Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe obrazowanie konfokalne trymerów kolców SARS-CoV-2 sprzężonych z kropkami kwantowymi w celu śledzenia wiązania i endocytozy w komórkach HEK293T

DOI:

10.3791/63202

⸱

21 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1National Center for Advancing Translational Sciences, 2Optical Sciences Division, Code 5600, Naval Research Laboratory, 3Jacobs Corporation

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, kropki kwantowe sprzężone z rekombinowanym kolcem SARS-CoV-2 umożliwiają testom komórkowym monitorowanie wiązania kolców z hACE2 na błonie plazmatycznej i późniejszej endocytozy białek związanych z cytoplazmą.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój nowych technologii dla komórkowej mikroskopii fluorescencyjnej ułatwił wysokoprzepustowe metody badań przesiewowych w celu odkrywania leków. Kropki kwantowe to fluorescencyjne nanocząstki o doskonałych właściwościach fotofizycznych, nasycone jasną i stabilną fotoluminescencją oraz wąskimi pasmami emisji. Kropki kwantowe mają kształt kulisty i przy odpowiedniej modyfikacji chemii powierzchni mogą być używane do koniugacji biomolekuł do zastosowań komórkowych. Te właściwości optyczne, w połączeniu ze zdolnością do funkcjonalizacji ich biomolekułami, sprawiają, że są one doskonałym narzędziem do badania interakcji receptor-ligand i transportu komórkowego. W tym miejscu przedstawiamy metodę, która wykorzystuje kropki kwantowe do śledzenia wiązania i endocytozy białka kolca SARS-CoV-2. Protokół ten może być wykorzystany jako przewodnik dla eksperymentatorów, którzy chcą wykorzystać kropki kwantowe do badania interakcji białko-białko i transportu w kontekście fizjologii komórki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia badaczom wgląd w wewnętrzne funkcjonowanie komórki za pomocą specjalistycznych barwników1, genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych2, oraz fluorescencyjnych nanocząstek w postaci kropek kwantowych (QDs)3. W przypadku globalnej pandemii koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej z 2019 r. (SARS-CoV-2) naukowcy zastosowali mikroskopię fluorescencyjną, aby zrozumieć, w jaki sposób wirus oddziałuje z komórką zarówno na błonie komórkowej, jak i w cytoplazmie. Na przykład naukowcom udało się uzyskać wgląd w wiązanie białka kolca SARS-CoV-2 na powierzchni wirionu z ludzkim enzymem konwertującym angiotensynę 2 (hACE2) na powierzchni komórek ludzkich, późniejszą internalizację poprzez fuzję w błonie plazmatycznej i endocytozę kompleksu białkowego Spike:hACE24,5. Uzyskano również doskonałe informacje na temat wydostania się SARS-CoV-2 z komórek przez lizosom przy użyciu obrazowania fluorescencji komórkowej, unikalnej cechy koronawirusów, o której wcześniej sądzono, że zachodzi poprzez tradycyjne pączkowanie pęcherzyków z Golgiego, podobnie jak w przypadku wielu innych wirusów6. Technika mikroskopii fluorescencji komórkowej, będąca podstawą prawie wszystkich aspektów badań biologicznych, z konieczności rozwinęła się pod względem zakresu zastosowań, od obrazowania w superrozdzielczości całych zwierząt po zautomatyzowane obrazowanie wieloparametryczne o wysokiej zawartości do badań przesiewowych leków. W tym przypadku zautomatyzowana mikroskopia konfokalna o wysokiej zawartości jest stosowana do badania wnikania komórek SARS-CoV-2 za pomocą fluorescencyjnych QD sprzężonych z białkiem kolca wirusa.

