma to miejsce w przypadku organizatora Spemanna6,7. Warga grzbietowa blastoporu indukuje drugą oś embrionalną w embrionie gospodarza8,9. Dzisiaj, dzięki szczepieniu i innym klasycznym eksperymentom połączonym z podejściami molekularnymi, wiadomo, że różne czynniki transkrypcyjne i czynniki wzrostu działają w celu kierowania indukcją embrionalną w klasie Spemann organizer10. W związku z tym manipulacja eksperymentalna jest ważnym narzędziem do zrozumienia różnicowania komórek, morfogenezy i procesów wzorcowania podczas embriogenezy.
Interesujące, w systemach embrionalnych, gdzie przeszczep tkanek jest trudny lub gdy induktory są już dobrze znane, nośniki są używane do dostarczania cząsteczek (np. białek, chemikaliów, toksyn, itp.) w celu regulacji różnicowania komórek, morfogenezy, a nawet wzorcowania. Jeden z takich systemów nośników polega na wszczepianiu kulek nasączonych określoną cząsteczką w dowolnym eksperymentalnym organizmie modelowym w dowolnym punkcie czasowym rozwoju w celu określenia działania wspomnianego odczynnika lub kierowania różnicowaniem wspomnianego modelu. Na przykład, wszczepiając kulki nasączone kwasem retinowym (RA) do pąka kończyny skrzydła kurczaka, Cheryl Tickle i in. (1985) wykazali, że RA indukuje ekspresję jeża sonicznego w strefie aktywności polaryzacyjnej (ZPA)11,12. Ta sama strategia eksperymentalna została wykorzystana do odkrycia, że RZS kontroluje asymetrię somitów i śmierć komórek w pączku kończyny podczas rozwoju palca oraz w innych embrionalnych regionach kończyn13,14,15. Inne czynniki, głównie białka (np. czynniki wzrostu fibroblastów [FGF], transformujący czynnik wzrostu-beta [TGF-ß]) zostały wykorzystane do indukowania kończyn w bokach wczesnych zarodków i nowych palców w okolicy międzypalcowej, odpowiednio16,17,18,19,20,21. Eksperymenty te dowodzą mocy i użyteczności tej techniki do określania etapu zaangażowania lub kompetencji tkanek lub grup komórek wystawionych na działanie cząsteczek.
W tym protokole, kończyna pisklęcia na etapie formowania palców służyła jako eksperymentalny model do przedstawienia krok po kroku, jak przygotować i wszczepić namoczone koraliki. Jednak to eksperymentalne narzędzie nie ogranicza się do tego zastosowania, ale może być wykorzystane w dowolnym eksperymentalnym modelu zwierzęcym i dowolnym punkcie czasowym in vitro i in vivo do badania indukcji, różnicowania, śmierci komórki i wzorców.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie zostało zrecenzowane i zatwierdzone przez Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals of the Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Meksyk).
1. Inkubacja jaj i inscenizacja zarodków
UWAGA: Zapłodnione jaja kurze można uzyskać z lokalnych gospodarstw. Najczęściej stosuje się zapłodnione jaja kurze White Leghorn. Świeżo nawożone jaja kurze należy przechowywać w temperaturze 15 °C przez okres do 1 tygodnia przed inkubacją.
- Inkubuj zapłodnione jaja kurze pionowo spiczastą stroną do dołu w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 °C i wilgotności względnej 70%, aż osiągną etap 28 HH (około 5,5 dnia według Hamilton i Hamburger, 1951)22. Podczas inkubacji należy obracać jaja, aby zapobiec przyleganiu zarodka do błony skorupy.
UWAGA: Wybór etapu rozwojowego zależy od celów eksperymentalnych. W tym przypadku etap 28 HH jest optymalny do implantacji kulek międzypalcowych w celu wywołania palca ektopowego lub przyspieszenia śmierci komórki. - Wyjmij jaja z inkubatora, przetrzyj je 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Zdezynfekuj obszar roboczy, mikroskopy i instrumenty 70% etanolem.
- Zapal jajko, aby zidentyfikować naczynia krwionośne i zlokalizować zarodek. Wyrzuć jaja, które nie mają zarodka.
- Używając końcówki kleszczy bez zębów, otwórz okno w około pięciu jajach, stukając w koniec jajka, a następnie usuń kleszczami1-centymetrowy 2 odcinek skorupy.
- Przenieś jajko do kartonu lub plastikowego uchwytu i umieść je pod mikroskopem stereoskopowym. Usuń membranę powietrzną, nakłuwając ją i wyciągając cienkimi kleszczami chirurgicznymi. Usuń wszelkie małe kawałki skorupki jaja, które mogłyby zetknąć się z zarodkiem.
