Reaktywacja nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila

Komórki macierzyste cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na ich potencjał do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej^1,2. Wiele zwierząt, zwłaszcza tych długowiecznych, utrzymuje komórki macierzyste w swoich dorosłych tkankach. Te rezydentne komórki macierzyste funkcjonują w celu utrzymania homeostazy tkanek i są wykorzystywane do naprawy po urazie fizycznym lub chorobie^3,4. Większość komórek macierzystych u dorosłych zwierząt jest w stanie spoczynku, stosunkowo uśpionym stanie charakteryzującym się zatrzymaniem cyklu komórkowego i inaktywacją sygnalizacji wzrostu⁵. W odpowiedzi na sygnały zewnętrzne komórki macierzyste wychodzą ze stanu spoczynku, wchodzą w cykl komórkowy i zaczynają wytwarzać potomstwo potomne specyficzne dla ich typu tkanki. Na przykład, w celu wywołania skutecznej odpowiedzi immunologicznej, komórki prezentujące antygen indukują spoczynkowe naiwne limfocyty T do wejścia w cykl komórkowy i klonalnego rozszerzania się⁶. W odpowiedzi na uszkodzenie mięśni szkieletowych, satelitarne komórki macierzyste mięśni wchodzą w cykl komórkowy i wytwarzają mioblasty potomne, które zastępują uszkodzone miofibryle^5,7. Chociaż oczywiste jest, że spokojne komórki macierzyste reagują na sygnały zewnętrzne, w wielu przypadkach natura sygnału zewnętrznego pozostaje niejasna, podobnie jak mechanizm aktywacji komórek macierzystych indukowanej przez sygnał. Lepsze zrozumienie, w jaki sposób komórki macierzyste w stanie spoczynku reagują na sygnały zewnętrzne i wchodzą w cykl komórkowy, pomoże w opracowaniu lepszych terapii komórkami macierzystymi w praktyce klinicznej i zwiększy wiedzę naukową.

Przez dziesięciolecia organizmy modelowe były wykorzystywane do odkrywania genów i szlaków sygnalizacji komórkowej, które regulują proliferację komórek macierzystych podczas rozwoju i w wieku dorosłym. U Drosophila nerwowe komórki macierzyste (NSC), znane jako neuroblasty (NB), dzielą się w trakcie rozwoju, aby wytworzyć wszystkie neurony i komórki glejowe, które ostatecznie integrują się, tworząc obwód nerwowy niezbędny do funkcjonowania mózgu^8,9. Podobnie jak inne komórki macierzyste, nanocząsteczki dzielą się asymetrycznie, aby samoodnawiać się, a w niektórych przypadkach symetrycznie, aby rozszerzyć pulę komórek macierzystych. NB są określane podczas embriogenezy i większość z nich przechodzi w stan spoczynku pod koniec, co zbiega się ze zmniejszającymi się zapasami składników odżywczych u matki (Ryc. 1). Po zakończeniu embriogenezy larwy wylęgają się i rozpoczynają żerowanie. W odpowiedzi na karmienie zwierząt, NB reaktywują się ze stanu spoczynku i wznawiają podziały komórek^{10,11,12,13,14,15,16}. Ponieważ OUN Drosophila jest stosunkowo prosty i ponieważ NB wchodzą i wychodzą ze stanu spoczynku w określonych momentach, użycie Drosophila do zbadania regulacji spoczynku, wejścia i wyjścia okazuje się idealne.