Analiza obrazów generowanych przez platformy obrazowania biologicznego o wysokiej zawartości pozwala na wydobycie cennych informacji biologicznych w większym stopniu niż pojedyncze parametry, takie jak intensywność całego dołka, które można uzyskać za pomocą multimodalnego czytnika płytek7. Oddzielając obiekty w polu widzenia za pomocą zautomatyzowanych algorytmów segmentacji, każdy obiekt lub populacja obiektów może być analizowana pod kątem parametrów, takich jak intensywność, obszar i tekstura w każdym dostępnym kanale fluorescencyjnym8. Łączenie wielu pomiarów w wielowymiarowe zestawy danych jest użytecznym podejściem do profilowania fenotypowego. Gdy znany jest pożądany fenotyp, taki jak internalizacja QD w postaci puncta, można użyć pomiarów związanych z puncta, takich jak rozmiar, liczba i intensywność, aby ocenić skuteczność leczenia.

Oparte na chmurze oprogramowanie do analizy obrazowania o wysokiej zawartości może obsługiwać szeroką gamę danych wyjściowych instrumentu, w tym platformę obrazowania o wysokiej zawartości. Korzystając z serwera w chmurze do przechowywania obrazów i analizy online, użytkownik może przesyłać swoje dane z urządzenia do obrazowania lub z dysku sieciowego, na którym dane są przechowywane. Część analityczna protokołu jest przeprowadzana w środowisku oprogramowania w chmurze, a dane można eksportować w różnych formatach plików w celu dalszej wizualizacji danych.

Wirus SARS-CoV-2 składa się z niestrukturalnych i strukturalnych białek, które pomagają w jego składaniu i replikacji. Kolec SARS-CoV-2 ma dwie domeny zwane S1 i S2, przy czym S1 zawiera domenę wiążącą receptor odpowiedzialną za interakcje hACE2 na błonie plazmatycznej9. Stwierdzono również, że Spike oddziałuje z innymi cząsteczkami błony komórkowej, które mogą działać jako koreceptory oprócz hACE210,11. W całej sekwencji białka kolca, a szczególnie na granicy faz S1/S2, znajdują się miejsca rozszczepienia proteazy, które umożliwiają fuzję na błonie po transbłonowej proteazie serynowej 2 (TMPRSS2)12. Różne rekombinowane białka kolców SARS-CoV-2 zostały wyprodukowane z indywidualnych domen wiążących receptory, do S1, S2, S1 z S2 i całych trimerów kolców od wielu komercyjnych dostawców do wykorzystania w działalności badawczej13.

W tej pracy powierzchnia QD została funkcjonalizowana za pomocą rekombinowanych trimerów kolców, które zawierają znacznik histydyny (QD-Spike). Płyty QD produkowane przez Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section zawierają rdzeń z selenku kadmu i powłokę z siarczku14,15. na powierzchni QD koordynuje reszty histydyny w rekombinowanym białku, tworząc funkcjonalizowany QD, który przypomina pod względem formy i funkcji cząsteczkę wirusa SARS-CoV-2. Wytwarzanie nanocząstek i koniugacja białek zostały wcześniej opisane przy użyciu domeny wiążącej receptor sprzężony z QD15. Metoda ta opisuje preparaty do hodowli komórkowych, leczenie QD, akwizycję obrazu i protokół analizy danych, który może pomóc badaczowi w badaniu aktywności kolca SARS-CoV-2 w fizjologicznym kontekście komórki ludzkiej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HEK293T linia komórkowa użyta w tym badaniu to nieśmiertelnie unieśmiertelniona linia komórkowa. W badaniu tym nie wykorzystano żadnych uczestników ani badań, ani ludzi.

