Przygotowanie eksplantatów pojedynczych somitów z zarodków danio pręgowanego

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół izolacji pojedynczych somitów z zarodków danio pręgowanego, którego dynamikę można śledzić w hodowli przez kilka godzin za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu poklatkowego, dostarczając w ten sposób metodologii do ilościowego określania zmian kształtu w skali tkankowej przy rozdzielczości pojedynczej komórki.

Streszczenie

Oś ciała zarodków kręgowców jest okresowo dzielona na wielokomórkowe jednostki 3D zwane somitami. Podczas gdy oscylacje genetyczne i prewzorce molekularne determinują początkową skalę długości somitów, procesy mechaniczne są zaangażowane w ustalanie ich ostatecznego rozmiaru i kształtu. Aby lepiej zrozumieć wewnętrzne właściwości materiałowe somitów, opracowano metodę hodowli eksplantatu pojedynczego somitu z zarodków danio pręgowanego. Pojedyncze somity izoluje się najpierw poprzez usunięcie skóry zarodków, a następnie usunięcie żółtka i sekwencyjne wycięcie sąsiednich tkanek. Za pomocą transgenicznych zarodków można obserwować rozmieszczenie różnych struktur subkomórkowych za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Dynamikę eksplantowanych somitów można obserwować przez kilka godzin, zapewniając w ten sposób eksperymentalne ramy do badania zmian kształtu w skali tkankowej w rozdzielczości pojedynczej komórki. Takie podejście umożliwia bezpośrednią mechaniczną manipulację somitami, co pozwala na analizę właściwości materiałowych tkanki. Wreszcie, opisaną tutaj technikę można łatwo rozszerzyć o eksplantację innych tkanek, takich jak struna grzbietowa, płytka nerwowa i mezoderma płytki bocznej.

Wprowadzenie

Znaczna część układu mięśniowo-szkieletowego dorosłego kręgowca wyłania się z embrionalnych somitów, które tworzą się okresowo i rytmicznie wzdłuż osi ciała zarodków^1,2. Somity to trójwymiarowe (3D) jednostki wielokomórkowe zwykle składające się z wewnętrznego rdzenia komórek mezenchymalnych i obwodowej warstwy nabłonka otoczonej bogatą w fibronektynę macierzą zewnątrzkomórkową³. Morfologia somitów, tj. ich rozmiar i kształt, jest częściowo zdeterminowana przez zegar segmentacji i dalsze wzorce molekularne. Jednak w ciągu ostatniej dekady okazało się, że mechaniczne wskazówki i siły również odgrywają rolę w regulacji segmentacji clock⁴, oprócz ułatwiania tworzenia somitów^5,6,7 i zapewnianiu zwiększonej precyzji długości somitów po początkowym tworzeniu somitów⁸.

Mechanika tkanek może być badana bezpośrednio in vivo dzięki dostępności nowych narzędzi⁹, jednakże, aby uzyskać pełny obraz leżący u podstaw procesów fizycznych, wewnętrzne właściwości tkanek muszą być badane równocześnie. Opisany tutaj protokół zapewnia proste podejście do przygotowania pojedynczych somitów, których właściwości fizyczne od skali komórkowej do tkankowej mogą być badane w izolacji od zarodka. Chociaż istnieje kilka protokołów przygotowania eksplantatów na podobnych etapach rozwoju^{10,11,12,13,14}, według naszej wiedzy, jest to pierwszy protokół opisujący izolację pojedynczych somitów. Protokół jest prosty do wdrożenia i wymaga jedynie podstawowego sprzętu dostępnego w większości laboratoriów danio pręgowanego pracujących z zarodkami.

Aby pomóc w wyjaśnieniu roli mechaniki w morfologicznym tworzeniu somitów, opracowano metodę hodowli eksplantatu pojedynczego somitu z zarodków danio pręgowanego, która może być wykorzystana do zbadania wewnętrznych właściwości materiałowych somitów.

