Artykuł metodologiczny

Wydajna i skalowalna produkcja pełnowymiarowych wariantów ludzkiej huntingtyny w komórkach ssaków przy użyciu systemu ekspresji przejściowej

DOI:

10.3791/63190

⸱

10 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Discovery Biology, Curia Global Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapewniamy skalowalne protokoły obejmujące projektowanie konstrukcji, transfekcję przejściową oraz ekspresję i oczyszczanie pełnowymiarowych wariantów ludzkiego białka huntingtyny w komórkach HEK293.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huntingtyna o pełnej długości (FL HTT) to duże (aa 1-3,144), powszechnie wyrażane, białko zawierające poliglutaminę (polyQ) o masie około 350 kDa. Chociaż funkcja komórkowa FL HTT nie jest do końca poznana, zmutowana ekspansja przewodu polyQ powyżej ~36 powtórzeń jest związana z chorobą Huntingtona (HD), przy czym długość polyQ odpowiada mniej więcej wiekowi zachorowania. Aby lepiej zrozumieć wpływ struktury na funkcję zmutowanego HTT (mHTT), potrzebne są duże ilości białka. Submiligramową produkcję FL HTT w komórkach ssaków osiągnięto przy użyciu indukowanej doksycykliną stabilnej ekspresji linii komórkowej. Jednak produkcja białek ze stabilnych linii komórkowych ma ograniczenia, które można przezwyciężyć za pomocą metod transfekcji przejściowej.

Ten artykuł przedstawia solidną metodę produkcji FL HTT i jego wariantów z plazmidów zoptymalizowanych pod kątem kodonów za pomocą transfekcji przejściowej przy użyciu polietylenininy (PEI). Metoda jest skalowalna (>10 mg) i konsekwentnie daje 1-2 mg/L hodowli komórkowej wysoko oczyszczonego FL HTT. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, stwierdzono, że stan oczyszczonego roztworu FL HTT jest wysoce dynamiczny; Białko ma skłonność do tworzenia dimerów i oligomerów wysokiego rzędu. Kluczem do spowolnienia powstawania oligomerów jest szybka praca nad wyizolowaniem frakcji monomerycznych od dimerycznych i oligomerycznych frakcji wysokiego rzędu podczas chromatografii wykluczania wielkości.

Chromatografia wykluczania wielkości z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) została użyta do analizy zawartości dimerów i oligomerów wyższego rzędu w oczyszczonym HTT. Nie zaobserwowano korelacji między długością poliQ FL HTT (Q23, Q48 i Q73) a zawartością oligomerów. Konstrukt delecyjny ekson1 (aa 91-3,144) wykazywał porównywalną skłonność do oligomeryzacji do FL HTT (aa 1-3,144). W niniejszym dokumencie opisano metody wytwarzania, oczyszczania i charakteryzowania za pomocą indeksu refrakcyjnego (RI) SEC/MALS, elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE i Blue Native PAGE.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Huntingtona (HD) jest rzadką chorobą neurodegeneracyjną, charakteryzującą się głównie niestabilnymi i mimowolnymi ruchami motorycznymi, a także zmianami poznawczymi i psychiatrycznymi, takimi jak zmiany osobowości i apatia1,2. Choroba Huntingtona jest związana z rozszerzeniem drogi powtórzeń CAG zlokalizowanej w eksonie 1 genu huntingtyny (HTT) do ponad 35 powtórzeń, przy czym większa liczba powtórzeń CAG koreluje z wcześniejszym początkiem choroby3,4. Produkt translacyjny HTT, białko huntingtyny (HTT), jest zaangażowany w żywotność neuronów i rozwój mózgu5,6,7,8,9.

HTT to białko rusztowania, które według doniesień uczestniczy w szerokim zakresie procesów komórkowych, transportu pęcherzyków, podziału komórek, ciliogenezy i autofagii10,11. Jednak molekularna patogeneza HD nie jest do końca jasna, a identyfikacja kluczowych interaktorów białkowych pośredniczących w patologicznym wpływie mHTT ekspandowanego poliQ jest niepełna. Niektóre badania sugerują wzrost toksycznej funkcji mHTT spowodowany skłonnością do oligomeryzacji ekspandowanego białka HTT, ponieważ agregaty HTT zostały zidentyfikowane w neuronach i gleju u pacjentów z HD i zwierzęcych modelach choroby12,13,14,15,16,17. Aby wesprzeć badania nad funkcją i strukturą wariantów FL HTT i mHTT oraz zapewnić naukowcom wysokiej jakości standardy białka do opracowywania testów, potrzebne jest solidne i skalowalne zaopatrzenie w jednorodne białko rekombinowane.

Ze względu na swój rozmiar (aa 1-3,144, numeracja na podstawie długości polyQ Q23), niestabilność proteolityczną i skłonność do agregacji, FL HTT okazał się trudny do wyrażenia i wyizolowania jako rozpuszczalne białko. Wcześniej region eksonu 1 (aa 2-90) HTT był wyrażany i oczyszczany na dużą skalę przy użyciu różnych znaczników, które mogą zwiększyć rozpuszczalność białka w Escherichia coli18,19,20. FL HTT został po raz pierwszy wyrażony i oczyszczony w systemie ekspresji komórek owadów przy użyciu baculovirus21,22, a struktury mikroskopii elektronowej (EM) o niskiej rozdzielczości 30 A chemicznie usieciowanych FL Q23-HTT i Q78-HTT zostały zgłoszone23. Badania nad strukturą HTT posunęły się jeszcze bardziej, gdy w komórkach ludzkich przy użyciu stabilnych linii komórkowych lub > Badania te sugerują, że chociaż oczyszczony HTT występuje głównie w stanie monomerycznym, ma również tendencję do tworzenia oligomerów i agregatów wysokiego rzędu.

Analityczne ultrawirowanie FL Q128-HTT, z wysoce rozwiniętym regionem polyQ, dostarczyło więcej frakcji oligomerycznych i zagregowanych niż białko z nieekspandowanym regionem polyQ24. Wykorzystując stabilną linię komórkową, z powodzeniem zaadaptowano strategię stabilizacji FL HTT poprzez koekspresję z partnerem interakcji HAP40. Struktura krio-EM kompleksu FL HTT i HAP40 została rozwiązana w średniej rozdzielczości 4 A przy użyciu oczyszczonego kompleksu białkowego (PDB:6EZ8)25. Ta strategia koekspresji została z powodzeniem zaadaptowana do systemu bakulowirusa, a seria wysokiej jakości wariantów HTT o różnych długościach polyQ została wyrażona i oczyszczona z komórek owadów26. Od tego czasu więcej struktur krio-EM kompleksu HTT o zmiennych długościach polyQ i strukturach HAP40 i wyższej rozdzielczości zostało rozwiązanych i zdeponowanych w Bazie Danych Białek27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O).

Zoptymalizowaliśmy metodę transfekcji i ekspresji w komórkach HEK293, używając polietylenininy (PEI), do szybkiej przejściowej ekspresji FL HTT. Jako dowód słuszności zasady, warianty FL HTT zawierające 23 glutaminy (FL Q23-HTT) zostały najpierw oczyszczone i scharakteryzowane przy użyciu modyfikacji metody oczyszczania opisanej wcześniej24. Ta metoda transfekcji przejściowej jest wygodna, wysoce wydajna i skalowalna; może wytwarzać oczyszczony HTT z wydajnością 1-2 mg / L, porównywalną z metodą stabilnej linii komórkowej reported24. Ponieważ białko jest wytwarzane w ludzkiej linii komórkowej, wytworzone HTT jest bardziej prawdopodobne, że będzie miało natywne ludzkie PTM po poddaniu analizie proteomicznej spektrometrii mas11,29,30,31. Wyprodukowano miligramowe ilości wariantów FL Q48-HTT, FL Q73-HTT i wariantów FL HTT z delecją ekson1 (ΔExon1-HTT), co pokazuje, że metoda ekspresji przejściowej jest szczególnie przydatna w szybkim wytwarzaniu alternatywnych wariantów HTT bez konieczności podejmowania czasochłonnego wysiłku wymaganego do ustanowienia stabilnych linii komórkowych do produkcji.

Poniższy protokół ilustruje standardową metodę stosowaną w laboratorium tych autorów do hodowli komórek, transfekcji, oczyszczania białek i charakterystyki białek po oczyszczeniu do produkcji FL Q23-HTT z hodowli komórkowej o pojemności 2 litrów. Protokół może być skalowany do większych kultur lub dostosowany do oczyszczania innych wariantów HTT. Do 10 kultur komórek L FL HTT oraz różne mutacje miejscowe lub skrócone homologów HTT i HTT zostały pomyślnie przeprowadzone w laboratorium przy użyciu tego samego protokołu. Oczyszczony FL HTT zawiera wysoki procent monomerów wraz z dimerami i oligomerami wyższego rzędu. Ten sam zagregowany profil obserwuje się wśród wytworzonych wariantów (Q23, Q48, Q73 i usunięty Exon1). Ponieważ agregacja może zachodzić, gdy nie zostanie zachowana odpowiednia ostrożność, przeprowadzono badanie odporności preparatu i stabilności zamrażania i rozmrażania w celu określenia najlepszych warunków obchodzenia się z białkiem. Opisano również metody, takie jak Blue Native PAGE i SEC/MALS-RI, służące do analizy zawartości oligomerów HTT w ramach procesu kontroli jakości. Aby przynieść korzyści społeczności badawczej HD, plazmidy i białka HTT opisane w tym badaniu są również zdeponowane w Repozytorium Społeczności HD w Instytucie Coriell (www.coriell.org/1/CHDI).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i produkcja konstrukcji do ekspresji ssaków HTT oznaczonej flagą