1. Hodowla i wysiew komórek

  1. Wewnątrz sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego, ubrany w środki ochrony osobistej (w tym rękawice laboratoryjne, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne), przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych, uzupełniając zmodyfikowaną pożywkę Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliną/streptomycyną (P / S) i 250 μg / ml G418.
    1. Na 500 ml pożywki dodaj 443,75 ml DMEM, 50 ml FBS, 5 ml P / S i 1,25 ml G418.
    2. Przefiltrować przez kolbę filtracyjną 0,2 μm i zachować sterylność, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego.
  2. Wewnątrz sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego wysiew wewnętrzne 60 dołków czarnej, przezroczystej, pokrytej poli-D-lizyną 96-dołkowej płytki z 20 000 komórek w 100 μl na studzienkę pożywki do hodowli komórkowych. Napełnij zewnętrzne 36 studzienek 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na studzienkę.
    1. Aby policzyć komórki, dodaj 2 μl oranżu akrydynowego i barwienia jodkiem propidyny do 18 μl zawiesiny komórek.
    2. Załadować 10 μl tego roztworu po jednej stronie szkiełka do liczenia komórek.
    3. Powtórz kroki 1.2.1 i 1.2.2, aby załadować obie strony szkiełka.
    4. Umieść szkiełko w automatycznym liczniku komórek.
    5. Wybierz protokół zliczania fluorescencji i naciśnij Zlicz. Policz obie strony szkiełka i oblicz średnią z dwóch gęstości żywych komórek.
    6. Aby obliczyć wymaganą objętość zawiesiny komórek, podziel całkowitą liczbę potrzebnych komórek przez średnią gęstość komórek.
  3. Sprawdź dołki po wysianiu pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że osiągnięto odpowiednią gęstość i dystrybucję.
  4. Inkubować płytkę przez noc w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

2. Leczenie komórek za pomocą QD-Spike

  1. Przygotować 0,1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) przez rozcieńczenie w pożywce do obrazowania.
    1. W przypadku 10 ml podłoża do obrazowania dodaj 130 μl 7,5% BSA i wymieszaj.
  2. W 12-dołkowym zbiorniku lub płytce testowej rozcieńczyć materiał 440 nM QD-Spike (SARS-CoV-2, izolat USA-WA1/2020) do 20 nM przy użyciu 0,1% BSA w pożywce do obrazowania.
    1. Dla 1 dołka QD-Spike dodaj 2,27 μl 440 nM QD-Spike do 47,73 μl 0,1% pożywki obrazowej BSA, aby uzyskać końcowe stężenie 20 nM.
    2. Aby wygenerować sześciopunktowe seryjne rozcieńczenie 1:3 (w trzech powtórzeniach), dodaj 14,26 μl QD-Spike do 285,74 μl 0,1% pożywki obrazowej BSA, aby uzyskać najwyższe stężenie 20 nM. Dodać 100 μl 20 nM QD-Spike do 200 μL 0,1% pożywki BSA, aby uzyskać drugie rozcieńczenie 6,67 nM QD-Spike. Powtórz cztery razy, aby wygenerować sześć punktów koncentracji.
  3. Za pomocą aspiratora wielokanałowego usuń wszystkie zużyte media z każdej studzienki. Za pomocą pipety wielokanałowej przemyć raz pożywką do obrazowania (100 μl/studzienkę).
  4. Odessać 100 μl podłoża obrazowego i dodać z powrotem 50 μl/studzienkę roztworu QD-Peak.
  5. Inkubować płytkę przez 3 godziny w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Przejdź do kroku 4.

3. Utrwalanie i barwienie jąder

  1. Wewnątrz sterylnej szafki bezpieczeństwa biologicznego, ubrany w środki ochrony osobistej (w tym rękawice laboratoryjne, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne), przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1% pożywce do obrazowania BSA.
  2. Odessać 50 μl QD-Spike z każdej studzienki i dodać 100 μl/studzienkę 4% PFA.
    1. Nie pozwól, aby studzienki wyschły. Użyj automatycznej pipety wielokanałowej, aby uniknąć wysuszenia studzienek (zalecane).
  3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Przemyć trzykrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  5. Przygotować ciemnoczerwony barwnik jądrowy, rozcieńczając 5 mM roztwór podstawowy do rozcieńczenia 1:1000 w PBS.
  6. Odessać PBS i dodać z powrotem 50 μl/studzienkę rozcieńczonego barwnika jądrowego.
  7. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Umyj trzy razy PBS.
  9. Zobrazuj płytkę lub uszczelkę za pomocą uszczelniacza do płyt w celu zobrazowania w późniejszym terminie. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C. Fluorescencja powinna być stabilna przez kilka tygodni lub dłużej.

