Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Reaktywacja nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63189

⸱

18 maja 2022

 ,  , 
1Biology department, University of Virginia

W tym artykule

Podsumowanie

Ustalono metodę reaktywacji uśpionych nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila. Za pomocą tej metody można oddzielić rolę sygnałów ogólnoustrojowych od sygnałów wewnętrznych w tkance w regulacji spoczynku, wejścia i wyjścia nerwowych komórek macierzystych.

Streszczenie

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) mają zdolność do namnażania się, różnicowania, przechodzenia apoptozy, a nawet wchodzenia i wychodzenia ze stanu spoczynku. Wiele z tych procesów jest kontrolowanych przez złożone wzajemne oddziaływanie między wewnętrznymi programami genetycznymi NSC a zewnętrznymi czynnikami NSC, lokalnymi i ogólnoustrojowymi. W modelowym organizmie genetycznym, Drosophila melanogaster, NSC, znane jako neuroblasty (NB), przechodzą ze stanu spoczynku do proliferacji podczas przejścia embrionalnego do larwalnego. W tym czasie larwy wyłaniają się ze skorupek jaj i zaczynają pełzać, szukając składników odżywczych w diecie. W odpowiedzi na karmienie zwierząt ciało tłuszczowe, narząd endokrynny o zdolności magazynowania lipidów, wytwarza sygnał, który jest uwalniany ogólnoustrojowo do krążącej hemolimfy. W odpowiedzi na sygnał pochodzący od ciała tłuszczowego (FBDS), peptydy insulinopodobne Drosophila (Dilps) są wytwarzane i uwalniane z neuronów neurowydzielniczych mózgu i gleju, co prowadzi do dalszej aktywacji sygnalizacji wzrostu kinazy PI3 w NB oraz ich niszy glejowej i tchawicy. Chociaż jest to obecny model przechodzenia NB ze stanu spoczynku do proliferacji, natura zewnętrznej wskazówki FBDS pozostaje nieuchwytna. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób zewnętrzne sygnały ogólnoustrojowe NB regulują wyjście ze stanu spoczynku, opracowano metodę hodowli wczesnych mózgów larw in vitro przed karmieniem zwierząt. Dzięki tej metodzie czynniki egzogenne mogą być dostarczane do pożywki hodowlanej i NB wychodzić z oznaczonego stanu spoczynku. Odkryliśmy, że egzogenna insulina jest wystarczająca do reaktywacji NB ze stanu spoczynku w eksplantatach całego mózgu. Ponieważ metoda ta dobrze nadaje się do badań przesiewowych na dużą skalę, naszym celem jest zidentyfikowanie dodatkowych zewnętrznych wskazówek, które regulują decyzje dotyczące spoczynku NB w porównaniu z decyzjami dotyczącymi proliferacji. Ponieważ geny i szlaki, które regulują decyzje dotyczące proliferacji NSC, są ewolucyjnie zachowane, wyniki tego testu mogą dostarczyć informacji na temat poprawy terapii regeneracyjnych w klinice.

Wprowadzenie

Komórki macierzyste budzą duże zainteresowanie ze względu na ich potencjał zastosowania w medycynie regeneracyjnej1,2. Wiele zwierząt, szczególnie gatunki długowieczne, posiada komórki macierzyste w obrębie tkanek dorosłego organizmu. Te rezydentne komórki macierzyste służą do utrzymania homeostazy tkankowej i są wykorzystywane do naprawy po urazach fizycznych lub w wyniku chorób3,4. Większość komórek macierzystych u dorosłych zwierząt znajduje się w stanie spoczynku (quiescence), czyli względnie uśpionym stanie charakteryzującym się zatrzymaniem cyklu komórkowego i nieaktywnością sygnałów wzrostu5. W odpowiedzi na sygnały zewnętrzne komórki macierzyste wychodzą ze stanu spoczynku, wchodzą w cykl komórkowy i zaczynają generować komórki potomne specyficzne dla danego typu tkanki. Na przykład, aby wywołać skuteczną odpowiedź immunologiczną, komórki prezentujące antygen indukują naiwne limfocyty T w stanie spoczynku do wejścia w cykl komórkowy i ekspansji klonalnej6. W odpowiedzi na uszkodzenie mięśni szkieletowych, komórki satelitarne mięśni wchodzą w cykl komórkowy i generują mioblasty potomne w celu zastąpienia uszkodzonych miofibryli5,7. Choć wiadomo, że spoczywające komórki macierzyste reagują na sygnały zewnętrzne, w wielu przypadkach natura tych sygnałów oraz mechanizm indukowanej przez nie aktywacji komórek macierzystych pozostaje niejasna. Lepsze zrozumienie sposobu, w jaki spoczywające komórki macierzyste reagują na sygnały zewnętrzne i wchodzą w cykl komórkowy, pomoże w opracowaniu skuteczniejszych terapii opartych na komórkach macierzystych w praktyce klinicznej oraz poszerzy wiedzę naukową.