Protokół

Ten protokół obejmuje wykorzystanie żywych zarodków kręgowców młodszych niż 1 dzień po zapłodnieniu. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone na embrionach pochodzących z swobodnie krytych osobników dorosłych, a zatem są objęte ogólną licencją EPFL na prowadzenie doświadczeń na zwierzętach udzieloną przez Service de la Consommation et des Affaires Vétérinaires kantonu Vaud - Szwajcaria (numer zezwolenia VD-H23).

1. Przed sekcją

1. Uzyskaj zarodki z krzyżówki heterozygotycznych linii transgenicznych będących przedmiotem zainteresowania. Do eksplantacji dwóch do trzech somitów zwykle potrzeba tylko kilku zarodków. W tym protokole jeden zarodek został użyty do eksplantacji jednego somitu.
2. Przygotuj 1x bufor E3 z dwóch 50x zapasów: zapas 1 zawiera 0.458 mM Na₂HPO₄, 0.042 mM KH₂PO₄, 4.084 mM NaCl, 0.128 mM KCl, a zapas 2 zawiera 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄. Przygotuj 500 ml 1x buforu E3, mieszając 480 ml wody destylowanej z 10 ml każdego z dwóch 50-krotnych zapasów.
3. W przypadku preparacji w tym samym dniu, należy hodować zarodki w 25 ml pożywki E3 na szalce Petriego w temperaturze 33 °C do stadium trzech somitów. W przypadku preparacji następnego ranka należy hodować zarodki w pożywce E3 w temperaturze 28 °C do fazy osłony, a następnie przenieść do temperatury 19 °C w celu inkubacji przez noc.
4. Do identyfikacji stopnia tarczy lub różnych stopni somitowych należy użyć standardowego laboratoryjnego mikroskopu stereoskopowego o regulowanym zakresie powiększenia od około 0,67x do 4,5x.
5. Zbierz narzędzia i odczynniki potrzebne do sekcji.
   1. Pożywkę L-15 firmy Leibovitz należy przechowywać w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w lodówce. Zalecamy użycie tej samej porcji z lodówki na maksymalnie dwie rundy.
   2. Przygotować 50 ml 2% agarozy w pożywce L-15 za pomocą mieszadła magnetycznego i utrzymując temperaturę na poziomie 85 °C. Po rozpuszczeniu przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej.
   3. Przygotować 25 ml 2% niskotopliwej agarozy w pożywce L-15 za pomocą mieszadła magnetycznego i utrzymując temperaturę na poziomie 85 °C. Po rozpuszczeniu rozdzielić roztwór na porcje do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C. Zostanie on wykorzystany do przygotowania komory obrazowania.
   4. Wlej stopioną 2% agarozę do szalki Petriego o średnicy 20 mm, aż wypełni się jedna trzecia głębokości naczynia i pozwól, aby roztwór agarozy zastygł. Sekcje zostaną przeprowadzone na tych szalkach Petriego. Przygotować szalki Petriego z powłoką agarozową z dużym wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   5. Zbierz następujące narzędzia: pipetę Pasteura do transferu zarodków, parę kleszczyków do dekorionacji zarodków, parę cienkich kleszczyków do usuwania skóry zarodków, mikronóż do wykonywania nacięć w zarodkach, pipetę z polerowanego szkła do przenoszenia eksplantatów do komory obrazowania.
   6. Sterylizuj szklaną pipetę w 100% etanolu przez 15 minut i przepłucz dwukrotnie, pipetując 5 ml pożywki L-15 w górę iw dół.
   7. Przygotuj narzędzie do rzęs, przyklejając rzęsę lub włosy z brwi do szklanej kapilary.
6. Użyj stereoskopu fluorescencyjnego z regulowanym zakresem powiększenia od około 0,63x do 6,3x oraz standardowych filtrów GFP i RFP, aby posortować dodatnie transgeniczne zarodki i przenieść je na oddzielną szalkę Petriego z pożywką E3.