4. Konfiguracja akwizycji i obrazowanie

  1. Uruchom oprogramowanie platformy do obrazowania. Włącz platformę obrazowania o wysokiej zawartości, a kontrolka na pasku stanu powinna się zaświecić. Jeśli maszyna nie jest podłączona, oprogramowanie przejdzie w tryb analizy offline.
  2. Zaloguj się do platformy obrazowania.
  3. Utwórz nowy protokół pozyskiwania.
    1. Wybierz typ płytki jako 96-dołkową przezroczystą dolną płytkę obrazową.
      UWAGA: Wybór płyt w instrumencie może się różnić i można go dostosować, wczytując prawidłowe definicje płyt, które obejmują wymiary płyty, takie jak wysokość, szerokość i inne odległości, w celu zdefiniowania odstępów między studniami i punktów ogniskowych.
    2. Wybierz tryb optyczny jako konfokalny i powiększenie jako 40-krotne zanurzenie w wodzie.
    3. Wybierz opcję Binning jako 1.
    4. Wybierz kanały i długości fal wzbudzenia/emisji fluorescencji zgodnie z opisem w krokach 4.3.5-4.3.8. Zrób migawkę po wybraniu ustawień, aby wyświetlić obraz i upewnij się, że ustawienia są odpowiednie.
      UWAGA: Cyfrowy kontrast fazowy (DPC) umożliwia wizualizację żywych komórek bez barwienia komórek lub barwnika fluorescencyjnego. Nie jest zalecany do ogniw stałych.
    5. Wybierz tryb DPC, taki jak Wysoki kontrast, aby uzyskać dobrze zdefiniowane ciała komórek. Wykonaj migawkę, aby potwierdzić, że to ustawienie jest odpowiednie, jak pokazano w oknie obrazu.
    6. Wybierz kanał FITC do użytku z linią komórkową ACE2-GFP, która umożliwia wizualizację transportu ACE2 w komórce.
    7. Aby utworzyć niestandardowy kanał dla kanału QD, wybierz trójkątne menu rozwijane dla kanału i wybierz wzbudzenie w zakresie 405 nm i emisję w zakresie 608 nm.
    8. Jeśli komórki były unieruchomione i użyto ciemnoczerwonego barwnika jądrowego, wybierz kanał dalekiej czerwieni o emisji większej niż 630 nm, aby dalej nakreślić ciało komórki i działać jako maska komórkowa.
    9. Wybierz studzienkę z silnym cytoplazmatycznym sygnałem QD, aby ustawić czas ekspozycji, moc lasera i pozycję wysokości Z. Postępuj zgodnie z krokami z 4.3.10-4.3.13.
    10. Sprawdź, czy domyślna wysokość tworzy obraz, w którym komórki znajdują się w żądanej płaszczyźnie ogniskowej. Jeśli endocytozowane puncta są organellą docelową, pozycja Z będzie niższa niż w przypadku, gdy błona plazmatyczna jest organellą docelową.
    11. Wybierz czas naświetlania, który daje jasny obraz z poziomami szarości co najmniej trzykrotnie większymi niż sygnał tła. Zwykle jest to od 100 do 300 ms. Przy 20 nm poziomy szarości powinny wynosić około 6000 j.m. przy czasie naświetlania 200 ms i mocy lasera 80%.
    12. Sprawdź poziomy szarości, klikając prawym przyciskiem myszy obraz utworzony za pomocą funkcji migawki w każdym kanale i wybierając opcję Pokaż intensywność. Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy interesujący Cię obiekt lub tło, aby wyświetlić poziom szarości dla tego piksela.
    13. Dostosuj moc lasera, aby precyzyjnie dostroić intensywność interesujących Cię obiektów.
  4. Zapisz protokół nabycia.
  5. Przełącz się na pozycję Uruchom eksperyment i wprowadź nazwę tabliczki.
  6. Uruchom eksperyment.