Od dziesięcioleci organizmy modelowe są wykorzystywane do odkrywania genów i szlaków sygnalizacji komórkowej, które regulują proliferację komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym. U Drosophila neuralne komórki macierzyste (NSCs), znane jako neuroblasty (NBs), dzielą się w trakcie całego rozwoju, aby wytworzyć wszystkie neurony i glej, które ostatecznie integrują się, tworząc obwody neuronalne niezbędne do funkcjonowania mózgu8,9. Podobnie jak inne komórki macierzyste, neuroblasty dzielą się asymetrycznie w celu samoodnowienia, a w niektórych przypadkach symetrycznie, aby zwiększyć pulę komórek macierzystych. Neuroblasty są specyfikowane podczas embriogenezy, a większość z nich wchodzi w stan uśpienia (quiescence) pod koniec tego procesu, co zbiega się ze spadkiem zapasów składników odżywczych pochodzących od matki (Rysunek 1). Po zakończeniu embriogenezy wykluwają się larwy i zaczynają odżywiać. W odpowiedzi na żerowanie zwierzęcia neuroblasty aktywują się z okresu uśpienia i wznawiają podziały komórkowe10,11,12,13,14,15,16. Ze względu na to, że OUN Drosophila jest stosunkowo prosta, a neuroblasty wchodzą w stan uśpienia i opuszczają go w ściśle określonych momentach, wykorzystanie Drosophila do badania regulacji uśpienia, jego inicjacji i zakończenia, okazuje się idealnym rozwiązaniem.

Schemat proliferacji neuroblastów Drosophila; aktywność MBNB, CBNB; stadia rozwoju, wpływ karmienia.
Rycina 1: Względna proliferacja neuroblastów CB (neuroblasty centralne mózgu, kolor czerwony) oraz neuroblastów MB (neuroblasty ciał grzybkowatych, kolor niebieski) w czasie rozwoju. Pod koniec embriogenezy większość neuroblastów (linia czerwona) zaprzestaje proliferacji i wchodzi w stan spoczynku (quiescence). Stan spoczynku trwa do momentu, gdy nowo wyklute larwy spożyją swój pierwszy pełny posiłek. Punkty czasowe będące przedmiotem tej metodologii są zaznaczone czerwonymi okręgami (1, spoczynek oraz 2, reaktywacja). Neuroblasty MB (kolor niebieski) stanowią podgrupę neuroblastów centralnych mózgu, które dzielą się nieprzerwanie przez cały okres rozwoju (4 na półkulę mózgu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W odpowiedzi na karmienie zwierzęcia, szlaki sygnalizacyjne wzrostu PI3-kinazy i TOR stają się aktywne w NBs oraz w ich niszy glejowej i tchawkowej10,11,15,16. Gdy składniki odżywcze z diety zostaną wycofane lub gdy poziomy PI3-kinazy zostaną obniżone, NBs nie ulegają reaktywacji, a wzrost glejowców i tchawki jest również zredukowany10,11,15,16. Obecny model zakłada, że reaktywacja NBs jest sprzężona ze wzrostem larwy poprzez ciało tłuszczowe, które w odpowiedzi na karmienie zwierzęcia uwalnia sygnał systemowy12,17,18. Sygnał ten, który wciąż pozostaje nieznany, prawdopodobnie promuje ekspresję i uwalnianie insulinopodobnych peptydów Drosophila (Dilps) w mózgu, co prowadzi do kaskadowej aktywacji PI3-kinazy w NBs oraz w ich niszy glejowej i tchawkowej. Aby lepiej zrozumieć naturę systemowych sygnałów, opracowaliśmy metodę reaktywacji spoczywających NBs w hodowlanych eksplantach mózgu. Dzięki tej metodzie reaktywację NBs można badać w obecności systemowych sygnałów z całego organizmu. Czynniki egzogenne mogą być ponownie dostarczane do pożywki hodowlanej, a reaktywację NBs ocenia się na podstawie wbudowania analogu tymidyny, EdU. Stosując tę metodę, ustaliliśmy, że egzogenna insulina jest wystarczająca do reaktywacji spoczywających NBs w eksplantach mózgu. Przyszłe prace będą ukierunkowane na identyfikację dodatkowych czynników, które po ponownym dodaniu pozytywnie lub negatywnie regulują spoczynek NBs w eksplantach mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zbieranie larw Drosophila

UWAGA: Przed rozpoczęciem przygotuj płytkę z drożdżami, pastę z winogron oraz kondominium dla muszek:

  1. Pasta drożdżowa: W małym pojemniku wymieszaj 5 g aktywnych suchych drożdży z 10 mL wody, aby utworzyć pastę o konsystencji masła orzechowego. Przykryj pastę drożdżową folią spożywczą i użyj gumki recepturki, aby mocno przymocować ją do pojemnika.
    UWAGA: Świeża pasta drożdżowa zwiększy swoją objętość w pojemniku i może wypchnąć pokrywkę, jeśli nie zostanie mocno przymocowana. Pasta drożdżowa zachowuje trwałość przez kilka dni w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Płytki winogronowe: Postępuj zgodnie z przepisem na przygotowanie płytek winogronowych (Tabela 1). W przypadku użycia płytek przechowywanych w temperaturze 4°C, należy je uprzednio ogrzać przed użyciem, pozostawiając je w RT przez 1 h.
    1. Wymieszaj wodę (750 mL) i agar (18,75 g) w kolbie o pojemności 4 L, zamieszaj i autoklawuj przez 20 min (cykl dla cieczy).
    2. Wymieszaj sok winogronowy (250 mL) i sacharozę (25 g) w kolbie o pojemności 1 L z dużym mieszadełkiem magnetycznym na płycie grzewczej (niska temperatura). Po rozpuszczeniu sacharozy wyłącz grzanie i poczekaj, aż kolba stanie się bezpieczna w dotyku, przed dodaniem Tegoseptu (10%, 4 mL) i kwasu propionowego (5 mL). Pozostaw włączone mieszadło.
    3. Po zakończeniu autoklawowania pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury, w której kolba jest bezpieczna w dotyku (~60 °C), a następnie dodaj mieszaninę soku winogronowego.
    4. Połącz wszystkie roztwory w jednej kolbie i pozostaw do wymieszania na płycie grzewczej.
    5. Pipetuj roztwór do pokrywek małych szalek Petriego (35 mm). Pipetuj około 9 mL na pokrywkę lub do uzyskania wypukłej kopuły.
    6. OPCJONALNIE: Opal pokrywki płomieniem, aby pozbyć się pęcherzyków powietrza.
    7. Po zastygnięciu płytek ułóż płytki winogronowe w pudełku z hermetyczną pokrywką i umieść pudełko w temperaturze 4 °C. Płytki można przechowywać do 1 miesiąca.
  3. Kondominium dla much: Wywierć około 20 otworów w kwadratowej butelce polipropylenowej do Drosophila o pojemności 6 uncji, używając igły 18 G.
  4. Przenieś dorosłe muchy (~100 OregonR lub dowolny genotyp) do kondominium i zamknij je pokrywką z płytki z agarem winogronowym, na której naniesiono niewielką ilość pasty drożdżowej. Umieść kropkę z pasty w kierunku środka płytki i przymocuj płytkę do kondominium za pomocą taśmy laboratoryjnej.
  5. Odwróć pojemnik tak, aby płytka z agarem winogronowym znalazła się na dole i umieść go w inkubatorze w temperaturze 25 °C na 24 h (Rysunek 2).

Inkubacja much, schemat eksperymentu genetycznego przedstawiający Drosophila w fiolce, umieszczonej w inkubatorze laboratoryjnym.
Rysunek 2: Przedstawienie wizualne odwróconej butelki dla much (condo) z dorosłymi osobnikami Drosophila płci męskiej i żeńskiej. Plastikowa butelka posiada małe nakłucia, wykonane igłą 18 G, w celu wymiany tlenu. Wlot butelki jest uszczelniony korkiem z agaru i soku winogronowego, a następnie butelka zostaje odwrócona i przechowywana w inkubatorze w temperaturze 25 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Po 24 h wymień płytkę z agarem winogronowym na nową płytkę z nałożoną pastą drożdżową. Szybko zamień obie płytki, jednocześnie delikatnie stukając kondominium o blat, aby dorosłe muchy nie uciekły.
  2. Obejrzyj płytkę gołym okiem i oceń liczbę zarodków na płytce. Zarodki Drosophila są podłużne i białe z dwoma przypominającymi nitki wyrostkami.
  3. Jeśli na płytce znajduje się bardzo mało zarodków (mniej niż 100), wyrzuć płytkę (zeskrob agar do odpadów z much i zachowaj plastikową pokrywkę do ponownego użycia). W wielu przypadkach dorosłe samice nie złożą wielu jaj w pierwszą noc w nowym kondominium. Jeśli tak się stanie, daj dorosłym muchom kolejne 24 h na aklimatyzację.
  4. Jeśli na płytce znajduje się duża liczba zarodków (co najmniej 100), zachowaj ją i ostrożnie usuń pastę drożdżową za pomocą szpachelki o płaskim dnie.
  5. Po usunięciu pasty drożdżowej użyj metalowej igły, aby ręcznie usunąć wszystkie larwy z płytki z agarem winogronowym pod mikroskopem stereoskopowym. Podczas oglądania płytki pod mikroskopem stereoskopowym powinny być widoczne zarówno pełzające larwy, jak i zarodki.
  6. Usuń wszystkie larwy, przesuwając metalową igłę w stronę jednej z larw. Larwy są lepkie i przykleją się do igły. Gdy jedna larwa znajdzie się na igle, kolejne można łatwo zebrać, wykorzystując larwę na narzędziu do przyczepienia pozostałych.
    UWAGA: Larwy mają tendencję do przyklejania się do siebie. Na tym etapie nie ma znaczenia, czy larwy zostaną uszkodzone. Larwy te zostaną wyrzucone.
  7. Po zebraniu i usunięciu wszystkich larw umieść płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 25 °C. Upewnij się, że płytka znajduje się w większym pojemniku, który można szczelnie zamknąć. Na dno większego pojemnika włóż mokre ręczniki papierowe, aby utrzymać wilgotność.
  8. Po 30-60 min przenieś płytkę z powrotem pod mikroskop stereoskopowy i teraz ostrożnie wybierz ~20-25 larw z tej samej płytki z agarem winogronowym, aby mieć pewność, że wybrane larwy wykluły się niedawno, w oknie czasowym 30-60 min.
  9. Zanurz końcówkę narzędzia z 20-25 świeżo wyklutymi larwami w czarce Petriego (60 mm) wypełnionej 1-2 mL 1x soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) na 2 min.
  10. Po 2 min przechyl czarkę pod kątem, aby zgromadzić ciecz na dnie. Używając małego pędzla, wymieć larwy z cieczy na dno czarki Petriego.
  11. Zbierz wszystkie larwy na pędzel i przenieś je do nowej czarki Petriego (60 mm) zawierającej 1-2 mL 70% etanolu. Powtórz kroki 1.15, aby zebrać larwy pędzlem i przenieść je do nowej czarki Petriego z 1-2 mL 1x PBS.