2. Przygotowanie eksplantatu z pojedynczym somitem

1. Przenieść 2 lub 3 zarodki do naczynia pokrytego agarozą (przygotowanego w kroku 1.5.4) wypełnionego 10 ml pożywki L-15. Upewnij się, że naczynie wraz z podłożem L-15 jest wstępnie ogrzane w temperaturze 28 °C w inkubatorze przez 30 minut przed transferem zarodków.
2. Ostrożnie zdechorionować (Rysunek 1 A,B) zarodek za pomocą pary kleszczy. Przytrzymaj kosmówkę jednym ze szczypiec i użyj drugich kleszczy, aby uszczypnąć i pociągnąć kosmówkę w pobliżu miejsca, w którym znajduje się pierwsze kleszcze.
3. Powtórz ten krok jeszcze raz, aby szeroko otworzyć kosmówkę, po czym zarodek można delikatnie wypchnąć. Upewnij się, że zarodek nie jest uszkodzony lub ściśnięty podczas dechorionacji.
4. Ustaw zarodek na bocznej stronie i przytrzymaj skórę między głową a ogonem zarodka za pomocą jednego z cienkich kleszczyków. Użyj drugich cienkich kleszczyków, aby uszczypnąć skórę w pobliżu miejsca, w którym nadal znajduje się pierwsze kleszcze.
5. Odsuń dwa kleszcze od siebie, trzymając się skóry, tworząc w ten sposób duży otwór. Zwolnij jeden z kleszczyków ze skóry i przesuń go blisko miejsca, w którym trzymane są drugie kleszcze i powtarzaj proces usuwania skóry, aż skóra zostanie usunięta w obszarach tworzących somit.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby całkowicie usunąć skórę otaczającą somity, które zostaną eksplantowane, w przeciwnym razie trudno będzie przeprowadzić dokładniejsze sekcje na późniejszych etapach protokołu.
6. Użyj mikro noża, aby zeskrobać żółtko (Rysunek 1C - eksplantat z usuniętą skórką i zeskrobanym żółtkiem) i wykonaj serię nacięć w następujący sposób:
   1. Przeciąć zarodek pierwszym cięciem przed pierwszym somitem morfologicznym w zarodku, a drugim przecięciem tylnym do ostatnio utworzonego somitu (Ryc. 1D). Przetnij jeszcze raz tylną i przednią do interesujących nas somitów (Ryc. 1E).
   2. Użyj mikronoża, aby zeskrobać pozostałe żółtko z eksplantowanych obszarów zarodka. Spróbuj usunąć jak najwięcej żółtka, aby zmniejszyć możliwość przyklejenia się eksplantatów do mikronoża. Jeśli tak się stanie, użyj narzędzia do rzęs, aby przesunąć eksplant z powrotem do roztworu, trzymając mikronóż zanurzony w podłożu.
   3. Umieść eksplant grzbietowo i wykonaj plasterek wzdłuż osi przednio-tylnej przez strunę grzbietową, blisko somitów z jednej strony (Rysunek 1F,G).
   4. Weź eksplant bez struny grzbietowej i przetnij mezodermę płytki bocznej (LPM) w pobliżu somitów.
      UWAGA: Ten krok można zamienić z poprzednim krokiem, tj. działa równie dobrze, aby najpierw przeciąć LPM, a następnie przeciąć strunę grzbietową.
7. Wybierz somit, który ma zostać eksplantowany i zrób dwa plastry odpowiednio z tyłu i z przodu somitu (Rysunek 1H).
8. Na koniec obróć somitę o 90° za pomocą narzędzia do rzęs, aby uwidocznić płytkę nerwową nadal przyczepioną do somitu. Zrób plasterek między somitem a płytką neuronową, uwalniając w ten sposób pojedynczy somit (Rysunek 1I).
   UWAGA: Płytkę nerwową można również usunąć natychmiast po kroku 2.6.4, tj. po usunięciu struny grzbietowej i LPM oraz przed wypreparowaniem somitu z sąsiednich somitów.