5. Analiza danych

  1. Zaimportuj dane do oprogramowania do obrazowania.
    1. Po uzyskaniu wszystkich obrazów wyeksportuj pomiary do oprogramowania do obrazowania. Wymaga to ustanowienia serwera i utworzenia konta. Utwórz ekran dla danych, które mają zostać wyeksportowane do oprogramowania do obrazowania.
  2. W oprogramowaniu do obrazowania wybierz opcję Image Analysis (Analiza obrazu), aby rozpocząć tworzenie protokołu analizy.
  3. Załaduj pomiary z eksperymentu obrazowania, klikając prawym przyciskiem myszy plik na liście ekranów i klikając Wybierz. Mapa tablicowa zobrazowanych studni i powiązanych z nimi pól powinna być widoczna w lewym dolnym rogu okna.
  4. Wybierz studzienkę z jasnymi cytoplazmatycznymi plamkami QD, aby rozpocząć segmentację obrazu.
  5. W bloku konstrukcyjnym obrazu wejściowego wybierz opcję Korekcja płaskiego pola.
  6. Dodaj następny blok konstrukcyjny do protokołu, wybierając pozycję Znajdź jądra.
    1. Tutaj użyj DPC lub kanału dalekiej czerwieni jako znacznika jąder.
    2. Najpierw wybierz metodę, która dokładnie segmentuje obiekty, a następnie dostosuj segmentację za pomocą menu rozwijanego i dostosowując suwaki.
      UWAGA: Dobra segmentacja dokładnie definiuje obszar zainteresowania (ROI) dla jądra, komórki i plamek. Tylko te piksele, które są dodatnie dla znacznika, powinny być przechwytywane w ramach indywidualnego ROI. Sygnał tła powinien być wykluczony. Jeśli tło zostanie uchwycone w ROI, czułość metody może zostać zmniejszona lub próg intensywności może zostać zwiększony, aby zwiększyć rygorystyczność algorytmu segmentacji. Dotyczy to wszystkich bloków konstrukcyjnych Znajdź.
  7. Następnie dodaj blok konstrukcyjny Znajdź cytoplazmę, aby zidentyfikować cytoplazmę.
    1. W takim przypadku należy użyć kanału ACE2-GFP do segmentacji cytoplazmatycznej.
    2. Wybierz metodę, która najlepiej identyfikuje cytoplazmę każdej komórki.
  8. Następnie dodaj blok konstrukcyjny Znajdź miejsca, aby zidentyfikować puncta QD-Spike.
    1. Wybierz jądra jako populację ROI.
    2. Wybierz komórkę jako region ROI. Spowoduje to uchwycenie puncta w całej komórce.
    3. Wybierz metodę, która najlepiej identyfikuje punkt odstępu czasu w każdej komórce.
  9. Gdy wszystkie obiekty na obrazie zostaną podzielone na segmenty i dokładnie zidentyfikowane w tym dołku, wybierz inne studnie, aby upewnić się, że bloki konstrukcyjne i ustawienia można ogólnie zastosować do innych studni i innych warunków.
  10. Dodaj właściwości Oblicz intensywność dla wszystkich podzielonych na segmenty obiektów (jąder, cytoplazmy/komórek i plamek).
  11. Dodaj Oblicz właściwości morfologii dla wszystkich segmentowanych obiektów (jąder, cytoplazmy/komórek i plamek).
  12. Dodaj opcję Oblicz właściwości tekstury dla wszystkich podzielonych na segmenty obiektów (jąder, cytoplazmy/komórek i plamek).
  13. Zdefiniuj wyniki, wybierając parametry dla każdej populacji, w tym jądra i plamki. Liczba obiektów może być używana jako pośrednia miara żywotności komórek.