Rysunek 1: Względna proliferacja CB NB (centralne neuroblasty mózgu, czerwony) i MB NB (neuroblasty ciała grzyba, niebieski) w czasie rozwoju. Pod koniec embriogenezy większość NB (czerwona linia) przestaje się namnażać i przechodzi w stan spoczynku. Spoczynek trwa do momentu, gdy świeżo wyklute larwy spożyją swój pierwszy pełnowartościowy posiłek. Punkty czasowe, na których skupia się ta metodologia, są oznaczone czerwonymi kółkami (1, spoczynek i 2, reaktywacja). MB NB (niebieski) są podzbiorem centralnych NB w mózgu, które dzielą się w sposób ciągły podczas rozwoju (4 na półkulę mózgu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W odpowiedzi na żywienie zwierząt, szlaki sygnalizacji wzrostu kinazy PI3 i TOR stają się aktywne w NB oraz w ich niszy glejowej i tchawicy^10,11,15,16. Kiedy składniki odżywcze w diecie są wycofywane lub gdy poziom kinazy PI3 jest obniżony, NB nie reaktywują się, a wzrost gleju i tchawicy również jest zmniejszony^10,11,15,16. Obecny model zakłada, że reaktywacja NB jest sprzężona ze wzrostem larw przez ciało tłuszczowe, które uwalnia sygnał ogólnoustrojowy w odpowiedzi na karmienie zwierząt^12,17,18. Ten sygnał, który pozostaje nieuchwytny, prawdopodobnie sprzyja ekspresji i uwalnianiu peptydu insulinopodobnego Drosophila (Dilps) w mózgu, co prowadzi do dalszej aktywacji kinazy PI3 w NB i ich niszy glejowej i tchawicy. Aby lepiej zrozumieć naturę sygnałów ogólnoustrojowych, opracowaliśmy metodę reaktywacji spoczynkowych NB w hodowanych eksplantatach mózgu. Dzięki tej metodzie reaktywację NB można oznaczyć przy braku sygnałów ogólnoustrojowych całego zwierzęcia. Czynniki egzogenne mogą być ponownie dostarczone do pożywki hodowlanej, a reaktywacja NB oznaczona na podstawie włączenia analogu tymidyny, EdU. Korzystając z tej metody, ustaliliśmy, że egzogenna insulina jest wystarczająca do reaktywacji spoczynkowych NB w eksplantatach mózgu. Przyszłe prace będą miały na celu zidentyfikowanie dodatkowych czynników, które po dodaniu pozytywnie lub negatywnie regulują spoczynek NB u eksplantatów mózgu.

1. Kolekcja larw Drosophila

UWAGA: Przygotuj talerz drożdży, pastę winogronową i mieszkanie Fly przed rozpoczęciem:

1. Pasta drożdżowa: W małym pojemniku wymieszaj 5 g aktywnych suchych drożdży z 10 ml wody, aby uzyskać pastę o konsystencji masła orzechowego. Przykryj pastę drożdżową folią spożywczą i za pomocą gumki mocno przymocuj ją do pojemnika.
   UWAGA: Świeża pasta drożdżowa rozszerzy się w pojemniku i wyskoczy z pokrywki, chyba że jest mocno przymocowana. Pasta drożdżowa wystarczy na kilka dni w temperaturze pokojowej (RT).
2. Talerze z winogronami: Postępuj zgodnie z przepisem na robienie talerzy winogronowych (Tabela 1). Jeśli używasz talerzy przechowywanych w temperaturze 4°C, pamiętaj o ich wstępnym podgrzaniu przed użyciem, umieszczając je w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
   1. Wymieszaj wodę (750 ml) i agar (18,75 g) w kolbie o pojemności 4 l, zawiruj i autoklaw przez 20 minut (cykl płynny).
   2. Wymieszaj sok winogronowy (250 ml) i sacharozę (25 g) w kolbie o pojemności 1 l z dużym mieszadłem na rozgrzanym talerzu (na małym ogniu). Gdy sacharoza się rozpuści, wyłączyć ogień, poczekać, aż kolba będzie można dotknąć przed dodaniem Tegoseptu (10%, 4 ml) i kwasu propionowego (5 ml). Trzymaj mieszadło włączone.
   3. Po zakończeniu autoklawowania pozwól mu ostygnąć, aż kolba będzie można dotknąć (~60 °C), a następnie wymieszaj z mieszanką soku winogronowego.
   4. Połącz wszystkie roztwory w jednej kolbie i pozostaw na talerzu.
   5. Odpipetować roztwór do pokrywek małych szalek Petriego (35 mm). Pipetować około 9 ml na pokrywkę lub do uzyskania wypukłej kopuły.
   6. OPCJONALNIE: Podpal pokrywki, aby pozbyć się wszelkich pęcherzyków.
   7. Gdy talerze zastygną, ułóż talerze winogron w pudełku z hermetyczną pokrywką i umieść pudełko w temperaturze 4 °C. Talerze można przechowywać do 1 miesiąca.
3. Fly condo: Wybij ~ 20 otworów w 6-uncjowej butelce polipropylenowej Drosophila z kwadratowym dnem za pomocą igły 18 G.
4. Przenieś dorosłe muchy (~100 OregonR lub dowolny genotyp) do mieszkania dla much i przykryj mieszkanie talerzem z agarem winogronowym zwieńczonym odrobiną pasty drożdżowej. Umieść odrobinę w kierunku środka talerza i przymocuj płytkę do mieszkania za pomocą taśmy laboratoryjnej.
5. Odwróć pojemnik tak, aby płytka z agarem winogronowym znalazła się na dnie i umieść go w inkubatorze o temperaturze 25 °C na 24 godziny (Rysunek 2).