2. Przygotowanie pożywek i narzędzi

  1. Spryskać blat i obszar roboczy 70% etanolem i pozostawić do wyschnięcia.
  2. Spryskać narzędzia do sekcji, pincety oraz dwie szalki zegarkowe 70% etanolem i pozostawić je do wyschnięcia na blacie.
  3. Przygotować suplementowane pożywkę Schneidera (SSM, Tabela 2) i umieścić ją w lodzie.
  4. Pipetować 1 mL SSM do każdej z szalek zegarkowych.
  5. Za pomocą mikropipety ze sterylnym końcem przenieść świeżo wyklute larwy z płytki z PBS do SSM w pierwszej szalce zegarkowej. Za pomocą mikropipety ze sterylnym końcem przenieść świeżo wyklute larwy do SSM w drugiej szalce zegarkowej.

3. Disekcje i hodowle mózgu

  1. Gdy larwy znajdą się w drugiej szalkoce warzywnej z SSM, wypreparuj mózgi z larw, używając pęsety i mikroskopu sekcyjnego. Dostosuj powiększenie w razie potrzeby.
  2. Użyj jednej pęsety do uchwycenia haczyków gębowych, a drugą delikatnie chwyć ciało w połowie długości i pociągnij w przeciwnym kierunku (Rysunek 3), aby podzielić larwę na dwie części.
    UWAGA: Mózg znajduje się bezpośrednio za haczykami gębowymi. Należy pamiętać, że mózg może być otoczony innymi tkankami. Zachowaj szczególną ostrożność podczas usuwania tych tkanek, ponieważ może to doprowadzić do uszkodzenia mózgu.

Schemat techniki sekcji; anatomia mózgu i haczyków gębowych larwy w układzie z szalką Petriego.
Rycina 3: Larwy Drosophila w szklanym szkiełku zegarkowym z SSM. Pinceta jest prawidłowo ustawiona do sekcji. Położenie mózgu larwy (ciemnoszary) znajduje się za haczykami gębowymi (czarne); oba elementy są pokazane wewnątrz larwy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Po wypreparowaniu 15-20 mózgów, należy dodać 1 mL SSM do jednego dołka sterylnej 12-dołkowej płytki hodowlanej. Świeżo wypreparowane mózgi należy przenieść do SSM za pomocą mikropipety ze sterylnym końcem (Rysunek 4A).
  2. Mózgi w pożywce SSM w 12-dołkowej płytce hodowlanej należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 25 °C na 24 h (Rysunek 4A).