3. Obrazowanie eksplantatów z pojedynczym somitem

UWAGA: Tutaj opisana jest procedura obrazowania eksplantatów z pojedynczym somitem za pomocą mikroskopu z pojedynczym widokiem na arkusze świetlne. Alternatywnie, eksplantowane pojedyncze somity można również obrazować w mikroskopie konfokalnym, który jest szerzej dostępny, a nawet w mikroskopie szerokokątnym, jeśli interesuje nas wyłącznie śledzenie ogólnej morfologii eksplantatów.

1. Przygotować komorę obrazowania w następujący sposób:
   1. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml preparatem z gumy silikonowej. Odciąć końcówkę pipety o pojemności 200 μl w odległości około 1 cm od ust i włożyć strzykawkę do końcówki pipety.
   2. Ręcznie owiń uchwyt membrany wstępnie przyciętym paskiem membrany z fluorowanego etylenu i propylenu (FEP) (Rysunek 2A-C) i przymocuj komorę obrazowania do uchwytu membrany, które ściśle przylegają do siebie (Rysunek 2D).
   3. Dodaj preparat z kauczuku silikonowego wzdłuż przecięcia komory i membrany i wysusz go przez noc, co pozwoli membranie przykleić się do komory. Usuń uchwyt membrany 1 godzinę przed eksperymentem z eksplantatem.
   4. Podgrzewać podwielokrotność zawierającą 0,5 ml 2% niskotopliwej agarozy sporządzonej z pożywki L-15 w temperaturze 75 °C przez 10 minut. Dodać 160 μl podgrzanej niskotopliwej agarozy do środka komory i umieścić formę do obrazowania w agarozie (Rysunek 2E,F) i trzymać ją w pozycji pionowej, aż agaroza zastygnie.
   5. Dodać kolejne 160 μl podgrzanej, niskotopliwej agarozy na dwa końce formy i przenieść całe urządzenie do temperatury 4 °C na 30 minut.
   6. Do komory dodać 600 μl pożywki L-15 i wyjąć formę z komory za pomocą kleszczyków. Poczekaj, aż komora z pożywką L-15 powróci do temperatury pokojowej.
2. Przenieś eksplantowany somit za pomocą pipety z polerowanego szkła przez pipetowanie do komory obrazowania i użyj narzędzia do rzęs, aby umieścić eksplant na środku komory.
3. Ustawić lasery obrazujące zgodnie z instrukcjami producenta i ostrożnie przenieść komorę obrazowania do mikroskopu wyposażonego w komorę inkubacyjną, aby utrzymać eksplantaty w temperaturze 28 °C.
4. Wykonaj drugą rundę wyrównywania lasera z obszarami zainteresowania z linii transgenicznej, a następnie ustaw żądany stos z, interwał czasowy i czas trwania dla obrazowania poklatkowego. Na potrzeby tego eksperymentu należy pobrać 70 plasterków z odstępem 2 μm i odstępem między ramkami wynoszącym 2 minuty.
5. Wykonaj dwukolorowe obrazowanie za pomocą arkuszy świetlnych (Rysunek 1J) eksplantatów za pomocą laserów 561 nm (10% mocy lasera, ekspozycja 100 ms) i 488 nm (10% mocy lasera, ekspozycja 100 ms). W tym protokole sygnał został zebrany za pomocą obiektywu 25x/1,1 NA oraz przez filtry pasmowoprzepustowe 561/25 nm i 525/50-25 odpowiednio do kamery sCMOS.