  1. Pobierz pełnowymiarową sekwencję ludzkiego białka HTT (P42858) z National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
    UWAGA: Badacze muszą być zaznajomieni z organizacjami dziedzinowymi HTT i utrzymywać podstawową strukturę 3D HTT podczas projektowania konstruktów dla mutantów HTT.
  2. Poproś o usługę syntezy genów, aby przeprowadzić optymalizację kodonów pod kątem ekspresji komórek ludzkich w oparciu o sekwencję P42858. Zmień liczbę polyQ z Q16 na żądaną długość Q (Q23 został tutaj wybrany jako pierwszy konstrukt) i zsyntetyzuj gen HTT o pełnej długości.
    UWAGA: Zsyntetyzowany konstrukt Q23-HTT zoptymalizowany pod kątem kodonów o pełnej długości został dostarczony jako wstawka do plazmidu pUC18 w tym badaniu.
  3. Opcjonalnie: Dodano funkcje ułatwiające klonowanie różnych długości Q i oczyszczanie w konstrukcjach.
    UWAGA: Miejsce rozszczepienia wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) i znacznik oczyszczania FLAG (AAAENLYFQGDYKDDDDK) zostały dodane do C-końcowego końca konstrukcji. W konstruktach zaprojektowano dwa miejsca HindIII tak, aby obejmowały region polyQ (translowana sekwencja białka nie jest zmieniana przez wprowadzenie miejsc HindIII). Pozwala to badaczowi na zmianę długości Q HTT poprzez trawienie enzymów restrykcyjnych i ligację bez resyntezy całego genu HTT.

2. Sklonuj zsyntetyzowane konstrukcje HTT do pcDNA3.1.

  1. Trawić 5 μg pUC18-Q23-HTT i 5 μg pcDNA3.1 przy użyciu 2 μl NheI i PmeI każdy w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  2. Uruchom 0,5% w/v żelu agarozowego i oczyść fragment Q23-HTT oraz strawiony wektor pcDNA3.1 za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu agarozowego. Określ ilościowo stężenia oczyszczonego DNA przez OD280 za pomocą spektrometru UV, który może mierzyć mikrolitry próbek.
    UWAGA: Zwykle obserwuje się OD260/280 w zakresie od 1,8 do 2,0. Zsyntetyzowany FL HTT jest dostarczany w postaci wkładki z NheI i PmeI na obu końcach w plazmidzie pUC18. Stosuj inne enzymy restrykcyjne, jeśli HTT jest syntetyzowany inaczej.
  3. W reakcji należy użyć 10 ng strawionego wektora pcDNA3.1. Zliguj oczyszczone DNA w stosunku molowym 1:1 (HTT:pcDNA3.1) w reakcji 10 μl w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy użyciu ligazy DNA T4.
  4. Przekształcić ligowany produkt w kompetentne komórki E. coli (patrz tabela materiałów) przy użyciu protokołu określonego przez producenta ligazy.
  5. Zbierz 6 pojedynczych kolonii i zrób nocne hodowle w 4-6 ml LB uzupełnionym 100 μg/ml karbenicyliny w temperaturze 37 °C.
  6. Przydziel 1 ml z każdej nocnej hodowli. Dodać glicerol do 25% v/v i zachować zapas glicerolu w temperaturze -80 °C. Oczyść pozostałą nocną kulturę za pomocą mini-zestawu przygotowawczego zgodnie z krokami określonymi w instrukcji obsługi.
  7. Sekwencjonuj wszystkie plazmidy za pomocą starterów sekwencjonowania obejmujących region transkrypcji plazmidu. Wybierz jeden zapas glicerolu, który ma prawidłową sekwencję jako główny zapas glicerolu i wyrzuć resztę.
  8. Opcjonalnie: Poproś o usługę syntezy genów w celu syntezy DNA o różnych długościach Q (Q48, Q73 i Exon1), które obejmują dwie lokalizacje HindIII w plazmidzie pcDNA3.1-Q23-HTT. Trawić pcDNA3.1-Q23-HTT i nowo zsyntetyzowane DNA za pomocą HindIII i ligazować je ligazą T4, jak w krokach 2.2-2.7, aby uzyskać FL HTT o różnych długościach polyQ w plazmidzie pcDNA3.1.
    UWAGA: Konstrukty plazmidowe użyte w tym badaniu są również dostępne bezpośrednio w Repozytorium Społeczności HD w Instytucie Coriell (www.coriell.org/1/CHDI); patrz Tabela Materiałów.

3. GIGA przygotowuje plazmidowe DNA wolne od endotoksyn do transfekcji na dużą skalę

  1. Umieść zapasy glicerolu bakteryjnego pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG na płytce agarowej LB z karbenicyliną (100 μg/ml). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 16-24 godzin, aż pojawią się pojedyncze kolonie.
  2. Zebrać pojedynczą kolonię, zaszczepić 5 ml kultury starterowej w bogatej pożywce opracowanej do amplifikacji plazmidu karbenicyliną (100 μg/ml) i rosnąć w temperaturze 37 °C przez 8 godzin.
  3. Wybierz zestaw do oczyszczania plazmidu GIGA bez endotoksyn. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w instrukcji zestawu plazmidu GIGA, aby oczyścić plazmid pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG.
  4. Zmierz poziomy endotoksyn plazmidowych za pomocą zestawu do oznaczania ilościowego endotoksyn na bazie lizatu amebocytów limulusa (LAL). Postępuj zgodnie z procedurą określoną w instrukcji producenta.
    UWAGA: Wysokiej jakości oczyszczanie plazmidu o niskim poziomie endotoksyn jest niezbędne do uzyskania dobrej wydajności transfekcji. Korzystając z tego protokołu, można uzyskać 20-40 mg plazmidu (forma superskręcona >80%) na litr kultury bakteryjnej przy stężeniach plazmidu > 4 mg/ml. Prawidłowo oczyszczony plazmid powinien mieć poziom endotoksyn < 30 EU/mg. Zazwyczaj obserwuje się OD260/280 w zakresie od 1,8 do 2,0.

4. Transfekcja na dużą skalę 2 L komórek HEK293 za pomocą polietylenoinoiminy (PEI)

  1. Dodać 1 g PEI 25K do 1 l wody wolnej od endotoksyn, mieszając. Dostosuj pH do 2,0 za pomocą 100 mM HCl i mieszaj, aż cały PEI 25K się rozpuści. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą 100 mM roztworu NaOH i przefiltruj przez filtr 0,2 μm. Porcjować i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do roku.
    UWAGA: Podwielokrotności PEI można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni, ale nigdy nie należy ich ponownie zamrażać po rozmrożeniu.
  2. Rozmnażać komórki HEK293 w pożywce wzrostowej (patrz tabela materiałów) uzupełnionej penicyliną-streptomycyną (końcowe stężenie 5 U/ml dla penicyliny i 5 μg/ml dla streptomycyny) w wilgotnym inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C, 90 obr./min, 5% CO2 przez 18-24 h. Rozcieńczyć komórki do 2 l o gęstości ~1,2 × 106 komórek/ml za pomocą pożywki wzrostowej w 5 l kolbach Erlenmeyera dzień wcześniej do transfekcji.
  3. Kontynuuj hodowlę komórek w temperaturze 37 °C, 90 obr./min, 5% CO2 przez 18-24 godziny. Zmierz parametry komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, który może mierzyć gęstość i żywotność komórek, zgodnie z instrukcją obsługi.
    UWAGA: Gęstość komórek powinna się podwoić, a żywotność powinna wynosić >95%. Gęstość komórek przed transfekcją powinna wynosić około 2,0 × 10 6-2,4 × 106 komórek/ml. W razie potrzeby rozcieńczyć komórki do pożądanej gęstości przed transfekcją.
  4. Obliczyć ilości plazmidu i PEI wymagane do transfekcji; użyć 1 mg plazmidu i 3 mg PEI do transfekcji każdego litra hodowli komórkowej. Przydzielić 2 mg plazmidu i 6 mg PEI potrzebne do transfekcji o pojemności 2 litrów.
  5. Rozcieńczyć plazmid i PEI pojedynczo w objętości soli fizjologicznej buforowanej fosforanami równej 1/20 całkowitej objętości hodowli komórkowej (po 100 ml na transfekcję 2 l) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wymieszać rozcieńczony plazmid i PEI przez delikatne wirowanie i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    UWAGA: Po inkubacji mieszanina będzie lekko mętna.
  6. Dodaj mieszaninę do kultury komórkowej i delikatnie zamieszaj, aby je wymieszać.
  7. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 90 obr./min przez 24 godziny.
  8. Dodać 2 M roztwór maślanu sodu do końcowego stężenia 2 mM. Do kultury dodać środek przeciwzbrylający w proporcji 1:1000 (v/v) i środek przeciwpieniący w proporcji 1:1000 (v/v).
  9. Przenieść kolbę do nawilżonego inkubatora z wytrząsarką w temperaturze 32 °C, 90 obr./min, 5% CO2 i kontynuować wzrost przez 48 godzin.
  10. Zmierz parametry komórek, w tym gęstość komórek i żywotność, za pomocą automatycznego licznika komórek, postępując zgodnie z instrukcją obsługi.
  11. Przenieść 2,0 × 106 komórek (objętość = 2,0 ×10 6/gęstość komórek) w probówce mikrowirówkowej. Granulować komórki w ilości 2 000 × g przez 1 minutę w wirówce do western blot w sekcji 5.
  12. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 2 000 × g przez 30 minut i przechowywać granulki komórek w temperaturze -80 °C przed oczyszczeniem.