Układ eksperymentu hodowli tkankowej; sekcja mózgu, inkubacja, pipeta, schemat płytki wielodołkowej.
Rysunek 4: Hodowla mózgu i immunostaining. (A) Całe mózgi w 12-dołkowej płytce hodowlanej zawierającej 1 mL SSM. Płytka hodowlana jest następnie umieszczana w inkubatorze w temperaturze 25 °C na 24 h. (B) 72-dołkowa minitacka służąca do utrzymania eksplantów mózgu podczas immunostainingu. Mózgi są płukane, a roztwory przenoszone za pomocą mikropipety P20 ustawionej na 10 μL. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Test proliferacji, utrwalanie mózgu i barwienie przeciwciałami

  1. Następnego dnia przygotować 1 mL roztworu EdU SSM. Do sterylnej probówki do mikrocentryfugi pipetować 10 μL stoku 5-etynylo-2′-deoksyurydyny (EdU) o stężeniu 10 mM oraz 990 μL SSM (końcowe stężenie EdU wynosi 0,1 mM), a następnie wymieszać. Po zakończeniu 24-godzinnej inkubacji pipetować 1 mL EdU SSM do jednego dołka sterylnej 12-dołkowej płytki hodowlanej.
  2. Za pomocą mikropipety ze sterylną końcówką przenieść mózgi z dołka zawierającego sam SSM do nowego dołka z roztworem EdU SSM. Inkubować przez 1 h w temperaturze 25 °C.
  3. Następnie przenieść oznakowane EdU mózgi do innego dołka w tej samej płytce hodowlanej zawierającego 1 mL utrwalacza (4% paraformaldehyd, przepis w Tabeli 3) na 20 min.
    OSTROŻNIE: Paraformaldehyd stanowi zagrożenie biologiczne i musi być utylizowany w odpowiedni sposób.
  4. Po utrwaleniu szybko przenieść mózgi za pomocą mikropipety do dołków 72-dołkowej mini płytki. Każdy dołek może pomieścić 10 mózgów i 10-15 µL cieczy (Rysunek 4B). Po przeniesieniu mózgów do mini płytki (nie więcej niż 10 mózgów na dołek) usunąć utrwalacz i wypłukać mózgi 3 razy w 10 µL 1x PBT (bufor fosforanowy, pH 7,4 zawierający 0,1% Triton-X 100).
    UWAGA: Płukanie polega na pipetowaniu 10 µL 1x PBT na mózgi, usunięciu cieczy i powtórzeniu tej czynności 3 razy.
  5. Następnie przemyć mózgi 3 razy po 10 min każdy, ponownie w 10 µL 1x PBT. Należy upewnić się, że mózgi przez cały czas są przykryte cieczą.
  6. Po zakończeniu przemywania pipetować 10 µL roztworu blokującego (1x PBT z 10% normalną surowicą kozią) na mózgi. Przykryć płytkę i uszczelnić ją paskiem parafili wokół krawędzi.
  7. Po uszczelnieniu umieścić mini płytkę w zamkniętym pudełku z wilgotnymi ręcznikami, aby zapewnić wilgotne środowisko i zapobiec odparowaniu. Pudełko z płytką pozostawić w temperaturze 4 °C przez noc.
  8. Następnego dnia przygotować roztwór przeciwciał pierwszorzędowych.
    UWAGA: W tym protokole do znakowania błon komórkowych użyto przeciwciała króliczego anty-scribble, a do znakowania neuroblastów przeciwciała szczurzego anty-deadpan, choć można zastosować dowolną liczbę innych przeciwciał pierwszorzędowych.
    1. Aby przygotować roztwór przeciwciał pierwszorzędowych, najpierw wykonać rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych w roztworze blokującym. Na przykład przeciwciało królicze anty-scribble stosuje się w końcowym stężeniu 1:1000. Dlatego najpierw należy rozcieńczyć przeciwciało królicze anty-scribble 1:100 (1 µL przeciwciała plus 99 µL roztworu blokującego). Przeciwciało szczurze anty-deadpan stosuje się w końcowym stężeniu 1:100. Dlatego najpierw należy rozcieńczyć przeciwciało szczurze anty-deadpan 1:10 (1 µL przeciwciała plus 9 µL roztworu blokującego).
      UWAGA: Rozcieńczenia te można przechowywać długoterminowo w temperaturze 4 °C, jeśli dodano azydku sodu (0,05%) w celu zahamowania wzrostu bakterii.
    2. Następnie policzyć liczbę dołków zawierających mózgi. Liczba dołków określa objętość roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do przygotowania. Na przykład, jeśli są 2 dołki z mózgami, przygotować 20 µL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych (dla 10 dołków 100 µL itd.). Aby przygotować 20 µL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych, dodać 2 µL każdego rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego i 16 µL roztworu blokującego.
      UWAGA: Końcowe stężenia przeciwciał pierwszorzędowych wynoszą odpowiednio 1:1000 i 1:100. Krótko mówiąc, należy wykonać pierwsze rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych w takim stężeniu, aby drugie rozcieńczenie zawsze wynosiło 1:10, co pozwoli osiągnąć odpowiednie stężenia końcowe. W tym przypadku 1:1000 dla przeciwciała króliczego anty-scribble i 1:100 dla przeciwciała szczurzego anty-deadpan.
  9. Usunąć roztwór blokujący mikropipetą ustawioną na 10 µL i pipetować 10 µL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do każdego dołka.
  10. Przykryć i uszczelnić płytkę parafilią, a następnie umieścić ją ponownie w zamkniętym pudełku z wilgotnymi ręcznikami. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Wstrząsanie nie jest wymagane i jest zdecydowanie odradzane. Przeciwciała przenikną do mózgów bez wstrząsania lub mieszania.
  11. Następnego dnia usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych za pomocą mikropipety i wypłukać mózgi 3 razy w 10 µL 1x PBT. Następnie przemyć mózgi 4 razy w 10 µL 1x PBT po 10 min każde. Podczas 10-minutowych przemywań przygotować roztwór przeciwciał wtórnych.
  12. Aby przygotować roztwór przeciwciał wtórnych, wybrać przeciwciała wtórne rozpoznające przeciwciała pierwszorzędowe. W tym protokole użyto przeciwciał kozich anty-króliczych Alexa Fluor 488 oraz kozich anty-szczurzych Alexa 555.
    1. Pipetować 1 µL każdego z przeciwciał wtórnych do probówki do mikrocentryfugi z 298 µL roztworu blokującego, aby uzyskać końcowe stężenie 1:300 dla każdego przeciwciała wtórnego.
  13. Po ostatnim 10-minutowym przemywaniu usunąć 1x PBT i pipetować 10 µL roztworu przeciwciał wtórnych do każdego dołka. Uszczelnić płytkę parafilią i umieścić ją ponownie w pudełku z wilgotnymi ręcznikami. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Nie należy martwić się o usunięcie każdego ostatniego µL z dołków pomiędzy płukaniami, przemywaniami lub podczas dodawania roztworów przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych. Mózgi zawsze pozostaną zanurzone w kilku µL cieczy, co jest dopuszczalne.
  14. Następnego dnia usunąć roztwór przeciwciał wtórnych za pomocą mikropipety i wypłukać mózgi 3 razy w 10 µL 1x PBT. Następnie przemyć mózgi 4 razy w 10 µL 1x PBT po 10 min każde.
  15. Podczas 10-minutowych przemywań przygotować mieszaninę reakcyjną EdU do wykrycia wbudowania EdU. Przygotować mieszaninę reakcyjną EdU zgodnie z wytycznymi producenta.
  16. Po ostatnim przemywaniu usunąć 1x PBT i pipetować 10 µL mieszaniny reakcyjnej EdU do każdego dołka z mózgami. Uszczelnić płytkę z mikrodołkami parafilią i przykryć folią aluminiową. Pozostawić płytkę na blacie na 30 min.
  17. Po 30 min wypłukać mózgi 3 razy w 10 µL 1x PBT i przemyć mózgi 3 razy w 10 µL 1x PBT po 5 min każde.
  18. Po ostatnim przemywaniu usunąć 1x PBT i pipetować 10 µL roztworu medium montażowego na bazie glicerolu. Uszczelnić płytkę i pozostawić w temperaturze 4 °C przez noc.