Wyniki

Eksplanty umożliwiają kwantyfikację wielkoskalowych zmian kształtu w 3D. Aby to zilustrować, wyizolowano eksplanty czwartego somitu (N = 3) z wczesnych embrionów danio pręgowanego, uzyskanych z krzyżówki linii heterozygotycznych Utr::mCherry (Tg(actb2:mCherry-Hsa.UTRN); e119Tg) i H2B::GFP (Tg(h2az2a:h2az2a-GFP); kca6Tg). Utrofina jest białkiem wiążącym aktynę, a linia Utr::mCherry obrazuje rozkład struktur aktyny filamentownej. Transgen ten został tutaj wykorzystany jako marker obrysów komórek. H2B::GFP to histon znakowany fluorescencyjnie, który w konsekwencji wyznacza rozkład chromatyny, zapewniając skuteczny opis lokalizacji i kształtu jądra, a także obrazując figury mitotyczne uwypuklające podziały komórkowe.

Skuteczność protokołu przygotowania eksplantów ocenialiśmy podczas obrazowania. Zaobserwowaliśmy, że w przypadku somitu uszkodzonego podczas sekcji dochodzi do naruszenia integralności tkanki somitycznej, objawiającego się dysocjacją i usuwaniem wielu komórek z eksplantu somitu, i/lub do obumierania wielu komórek, co można odnotować na podstawie obecności pofragmentowanych jąder w kanale jądrowym. Prawidłowo przygotowane eksplanty pozostawały zdrowe przez 4-6 h, po czym obserwowano zmiany w integralności somitu, objawiające się dysocjacją komórek z eksplantu oraz ich obumieraniem.

W kanale utrofiny przeprowadziliśmy ręczną segmentację eksplantów w programie MATLAB (R2018b) na przekrojach z rozmieszczonych co 10 µm. Opracowaliśmy w MATLAB własny algorytm segmentacji, który jest dostępny do bezpłatnego pobrania (https://github.com/sundar07/SomSeg). W algorytmie można ustawić plik, klatkę i przekrój z do segmentacji, po czym pojawia się monit dla użytkownika, który umożliwia ręczne narysowanie obrysu wokół obszaru zainteresowania. Czynność tę powtórzono dla wielu przekrojów z i naniosło je na wykres, co wykazało zaokrąglanie się eksplantów w czasie w 3D (Rysunek 3A). Dodatkowo uzyskano uzupełniające informacje o kształcie tkanki z wykorzystaniem kanału jąder komórkowych. W tym celu użyliśmy programu Mastodon (wersja 1.0.0-beta-19, https://github.com/mastodon-sc/mastodon), wtyczki do FIJI¹⁵, aby uzyskać pozycje centroidów jąder poprzez detekcję punktów. Najpierw przekonwertowaliśmy pliki tif z mikroskopu do formatu xml/hdf5 w FIJI, po czym za pomocą wtyczki Mastodon otwarto nowy projekt. W wtyczce wybraliśmy opcję detekcji punktów, w której zdefiniowaliśmy obszar zainteresowania obejmujący eksplant i użyliśmy detektora różnicy Gaussa (difference of Gaussian) o średnicy 5 µm i współczynniku jakości 25 do detekcji punktów. Następnie przenieśliśmy pozycje centroidów jąder do programu MATLAB i użyliśmy wbudowanej funkcji (convhull) do wyznaczenia otoczki wypukłej (convex hull) (Rysunek 3B), która scharakteryzowała geometrię eksplantu. Wykazało to analogicznie zaokrąglanie się eksplantów w czasie (Rysunek 3B). Dane dotyczące jąder umożliwiają dodatkowo ilościowe określenie ruchów komórek poprzez śledzenie w 3D oraz zmianę liczby komórek w czasie. Z kolei kanał utrofiny pozwala na kwantyfikację zmian w kształcie komórek w miarę zaokrąglania się eksplantów. Wspólnie parametry te są cenne dla charakterystyki wewnętrznych właściwości materiałowych somytów, co pomaga w opracowaniu skutecznych opisów fizycznych zmian kształtu w skali tkankowej.