5. SDS-PAGE i western blot lizatu komórkowego HEK293 w celu oszacowania poziomu ekspresji HTT

  1. Pobrać podwielokrotność 2,0 × 106 komórek uprzednio zamrożonych (krok 4.11) z transfekcji na dużą skalę hodowli komórek HEK293. Dodać 250 μl soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) uzupełnionej 50 μg/ml digitoniny, 5 mM EDTA i 1x koktajl inhibitorów proteazy i ponownie zawiesić osad komórkowy, zasysając kilkakrotnie za pomocą pipety.
  2. Delikatnie obracać probówki przez 30 minut w temperaturze 4 °C za pomocą minirotatora w celu lizy komórek. Nierozpuszczalny materiał należy osadzać przez odwirowanie w stężeniu 17 000 × g przez 5 minut.
  3. Dodać 1/3 objętości 4x redukującego buforu ładującego dodecylosiarczan litu (LDS) do supernatantu i podgrzewać w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
  4. Załaduj 5-20 μl lizatu komórkowego na prefabrykowany żel PAGE z 3-8% tris-acetatu. Korzystając z kompatybilnego z żelem bufora biegowego 1x Tris-acetate SDS, uruchom żel w trybie stałego napięcia przy 150 V przez 60 min.
    UWAGA: Tris-acetate SDS-PAGE został użyty do analizy FL HTT, ponieważ generuje wyższą rozdzielczość niż inne typy SDS-PAGE dla białek o masie cząsteczkowej powyżej 300 kDa. Białka użyte w tym badaniu są również dostępne bezpośrednio w Repozytorium Społeczności HD w Instytucie Coriella (www.coriell.org/1/CHDI); patrz Tabela Materiałów.
  5. Aby wykonać western blotting, złóż kanapkę transferową za pomocą grubego papieru transferowego z buforem transferowym, membrany z polifluorku winylidenu aktywowanego metanolem (PVDF) i żelu SDS-PAGE. Przenieś białka do membrany PVDF za pomocą półsuchej bibuły zachodniej zgodnie z instrukcją obsługi producenta.
    UWAGA: Zazwyczaj 20-30 min przy 135 mA jest wystarczające dla membrany o wymiarach 10 cm x 10 cm.
  6. Zdemontuj kanapkę transferową i zablokuj membranę w TBST (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl i 0,1% v/v Tween-20) uzupełnionym 5% m.w. mlekiem beztłuszczowym.
  7. Inkubować błonę na kołysce przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 15 ml przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczenie 1:2,500 dla przeciwciała monoklonalnego przeciwciała anty-FLAG i 1:2,000 dla wszystkich innych przeciwciał pierwszorzędowych).
    UWAGA: Pierwszorzędowe przeciwciała użyte w tym badaniu to anty-FLAG M2, MAB5492, MAB5490, MAB2166, MAB3E10, MAB4E10, MAB2168, MAB8A4 (patrz tabela materiałów).
  8. Umyj membranę 3 x 5 min przy użyciu 30-50 ml TBST.
  9. Inkubować błonę na rockerze z fluorescencyjnym sprzężonym barwnikiem kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko mysim IgG w temperaturze 1:15 000 w temperaturze pokojowej w 15 ml TBST zawierającej 5% m.w. mleka w proszku.
  10. Wizualizacja pasm western blot na obrazie fluorescencyjnym przy użyciu długości fali specyficznej dla przeciwciała drugorzędowego. Określ ilościowo sygnał pasma za pomocą oprogramowania dołączonego do imagera zgodnie z instrukcją obsługi.
    UWAGA: Ilościowe western blotting można wykonać przy użyciu oczyszczonego HTT jako standardu. Liniowy zakres wzorcowy HTT jest specyficzny dla danego urządzenia i został ustalony w tym laboratorium od 25 ng do 250 ng HTT na linię przy użyciu przeciwciała anty-FLAG. Western blot HTT powinien być wolny od degradacji; zwykle obserwuje się całkowity poziom ekspresji HTT wynoszący 2-4 pg / komórkę. Zapoznaj się z wcześniej opublikowanym protokołem32, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wykonywania ilościowego western blot.

6. Oczyszczanie HTT metodą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) przy użyciu kolumny anty-FLAG i SEC

  1. Oczyszczanie anty-FLAG
    1. Oszacuj ilość żywicy FLAG potrzebną do oczyszczenia (zazwyczaj 12 ml żywicy powinowactwa anty-FLAG M2 do oczyszczania 2-4 l transfekowanej hodowli komórkowej). Spakować 12-25 ml żywicy anty-FLAG do pustej kolumny (patrz tabela materiałów) za pomocą FPLC przy natężeniu przepływu 4 ml / min przy użyciu buforu A (tabela 1). Wyreguluj wysokość tłoka tak, aby nie było przerwy między końcem tłoka a złożem żywicy.
    2. Stosując proporcje 10 ml buforu do lizy na 1 g osadu komórkowego, rozmrozić i zawiesić osad komórkowy w zimnym buforze do lizy (tabela 1).
    3. Przepuść zawiesinę komórek raz przez homogenizator o wysokim stopniu ścinania przy 10 000 psi. Klarować lizat przez odwirowanie w ilości 20 000 × g przez 1 godzinę w wirówce wyposażonej w kompatybilny wirnik o stałym kącie nachylenia.
    4. Zaprogramuj FPLC (patrz Tabela materiałów dla oprogramowania użytego w badaniu) i uruchom następujące sekwencje.
      1. Załadować oczyszczony lizat przez pompę do pobierania próbek.
      2. Przemyć 4 objętościami kolumn (CV) buforu A (tabela 1).
      3. Przemyć 4 CV buforu B (Tabela 1).
      4. Przemyć 8 CV buforu C (tabela 1).
      5. Przemyć 3 CV buforu D (tabela 1).
      6. Przemyć 3 CV buforu elucyjnego (tabela 1).
    5. Przeanalizuj 10 μl frakcji pikowych za pomocą SDS-PAGE. Zbierz i połącz frakcje pikowe o pożądanej czystości. Zaoszczędź ~50 μl połączonych eluatów do analizy SDS-PAGE.
      UWAGA: Zwykle pojawia się pojedynczy pik, a wszystkie frakcje eluowane w piku zawierają ~90% czystego HTT.
    6. Zregeneruj kolumnę anty-FLAG przy użyciu 5 CV bufora regeneracji (Tabela 1) i ponownie zrównoważ kolumnę przy użyciu 5 CV buforu A.
      UWAGA: Żywica Anti-FLAG może być ponownie użyta do pięciu razy lub do momentu, gdy względna wydajność/litr spadnie do 50% pierwszego oczyszczenia.
  2. Oczyszczanie kolumny wykluczenia rozmiaru (SEC) przy użyciu kolumny SEC
    1. Wstępnie zrównoważyć kolumnę SEC, która umożliwia separację białek o masie cząsteczkowej (MW) > 500 kDa (patrz tabela materiałów dla zastosowanej kolumny) przy użyciu 2 × CV buforu SEC (tabela 1).
    2. Bezpośrednio załadować eluat anty-FLAG (od kroku 6.1.5) przez superpętlę o pojemności 50 ml. Uruchom 1,2 × CV bufora SEC na wstrzyknięcie. Uruchomić separację SEC przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Maksymalnie 5 ml lub 15 ml próbki białka można załadować do kolumn SEC wybranych w tym badaniu. Zaprogramuj FPLC tak, aby wiele wstrzyknięć mogło być wykonywanych automatycznie. Przykładowe skrypty metod są również dołączone jako plik uzupełniający 1 i plik uzupełniający 2.
    3. Porównaj profil elucji ze standardowym profilem elucji HTT, aby odróżnić piki monomerowe, dimerowe i oligomeryczne wyższego rzędu. Połączyć monomeryczne frakcje HTT w oparciu o profil elucji kolumny SEC. W razie potrzeby należy oddzielnie połączyć oligomeryczne i dimeryczne frakcje HTT o wyższym rzędzie.
    4. Zagęścić zbiorcze białko HTT za pomocą koncentratora odśrodkowego o stężeniu 100 kDa w temperaturze 4 °C. Obliczyć stężenia białka, dzieląc ich wartości OD280 przez odpowiednie współczynniki ekstynkcji (teoretyczne współczynniki ekstynkcji Q23-HTT, Q48-HTT, Q73-HTT i ΔExon1-HTT wynoszą odpowiednio 0,776, 0,769, 0,762 i 0,798 (mg/ml)-1 cm-1 do obliczeń). Utrzymuj stężenie HTT ≤ poziomie 1,0 mg/mL.
      UWAGA: Konieczne jest monitorowanie procesu koncentracji, ponieważ nadmierna koncentracja spowoduje agregację.
    5. Podwielokrotność oczyszczonego białka HTT w kriobezpiecznych probówkach do mikrowirówek w objętości < 100 μl. Podwielokrotności należy błyskawicznie zamrozić przy użyciu ciekłego azotu i przechowywać w temperaturze -80 °C.