5. Montowanie i obrazowanie mózgów

  1. Następnego dnia przygotuj szkiełka przedmiotowe (25 mm x 75 mm x 1 mm): przyklej (np. superglue) jedno kwadratowe szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm x 1 mm na każdym końcu szkiełka przedmiotowego, aby stworzyć „mostek”, na którym zostanie umieszczone większe szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 50 mm x 1 mm, tworząc przestrzeń między szkiełkiem przedmiotowym a większym szkiełkiem nakrywkowym (Rysunek 5A). Przestrzeń ta zapewni mózgowi wystarczającą ruchomość do prawidłowej orientacji, zapobiegając jednocześnie jego zmiażdżeniu.

Montaż mózgu, schemat mikroskopowy; orientacja przednio-tylna, obrazowanie neuroblastów, analiza komórek.
Rycina 5: Schemat przedstawiający szkiełko mikroskopowe, orientację oraz typy komórek w mózgu larwy. (A) Wizualna reprezentacja szkiełka mikroskopowego, na którym zamontowano mózg larwy, gotowy do obrazowania. (B) Przedstawiono również wytyczną służącą do orientacji tkanki. (C) Szkiełko mikroskopowe przygotowane do obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego. (D) Rysunek schematyczny przedstawiający niektóre typy komórek w mózgu larwy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Po przyklejeniu szkiełek cover glass o wymiarach 22 mm x 22 mm x 1 mm do preparatu szkiełka mikroskopowego, nanieś pipetą 9,3 µL roztworu medium montażowego na bazie glicerolu zawierającego jeden mózg z dołka płytki mikrowyrazowej i umieść go w centrum szkiełka (Rysunek 5A).
    UWAGA: Mózgi larwalne mogą przywierać do końcówki pipety, należy zatem zachować ostrożność. Aby uniknąć przylegania, rozpocznij od pobrania środka antyblaknącego, a następnie pobierz pojedynczy mózg pod koniec objętości 9,3 µL.
  2. Po umieszczeniu mózgu na szkiełku, delikatnie połóż na nim szkiełko cover slip o wymiarach 22 mm x 50 mm x 1 mm. Ustaw mózg tak, jak przedstawiono na Rynku 5B. Delikatnie przesuń szkiełko, aby zorientować mózg. Próbka jest następnie gotowa do obrazowania.
  3. Do uzyskania najlepszych obrazów użyj mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw o dużym powiększeniu i wysokiej aperturze numerycznej (Rysunek 5C). Na przykład: obiektyw immersyjny olejowy 60x lub 63x, 1,4 NA.
    1. Obrazuj mózgi tak, aby powierzchnia grzbietowa znajdowała się najbliżej szkiełka cover slip (i obiektywu). Wykonaj stosy Z (Z stacks) przez całą półkulę mózgu, zaczynając od powierzchni brzusznej (najdalej oddalonej od obiektywu) w interwałach lub z krokiem Z wynoszącym 1 µm.
      UWAGA: Stosowane lasery zależą od przeciwciał wtórnych. W niniejszym protokole użyte linie laserowe to 488 nm do detekcji barwienia Scribble, 555 nm do detekcji Deadpan oraz 633 nm do detekcji EdU.