Rysunek 2: Wizualna reprezentacja odwróconej butelki na muchy (condo) z samcami i samicami dorosłej Drosophila. Plastikowa butelka ma małe nakłucia, generowane za pomocą igły 18 G, do wymiany tlenu. Otwór butelki jest zamknięty nakrętką z sokiem z winogron agarowych, jest odwracany i przechowywany w inkubatorze o temperaturze 25 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Po 24 godzinach zmień talerz agarowy winogronowy i zastąp go nowym talerzem posypanym pastą drożdżową. Szybko zamień dwa talerze, ciągle lekko stukając mieszkaniem o ławkę, aby dorosłe muchy nie uciekły.
7. Zbadaj płytkę na oko i oceń liczbę zarodków na płytce. Zarodki Drosophila są podłużne i białe z dwoma sznurkowatymi wyrostkami.
8. Jeśli na płytce znajduje się bardzo mało zarodków (mniej niż 100), wyrzuć płytkę (zeskrob agar do kosza na muchy i zachowaj plastikową pokrywkę do ponownego użycia). W wielu przypadkach dorosłe samice nie złożą wielu zarodków pierwszej nocy w nowym mieszkaniu. W takim przypadku należy dać dorosłym muchom kolejne 24 godziny na aklimatyzację.
9. Jeśli na talerzu znajduje się duża liczba zarodków (co najmniej 100), zachowaj go i ostrożnie usuń pastę drożdżową za pomocą szpatułki z płaskim dnem.
10. Po usunięciu pasty drożdżowej użyj metalowego kilofa, aby ręcznie usunąć wszystkie larwy z talerza winogronowego pod mikroskopem preparacyjnym. Patrząc na płytkę pod mikroskopem preparacyjnym, należy obserwować pełzające larwy, a także zarodki.
11. Usuń wszystkie larwy, przesuwając metalowy szpikulec w kierunku boku jednej larwy. Larwy są lepkie i przyklejają się do kilofa. Gdy jedna larwa znajdzie się na kilofie, dodatkowe larwy można łatwo zebrać, używając larwy na narzędziu, aby przyczepić więcej.
    UWAGA: Larwy lubią się do siebie przyklejać. W tym momencie nie ma znaczenia, czy larwy zostaną uszkodzone. Te larwy zostaną odrzucone.
12. Po pobraniu i usunięciu wszystkich larw umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 25 °C. Upewnij się, że umieściłeś płytkę w większym pojemniku, który można zamknąć. Umieść mokre ręczniki papierowe na dnie większego pojemnika, aby utrzymać wilgoć.
13. Po 30-60 minutach zabierz płytkę z powrotem do mikroskopu preparacyjnego, a teraz ostrożnie wybierz ~ 20-25 larw z tej samej płytki agagowej winogron, aby upewnić się, że zebrane larwy są świeżo wyklute w ciągu 30-60 minut.
14. Zanurz końcówkę narzędzia z 20-25 świeżo wyklutymi larwami na szalce Petriego (60 mm) wypełnionej 1-2 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 2 minuty.
15. Po 2 minutach przechyl naczynie pod kątem, aby płyn zebrał się na dnie. Za pomocą małego pędzla wyszczotkuj larwy z płynu na dnie szalki Petriego.
16. Zbierz wszystkie larwy na pędzel i przenieś larwy na nową szalkę Petriego (60 mm) zawierającą 1-2 ml 70% etanolu. Powtórz kroki 1.15, aby zebrać larwy pędzlem i przenieść je na nową szalkę Petriego z 1-2 ml 1x PBS.