7. Analityczne HPLC SEC-MALS-dRI do analizy polidyspersyjności HTT

  1. Wykonać wszystkie analityczne SEC-MALS w temperaturze 4 °C na systemie wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) sprzężonym z detektorem UV, wielokątowym detektorem rozpraszania światła i detektorem różnicowego indeksu refrakcji (dRI).
  2. Przed podłączeniem kolumny UHPLC do systemu należy przepłukać pompę i detektory przefiltrowaną (0,1 μm) wodą klasy HPLC.
  3. Podłącz kolumnę UHPLC (patrz tabela materiałów dla używanej kolumny) do systemu. Zrównoważyć kolumnę przefiltrowaną (0,1 μm) wodą, a następnie buforem SEC-MALS (Tabela 1), aż wszystkie sygnały detektora osiągną linię podstawową.
  4. Wstrzyknąć 2 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu przepływu 0,3 ml/min przez 15 minut na wstrzyknięcie i sprawdzić jakość danych. Wykonaj normalizację, wyrównanie pików i korekcję poszerzenia pasma w oparciu o profil BSA i utwórz szablon dla następujących serii próbek HTT.
  5. Szybko rozmrozić fiolkę z próbką FL Q23-HTT w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej za pomocą pływaka. Przefiltruj HTT przez filtr wirowy 0,1 μm. Wstrzyknąć 2-4 μl próbki HTT i pracować przez 15 minut w temperaturze 4 °C przy natężeniu przepływu 0,3 ml/min.
  6. Przeanalizować dane chromatograficzne i dotyczące rozpraszania światła za pomocą dołączonego oprogramowania (patrz tabela materiałów). Użyj detektora dRI jako detektora stężenia i użyj 0,185 jako przyrostu współczynnika załamania światła (dn/dc) dla HTT. Wygeneruj wykres Zimm, aby określić uśrednioną wagowo masę cząsteczkową dla każdego szczytu33,34.
    UWAGA: Przyrost współczynnika załamania światła HTT jest obliczany jako 0,185 za pomocą programu SEDFIT software35 i pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej HTT jako danych wejściowych.
    UWAGA: Monomer HTT MW jest oznaczany przez SEC-MALS przy ~370 kDa ± 30 kDa. Oczyszczony HTT ma zazwyczaj zawartość monomerów od 60 do 75% (w tym laboratorium). Niska zawartość monomerów może wskazywać na konieczność zachowania większej ostrożności podczas obchodzenia się z nimi, aby zapobiec agregacji.

8. Niebieska natywna strona do analizy polidyspersyjności HTT

  1. Przygotować 1 l buforu anodowego, mieszając 50 ml 20x Blue Native buforu do pracy PAGE (patrz tabela materiałów) z 950 mlH2O. Przygotować 2 l ciemnoniebieskiego buforu katodowego, mieszając 100 ml 20x Blue Native PAGE i 100 ml dodatku katodowego Blue Native PAGE (20x) z 1 800 mlH2O. Przed użyciem schłodzić do temperatury 4 °C.
  2. Szybko rozmrozić fiolkę z próbką FL Q23-HTT w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej za pomocą pływaka. Przed użyciem trzymaj rozmrożone białko na lodzie.
  3. Wymieszaj 5 μg FL Q23-HTT (~1 mg/ml), 1 μl 0,5% dodatku G250, 2,5 μl 4x buforu próbki Blue Native PAGE i wodę, aby uzyskać ostateczną objętość do 10 μl.
  4. Załaduj zmieszaną próbkę FL Q23-HTT na 3-12% prefabrykowany żel Bis-Tris. Załaduj 7,5 μl niebarwionego wzorca białka w tym samym żelu co wzorzec.
  5. Napełnij przód zbiornika ciemnoniebieskim buforem katodowym, a tył zbiornika buforem anodowym.
    UWAGA: Wypełnij po załadowaniu próbki, aby umożliwić łatwą wizualizację podczas ładowania próbek.
  6. Uruchom żel pod napięciem 150 V przez 120 minut w chłodni.
  7. Odbarwić żel roztworem odbarwiającym (Tabela 1) do momentu zaobserwowania prążków; przenieść żel do wody. Wizualizacja i dokumentacja żelu na stacji obrazowania.
    UWAGA: Blue Native PAGE został pierwotnie zaprojektowany do analizy białek błonowych. Został on zaadaptowany w tym laboratorium jako alternatywna metoda szacowania zawartości monomerycznej HTT. Wiąże się z hydrofobowymi obszarami HTT i zapobiega tworzeniu się agregatów w warunkach buforowych bez detergentu. Tradycyjna natywna strona bez użycia Coomassie blue G250 powoduje, że HTT tworzy rozpuszczalne oligomery i agregaty, prawdopodobnie z powodu wielu hydrofobowych kieszeni istniejących w HTT.

9. SDS STRONA, a następnie barwienie Coomassie lub srebro w celu analizy czystości HTT

  1. Dodaj 4x bufor próbki LDS i 10x odczynnik redukujący do oczyszczonego FL Q23-HTT, aby uzyskać końcowe stężenie buforu ładującego i odczynnika redukującego na poziomie 1x.
  2. Podgrzewać próbkę na suchym bloku grzewczym w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
  3. Załadować maksymalnie 1 μg białka na studzienkę do żelu octanowego Tris o stężeniu 3-8% i pracować pod napięciem 150 V przez 1 godzinę przy użyciu bufora do pracy Tris-acetate SDS.
    UWAGA: Białka użyte w tym badaniu są również dostępne bezpośrednio w Repozytorium Społeczności HD w Instytucie Coriella (www.coriell.org/1/CHDI); patrz Tabela Materiałów.
  4. Bejca Coomassie
    1. Myć żel za pomocąH2Oprzez 5 minut.
    2. Zabarwić żel w roztworze barwiącym Coomassie (Tabela 1), kołysząc żel w 30 ml roztworu barwiącego przez 15 minut.
    3. Odplamić, kołysząc żel w 50 mlH2Oprzez 5 minut. Powtórz dwukrotnie. Wizualizuj i dokumentuj żel barwiony Coomassie na stacji obrazowania.
  5. Srebrna bejca za pomocą komercyjnego zestawu do srebrnych bejc.
    1. Po SDS-PAGE utrwalić żel za pomocą roztworu utrwalającego (Tabela 1) przez 1 godzinę do nocy w temperaturze pokojowej.
    2. Wykonaj barwienie, umyj i wywołaj zgodnie z instrukcją zestawu.
    3. Przerwij etap wywoływania natychmiast, gdy pasma osiągną pożądaną intensywność.
    4. Udokumentuj żel w systemie dokumentacji żelu wyposażonym w źródło światła widzialnego.
      UWAGA: HTT oczyszczony w >95% może być wykryty przez Coomassie i barwienie srebrem za pomocą tego protokołu. Zapoznaj się z wcześniej opublikowanym protokołem32, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przeprowadzania ilościowej analizy białek.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przejściowy wektor ekspresji (pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG, Rysunek 1A) jest zaprojektowany do szybkiej produkcji w komórkach ssaków FL Q23-HTT (aa 1-3,144, w oparciu o numerację Q23). Konstrukt ten posiada cechy zaprojektowane do szybkiego generowania różnych konstruktów mutacji HTT poprzez klonowanie kasetowe, ułatwia oczyszczanie białka HTT do wysokiej jakości i jednorodności przy minimalnych krokach chromatograficznych oraz ma możliwość produkcji nieoznakowanego FL HTT. Lista funkcji obejmuje 1. Miejsca trawienia restrykcyjnego HindIII, otaczające powtórzenie CAG w eksonie 1 HTT, mogą być wykorzystane do generowania mutantów FL HTT z odcinkiem polyQ o różnych długościach poprzez trawienie i ligację enzymu restrykcyjnego; 2. C-końcowy koniec FL HTT jest oznaczony epitopem FLAG z miejscem rozpoznawania proteazy TEV w celu jednoetapowego oczyszczania powinowactwa FL HTT o wysokiej czystości i opcjonalnego wytwarzania wolnego od znaczników białka FL HTT przy użyciu rozszczepienia proteazy TEV; 3. Zoptymalizowana pod kątem kodonów sekwencja FL HTT do wykorzystania kodonu w komórkach ludzkich do ekspresji wysokiego poziomu w komórkach HEK293. Wektor pcDNA 3.1 (+) jest używany jako szkielet konstruktu w celu wykorzystania wysokiej aktywności aktywacji transkrypcyjnej promotora CMV w liniach komórkowych ssaków.

Używając pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG jako szablonu początkowego, konstrukcje Q48 i Q73 FL HTT zostały wytworzone przez syntezę fragmentów DNA o odpowiedniej długości Q, obejmujących dwa miejsca enzymu restrykcyjnego HindIII i zamianę tego samego regionu w szablonie. Mutant ΔExon1 FL HTT (aa 91-3,144) (Rysunek 1B) został wyprodukowany przy użyciu starterów skierowanych do usuniętych reszt obejmujących region eksonu 1 w szablonie. Komórki HEK293 transfekowane pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG przy użyciu PEI hodowano w 5-litrowych kolbach wytrząsarskich poniżej 5% CO2 . Typowe oczyszczanie na dużą skalę wykorzystuje 2-10 l komórek zawierających 6,0 × 10 9-3,0 × 1010 komórek. Przed przystąpieniem do oczyszczania poziom ekspresji HTT z każdej transfekcji oszacowano za pomocą ilościowego western blot przy użyciu oczyszczonego rekombinowanego HTT znakowanego FLAG jako wzorca i przeciwciała anty-FLAG jako pierwszego przeciwciała. Do oczyszczania użyto granulek o szacowanym poziomie ekspresji HTT na poziomie ≥2 pg HTT/komórkę.

Oczyszczanie FL HTT składa się z 2-etapowego procesu kolumnowego, najpierw z oczyszczaniem powinowactwa anty-FLAG, a następnie z SEC na żelowej kolumnie filtracyjnej z odpowiednim zakresem separacji dla HTT (Rysunek 2A; zobacz Tabelę Materiałów dla przykładów). Po obu etapach uzyskano HTT przy czystości próbki >95%, zgodnie z SDS-PAGE z zawartością niebieskiego Coomassie i >65% monomeru w oparciu o analityczne SEC-MALS. Ponieważ zarówno wydłużony czas oczyszczania, jak i temperatura mają negatywny wpływ na końcową zawartość monomeru HTT, FPLC zastosowano na obu etapach oczyszczania, aby zminimalizować obsługę i uzyskać stałą jakość próbki. Głównym zanieczyszczeniem podczas oczyszczania anty-FLAG był chaperon Hsp70 określony za pomocą spektrometrii mas (Rysunek 2B, pas 2). Jest to zgodne z odkryciem, że Hsp70 jest jednocześnie oczyszczany z FL HTT stabilnie eksprymowany w ludzkich liniach komórkowych24, co sugeruje, że Hsp70 może być powszechnym stabilizatorem FL HTT in vivo.