6. Analiza danych

  1. Należy użyć otwartoźródłowego oprogramowania Fiji do analizy półkul mózgu oraz wtyczki Fiji cell counter do policzenia komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mózgi świeżo wyklutych osobników typu dzikiego OregonR wypreparowano i hodowano przez 24 h w suplementowanym medium Schneidera (SSM) z dodatkiem insuliny. Tkanki utrwalono i barwiono zgodnie z protokołem. Wykorzystano przeciwciała pierwszorzędowe skierowane przeciwko Deadpan (Dpn) w celu wykrycia NB oraz przeciwko Scribble do znakowania błon komórkowych. W celu wykrycia wejścia w fazę S oraz reaktywacji NB dodano analog tymidyny 5-etynylo-2′-deoksyurydynę (Edu). Po 24 h hodowli stwierdzono obecność dużych, Edu-dodatnich ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda hodowli eksplantatów mózgu może być przeprowadzona w większości środowisk laboratoryjnych. Wymagane narzędzia, a także procedura i gromadzenie danych są proste i nieskomplikowane. Za pomocą tej metody można testować różne hipotezy, w tym te związane z kaskadami sygnalizacji komórkowej i czynnikami zewnętrznymi, które regulują reaktywację i proliferację NB. Tutaj, wykorzystując dzikie zwierzęta OregonR, stwierdziliśmy, że egzogenna insulina była wystarczająca do reaktywacji NB ze stanu spoczynku, niez...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Uznajemy program LSAMP Bridges to Doctorate do finansowania (CNK) oraz NIH/NIGMS (R01-GM120421 i R35-GM141886). Jesteśmy wdzięczni dr Conorowi Sipe'owi za rysunek 1. Dziękujemy również wszystkim członkom laboratorium Siegrist za ich nieustające wsparcie i mentoring. Szczególne podziękowania kierujemy do Chhavi Sooda i Gary'ego Teetersa za uważne zapoznanie się z manuskryptem i udzielenie komentarzy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 &mikro; L Końcówki do pipetDenville SciP2102
1000 µ L Końcówki do pipetDenville SciP2103-N
1000 µ L PipettorGilsonP1000
16% paraformaldehyd (10 x 10 mL)Mikroskopia elektronowa Sciences2912.60.0000Służy do utrwalania mózgów larw
20 &mikro; L PipetaGilsonP20
200 & mikro; L Końcówki do pipetDenville Sci1158U56
24-dołkowe płytki do hodowli wielodołkowychFisher Scientific50-197-4477
35 mm szalki PetriegoFisher Scientific08-757-100ATalerz winogronowy Składniki
4 & C lodówkaFisher ScientificZapewnia idealną temperaturę do >24 h inkubacji w roztworze przeciwciał
63x ObiektywLecia
Aktywne suche drożdżeWiększość supermarketów
AgarozaFisher Scientific214010Składniki talerza winogronowego
Zestaw do proliferacji komórek Click-iT EdU do obrazowania, barwnik Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificC10340do oznaczania komórek proliferujących
Mikroskop konfokalnyLeicaSP8
Szkiełka nakrywkowe 22 mm x 22 mm x 1 mm, 10 sztuk po 4 uncjeFisher Scientific12-544-10Dwa szkiełka nakrywkowe są super przyklejone do końców szkiełka mikroskopowego. Tworzy to przestrzeń, która pozwala mózgom unosić się w antifade podczas obrazowania.
Szkiełko nakrywkowe, 22 mm x 50 mm x 1 mmFisher Scientific12-545ESzkiełko nakrywkowe umieszcza się na dwóch kwadratowych szkiełkach nakrywkowych na szkiełku mikroskopowym, dzięki czemu mózg w antifade nie porusza się podczas obrazowania.
Mikroskop preparacyjnyZeissStemi 2000
Etanol 200 proof (100%), Decon Labs, butelka o pojemności 1 galonaFisher Scientific2701Służy do zmywania larw przed 24-godzinnym trzymaniem w pożywce hodowlanej
Surowica bydlęca płodu (10%)SigmaF4135-100MLSuplement do pożywek do hodowli komórkowych.
Cienkie kleszcze do preparacjiFine Science Tools11295-20Forcepty stosowane w sekcjach. Najlepiej sprawdzają się po naostrzeniu.
Butelki na muchy do krzyżowaniaGenessee Scientific32-130Ta butelka służy jako pojemnik, który pozwala muchom składać jaja na talerzu winogronowym.
Szklane naczynie preparacyjne (3 dołki)Nie są już dostępne
GlutationSigmaG6013Zapewnia ochronę oksydacyjną podczas hodowli komórek.
Kozia surowicaSigmaG9023- 10MLŚrodek
blokujący Talerze winogronoweWykonane w domuWyprodukowane w domuTalerze soku winogronowego/agarozy do zbierania świeżo wyklutych jaj
Obraz JImagej.net/fiji/downloadsBezpłatne pobieranie:  https://fiji.scPlatforma obrazowania, która służy do liczenia komórek i reaktywacji Edu