Eksplanty pozwalają również na ilościową charakterystykę naprężeń kontaktowych z sąsiadującymi tkankami. Aby to zilustrować, ręcznie wyizolowaliśmy dwa somity, umieściliśmy je w bliskim sąsiedztwie i obserwowaliśmy ich dynamikę (N = 2). W tym eksperymencie nie śledzono orientacji somitów względem osi ciała in vivo. Co ciekawe, z czasem eksplantowane somity przylgnęły do siebie wzdłuż jednej powierzchni, podczas gdy powierzchnie wolne, tj. obszary oddalone od miejsca kontaktu, uległy zaokrągleniu (Rysunek 4). Sugeruje to, że siły adhezyjne przeważają nad naprężeniami generowanymi przez napięcie powierzchniowe w miejscach kontaktu w eksplantach. Można to dalej scharakteryzować poprzez śledzenie zmian kształtu, jak opisano powyżej, oraz poprzez ilościowe określanie kątów kontaktu między dwiema tkankami w 3D w czasie. Zatem eksplanty stanowią atrakcyjny system do ilościowego badania konkurujących sił, które prowadzą do powstania specyficznych kształtów tkanek, a których znaczenie można następnie zbadać in vivo.

Rysunek 1: Przygotowanie eksplantatów pojedynczego somitu. Zarodek danio pręgowanego (A) jest najpierw zdechorionowany (B), a następnie usuwa się skórę i żółtko (C). Następnie wybierany jest region zarodka zawierający somity poprzez usunięcie pozostałych tkanek (D, E). Obszary wokół interesującego somitu są następnie usuwane seryjnie (F-H), aby ostatecznie wyizolować pojedynczy somit (I), po czym wykonuje się obrazowanie time-lapse przy użyciu mikroskopu arkusza światła (tutaj pokazano środkową sekcję z somitu) (J). Skróty: S = somite; N = notochord; LPM = lateral plate mesoderm; A = anterior; P = posterior. Linie przerywane wskazują miejsca cięć. Pasek skali = 50 µm na wszystkich panelach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 2: Montaż komory do obrazowania arkuszem światła (light-sheet imaging chamber). (A-D) Pasek membrany FEP (wymiary w (B)) jest owijany wokół uchwytu membrany, dopasowywany do komory obrazowania, a następnie membrana jest przyklejana do komory. (E-F) Następnego dnia uchwyt membrany zostaje usunięty, a forma do obrazowania (wymiary w (E)) zostaje umieszczona w centrum komory obrazowania w agarozie niskotopliwej. Cały układ jest utrzymywany w temperaturze 4 °C przez 30 min, po czym forma zostaje usunięta, a komora z rynienką jest wykorzystywana do obrazowania eksplantów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 3: Analiza 3D kształtów tkanek. (A) Obrysy komórek wizualizowano za pomocą utrofiny znakowanej fluorescencyjnie (Utr::mCherry), a jądra za pomocą histony znakowanej fluorescencyjnie (H2B::GFP). Obrysy eksplantu zostały poddane manualnej segmentacji na wielu głębokościach przy użyciu programu MATLAB i są tutaj przedstawione. (B) Jądra (czerwone) wykryto w tym samym eksplantcie przy użyciu wtyczki Mastodon do programu FIJI, a następnie zastosowano otoczkę wypukłą (convex hull, cyjan), co pozwala na określenie geometrii eksplantu. Zauważalnym wynikiem w obu analizach jest zaokrąglenie eksplantów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Eksplantowane somity przylegają do siebie. Dwa somity wyizolowane z embrionów i umieszczone ręcznie w bliskiej odległości wykazują tendencję do przylegania w czasie (N = 2). Za pomocą mikroskopu arkusza światła wykonano wielokrotne przekroje w płaszczyźnie z odstępem czasowym 2 min; przedstawiono tutaj sekcje środkowe somitów z wybranych punktów czasowych. Obrysy komórek zwizualizowano za pomocą znakowanej fluorescencyjnie utrofinyny (Utr::mCherry). Pasek skali = 25 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Dziedzina somitogenezy została zdominowana przez badania nad rolą zegara segmentacyjnego w ustalaniu długości segmentów podczas rozwoju zarodka. Jednak równie ważne jest rozważenie roli mechaniki tkankowej w określaniu końcowych morfologii somitów. Opisany tutaj protokół pozwala na eksplantację pojedynczych somitów, których wewnętrzne właściwości fizyczne można badać w izolacji od zarodka. Jednak ręczne przygotowanie ogranicza liczbę somitów, które są zwykle przygotowywane, do czterech do sześciu na sesję obrazowania. Ponieważ protokół obejmuje staranne, dokładne rozbiory kilku tkanek w zarodkach bez użycia jakichkolwiek enzymów ułatwiających usunięcie tkanek, opanowanie procesu preparacji może zająć kilka tygodni praktyki. W naszych rękach krytyczne kroki w protokole polegają na starannym usunięciu skóry i żółtka z eksplantatów, co zapobiega przywieraniu eksplantatów na różnych etapach protokołu do używanych narzędzi, co z kolei umożliwia łatwiejsze sekcje w celu seryjnego usuwania tkanek otaczających somit.