Zanieczyszczenie Hsp70 można wyeliminować poprzez dokładne mycie chlorkiem magnezu i ATP podczas etapu oczyszczania powinowactwa anty-FLAG (Rysunek 2B, ścieżka 1). Po usunięciu Hsp70, FL HTT ma skłonność do tworzenia oligomerów o wyższym rzędzie24 i musi być utrzymywany w stężeniu ≤ 1 mg/ml. Etap koncentracji przed SEC może często prowadzić do znacznej agregacji. Dlatego najlepszą praktyką jest bezpośrednie ładowanie frakcji szczytowych z oczyszczania anty-FLAG do kolumny wykluczającej rozmiar bez koncentracji. Po SEC próbkę zagęszczono do ≤1 mg/ml w celu maksymalnego odzysku monomerycznego FL HTT. Ilość HTT odzyskanego z każdego etapu oczyszczania oszacowano za pomocą błękitu Coomassie lub ilościowego western blot przy użyciu oczyszczonego FL HTT jako wzorca ilościowego (Tabela 2). Typowa wydajność oczyszczonych białek FL HTT wytwarzanych opisaną metodą wynosi około 1 mg/l hodowli komórkowej, ale może być znacznie niższa (Tabela 3) ze względu na zmienność między partiami lub jeśli żywica oczyszczająca anty-FLAG jest wielokrotnie używana.

Nadekspresja FL HTT może spowodować fragmentację białka22. FL Q23-HTT wytworzony metodą opisaną tutaj rozdzielony jako pojedyncze pasmo o prawidłowym MW 350 kDa przez SDS PAGE, wybarwione albo przez Coomassie G250, albo przez barwienie srebrem (Rysunek 2C). Przez western blotting, FL Q23-HTT reagował z przeciwciałami podniesionymi przeciwko epitopom na N-końcu, C-końcu i kilku domenach pośrednich, bez zaobserwowania dodatkowych prążków związanych z fragmentami, co wskazuje, że białko zostało wyizolowane bez znaczących wykrywalnych skrótów (Figura 3A). Warianty długości FL HTT polyQ Q23, Q48 i Q73 zareagowały zgodnie z oczekiwaniami w western blot, wykazując coraz silniejszy sygnał dla mAb MW1 skierowanego do polyQ korelującego ze wzrostem długości Q: Q23-HTT < Q48-HTT < Q73-HTT (Rysunek 3B). Nie zaobserwowano sygnału dla ΔExon1-HTT (aa 91-3,144) podczas sondowania przeciwciałami MW1 i MAB549, które są skierowane do końcowego eksonu N 1 (Figura 3B).

SEC-MALS został wykorzystany do analizy stanu agregacji i masy cząsteczkowej oczyszczonego białka HTT. Próbki analizowano za pomocą analitycznej SEC monitorowanej przez detektory UV, MALS i dRI. Bezwzględna masa molowa uzyskana z SEC-MALS nie zależy od kształtu cząsteczek33,34; w związku z tym SEC-MALS zapewnia bezstronne oszacowanie MW dla frakcji monomerycznych i oligomerycznych, gdy są one dobrze oddzielone. Spośród badanych kolumn HPLC, kolumna SEC (patrz Tabela materiałów) wykazała wystarczającą rozdzielczość między monomerem HTT a dimerem, tak że można było rozróżnić masy molowe (Rysunek 4). Stężenie białka określono za pomocą detekcji dRI. Przyrosty współczynnika załamania światła (dn/dc) FL HTT wynoszą 0,1853 mL/g, zgodnie z obliczeniami oprogramowania SEDFIT35. Podobne analityczne wzorce elucji SEC zaobserwowano dla ΔExon1 HTT (91-3,144), FL Q23, Q48 i Q73 HTT (1-3,144), z których każdy składa się z głównego piku monomeru z niewielkimi pikami dimerycznymi i oligomerycznymi (Tabela 4). Obliczona MW dla postaci monomerycznej jest większa niż teoretyczna MW. Jest to prawdopodobnie spowodowane nakładaniem się na siebie gatunków z oligomerycznych pików wyższego rzędu i błędami wynikającymi ze słabych sygnałów dRI, ponieważ białka HTT są utrzymywane w niskim stężeniu, aby uniknąć tworzenia oligomerów wyższego rzędu. Integrując piki UV kilku partii oczyszczonych wariantów FL HTT, nie zaobserwowano wyraźnej korelacji między długością polyQ a profilem agregatu (tabela 4).

Oprócz analitycznego SEC, przeprowadzono tradycyjne natywne PAGE w celu ustalenia, czy może być ona użyta jako metoda uzupełniająca do scharakteryzowania oligomerycznego stanu FL HTT. Oligomery wyższego rzędu rozdzielono za pomocą 3-8% żeli tris-acetatowych przy użyciu natywnego buforu bez detergentu. Oczyszczony FL HTT z SEC wykazał wiele pasm odpowiadających stanom oligomeryzacji (Rysunek 5A). Najniższe pasmo znajdowało się między natywnym markerem 480 kDa a 720 kDa, podobnie jak poprzednie wyniki zgłoszone dla FL HTT oczyszczonego z komórek owadów22. Jednak monomer HTT nie był najliczniejszym pasmem przy użyciu tradycyjnego natywnego PAGE, a wyniki nie korelują z zagregowanym profilem wyznaczonym przez analityczny SEC-MALS. Kilka hydrofobowych plam obecnych w FL HTT36,37,38, zwłaszcza hydrofobowy interfejs między HAP40 a FL HTT25, prawdopodobnie przyczynia się do powstawania oligomerów o wyższym stopniu rzędu podczas migracji w żelu. Dzieje się tak, ponieważ wiadomo, że regiony hydrofobowe oddziałują ze sobą przy braku detergentu lub stabilizujących interakcji białko-białko. Zgodnie z właściwościami hydrofobowymi HTT, FL HTT tworzy coraz większe ilości frakcji oligomerycznych o wyższym stopniu rzędu przy braku CHAPS podczas etapu oczyszczania SEC.

Niebieska natywna STRONA, która jest powszechnie używana do badania białek błonowych i dużych kompleksów białkowych zawierających hydrofobowe plamy39, została porównana z tradycyjną natywną STRONĄ. Oczyszczony HTT wykazał trzy główne pasma na Blue Native PAGE z szacowanym MW 643, 927 i 1070 kDa (Rysunek 5B), które prawdopodobnie reprezentują odpowiednio monomeryczne, dimeryczne i trimeryczne gatunki HTT. Pasmo monomeru pozostało najliczniejszym pasmem w Blue Native PAGE, dobrze odpowiadającym analitycznemu profilowi SEC tych samych próbek. Przeszacowanie MW monomeru HTT przez Blue Native PAGE może wynikać z unikalnej pustej struktury sferycznej lub hydrofobowych regionów HTT, które powodują wolniejszą migrację w stosunku do odpowiadających im markerów masy cząsteczkowej11,23,25. Ogólnie rzecz biorąc, FL Q23-HTT, FL Q48-HTT, FL Q73-HTT i ΔExon1-HTT mają podobne profile Blue Native PAGE z niewielkimi różnicami w migracji pasma białkowego ze względu na różnice w masie cząsteczkowej.

Jako dodatkowe sprawdzenie jakości oczyszczonych białek, znacznik C-końcowy FLAG może zostać usunięty z FL HTT poprzez leczenie proteazą TEV. Po rozszczepieniu proteolitycznym próbki analizowano za pomocą western blot przy użyciu czterech przeciwciał w celu potwierdzenia usunięcia znacznika FLAG i wykrycia degradacji HTT. Immunoreaktywność na anty-FLAG M2 i trzy przeciwciała specyficzne dla huntingtyny z epitopami do N-końca, domen pośrednich i C-końca HTT wykazała skuteczne usunięcie znacznika FLAG i brak produktów degradacji specyficznych dla HTT (rysunek uzupełniający S1).

