Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zwiększony odzysk oleju dzięki połączeniu biosurfaktantów

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63207

⸱

3 czerwca 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology Delhi, 2Indian Oil Corporation, Research and Development Faridabad

W tym artykule

Podsumowanie

Ilustrujemy metody związane z badaniem przesiewowym i identyfikacją mikrobów wytwarzających biosurfaktanty. Przedstawiono również metody charakterystyki chromatograficznej i identyfikacji chemicznej biosurfaktantów, określające przemysłowe zastosowanie biosurfaktantu w zwiększaniu odzysku oleju resztkowego.

Streszczenie

Biosurfaktanty to związki powierzchniowo czynne zdolne do zmniejszania napięcia powierzchniowego między dwiema fazami o różnych polarnościach. Biosurfaktanty stają się obiecującą alternatywą dla chemicznych środków powierzchniowo czynnych ze względu na mniejszą toksyczność, wysoką biodegradowalność, kompatybilność środowiskową i tolerancję na ekstremalne warunki środowiskowe. W tym miejscu ilustrujemy metody stosowane do badań przesiewowych drobnoustrojów zdolnych do produkcji biosurfaktantów. Mikroorganizmy wytwarzające biosurfaktanty zidentyfikowano za pomocą testów zapadania się kropli, rozprowadzania oleju i indeksu emulsji. Produkcja biosurfaktantów została zwalidowana poprzez określenie zmniejszenia napięcia powierzchniowego pożywki w wyniku wzrostu członków mikrobiologicznych. Opisano również metody związane z charakteryzacją i identyfikacją biosurfaktantów. Przeprowadzono chromatografię cienkowarstwową wyekstrahowanego biosurfaktantu, a następnie barwienie różnicowe płytek w celu określenia charakteru biosurfaktantu. LCMS, 1H NMR i FT-IR wykorzystano do chemicznej identyfikacji biosurfaktantu. Dalej ilustrujemy metody oceny zastosowania kombinacji wytworzonych biosurfaktantów w celu zwiększenia odzysku oleju resztkowego w symulowanej kolumnie z piaskiem.

Wprowadzenie

Biosurfaktanty to amfipatyczne cząsteczki powierzchniowo czynne produkowane przez mikroorganizmy, które mają zdolność do obniżania napięcia powierzchniowego oraz napięcia międzyfazowego pomiędzy dwiema fazami.1Typowy biosurfaktant zawiera część hydrofilową, która zazwyczaj składa się z reszty cukrowej, łańcucha peptydowego lub hydrofilowego aminokwasu, oraz część hydrofobową, utworzoną z nasyconego lub nienasyconego łańcucha kwasu tłuszczowego.2Ze względu na swój amfipatyczny charakter biosurfaktanty gromadzą się na granicy między dwiema fazami i obniżają napięcie międzyfazowe na tej granicy, co ułatwia dyspersję jednej fazy w drugiej.1,3Do różnych typów biosurfaktantów opisanych do tej pory należą glikolipidy, w których węglowodany są połączone z długołańcuchowymi kwasami alifatycznymi lub hydroksyalkilowymi. poprzez wiązania estrowe (np. ramnolipidy, trehalolipidy i sophorolipidy), lipopeptydy, w których lipidy są przyłączone do łańcuchów polipeptydowych (np. surfaktyna i lichenizyna) oraz polimerowe biosurfaktanty, które zazwyczaj składają się z kompleksów polisacharydowo-białkowych (np. emulsan, liposan, alasan i lipomannan)4Inne rodzaje biosurfaktantów produkowane przez mikroorganizmy obejmują kwasy tłuszczowe, fosfolipidy, lipidy obojętne oraz biosurfaktanty cząsteczkowe5Najlepiej przebadaną klasą biosurfaktantów są glikolipidy, a wśród nich większość badań dotyczyła ramnolipidów.6Rhamnolipidy składają się z jednej lub dwóch cząsteczek ramnozy (tworzących część hydrofilową) połączonych z jedną lub dwiema cząsteczkami długołańcuchowego kwasu tłuszczowego (zazwyczaj kwasu hydroksydekanowego). Rhamnolipidy są pierwotnymi glikolipidami, o których po raz pierwszy poinformowano w odniesieniu do Pseudomonas aeruginosa7.