2. Pożywki hodowlane i przygotowanie narzędzi

1. Spryskaj ławkę i miejsce pracy 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
2. Spryskaj narzędzia do preparacji, kleszcze i dwie szklane naczynia do zegarków 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na stole.
3. Przygotować uzupełnioną pożywkę Schneidera (SSM, tabela 2) i umieścić ją na lodzie.
4. Odpipetować 1 ml SSM do każdej ze szklanych naczyń zegarka.
5. Za pomocą mikropipety ze sterylną końcówką przenieś świeżo wyklute larwy z płytki PBS do SSM w pierwszym szklanym naczyniu do zegarka. Za pomocą mikropipety ze sterylną końcówką przenieś świeżo wyklute larwy do SSM w drugim szklanym naczyniu do zegarka.

3. Sekcje i kultury mózgu

1. Gdy larwy znajdą się w drugim szklanym naczyniu zegarkowym z SSM, wypreparuj mózgi z larw za pomocą kleszczy i mikroskopu preparacyjnego. Dostosuj powiększenie zgodnie z potrzebami.
2. Użyj jednego kleszczyka, aby chwycić haczyki do ust, a drugim delikatnie chwyć ciało do połowy i pociągnij w przeciwnym kierunku (Rysunek 3), aby podzielić larwę na dwie części.
   UWAGA: Mózg będzie zlokalizowany tuż za haczykami do ust. Należy pamiętać, że wokół mózgu mogą znajdować się inne tkanki. Zachowaj ostrożność podczas usuwania tych tkanek, ponieważ może to spowodować uszkodzenie mózgu

Rysunek 3: Larwy Drosophila w szklanym naczyniu zegarka z SSM. Kleszcze są odpowiednio ustawione do sekcji. Mózg larwy znajduje się za haczykami gębowymi (czarnymi) i oba są pokazane wewnątrz larwy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Po wypreparowaniu 15-20 mózgów dodaj 1 ml SSM do jednego dołka sterylnej 12-dołkowej tacki hodowlanej. Przenieś świeżo wypreparowane mózgi do SSM za pomocą mikropipety i sterylnej końcówki (Rysunek 4A).
4. Umieścić mózgi w pożywce SSM w 12-dołkowej tacce hodowlanej w inkubatorze w temperaturze 25 °C przez 24 godziny (Rysunek 4A).