Protokół preparacji można zatrzymać na etapach pośrednich, aby uzyskać somity przyczepione tylko do jednej z otaczających tkanek lub uzyskać eksplantaty grup somitów. Zapewnia to potężną metodę seryjnego rozbierania tkanek i badania wpływu sąsiednich tkanek na ułatwianie zmian kształtu w somitach lub w sąsiednich tkankach. Z drugiej strony, korzystając z tego protokołu, poszczególnym eksplantowanym tkankom można pozwolić na przyleganie i mechaniczną samoorganizację, jak wykazano poprzez umieszczenie dwóch eksplantowanych somitów w bliskiej odległości.

Eksplantaty przygotowane tą metodą nie wymagają żadnych dodatkowych składników w buforze ani ograniczeń, aby zapewnić przeżycie przez okres do kilku godzin. Można jednak wyobrazić sobie hodowlę ich w hydrożelach i śledzenie ich dynamiki w obecności zewnętrznych ograniczeń, co może służyć jako model dla naprężeń kontaktowych, z jakimi somity spotykają się in vivo. Co więcej, eksplantaty pozwalają na bezpośrednie badanie ich właściwości materiałowych za pomocą mikroskopii sił atomowych, aspiracji pipet lub przy użyciu narzędzi mikrorobotycznych¹⁶. Wreszcie, spodziewamy się, że metodę tę można łatwo dostosować do hodowli i badania innych tkanek rozwojowych na podobnych etapach, takich jak struna grzbietowa, płytka nerwowa i mezoderma płytki bocznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza	Sigma	9012-36-6	Do powlekania dna szalek Petriego
Agaroza, niska temperatura żelowania	Sigma	39346-81-1	Do przygotowania komory obrazowania Viventis
Aparat fotograficzny	Andor	Andor Zyla 4.2 Plus	Do akwizycji obrazu w mikroskopie arkuszowym
Obiektyw detekcyjny		Nikon Nikon CFI75 Apo LWD 25x/1.1 NA	Do obrazowania eksplantatów
Taśma membranowa FEP	Lohmann Technologies UK Ltd	Dupont FEP Folia fluorowęglowa, 200A	Do przygotowania komory obrazowania Viventis
Cienkie kleszcze	Dumont	Dumont 5SF 11252-00	Do usuwania skóry zarodków
Kleszcze	Dumont	Dumont 55	Do dekorionacji zarodków
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	21083-027	Pożywka do hodowli eksplantatów
Mikroskop arkuszowy	Viventis	LS1 live	Do obrazowania eksplantatów
Mikronóż	Fine Science Tools	10318-14	Do wykonywania nacięć w zarodkach
Preparat z kauczuku silikonowego	Wacker Chemie AG	Silpuran 4200	Do przygotowania komory obrazowania Viventis