Biosurfaktanty zyskują coraz większą uwagę w porównaniu do ich chemicznych odpowiedników ze względu na oferowane przez nie liczne unikalne i charakterystyczne właściwości8. Należą do nich wyższa swoistość, niższa toksyczność, większa różnorodność, łatwość przygotowania, wyższa biodegradowalność, lepsze pienienie, kompatybilność środowiskowa oraz aktywność w ekstremalnych warunkach9. Różnorodność strukturalna biosurfaktantów (Rycina S1) stanowi kolejną zaletę, która daje im przewagę nad odpowiednikami chemicznymi10. Są one zazwyczaj bardziej skuteczne i efektywne przy niższych stężeniach, ponieważ ich krytyczne stężenie micelarne (CMC) jest zazwyczaj o kilka razy niższe niż w przypadku surfaktantów chemicznych11. Wykazano, że są one wysoce termostabilne (do 100 °C) i tolerują wyższe pH (do 9) oraz wysokie stężenia soli (do 50 g/L)12, co zapewnia im szereg zalet w procesach przemysłowych wymagających ekspozycji na ekstremalne warunki13. Biodegradowalność i niższa toksyczność sprawiają, że nadają się one do zastosowań środowiskowych, takich jak bioremediacja. Ze względu na oferowane zalety, przyciągają one coraz większą uwagę w różnych gałęziach przemysłu, m.in. spożywczym, rolniczym, detergentowym, kosmetycznym i naftowym11. Biosurfaktanty zyskały również duże uznanie w remediacji olejowej w celu usuwania zanieczyszczeń naftowych i toksycznych substancji zanieczyszczających14.

W niniejszej pracy przedstawiamy produkcję, charakterystykę oraz zastosowanie biosurfaktantów wytwarzanych przez Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 oraz Paenibacillus sp. IITD108. Etapy związane z przesiewaniem, charakterystyką oraz zastosowaniem kombinacji biosurfaktantów w celu zwiększenia odzysku ropy naftowej przedstawiono na Rysunku 1.

Schemat ekstrakcji i charakterystyki biosurfaktantów; metody chromatograficzne, LCMS, NMR, FT-IR.
Rysunek 1: Metoda zwiększonego odzysku ropy naftowej z wykorzystaniem kombinacji biosurfaktantów. Przedstawiono etapowy przebieg prac. Badania przeprowadzono w czterech krokach. W pierwszej kolejności szczepy drobnoustrojów hodowano i przesiewano pod kątem produkcji biosurfaktantów za pomocą różnych testów, które obejmowały test rozlewności kropli (drop collapse assay), test rozprzestrzeniania oleju, test indeksu emulsyjnego oraz pomiar napięcia powierzchniowego. Następnie biosurfaktanty wyekstrahowano z bezkomórkowego bulionu i określono ich naturę za pomocą cienkowarstwowej chromatografii, a następnie poddano dalszej identyfikacji przy użyciu LCMS, NMR oraz FT-IR. W kolejnym kroku wyekstrahowane biosurfaktanty zmieszano, a potencjał otrzymanej mieszaniny w zakresie zwiększonego odzysku ropy naftowej określono za pomocą techniki kolumny z pakowanym piaskiem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przesiewowe badanie tych szczepów drobnoustrojów pod kątem produkcji biosurfaktantów przeprowadzono za pomocą testu zapadania się kropli, testu rozprzestrzeniania oleju, oznaczenia indeksu emulsyjnego oraz wyznaczenia stopnia obniżenia napięcia powierzchniowego pożywki wolnej od komórek w wyniku wzrostu drobnoustrojów. Biosurfaktanty wyekstrahowano, scharakteryzowano i zidentyfikowano chemicznie za pomocą LCMS, 1H NMR oraz FT-IR. Na koniec przygotowano mieszaninę biosurfaktantów produkowanych przez te mikroorganizmy i wykorzystano ją do odzyskania pozostałego oleju w symulowanej kolumnie z pakietem piasku.