Rysunek 4: Hodowla mózgu i barwienie immunologiczne. (A) Całe mózgi w 12-dołkowym naczyniu hodowlanym zawierającym 1 ml SSM. Naczynie hodowlane umieszcza się następnie w inkubatorze o temperaturze 25 °C na 24 godziny. (B) 72-dołkowa mini taca, na której znajdują się eksplantaty mózgu podczas barwienia immunologicznego. Mózgi są myte, a roztwory przenoszone za pomocą mikropipety P20 ustawionej na 10 μl. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Test proliferacji, fiksacja mózgu i barwienie przeciwciał

1. Następnego dnia przygotuj 1 ml roztworu EdU SSM. Pobrać pipetą 10 μl z 10 mM zapasu 5-etynylo-2′-deoksyurydyny (EdU) z 990 μl SSM (końcowe stężenie EdU wynosi 0,1 mM) do sterylnej probówki mikrowirówkowej i wymieszać. Po zakończeniu 24-godzinnej inkubacji odpipetować 1 ml EdU SSM do jednego dołka sterylnej 12-dołkowej tacki hodowlanej.
2. Przenieść mózgi za pomocą mikropipety ze sterylną końcówką z dołka zawierającego tylko SSM do nowego dołka zawierającego roztwór EdU SSM. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.
3. Następnie przenieś mózgi znakowane EdU do innego dołka w tej samej tacy hodowlanej zawierającej 1 ml utrwalacza (4% paraformaldehydu, patrz Tabela 3 dla przepisu) przez 20 min.
   UWAGA: Paraformaldehyd stanowi zagrożenie biologiczne i musi być odpowiednio zutylizowany.
4. Po utrwaleniu szybko przenieś mózgi do dołków 72-dołkowej mini tacy za pomocą mikropipety. Każda studzienka może pomieścić 10 mózgów i 10-15 μL płynu (Ryc. 4B). Po przeniesieniu mózgów na mini tacę (nie więcej niż 10 mózgów na studzienkę), usuń poprawkę i przepłucz mózgi 3 razy w 10 μl 1x PBT (bufor fosforanowy, pH 7,4 zawierający 0,1% Triton-X 100).
   UWAGA: Płukanie oznacza pipetowanie 10 μl 1x PBT na mózg, wyjmowanie i powtarzanie 3 razy.
5. Następnie umyj mózgi 3 razy po 10 minut, ponownie w 10 μl 1x PBT. Upewnij się, że mózgi są przez cały czas pokryte jakimś płynem.
6. Po zakończeniu płukania naniec na mózg pipetą 10 μl roztworu blokującego (1x PBT z 10% normalną surowicą kozą). Przykryj tackę i zamknij ją za pomocą paska parafilmu wokół krawędzi.
7. Po zamknięciu umieść mini tackę w szczelnie zamkniętym pudełku z mokrymi ręcznikami, aby zapewnić wilgotne środowisko i zapobiec parowaniu. Umieścić pudełko zawierające tacę w temperaturze 4 °C na noc.
8. Następnego dnia przygotuj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała.
   UWAGA: W tym protokole królicze przeciwciała bazgroły zostały użyte do znakowania błon komórkowych, a szczury anty-śmiertelne do oznaczania neuroblastów, chociaż można było użyć dowolnej liczby innych pierwszorzędowych przeciwciał.
   1. Aby przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, najpierw rozcieńcz przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze blokującym. Na przykład królicze przeciwciała bazgroły są stosowane w końcowym stężeniu 1:1000. Dlatego najpierw rozcieńczyć królicze przeciwciało przeciwbazgrołowe w stosunku 1:100 (1 μl przeciwciała plus 99 μl roztworu blokującego). Szczur martwy jest używany w końcowym stężeniu 1:100. Dlatego najpierw rozcieńczyć przeciwciało śmiertelne dla szczura w stosunku 1:10 (1 μl przeciwciała plus 9 μl roztworu blokującego).
      UWAGA: Rozcieńczenia te mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze 4 °C, jeśli dodaje się również azydek sodu (0,05%) w celu zahamowania wzrostu bakterii.