figure-results-1
Rysunek 1: Konstrukcja dla pełnowymiarowego wyrażenia HTT. (A) Pełnowymiarowy Q23 HTT został zoptymalizowany pod kątem kodonów i sklonowany do plazmidu pcDNA3.1 (+). Koniec 3' HTT został oznaczony epitopem flagowym i miejscem rozszczepienia proteazy TEV w celu wytworzenia białka HTT bez znaczników. Rozciągliwość poliglutaminy i domena bogata w prolinę zostały zaprojektowane z flankowanymi miejscami endonukleazy restrykcyjnej HindIII w celu wstawienia dodatkowych powtórzeń CAG za pomocą klonowania kasetowego, tj. Q48 i Q73, w celu wytworzenia wariantów HTT o różnych długościach polyQ. (B) Konstrukt ΔExon1 wykonano mutagenezę PCR przy użyciu pcDNA3.1-Q23-HTT jako matrycy. Reszty 91-3,144 HTT pozostały w konstrukcie ΔExon1 do ekspresji. Skróty: HTT = huntingtyna; CMV = wirus cytomegalii; Q23 = rozciąganie poliglutaminy; PRD = domena bogata w prolinę; TEV = miejsce rozszczepienia wirusa wytrawiania tytoniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Oczyszczanie HTT na dużą skalę. (A) Profil SEC pełnej długości Q23-HTT oczyszczonego anty-flagowo na kolumnie FPLC. Oligomery o wysokim porządku, dimery i piki monomerów Q23-HTT są oznaczone. Frakcje zawierające monomer pobrano jako końcową próbkę HTT. (B) SDS-PAGE oczyszczonego Q23-HTT z etapem płukania ATP/magnezu (tor 1) lub bez przemywania ATP/magnezu skutkuje koelucją, wynikiem koelucji Hsp70 (tor 2). (C) Końcowe, oczyszczone, pełnowymiarowe warianty HTT na SDS-PAGE barwione kolorem Coomassie blue G-250 lub srebrnym barwnikiem. Skróty: FL = pełna długość; HTT = huntingtyna; SEC = chromatografia wykluczająca rozmiar; FPLC = szybka chromatografia cieczowa białek; O = oligomer; D = ściemniacz; M = monomer; SDS-PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu; Hsp70 = białko szoku cieplnego 70. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza Western blot oczyszczonych wariantów HTT. (A) Oczyszczony FL Q23-HTT został uruchomiony na SDS-PAGE i przeniesiony do membrany PVDF. Pierwszorzędowe przeciwciała i oddziałujące epitopy to tor 1, α-FLAG M2, znacznik FLAG; Pas 2, MAB5492, HTT aa. 1-82; Pas 3, MAB5490, HTT aa 115-129; Pas 4, MAB2166, HTT aa 181-810; Pas 5, MAB3E10, HTT aa 1,171-1,177; Pas 6, MAB4E10, HTT aa 1,844-2,131; Pas 7, MAB2168, HTT aa 2,146-2,541; Pas 8, MAB8A4, HTT aa 2,703-2,911. (B) 1 μg oczyszczonych wariantów FL HTT przeprowadzono na SDS-PAGE i przeniesiono do PVDF (po lewej), a zduplikowany żel SDS przeprowadzono i wybarwiono Coomassie Blue (po prawej). Pierwszorzędowymi przeciwciałami i oddziałującymi epitopami są rząd 1, MW1, rozszerzone powtórzenia PolyQ; Rząd 2, MAB2166, HTT aa 181-810; Rząd 3, MAB5492, HTT aa 1-82. Skróty: FLL Q23-HTT = pełnowymiarowe białko huntingtyny zawierające 23 reszty glutaminy; SDS-PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu; WB = western blot; M = znacznik; PVDF = polifluorek winylidenu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza SEC-MALS pełnej długości HTT. Oczyszczony Q23-HTT o pełnej długości eluowano na kolumnie UPLC. Wskazane są pozycje pików przewidywanego monomeru, dimera i oligomeru. Masy cząsteczkowe obliczono dla pików monomerów, dimerów i trimerów i wymieniono w tabeli 5. Podobne profile elucji obserwuje się dla Q48, Q73 i ΔExon1 HTT, ze zmienną zawartością monomerów, dimerów i oligomerów w każdym oczyszczaniu. Skróty: SEC-MALS = chromatografia wykluczania wielkości z wielokątowym rozpraszaniem światła; UV = ultrafiolet; LS = rozpraszanie światła; MW = masa cząsteczkowa; Q23-HTT = białko huntingtyny zawierające 23 reszty glutaminy; M = monomer; D = ściemniacz; O = oligomer. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Charakterystyka oczyszczonego HTT przy użyciu przezroczystego żelu Native PAGE lub Blue Native PAGE. Marker natywny i pozorny monomeryczny Q23-HTT z SEC rozdzielono na 3-8% żelach Tris-acetate w niedenaturującym systemie PAGE (A) i systemie Blue Native PAGE (B). Skróty: FL = pełna długość; Q23-HTT = białko huntingtyny zawierające 23 reszty glutaminy; STRONA = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym; M = znacznik. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

kroknazwaKompozycja
6.1.1Bufor A50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glicerolu, 5 mM EDTA, 0,01% v/v Tween-20, pH 8,0.
6.1.2Bufor do lizy50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glicerolu, 5 mM EDTA i 1x koktajl inhibitorów proteazy
6.1.4.2Bufor A50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glicerolu, 5 mM EDTA, 0,01% v/v Tween-20, pH 8,0.
6.1.4.3Bufor B50 mM Tris; 500 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5% v/v glicerol; 0,01% v/v Tween-20, pH 8,0
6.1.4.4Bufor C20 mM Tris; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM ATP; 0,01% v/v Tween-20; 5% v/v glicerol, pH 8,0
6.1.4.5Bufor D50 mM Tris; 500 mM NaCl; 5% v/v glicerol; 5 mM EDTA; 0,5% w/v CHAPS, pH 8,0
6.1.4.6Bufor elucyjny50 mM Tris; 500 mM NaCl; 5% v/v glicerolu; 0,5% w/v CHAPS; 0,2 mg/mL peptyd DYKDDDDK, pH 8,0
6.1.6Bufor regeneracyjny0,1 M glicyna HCl, pH 3,5; 0,01% v/v Tween-20
6.2.1Bufor SEC50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glicerol, 0,5% w/v CHAPS, 1 mM TCEP
7,3Bufor SEC-MALS50 mM HEPES, pH 7,2, 500 mM NaCl, 5% v/v glicerolu, 0,5% w/v CHAPS
8,7Roztwór odbarwiający40% v/v metanolu i 7% v/v kwasu octowego
Rozdział 9.4.2Roztwór do barwienia Coomassie0,01% w/v Coomassie G250, 50% v/v/ metanol, 10% v/v kwas octowy
Rozdział 9.5.1Rozwiązanie mocujące50% v/v metanolu, 10% v/v kwasu octowego, 50 μL formaldehydu/100 ml roztworu

Tabela 1: Skład i roztworów

jedn. szt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt.
KrokiStężenie HTT (mg/ml)Całkowita objętość (ml)Zawartość HTT (mg)Wydajność HTT na komórkę (pg/komórkę)% Wydajność
Supernatant0,179222039,44.4100
Anty-flaga1,5248,6Rozdział 13.1Pytanie 1,4733,4
S0,913,93,540,4Rozdział 9.1

Tabela 2: Wydajność HTT z 2 L granulatu HEK293 transfekowanego pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-Flag. Skróty: FL Q23-HTT = pełnowymiarowe białko huntingtyny zawierające 23 reszty glutaminy; TEV = miejsce rozszczepienia wirusa wytrawiania tytoniu; SEC = chromatografia wykluczająca rozmiar.

pkt. pkt. pkt. pkt.
Próbka HTTWydajność HTT (mg/L)Średnia czystość (%)
BCA (Kodeks PostępowaniaA280
1FL DEx1-HTT (N=3)0,67-1,300,69-1,18Nr 99,3
cyfra arabskaFL Q23-HTT (N=3)0,25-0,920,28-0,9896,9
3FL Q48-HTT (N=3)0,28-1,150,38-1,1697,4
4FL Q73-HTT (N=3)0,58-1,050,57-0,9798,8

Tabela 3: Podsumowanie wydajności białka z czterech wariantów FL HTT i ich końcowej czystości. Skrót: FLL HTT = pełnowymiarowe białko huntingtyny.

Próbka HTTZADM
FL Q23-HTT4,2-6,9%18,7-29,3%66,5-76,0%
FL Q48-HTT4,0-9,4%10,6-17,8%73,6-85,4%
FL Q73-HTT2,0-14,0%16,9-24,6%65,1-81,1%

Tabela 4: Podsumowanie reprezentatywnej zawartości agregatów, dimerów i monomerów w wariantach FL HTT z oczyszczania. Skróty: FL HTT = białko huntingtyny o pełnej długości; A = suma; D = ściemniacz; M = monomer; SEC = chromatografia wykluczająca rozmiar.