InkubatorThermo Fisher ScientificZapewnia, że temperatura, wilgotność i ekspozycja na światło są dokładnie takie same przez cały eksperyment.
InsulinaSigmaI0516Zmienna niezależna eksperymentu
Kaptur z przepływem laminarnym Doporcjowania pożywek hodowlanych
L-glutaminaSigmaG7513Zapewnia wsparcie podczas hodowli komórkowej
Nunc 72-dołkowe mini tace MicrowellFisher Scientific12-565-154Etapy barwienia immunologicznego są wykonywane w tej tacy
ParafilmFisher ScientificS37440Folia służąca do uszczelniania płytek w celu zapobiegania parowaniu
Pen-StrepSigmaP4458-100mlAntybiodyka stosowana w celu zapobiegania zanieczyszczeniu bakteryjnemu komórek podczas hodowli.
Bufor fosforanowy, pH 7,4Wyprodukowano wdomu Wyprodukowano w domuRozpuszczalnik używany do mycia mózgów po etapach mocowania i barwienia
WybierzFine Science Tools10140-01Służy do zbierania larw z talerza winogronowego
Kwas propionowyFisher ScientificA-258Składniki na talerz winogronowy
Królik 405Abcamab175653Przeciwciała stosowane do barwienia immunologicznego
Szczur 555Abcamab150166Przeciwciała używane do barwienia immunologicznego
Rb ScribblePrezent od Chrisa DoePrzeciwciała używane do barwienia immunologicznego
Rt DeadpanAbcamab195173Przeciwciała używane do barwienia immunologicznego
Schneiders Culture MediumLife Tech21720024Zawiera składniki odżywcze, które pomagają komórkom rosnąć i namnażać
się SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL)Life TechS36963Odczynnik zapewniający ochronę przed blaknięciem fluoroforów
Autoklaw sterylnej wodyWoda Milli-Q wyprodukowana we własnym zakresiePotrzebne do roztworów
SacharozaFisherS2-12Tabliczka winogronowa Składniki
Szkiełka mikroskopowe SuperfrostFisher Scientific12-544-7
SuperglueWiększość supermarketów
TegoseptGenesee Scientific20-259Grape Plate Składniki
Triton-X 100SigmaT9284-100MLPBT
100% sok winogronowy Welch'sWiększość supermarketówSkładniki na talerz winogronowy

Bibliografia

  1. Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
  2. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  3. Daley, G. Q. Stem cells and the evolving notion of cellular identity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376(2015).
  4. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).
  5. van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).
  6. Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).
  7. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).
  8. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  9. Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).
  10. Chell, J. M., Brand, A. H. Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence. Cell. 143, 1161-1173 (2010).
  11. Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila. Nature. 471, 508-512 (2011).
  12. Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
  13. Lin, S., et al. Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain. Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).
  14. Sipe, C. W., Siegrist, S. E. Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila. Elife. 6, 26343(2017).
  15. Speder, P., Brand, A. H. Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila. Elife. 7, 30413(2018).
  16. Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche. PLoS Biology. 18, 3000721(2020).
  17. Colombani, J., et al. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
  18. Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila. Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).
  19. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).
  20. Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270(2012).
  21. Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094(2020).
  22. Datta, S. Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS. Brain Research. 818, 77-83 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

neuronalne kom rki macierzystereaktywacja neuroblast wspoczynek kom rek macierzystychegzogenna insulinapo ywka Schneiderasekcja m zguznakowanie EDUobrazowanie konfokalnesygnalizacja zewn trzna
Reaktywacja nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.