   2. Następnie policz liczbę studzienek, w których znajdują się mózgi. Liczba dołków określa objętość pierwotnego roztworu przeciwciała do wykonania. Na przykład, jeśli są 2 dołki mózgów, przygotuj 20 μl roztworu przeciwciała pierwotnego (na 10 dołków 100 μl itp.). Aby przygotować 20 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego, dodaj 2 μl każdego rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego i 16 μl roztworu blokującego.
      UWAGA: Końcowe stężenie każdego z przeciwciał pierwszorzędowych wynosi odpowiednio 1:1000 i 1:100. Krótko mówiąc, należy wykonać pierwsze rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych w stężeniu tak, aby drugie rozcieńczenie zawsze wynosiło 1:10, aby uzyskać odpowiednie stężenia końcowe. W tym przypadku 1:1000 dla królików i 1:100 dla szczurów anty-deadpo.
9. Usunąć roztwór blokujący za pomocą mikropipety ustawionej na 10 μl i odpipetować 10 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do każdej studzienki.
10. Przykryj i uszczelnij tackę za pomocą parafolii i umieść ją z powrotem w szczelnie zamkniętym pudełku z mokrymi ręcznikami. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Potrząsanie nie jest wymagane i jest zdecydowanie odradzane. Przeciwciała przenikną do mózgu bez wstrząsania i mieszania.
11. Następnego dnia usuń roztwór przeciwciała pierwotnego za pomocą mikropipety i przepłucz mózg 3 razy 10 μl 1x PBT. Następnie umyj mózgi 4 razy 10 μl 1x PBT przez 10 minut każdy. Podczas 10-minutowego płukania przygotuj drugorzędowy roztwór przeciwciała.
12. Aby przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, wybierz przeciwciała drugorzędowe, które rozpoznają przeciwciała pierwszorzędowe. W tym protokole zastosowano kozioł anty-królik Alexa Fluor 488 i kozioł anty-szczur Alexa 555.
    1. Pobrać pipetę po 1 μl każdego z przeciwciał drugorzędowych do probówki mikrowirówkowej z 298 μl roztworu blokującego, aby uzyskać końcowe stężenie 1:300 dla każdego przeciwciała drugorzędowego.
13. Po ostatnich 10 minutach płukania wyjąć 1x PBT i odpipetować 10 μl roztworu przeciwciał wtórnych do każdej studzienki. Uszczelnij tackę za pomocą parafilmu i umieść ją z powrotem w pudełku z wilgotnymi ręcznikami. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Nie martw się o usuwanie każdego ostatniego μl w studzienkach między płukaniem, płukaniem lub podczas dodawania pierwszorzędowych i wtórnych roztworów przeciwciał. Mózgi zawsze pozostaną zanurzone w kilku μl płynu, co jest w porządku.
14. Następnego dnia usuń roztwór przeciwciała wtórnego za pomocą mikropipety i przepłucz mózgi 3 razy po 10 μl 1x PBT. Następnie umyj mózgi 4 razy po 10 μl 1x PBT przez 10 minut każdy.
15. Podczas 10-minutowego płukania przygotuj mieszaninę reakcyjną EdU, aby wykryć włączenie EdU. Przygotować mieszaninę reakcyjną EdU zgodnie z wytycznymi producenta.
16. Po ostatnim płukaniu wyjąć 1x PBT i odpipetować 10 μl mieszaniny reakcyjnej EdU do każdej studzienki z mózgami. Uszczelnij płytkę mikrodołkową parafolią i przykryj folią aluminiową. Pozostaw talerz na ławce na 30 minut.
17. Po 30 minutach przepłucz mózgi 3 razy po 10 μl 1x PBT i przepłucz mózgi 3 razy po 10 μl 1x PBT przez 5 minut każdy.
18. Po ostatnim praniu wyjąć 1x PBT i odpipetować 10 μl roztworu podłoża montażowego na bazie glicerolu. Zamknąć płytkę i umieścić ją na noc w temperaturze 4 °C.