UWAGA: Błona powietrzna to biała, nieprzezroczysta membrana obserwowana natychmiast po umieszczeniu jaja w oknie. - Obserwuj pod mikroskopem, lekko otwierając worek owodniowy, rozrywając go za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych. Uważaj, aby nie uszkodzić układu naczyniowego błony kosmówkowej.
UWAGA: Owodnia to przezroczysta błona ściśle otaczająca zarodek, która otacza go płynem owodniowym. - Etapuj zarodki in ovo, aby określić, czy są w pożądanym stadium. Zarodki we wcześniejszych stadiach można zwrócić do inkubatora po uszczelnieniu okienka skorupki jaja taśmą.
2. Przygotowanie koralików
UWAGA: W zależności od celu eksperymentu i leczenia, alternatywne typy kulek (np. Affi-Gel, AG1-X2, heparyna) mogą być bardziej odpowiednie. Kulki Affi-Gel są optymalne dla białek (np. TGF-ß1), podczas gdy kulki heparyny są idealne dla czynników wzrostu (np. FGF, WNT), a kulki AG1-X2 dla chemikaliów rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych (np. DMSO).
- Preparat Affi-Gel i granulek heparyny
- Wytnij kwadrat parafilmu tak, aby pasował do 45-milimetrowej szalki Petriego. Umieść parafilm na dnie szalki Petriego, aby ją przykryć i przymocuj ją do dna szalki Petriego, popychając każdy wierzchołek za pomocą końcówek kleszczy nieząbkowanych. Uchylenie.
- Za pomocą pipety lub szpatułki przenieś kulki do probówki mikrowirówkowej i umyj je dwukrotnie w 1x PBS, osadzając i pipetując.
- Przenieś ~40-50 koralików za pomocą mikropipety na środek sparafilmowanej szalki Petriego z kroku 1.
- Za pomocą mikroskopu wybierz do użycia ~30 kulek Affi-Gel lub heparyny o średnicy ~100 μm. Użyj siatki okularu mikroskopu, aby określić rozmiar koralików lub użyj trzeciego palca międzypalcowego zarodka HH 28 jako odniesienia; Koralik musi być mniejszy niż interdigent.
- Ostrożnie usuń jak najwięcej nadmiaru PBS otaczających kulki i zanurz je w 2-5 μl roztworu leczniczego. Upewnij się, że roztwór całkowicie zakrywa koraliki.
- Równolegle przygotować kulki kontrolne, mocząc je w roztworze zawierającym taką samą ilość nośnika, jaka została użyta w eksperymentalnym roztworze do zabiegu.
UWAGA: Stężenia należy obliczyć dla każdego zabiegu zgodnie z eksperymentem. Podczas pracy z potencjalnie szkodliwymi odczynnikami należy używać odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej. - Inkubować kulki w roztworze przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Aby zapobiec wysychaniu kulek podczas inkubacji, odpipetuj kilka kropli 1x PBS lub wody wokół kulek, aby nawilżyć lokalną atmosferę i przykryj naczynie parafilmem, aby spowolnić parowanie.
- Umieść szalkę Petriego na lodzie i wszczep koraliki w ciągu tego samego dnia.
- Przygotowanie ściegu AG 1-X2
- Wytnij kwadrat parafilmu tak, aby pasował do 45-milimetrowej szalki Petriego. Przykryj spód szalki Petriego parafilmem i przymocuj, popychając każdy wierzchołek za pomocą końcówek kleszczy nieząbkowanych. Uchylenie.
- Za pomocą szpatułki przenieś kulki AG 1-X2 do probówki do mikrowirówki. Dodać 30-50 μl roztworu zabiegowego o pożądanym stężeniu końcowym.
- Równolegle inkubować kulki kontrolne w roztworze z samym nośnikiem, przygotowanym bez doświadczalnej substancji chemicznej lub białka będącego przedmiotem zainteresowania.
- Inkubuj koraliki przez 20 minut, powoli wstrząsając w temperaturze pokojowej. Owiń probówki do mikrowirówek folią, aby chronić je przed światłem podczas całej inkubacji, biorąc pod uwagę, że wiele z tych cząsteczek jest wrażliwych na światło
- Usunąć jak najwięcej roztworu za pomocą pipety i zabarwić 2% czerwienią fenolową rozpuszczoną w wodzie o temperaturze pokojowej przez 2 minuty z łagodnym mieszaniem w wirze.