Niniejsza praca przedstawia jedynie metody związane z przesiewaniem, identyfikacją, charakterystyką strukturalną oraz zastosowaniem kombinacji biosurfaktantów w celu zwiększenia odzysku pozostałej ropy naftowej. Nie zawiera ona szczegółowej charakterystyki funkcjonalnej biosurfaktantów produkowanych przez szczepy drobnoustrojów15,16. W celu szczegółowej charakterystyki funkcjonalnej dowolnego biosurfaktantu przeprowadza się różne eksperymenty, takie jak wyznaczanie stężenia krytycznego miceli, analiza termograwimetryczna, badanie zwilżalności powierzchni oraz biodegradowalności. Jednakże, ponieważ niniejsza publikacja jest artykułem metodycznym, skupia się ona na przesiewaniu, identyfikacji, charakterystyce strukturalnej i zastosowaniu kombinacji biosurfaktantów w zwiększaniu odzysku pozostałej ropy naftowej; wspomniane eksperymenty nie zostały uwzględnione w niniejszym badaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla szczepów drobnoustrojów

  1. Odważyć 2 g proszku Luria Broth i dodać do 50 mL wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 mL. Mieszać zawartość do całkowitego rozpuszczenia proszku, a następnie uzupełnić objętość do 100 mL wodą destylowaną.
  2. W podobny sposób przygotować dwie kolejne kolby zawierające po 100 mL Luria Broth i zamknąć szyjki kolb watowymi czopami.
  3. Przykryć watowe czopy folią aluminiową i autoklawować kolby przez 15 min w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 15 psi, aby wysterylizować podłoże.
  4. Po autoklawowaniu pozostawić podłoże do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
  5. W celu przygotowania kultury pierwotnej szczepu, pobrać pojedynczą kolonię z płytki LA za pomocą pętli szczepiącej i zaszczepić do probówki zawierającej 5 mL sterylnego Luria broth.
  6. Inkubować probówkę przez noc w temperaturze 30 °C przy 180 rpm.
  7. Zaszczepić kolby zawierające 100 mL autoklawowanego Luria Broth, dodając 1 mL nocnie wyhodowanych kultur startowych do kolb wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.
  8. Inkubować kolby w inkubatorze obrotowym w temperaturze 30 °C i przy 180 rpm przez 7 dni.
  9. Po zakończeniu okresu inkubacji zebrać zawartość kolb i przenieść bulion hodowlany do probówek do wirowania. Wirować kulturę z prędkością 4,500 x g przez 20 min w wirówce chłodzącej w temperaturze 4 °C.
  10. Ostrożnie przelać wolny od komórek nadsącz do czystego zlewki i wykorzystać go w testach przesiewowych produkcji biosurfaktantów.

2. Testy przesiewowe w celu wykrycia produkcji biosurfaktantów

UWAGA: W poniższych sekcjach komercyjny surfaktant (Saponina) został użyty jako kontrola pozytywna, natomiast woda i niezaszczepione podłoża posłużyły jako kontrola negatywna.