Rysunek uzupełniający S1: Analiza Western blot po trawieniu proteazy TEV. Oczyszczone FL Q23-HTT i FL Q48-HTT przeprowadzono na SDS-PAGE, przeniesiono do membran PVDF i przeanalizowano za pomocą western blot po trawieniu TEV. Pierwszorzędowymi przeciwciałami były przeciwciała anty-Flag M2 (znacznik flagi), MAB5492 (HTT aa 1-82), MAB3E10 (HTT aa 997-1,276) i MAB2168 (HTT aa 2,146-2,541). Tor 1, standard białka; Tor 2, Q23-HTT-TEV-Flaga; Tor 3, Q48-HTT-TEV-Flaga; Tor 4, Q23-HTT-TEV-Flag traktowany proteazą TEV w stosunku 1:5, przez noc w temperaturze 4 °C; Tor 5, Q48-HTT-TEV-Flag traktowany proteazą TEV w stosunku 1:5, przez noc w temperaturze 4 °C. Skróty: FL HTT = białko huntingtyny o pełnej długości; SDS-PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu; TEV = wirus wytrawienia tytoniu; PVDF = polifluorek winylidenu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Analiza SEC-MALS wariantów FL HTT poddanych cyklom zamrażania i rozmrażania. Oczyszczone Q23-HTT (A) i Q48-HTT (B) zamrażano w temperaturze -80 °C i rozmrażano w temperaturze pokojowej do 6 razy. Q23-HTT i Q48-HTT po pierwszym cyklu zamrażania-rozmrażania i szóstym cyklu zamrażania-rozmrażania były następnie analizowane przez SEC-MALS. Nieznaczny spadek frakcji monomerów i wzrost dimerów i frakcji oligomerów wyższego rzędu zaobserwowano w wyniku rozpraszania światła po powtarzających się cyklach zamrażania i rozmrażania. Wskazane są pozycje pików przewidywanego monomeru, dimera i oligomeru wysokiego rzędu. Skróty: FL HTT = białko huntingtyny o pełnej długości; O = oligomer; D = ściemniacz; M = monomer; SEC-MALS = Chromatografia wykluczania wielkości z wielokątowym rozpraszaniem światła. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: STRONA SDS wariantów FL HTT poddanych cyklom zamrażania i rozmrażania. Oczyszczone Q23-HTT (tory 2-7) i Q48-HTT (pasy 9-14) zamrażano w temperaturze -80 °C i rozmrażano w temperaturze pokojowej do 6 razy. Podwielokrotności Q23-HTT i Q48-HTT przechowywano po każdym cyklu zamrażania i rozmrażania, a następnie analizowano przez SDS PAGE. Nie zaobserwowano wzrostu ilości produktów kruszywa lub produktów degradacji; Próbki uznano za stabilne i czyste w >95% za pomocą densytometrii pasmowej. Skróty: FL HTT = białko huntingtyny o pełnej długości; SDS-PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Skrypt FPLC 15 mL anty-FLAG HTT. Skróty = FPLC = szybka chromatografia cieczowa białek; HTT = białko huntingtyny. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Skrypt FPLC SEC_MALS HTT. Skróty: SEC-MALS = chromatografia wykluczania wielkości z wielokątowym rozpraszaniem światła; FPLC = szybka chromatografia cieczowa białek; HTT = białko huntingtyny. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj metodę transfekcji, ekspresji i oczyszczania w celu wygenerowania wielu konstruktów białkowych FL HTT o odpowiedniej czystości i jednorodności do wykorzystania jako wzorce do opracowywania testów immunologicznych i MS, kontroli do analizy western blot oraz do badań struktura-funkcja. Ta metoda ekspresji przejściowej jest skalowalna i wszechstronna oraz umożliwia użytkownikowi generowanie niskomiligramowych ilości wariantów FL HTT w bardziej efektywny sposób niż przy użyciu stabilnych linii komórkowych lub metod opartych na wirusach opisanych wcześniej 21,22,23,24. Rutynowo, 2-5 mg wysoce oczyszczonego FL HTT można wygenerować z produkcji białka w skali 2 litrów w czasie krótszym niż tydzień przy użyciu metody ekspresji przejściowej po skonstruowaniu plazmidu, z typową wydajnością 1-2,5 mg FL HTT na litr hodowli komórkowej.

Opisana tutaj metoda ekspresji przejściowej pokonuje wiele przeszkód w stabilnej ekspresji linii komórkowych, takich jak długi czas potrzebny do ustanowienia linii komórkowych oraz trudności w przechowywaniu i utrzymywaniu stabilnych linii komórkowych. PEI jest również stosunkowo niedrogi w porównaniu z innymi odczynnikami do transfekcji dostępnymi na rynku, dzięki czemu transfekcja na dużą skalę jest ekonomicznie opłacalna. Istnieją również ograniczenia w protokole: skuteczność transfekcji w dużej mierze zależy od jakości plazmidów, optymalnego wzrostu komórek oraz tego, jak dobrze PEI jest przechowywany i przygotowywany. Operatorzy muszą zachować szczególną ostrożność i przeprowadzać kontrole jakości na tych krytycznych etapach, aby uniknąć drastycznego spadku wydajności białka. Żywica Anti-FLAG zastosowana w protokole jest również stosunkowo droga i wykazuje zmniejszone wychwytywanie FL HTT po kilku oczyszczaniach i regeneracjach. Niektórzy badacze mogą uznać, że bardziej praktyczne jest przejście na inny znacznik, aby umożliwić bardziej solidną regenerację żywicy powinowactwa.

Przetestowano różne linie komórkowe i warunki ekspresji w celu optymalizacji poziomów ekspresji FL HTT. Komórki HEK293 zostały wybrane do ekspresji FL HTT ze względu na wysoką ekspresję białka i łatwość obsługi w formie hodowli zawiesinowej, dzięki czemu metoda ta jest odpowiednia do ekspresji na dużą skalę w wytrząsarkach lub bioreaktorach. Wyższy poziom ekspresji białka FL HTT można osiągnąć w niższych temperaturach hodowli, takich jak 32 °C, zamiast zwyczajowej temperatury 37 °C. Możliwe, że niższa temperatura może spowolnić syntezę białek i sprzyjać prawidłowemu fałdowaniu FL HTT40. Zjawisko to nie jest jednak specyficzne dla FL HTT ani badanych linii komórkowych. Obniżona temperatura po transfekcji jest szeroko stosowana w ekspresji białek farmaceutycznych w komórkach CHO. Chociaż mechanizm nie jest w pełni zrozumiały, uważa się, że niskie temperatury zatrzymują cykl komórkowy w fazie G1 i kierują energię komórkową do produkcji białek41.

Pełnowymiarowy HTT oczyszczony z komórek ssaków koeluuje się z chaperonem Hsp7024, a etapy płukania Mg-ATP mogą usunąć białko Hsp70. Co ciekawe, koeluowanego Hsp70 nie obserwuje się w FL HTT oczyszczonym z systemu ekspresji komórek owadów 21,22,23. Może to odzwierciedlać różnicę w PTM FL HTT lub odpowiedzi białek szoku cieplnego na nadekspresję FL HTT w komórkach ssaków i owadów. Po usunięciu rekombinowanego białka z Hsp70, do ustabilizowania monomerycznej formy FL HTT wymagane są niejonowe detergenty, takie jak CHAPS lub DDM.

Stany oligomeryzacji wariantów FL HTT analizowano przy użyciu Blue Native PAGE i SEC-MALS. Niewielka frakcja dimerycznego i oligomerycznego HTT wyższego rzędu była obecna, gdy była analizowana przez Blue Native PAGE lub SEC-MALS. Warto zauważyć, że oligomery wyższego rzędu utworzone przez FL HTT nie wydają się korelować z długością polyQ, a nawet mutant delecji Exon1 wykazuje podobny stosunek oligomer-dimer-monomer. Rzeczywiste różnice w zawartości oligomerów między tymi konstruktami są prawdopodobnie spowodowane niewielkimi różnicami w produkcji i obchodzeniu się z każdą partią. W przeciwieństwie do agregatów i włókien utworzonych przez HTT Exon140,41, oligomery FL HTT o wyższym rzędzie pozostały rozpuszczalne i mogły być analizowane przez SEC i Native PAGE.

Oczyszczony monomeryczny FL HTT jest tylko stosunkowo stabilny. Długotrwałe przechowywanie w temperaturze 4 °C, krótka inkubacja w temperaturze pokojowej lub stężenia > 1 mg/ml przekształcą monomeryczny FL HTT w dimeryczne i oligomeryczne formy o wyższym rzędzie, nawet jeśli w tych warunkach nie zaobserwuje się widocznych opadów. Oczyszczony monomeryczny FL HTT utrzymywany na poziomie ≤1 mg/ml pozostawał względnie stabilny w temperaturze -80 °C w buforze magazynowym (50 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% v/v glicerolu, 0,5% w/v CHAPS i 5 mM DTT), jak opisano wcześniej24. Do 6 cykli zamrażania i rozmrażania FL HTT przygotowanego i przechowywanego w ten sposób nie powodowało widocznego wytrącania się białka, chociaż SEC-MALS zaobserwował niewielkie przesunięcie do wyższego stanu oligomerycznego (rysunek uzupełniający S2). Próbki zostały również przeanalizowane przez SDS PAGE po powtarzających się cyklach zamrażania i rozmrażania. Nie zaobserwowano widocznych opadów; SDS-PAGE nie zaobserwował żadnych agregatów ani dodatkowych produktów degradacji (rysunek uzupełniający S3). Długoterminowa stabilność oczyszczonego FL HTT jest nadal badana. W przypadku braku jednoznacznych danych długoterminowych zalecamy przechowywanie oczyszczonego FL HTT w temperaturze -80 °C nie dłużej niż 6 miesięcy.