6. Eksport danych

  1. Kliknij pozycję Batch analysis. Poczekaj na zakończenie analizy, zanim przejdziesz do następnego kroku (krok 6.2).
    UWAGA: Analiza wsadowa umożliwia serwerowi oprogramowania do analizy obrazu załadowanie protokołu analizy przy użyciu wybranych pomiarów w celu zdalnej analizy danych.
  2. Wyeksportuj zestaw danych na komputer lokalny lub dysk sieciowy.
    1. Połącz oprogramowanie do analizy obrazu z aplikacją pomocniczą na komputerze, pobierając i otwierając plik połączenia.
    2. Wybierz typ pliku wyników (.txt, .csv, .html lub Natywny XML).
    3. Wybierz ustawienia folderu plików za pomocą menu rozwijanego.

7. Analizuj dane w arkuszu kalkulacyjnym

  1. Otwórz wyeksportowany plik. Jeśli jest to plik .csv, zapisz go w formacie pliku .xls, aby umożliwić korzystanie z tabel przestawnych. Jeśli ścieżka do pliku jest zbyt długa, zapisz plik .xls wyżej w hierarchii folderów, aby uniknąć błędów podczas zapisywania.
  2. Dodaj kolumny do arkusza kalkulacyjnego, które wyznaczają warunki dla każdej studni. Na przykład typ komórki, warianty QD-Spike, stężenia QD-Spike, czas inkubacji itp.
  3. Wybierz funkcję Tabela przestawna i zbuduj tabelę, używając dodanych warunków jako wierszy i zmierzonych parametrów jako kolumn. Wybierz obliczenie dla każdego parametru, tj. Średnia, Odchylenie standardowe, Mediana, Min., Maksimum lub Liczba.
  4. Znormalizuj dane, aby kontrolować próbki, w tym niesprzężone QD jako 0% i najwyższe stężenie QD-Spike jako 100%.
    UWAGA: W przypadku oceny skuteczności inhibitorów, takich jak przeciwciała neutralizujące, należy znormalizować dane do komórek leczonych tylko pożywką (100% skuteczności) i QD-Spike bez inhibitora (0% skuteczności).
  5. Wykreśl dane w oprogramowaniu do tworzenia wykresów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po leczeniu, QD zostaną zinternalizowane, ponieważ nanocząstka zwiąże się z ACE2 na błonie plazmatycznej i wywoła endocytozę. Korzystając z linii komórkowej eksprymującej ACE2-GFP, translokację zarówno QD, jak i ACE2 można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Po internalizacji dwa sygnały QD i ACE2 wykazują silną kolokalizację. Na podstawie tych obrazów można przeprowadzić segmentację obrazu i późniejszą analizę w celu wyodrębnienia odpowiednich parametrów, takich jak liczba punktów (Rys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda opisana w tym artykule zapewnia niezbędne kroki do obrazowania funkcjonalizowanych QD w komórkach ludzkich przy użyciu wysokoprzepustowej mikroskopii konfokalnej. Metoda ta najlepiej nadaje się do komórek, w których główną drogą wnikania wirusa jest endocytoza, a nie aktywność TMPRSS2 i fuzja błonowa, ponieważ umożliwia badanie kolca SARS-CoV-2 i endocytozy hACE2. Ze względu na charakter modelu QD i C-końcowego znacznika Hisa na dostępnym na rynku trymerze Spike, każde TMPRSS2 rozszczepienie domen Spike S1 i S2 po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez Intramural Research Program of the National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Laboratorium Badawcze Marynarki Wojennej zapewniło finansowanie za pośrednictwem swojego wewnętrznego Instytutu Nanonauki. Przygotowanie odczynnika zostało wsparte za pośrednictwem funduszu podstawowego NRL COVID-19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
32% ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Nauki15714Służy do utrwalania komórek po leczeniu kropkami kwantowymi, stężenie końcowe 3,2%
Służy do stabilizacji QD w Optimem I i zapobiegania interakcjom niespecyficznym, stężenie końcowe 0,1%
7,5% Albumina surowicy bydlęcejGibco15260-037Stosowany jako barwnik żywotności komórek do fluorescencyjnego zliczania komórek