5. Montowanie i obrazowanie mózgów

1. Następnego dnia przygotuj szkiełka mikroskopowe (25 mm x 75 mm x 1 mm): Przyklej (np. superglue) jedno kwadratowe szkło nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm x 1 mm do każdego końca szkiełka mikroskopowego, aby utworzyć "most", na którym zostanie umieszczony większy szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 50 mm x 1 mm, aby zrobić przestrzeń między szkiełkiem podstawowym a większym szkiełkiem nakrywkowym (Rysunek 5A). Ta przestrzeń pozwoli mózgowi na ruch wystarczający do prawidłowej orientacji, jednocześnie zapobiegając jego zmiażdżeniu.

Rysunek 5: Schemat przedstawiający szkiełko mikroskopowe, orientację i typy komórek w mózgu larwy. (A) Wizualna reprezentacja szkiełka mikroskopowego, na którym zamontowany jest mózg larwy i jest on gotowy do zobrazowania. (B) Pokazano również, że wytyczne należy stosować w odniesieniu do orientacji tkanek. (C) Szkiełko mikroskopowe gotowe do obrazowania w mikroskopie konfokalnym. (D) Rysunek przedstawiający niektóre typy komórek w mózgu larwy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Po przyklejeniu szkieł nakrywkowych o wymiarach 22 mm x 22 mm x 1 mm do szkiełka mikroskopowego, odpipetuj 9,3 μl roztworu podłoża montażowego na bazie glicerolu zawierającego jeden mózg z dołka płytki mikrodołkowej i umieść go na środku szkiełka (Rysunek 5A).
   UWAGA: Mózgi larw mogą przylegać do końcówki pipety, więc należy zachować ostrożność. Aby uniknąć adhezji, zacznij od zasysania środka zapobiegającego zanikaniu, a następnie zasysania pojedynczego mózgu w kierunku końca objętości 9,3 μl.
3. Gdy mózg znajdzie się na szkiełku, delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 50 mm x 1 mm na wierzchu. Ustaw mózg tak, jak widać na Rysunek 5B. Delikatnie przesuwaj szkiełko nakrywkowe, aby zorientować mózg. Próbka jest następnie gotowa do obrazowania.
4. Użyj mikroskopu konfokalnego wyposażonego w duże powiększenie i obiektyw o dużej aperturze numerycznej (Rysunek 5C), aby uzyskać najlepsze obrazy. Na przykład: 60-krotny lub 63-krotny, 1,4-calowy obiektyw olejowy.
   1. Wyobraź sobie mózgi z powierzchnią grzbietową najbliżej szkiełka nakrywkowego (i obiektywu). Uzyskaj stosy Z przez całą półkulę mózgu, zaczynając od powierzchni brzusznej (najbardziej oddalonej od celu) w odstępach 1 μm lub kroku Z.
      UWAGA: Stosowane lasery zależą od przeciwciał drugorzędowych. W tym protokole użyte linie laserowe miały długość fali 488 nm do wykrywania barwienia bazgrołem, 555 nm do wykrywania martwego punktu widzenia i 633 nm do wykrywania EdU.

6. Analiza danych

1. Użyj oprogramowania typu open source Fidżi do analizy półkul mózgowych i użyj wtyczki licznika komórek Fidżi do liczenia komórek.

Świeżo wyklute mózgi dzikich typów OregonR zostały wypreparowane i hodowane przez 24 godziny w pożywce Schneidera (SSM) z dodatkiem insuliny. Tkanki zostały utrwalone i wybarwione zgodnie z protokołem. Zastosowano pierwszorzędowe przeciwciała wygenerowane przeciwko Deadpan (Dpn) w celu wykrycia NB i Scribble do znakowania błon komórkowych. Analog tymidyny 5-etynylo-2′-deoksyurydyny (Edu) został dodany w celu wykrycia wejścia w fazę S i reaktywacji NB. Po 24 godzinach w hodowli znaleźliśmy duże NB Edu dodatnie i Dpn (Rysunek 6A-C). Następnie, świeżo wyklute mózgi typu dzikiego OregonR hodowano przez 24 godziny w suplementowanej pożywce Schneidera bez insuliny. Po 24 godzinach w hodowli nie znaleźliśmy żadnych dużych rozmiarów dodatnich i dodatnich Dpn NB innych niż cztery NB ciała grzyba i jeden brzuszno-boczny NB (Rysunek 6D-F). Ciało grzyba i neuroblasty brzuszno-boczne są podzbiorem centralnych neuroblastów mózgu, które dzielą się w sposób ciągły podczas przejścia od embrionalnego do larwalnego. Wnioskujemy, że egzogenna insulina jest wystarczająca do reaktywacji neuroblastów ze stanu spoczynku w eksplantatach mózgu hodowanych w pożywce Schneidera.