UWAGA: Barwienie przezroczystych kulek AG 1-X2 ułatwia ich zagnieżdżenie w zarodku. - Usuń 2% czerwieni fenolowej i umyj kulki dwukrotnie w 1x PBS, aby usunąć nadmiar barwnika.
- Za pomocą końcówki do mikropipet przenieś ~40-50 kulek AG 1-X2 na środek pokrytej parafilmem szalki Petriego przygotowanej w kroku 1 i namocz je w 5 μl 1x PBS. Pod mikroskopem wybierz około 30 koralików o średnicy ~100 μm. Wyrzuć niewykorzystane koraliki.
- Koraliki są gotowe do wszczepienia. Upewnij się, że kulki są zanurzone w PBS przez cały czas implantacji, pipetując kilka kropli 1x PBS lub wody wokół kulek, aby nawilżyć lokalną atmosferę i/lub przykryć naczynie parafilmem, aby spowolnić parowanie.
3. Manipulacja zarodkiem i implantacja międzypalcowa
- Przed manipulowaniem zarodkami ustaw dwa mikroskopy stereoskopowe obok siebie na blacie stołu. Jeden służy do manipulacji zarodkami i implantacji kulek, a drugi do utrzymywania leczonych koralików w gotowości do zagnieżdżenia się w zarodku.
- Za pomocą kleszczy bez zębów utwórz okienko w pozostałych jajach, zgodnie z opisem w sekcji dotyczącej inkubacji jaj i oceny zarodków.
- Pod mikroskopem otwórz worek owodniowy, rozrywając błonę owodniową cienkimi kleszczami chirurgicznymi w pobliżu prawej kończyny tylnej tylko w ilości potrzebnej do wykonania zabiegu (tj. tak mało, jak to możliwe).
- Za pomocą cienkich kleszczy przytrzymaj zarodek za błonę owodniową, aby odsłonić prawą tylną kończynę. Za pomocą cienkiej igły wolframowej wykonaj otwór wyśrodkowany w dystalnej części trzeciego palca kończyny tylnej.
- Nie uwalniając zarodka i odsłoniętej kończyny tylnej, weź jeden leczony koralik z drugiego mikroskopu za pomocą jednej z końcówek kleszczy. Kleszcze muszą znajdować się w pozycji otwartej, aby jeden koralik przylegał do końcówki kleszczy.
- Przenieś koralik do zarodka pisklęcia w pobliżu kończyny tylnej i umieść go na górze otworu międzypalcowego.
- Zamknij kleszcze, aby wywrzeć nacisk na koralik, aż wejdzie do otworu.
- Uwolnij zarodek i uszczelnij okienko skorupki jajka taśmą.
- Umieść jaja z powrotem w inkubatorze, aż osiągną wymagany etap. Powtarzaj procedurę aż do osiągnięcia wymaganej liczby zmanipulowanych zarodków. Konieczne jest, aby koraliki w żadnym momencie nie wyschły.
UWAGA: Aby zaobserwować pełny palec ektopowy, inkubuj przez ~ 72 godziny po implantacji koralików. Natomiast wczesne geny różnicowania (np. Sox9) ulegają ekspresji ~30 minut po zagnieżdżeniu się kulki nasączonej TGF-ß1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystanie nasączonych kulek do oceny zachowania komórek w zarodkowej kończynie kurczaka
Aby zapewnić skuteczność tego testu, kulka musi być umieszczona konsekwentnie i precyzyjnie w odpowiednim miejscu; w tym przypadku w najbardziej dystalnej części trzeciej przestrzeni między palcami, pod grzebieniem ektodermalnym AER (Rysunek 1A). Takie rozmieszczenie pozwala badanej cząsteczce na równomierne rozprzestrzenienie się w tkance między palcami. Ponadto strefa pod AER za...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Główną zaletą narzędzia doświadczalnego opisanego w tym protokole jest możliwość kontrolowania czasu i miejsca ekspozycji na kulki nasączone daną cząsteczką eksperymentalną. Połączenie prawidłowego ułożenia z precyzyjnym wyczuciem czasu rozwoju daje ogromne możliwości badania procesów różnicowania komórek. Przeprowadzenie tych eksperymentów w tkance niezróżnicowanej umożliwia zbadanie pierwszych kluczowych zdarzeń w linii komórkowej. Na przykład umieszczenie koralika nasączonego TGFß w tkance międzypalcowej kończyn embri...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [numery grantów IN211117 i IN213314] oraz Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [numer grantu 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] przyznanego JC-M. JC M-L otrzymał stypendium podoktorskie od Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). Autorzy doceniają pomoc Lic. Lucia Brito z Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM w odniesieniach do przygotowania tego rękopisu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Koraliki Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Koraliki AG1-X2 | Inkubator jaj Bio-Rad | ||
| Incumatic de Mexico Incumatic | 1000 | ||
| Cienkie kleszcze chirurgiczne | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Koraliki sefarozy heparyny | Abcam ab193268 | ||
| Gniazdo szalki Petriego | |||
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Taśma | NA | NA Igła | |
| wolframowa | GoodFellow | E74-15096/01 |
Bibliografia
- Stapornwongkul, K. S., Vincent, J. P. Generation of extracellular morphogen gradients: the case for diffusion. Nature Reviews Genetics. 22 (6), 393-411 (2021).
- Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. Dynamic patterning by morphogens illuminated by cis-regulatory studies. Development. 148 (2), 196113(2021).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), (2019).
- Marín-Llera, J. C., Garciadiego-Cázares, D., Chimal-Monroy, J. Understanding the cellular and molecular mechanisms that control early cell fate decisions during appendicular skeletogenesis. Frontiers in Genetics. 10, 977(2019).
- Gurdon, J. B. Embryonic induction--molecular prospects. Development. 99 (3), 285-306 (1987).
- Bouwmeester, T. The Spemann-Mangold organizer: the control of fate specification and morphogenetic rearrangements during gastrulation in Xenopus. International Journal of Developmental Biology. 45 (1), 251-258 (2001).
- Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86 (4), 589-598 (1996).
- Cho, K. W., Blumberg, B., Steinbeisser, H., De Robertis, E. M. Molecular nature of Spemann's organizer: the role of the Xenopus homeobox gene goosecoid. Cell. 67 (6), 1111-1120 (1991).
- Thisse, B., Thisse, C. Formation of the vertebrate embryo: Moving beyond the Spemann organizer. Seminars in Cell & Development Biology. 42, 94-102 (2015).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Analytical Biochemistry. 142 (2), 542-555 (1984).
- Tickle, C., Lee, J., Eichele, G. A quantitative analysis of the effect of all-trans-retinoic acid on the pattern of chick wing development. Developmental Biology. 109 (1), 82-95 (1985).
- Vermot, J., Pourquié, O. Retinoic acid coordinates somitogenesis and left-right patterning in vertebrate embryos. Nature. 435 (7039), 215-220 (2005).
- Rodriguez-Leon, J., et al. Retinoic acid regulates programmed cell death through BMP signalling. Nature Cell Biology. 1 (2), 125-126 (1999).
- Rodriguez-Guzman, M., et al. Tendon-muscle crosstalk controls muscle bellies morphogenesis, which is mediated by cell death and retinoic acid signaling. Developmental Biology. 302 (1), 267-280 (2007).
- Cohn, M. J., Izpisúa-Belmonte, J. C., Abud, H., Heath, J. K., Tickle, C. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Ohuchi, H., et al. An additional limb can be induced from the flank of the chick embryo by FGF4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 209 (3), 809-816 (1995).
- Abu-Elmagd, M., Goljanek Whysall, K., Wheeler, G., Münsterberg, A. Sprouty2 mediated tuning of signalling is essential for somite myogenesis. BMC Medical Genomics. 8, Suppl 1 8(2015).
- Gañan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Merino, R., et al. Morphogenesis of digits in the avian limb is controlled by FGFs, TGFbetas, and noggin through BMP signaling. Developmental Biology. 200 (1), 35-45 (1998).
- Montero, J. A., Lorda-Diez, C. I., Gañan, Y., Macias, D., Hurle, J. M. Activin/TGFbeta and BMP crosstalk determines digit chondrogenesis. Developmental Biology. 321 (2), 343-356 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Díaz-Hernández, M. E., Bustamante, M., Galván-Hernández, C. I., Chimal-Monroy, J. Irx1 and Irx2 are coordinately expressed and regulated by retinoic acid, TGFβ and FGF signaling during chick hindlimb development. PLoS One. 8 (3), 58549(2013).
- Díaz-Hernández, M. E., Rios-Flores, A. J., Abarca-Buis, R. F., Bustamante, M., Chimal-Monroy, J. Molecular control of interdigital cell death and cell differentiation by retinoic acid during digit development. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 138-157 (2014).
- Chimal-Monroy, J., et al. Analysis of the molecular cascade responsible for mesodermal limb chondrogenesis: Sox genes and BMP signaling. Developmental Biology. 257 (2), 292-301 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