Barwnik pomarańczy akrydynowej / jodku propidynyLogos BiosystemsF23001Płytki mikrodołkowe używane do wysiewu komórek i oznaczania QD-Spike
przezroczysta 96-dobrze pokryta płytka pokryta poli-D-lizynąGreiner655946Służy do wspomagania hodowli komórek, suplement DMEM
Charakterystyka płodowej surowicy bydlęcejCytiva/HyCloneSH30071.03Oparte na chmurze oprogramowanie do analizy obrazu o wysokiej zawartości; V2.9.1
Columbus AnalyzerPerkin ElmerNASłuży do znakowania jąder komórkowych i ciał komórkowych po utrwaleniu, ciemnoczerwony barwnik jądrowy
DRAQ5 (5 mM)ThermoFisher Scientific62252bazowe do hodowli komórek
HEK293T Minimal Essential Podłoża Dulbecco, D-glukoza (4,5 g / L), L-glutamina, pirogronian sodu (110 mg / L), czerwień fenolowaGibco11995-065Służy do porządkowania danych po eksporcie z Columbus; V2110 Microsoft 365
ExcelMicrosoftNASłuży do kontynuacji selekcji komórek dodatnich hACE2-GFP, suplement DMEM
G418InvivoGenant-gn-5Ludzka linia komórek nerki z zarodkowym wyrazem stabilnej ekspresji ludzki enzym konwertujący angiotensynę 2 oznaczony GFP
HEK293T hACE2-GFPCodex BiosolutionsCB-97100-203Automatyczny licznik komórek
Luna Automatyczny licznik komórekLogos BiosystemsNAUżywany do fluorescencyjnego liczenia komórek
Luna Szkiełka do liczenia komórek LogosBiosystemsL12001Platforma obrazowania o wysokiej zawartości
Opera PhenixPerkin ElmerNAPożywka do obrazowania, używana do inkubacji komórek z kropkami kwantowymi
Opti-MEM I Zredukowana surowicaGibco11058-021Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez wapnia i magnezu stosowana do mycia komórek podczas pasażowania i oznaczania
PBS -/-Gibco10010-023Stosowany w celu zapobiegania bakteryjnemu zanieczyszczeniu hodowli komórkowej, suplement DMEM
Penicylina StreptomycynaGibco15140-122Używany do tworzenia wykresów, wizualizacji danych i analizy statystycznej; V9.1.0
PrismGraphPadNASłuży do oznaczania wiązania kolca SARS-Cov-2 z hACE2 i monitorowania endocytozy Spike
Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)wykonany na zamówienie przez Laboratorium Badawcze Marynarki WojennejUżywany do hamowania wiązania kolca SARS-Cov-2 z hACE2
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Przeciwciało neutralizujące kolce, mysz MabSino Biological40592-MM57Służy do dysocjacji komórek z kolby podczas pasażowania
TrypLE ExpressGibco12605-010
Podłoża

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571(2011).
  2. Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
  3. Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
  4. Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390(2020).
  5. Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
  6. Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
  7. Buchser, W., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. (2012).
  8. Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
  9. Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
  10. Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462(2020).
  11. Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80(2020).
  12. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  13. Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), New York, N.Y. 1586-1592 (2020).
  14. Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
  15. Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
  16. Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
  17. Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
  18. Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie kropkami kwantowymimikroskopia konfokalnawysokoprzepustowe przesiewanieendocytoza bia ka Spikekonjugacja bia ekmikroskopia fluorescencyjnawi zanie receptoroweprzeciwcia a neutralizuj ce

Powiązane artykuły