Wysokiej jakości, rekombinowane warianty białka FL HTT i metody ich produkcji są bardzo poszukiwane przez społeczność badawczą HD. Białka te są wykorzystywane jako testy immunologiczne i wzorce analityczne SM, w badaniach strukturalnych oraz do opracowywania nowych testów specyficznych dla FL HTT. Opisane tutaj metody ekspresji przejściowej na dużą skalę konsekwentnie wytwarzały miligramowe ilości wariantów FL HTT o czystości >95%, dostarczając niezbędnych narzędzi do badań HTT. Produkcja dziesiątek miligramów wysoko oczyszczonych wariantów FL HTT polyQ i innych mutantów w celu wsparcia badań nad HD stała się rutyną.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego artykułu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Wydziałowi Nauk Farmaceutycznych Uniwersytetu Stanowego Nowego Jorku w Buffalo za przeprowadzenie analizy HTT w kierunku stwardnienia rozsianego. Praca ta była wspólnym wysiłkiem Fundacji CHDI. W szczególności dziękujemy Elizabeth M. Doherty; Ignacio Muñoz-Sanjuan; Douglas Macdonald, Fundacja CHDI; oraz Rory'emu Curtisowi, Kurii, za ich nieoceniony wkład w przygotowanie tego manuskryptu. Jesteśmy również wdzięczni Michele Luche, Mithrze Mahmoudi i Stephanie Fox za ich wsparcie w tym wysiłku badawczym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koncentrator 100 kDa - AmiconMilliporeUFC910096Protokół Numer sekcji-6.2.4
20x niebieski natywny bufor uruchomiony PAGEProtokół InvitrogenBN2001Numer sekcji-8.1
20x TBSThermo FisherPI28358Protokół Numer sekcji-5.1 4x
niebieski natywny bufor próbki PAGEInvitrogenBN2003 Protokół Invitrogen BN2003Numer sekcji-8.3
4x bufor ładujący LDSInvitrogenNP0007Protokół Numer sekcji-5.3
Kolby Erlenmeyera5 L Protokół Corning431685Numer sekcji-4.2
Zestaw do ekstrakcji żelu agarozowegoQiagen28704Protokół Numer sekcji-2.2
Środek przeciwzbrylającyThermo Fisher0010057AEProtokół Numer sekcji-4.8
powinowactwo anty-FLAG M2 żelSigmaA2220Numer sekcji protokołu-6.1.1
anty-FLAG M2SigmaF3165Protokół numer sekcji-5.7
Przeciwpieniąco-Excell przeciwpieniącySigma59920C-1BNumer sekcji protokołu-4.8
ATPSigmaA6419sekcji protokołu 6.1.4.4
BEH 450 SECWaters1860068512,5 &mikro; m x 4,6 mm x 150 mm
Protokół Numer sekcji-7.3
niebieski natywny STRONA 5% Dodatek do próbek G-250Protokół InvitrogenBN2004Numer sekcji-8.3
karbenicylinaThermo Fisher10177012Protokół Nr sekcji-2.5
Wirówka - Sorvall Lynx 6000Thermo Fisher75006590Protokół Nr sekcji-6.1.3
Licznik komórek - ViCELLBECKMAN COULTERNumer sekcji protokołu-4.3
CHAPSAnatraceC316SNumer sekcji protokołu-6.1.4.6
Właściwe komórki E. coli-TOP10Protokół InvitrogenC404010Numer sekcji-2.4
digitoninaSigmaD141Sekcja protokołu numer 5.1
różnicowego indeksu refrakcjiWyatt Protokół WyattNumer sekcji-7.1
peptydów peptydu DYKDDDDKGenscript
Numer sekcji protokołu 5.1.4.6
EDTASigmaEDSNumer sekcji-5.1
EndoFree Plasmid Giga KitQiagen12391Numer sekcji protokołu-3.3
Woda wolna od endotoksynCytivaSH30529.03Numer sekcji protokołu-4.1
zestaw do oznaczania ilościowego endotoksyn-CRL System wykrywania Endosafe Nexgen-PTSRiverPTS150KProtokół Numer sekcji-3.4
Wirnik o stałym kącie Wirnik A23-6x100Protokół Thermo Fisher75003006Numer sekcji-6.1.3
Oprogramowanie FPLC - Jednorożec 6.2Protokół CytivaNumer sekcji-6.1.4
Synteza genówGenscriptUsługa syntezy genów
Protokół Numer sekcji-1.2
GlicerolFisher Scientific Glycerol (certyfikowany ACS)G33-4Protokół numer 5.6
Pożywka wzrostowa-Expi293 Podłoże do wyrażaniaThermo FisherA1435102Protocol Numer sekcji-4.2
Ogniwa HEK293Thermo FisherR79007Sekcja protokołu Numer-4
wysokie ścinanie homogenizator-MikrofluidyzatorMicroFluidicsLM10Protokół Numer sekcji-6.1.3
HPLC - 1260 nieskończoność II Bio-Insert HPLCAgilentProtokół Nr sekcji-7.1
Image StudioLiCorOprogramowanie do analizy obrazu
Protokół nr 5.1
MAB2166Sigma MAB2166 Numer sekcji protokołu Sigma-5.7
MAB2168Numer sekcji protokołu EMD MAB2168-5.7
MAB3E10Santa CruzSC-47757Numer sekcji protokołu-5.7
MAB4E10Santa CruzSC-7757Numer sekcji protokołu-5.7
MAB5490SigmaMAB5490numer sekcji-5.7
MAB5492Sigma
MAB8A4Santa CruzSC-47759Numer sekcji protokołu-5.7
Wielokątowy detektor rozpraszania światłaWyattNumer sekcji-7.1
NativeMark Unbared Protein StandardInvitrogenLC0725Protokół Numer sekcji-8.4
NaClSigmaS9888Numer sekcji protokołu-5.6
NheINew England BiolabR0131SDostępna wersja Hi-Fi
Sekcja protokołu nr 2.2
NuPAGE 3– 8% żele octanowe TrisProtokół InvitrogenEA0375PK2Numer sekcji-5.4
NuPAGE Tris-Acetate SDS Bufor do bieganiaInvitrogenLA0041Protokół nr sekcji-5.4
PEI 25KPolysciences23966-1Numer sekcji protokołu-4.1
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher15070063Protokół Numer sekcji-4.2
Fosforan Buforowana sól fizjologiczna (PBS)CytivaSH30256.02Protokół Numer sekcji-4.5
Zestaw do miniprzygotowania plazmiduQiagen27104 Protokół Qiagen 27104sekcji-2.6
PmeINew England BiolabR0560SProtokół nr sekcji-2.2
prefabrykowany żel Bis-tris - 3-12% NativePAGE Novex Bis-tris GelInvitrogenBN1003BOXProtokół Nr sekcji Numer-8.4
proteaza koktajl inhibitorówGoldBioGB-331-1Protokół Numer sekcji-5.1
Oprogramowanie do analizy SEC-MALS - Astra 7Wyatt TechnologyProtocol Sekcja numer sekcji-7.6
przeciwciało wtórne -IRdye 800 CW koza anty-mysia IgGLiCor926-32210Numer sekcji protokołu-5.9
Superose 6 pg XK 16/70Cytiva90100042Protokół Numer sekcji-6.2
Tris baseFisherBP152Protokół nr sekcji-5.6
Tween-20Thermo FisherAAJ20605APProtokół numer sekcji-6.1.1
Spektrometr UV - Nanodrop 8000Thermo FisherND-8000-GLNumer sekcji protokołu-2.2
XK26/100Cytiva28988951sekcji protokołu-6.1.1
Numer detektor Usługa syntezy Protokół Charles Protokół Numer sekcji protokołu MAB5492-5.7 Protokół Numer Numer

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walker, F. O. Huntington's disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
  2. McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
  3. Duyao, M., et al. Trinucleotide repeat length instability and age of onset in Huntington's disease. Nature Genetics. 4 (4), 387-392 (1993).
  4. MacDonald, M. E., et al. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  5. Nasir, J., et al. Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes. Cell. 81 (5), 811-823 (1995).
  6. Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice. Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).
  7. Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons. Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).
  8. Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis. PLoS Genetics. 13 (7), 1006846(2017).
  9. Dragatsis, I., et al. Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum. Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).
  10. Benn, C. L., et al. Huntingtin modulates transcription, occupies gene promoters in vivo, and binds directly to DNA in a polyglutamine-dependent manner. Journal of Neuroscience. 28 (42), 10720-10733 (2008).
  11. Saudou, F., Humbert, S. The biology of huntingtin. Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).
  12. Davies, S. W., et al. Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation. Cell. 90 (3), 537-548 (1997).
  13. DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
  14. Gutekunst, C. A., et al. Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology. Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).
  15. Hodgson, J. G., et al. A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration. Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).
  16. Hoffner, G., Djian, P. Polyglutamine aggregation in Huntington disease: does structure determine toxicity. Molecular Neurobiology. 52 (3), 1297-1314 (2015).
  17. Waldvogel, H. J., Kim, E. H., Tippett, L. J., Vonsattel, J. P. G., Faull, R. L. M. The neuropathology of Huntington's disease. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 22, 33-80 (2014).
  18. Kim, M. Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues. Prion. 7 (3), 221-228 (2013).
  19. Hoop, C. L., et al. Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).
  20. Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
  21. Seong, I. S., et al. Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2. Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).
  22. Li, W., Serpell, L. C., Carter, W. J., Rubinsztein, D. C., Huntington, J. A. Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein. Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15916-15922 (2006).
  23. Vijayvargia, R., et al. Huntingtin's spherical solenoid structure enables polyglutamine tract-dependent modulation of its structure and function. eLife. 5, 11184(2016).
  24. Huang, B., et al. Scalable production in human cells and biochemical characterization of full-length normal and mutant huntingtin. PLoS ONE. 10 (3), 0121055(2015).
  25. Guo, Q., et al. The cryo-electron microscopy structure of huntingtin. Nature. 555 (7694), 117-120 (2018).
  26. Harding, R. J., et al. Design and characterization of mutant and wildtype huntingtin proteins produced from a toolkit of scalable eukaryotic expression systems. Journal of Biological Chemistry. 294 (17), 6986-7001 (2019).
  27. Harding, R. J., et al. HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1. bioRxiv. , (2021).
  28. Huang, B., et al. Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex. Structure. 29 (8), 804-809 (2021).
  29. Colin, E., et al. Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons. EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).
  30. Thompson, L. M., et al. IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome. Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).
  31. Ratovitski, T., et al. Post-translational modifications (PTMs), identified on endogenous Huntingtin, cluster within proteolytic domains between HEAT repeats. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2692-2708 (2017).
  32. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  33. Tarazona, M. P., Saiz, E. Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1-3), 95-116 (2003).
  34. Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods in Molecular Biology. 328, Clifton, N.J. 97-112 (2006).
  35. McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).
  36. Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
  37. Kegel-Gleason, K. B. Huntingtin interactions with membrane phospholipids: Strategic targets for therapeutic intervention. Journal of Huntington's Disease. 2 (3), 239-250 (2013).
  38. Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin. Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).
  39. Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1 (1), 418-428 (2006).
  40. Nissley, D. A., O'Brien, E. P. Altered co-translational processing plays a role in huntington's pathogenesis-A hypothesis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 54(2016).
  41. Kumar, N., Gammell, P., Clynes, M. Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture: A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines. Cytotechnology. 53 (1-3), 33-46 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pe nowymiarowa huntingtynaekspansja poliglutaminowatransfekcja polietyleniminchromatografia wykluczaniaanaliza SEC MALSoczyszczanie bia ekWestern blot

Powiązane artykuły