Podczas obrazowania konfokalnego, czasami obserwowano uszkodzone niektóre półkule mózgu. Uszkodzenia, które znaleźliśmy, składały się z małych lub dużych otworów w eksplantowanej tkance mózgowej (Rysunek 6G, H). Tkanki te zostały wyłączone z analizy. Oprócz 24-godzinnego punktu czasowego, mózgi były również z powodzeniem hodowane przez 48 godzin (dane nie pokazane). Po 48 godzinach w hodowli stwierdziliśmy dalszy wzrost liczby Dpn dodatnich EdU CB NB i wzrost liczby mózgów z uszkodzeniem tkanek. Sugeruje to, że hodowla mózgów w dłuższej perspektywie jest prawdopodobnie wykonalna; Należy jednak zachować dużą ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia tkanek.

Rysunek 6: Obrazowanie konfokalne. (A-C) Egzogenna insulina jest wystarczająca do reaktywacji spoczynkowych NB. (A) Maksymalna intensywność projekcji jednej półkuli mózgu wykazująca Deadpan (Dpn) i Edu dodatnie NB po 24 godzinach hodowli w obecności insuliny. (B) Pojedynczy obraz wycinka Z tej samej półkuli mózgu z immunologicznie barwiącymi błonami komórkowymi Scribble (Scrib). (C) Duże powiększenie NB we wstawce w panelu B. Jednokanałowe obrazy w skali szarości ze scalaniem kolorów w prawym dolnym rogu. (D-F) NB pozostają w stanie spoczynku przy braku insuliny egzogennej. (D) Projekcja maksymalnej intensywności jednej półkuli mózgu wykazująca dodatnie NB Dpn i Edu po 24 godzinach posiewu przy braku insuliny. (E) Pojedynczy stos Z tej samej półkuli mózgowej z barwieniem immunologicznym Scrib. (F) Duże powiększenie NB we wstawce w panelu E. Jednokanałowe obrazy w skali szarości ze scalaniem kolorów w prawym dolnym rogu. Grot strzałki oznacza jeden z 4 MB NB, które dzielą się w sposób ciągły i nie wchodzą i nie wychodzą ze stanu spoczynku (patrz Rysunek 1). (G,H) Przykłady uszkodzonych eksplantatów mózgu, niewykorzystane w analizie. (G) Pojedynczy wycinek Z jednej półkuli mózgowej z dużymi otworami w tkance. (H) Pojedynczy wycinek półkuli mózgowej pokazuje małe w tkance. Podziałka: 10 μm. Biała przerywana linia oznacza linię środkową. Przednia jest górna, a tylna jest dołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przepis na robienie talerzy winogronowych. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w sekcji 1.2.

Tabela 2: Przepis na tworzenie uzupełnionych nośników Schneidera (SSM). W tabeli podano objętość wszystkich składników potrzebnych do przygotowania 5 ml SSM.

Tabela 3: Przepis na tworzenie bufora utrwalającego i PEM. W tabeli wymieniono substancje chemiczne i ich odpowiednie stężenia do przygotowania utrwalacza i buforu PEM.

Autorzy nie mają sprzecznych interesów.