  1. Test zapadania kropli
    1. Należy wziąć czyste szkiełko przedmiotowe i pokryć jego powierzchnię 200 µL oleju.
    2. Do środka warstwy oleju należy dodać 20 µL supernatantu pozbawionego komórek i pozostawić go w spokoju na 2-3 min.
      UWAGA: Jeśli kropla zapadnie się, supernatant uznaje się za pozytywny pod kątem obecności biosurfaktantu.
  2. Test rozprzestrzeniania oleju
    1. Do szalki Petriego (średnica 75 mm) należy nalać 20 mL wody dwukrotnie destylowanej i dodać 200 µL ropy naftowej na powierzchnię wody.
    2. Do środka plamy oleju należy dodać 20 µL supernatantu pozbawionego komórek i pozostawić go w spokoju na 1 min.
      UWAGA: Jeśli w wyniku przemieszczenia oleju utworzy się strefa przejaśnienia, supernatant uznaje się za pozytywny pod kątem obecności biosurfaktantu.
  3. Test indeksu emulsyfikacji (test E24)
    1. Do czystej szklanej probówki należy dodać po 4 mL benzyny oraz supernatantu pozbawionego komórek.
    2. Mieszaninę należy intensywnie wortexować przez 3 min, a następnie pozostawić w spokoju na kolejne 24 h.
    3. Po 24 h należy wyznaczyć indeks E24 jako procentową wysokość warstwy zemulgowanej (cm) w stosunku do wysokości całej kolumny cieczy (cm).
      Równanie indeksu emulsyfikacji do pomiaru stabilności emulsji; wzór: (Wysokość emulsji/Wysokość całkowita)×100.
      UWAGA: Jeśli po 24 h zaobserwowano emulsję (olej w wodzie lub woda w oleju), supernatant prawdopodobnie zawiera biosurfaktant.
  4. Pomiar napięcia powierzchniowego
    UWAGA: Napięcie powierzchniowe mierzono metodą pierścienia Du Noüya17. Przyrząd użyty w tym eksperymencie (patrz Tabela materiałów) jest bardzo czuły, dlatego należy zapewnić odpowiednie oczyszczenie naczynia szklanego i sondy.
    1. Należy włączyć system i dwukrotnie kliknąć w powiązaną aplikację, aby ją otworzyć.
    2. Naczynie szklane należy wypłukać cieczą, której napięcie powierzchniowe ma zostać określone.
    3. Do naczynia należy nalać ciecz (40 mL) i zamocować naczynie w uchwycie.
    4. Należy odblokować uchwyt sondy i zamontować w nim sondę. Następnie należy zablokować uchwyt sondy, naciskając przycisk Lock na kontrolerze ręcznym.
    5. Za pomocą kontrolera ręcznego należy wyregulować wysokość platformy tak, aby sonda znajdowała się około 2-3 mm od powierzchni cieczy.
    6. Następnie należy użyć oprogramowania do pomiaru napięcia powierzchniowego. Należy kliknąć w zakładkę File znajdującą się w lewym górnym panelu ekranu. Następnie kliknąć Open Workspace. Pojawi się okno pop-up.
    7. Należy przewinąć listę w dół i dwukrotnie kliknąć ikonę K100: Surface and Interfacial Tension.
    8. Następnie należy kliknąć ikonę File w lewym górnym rogu ekranu. Kliknąć New Database. Należy wprowadzić nazwę do zapisu danych i kliknąć OK.
    9. Ponownie należy kliknąć File > New Measurement > SFT > Ring. Należy wprowadzić nazwę pomiaru. Należy upewnić się, że szablon konfiguracji wskazuje SFT ring.
    10. W oknie Measurement Configuration należy uzupełnić szczegóły, wybierając sondę i naczynie używane do pomiaru. Należy również wprowadzić dane dotyczące cieczy i fazy gazowej.
      UWAGA: Fazą ciekłą będzie woda, a fazą gazową powietrze. Gęstością fazy ciekłej jest gęstość supernatantu pozbawionego komórek. Można ją wyznaczyć, ważąc 50 mL cieczy i obliczając gęstość w kg/m3.
    11. Następnie należy kliknąć kartę Procedure i wprowadzić następujące dane: Detection Speed: 6 mm/min, Detection Sensitivity: 0.005 g, Search Speed: 6 mm/min, Search Sensitivity: 0.005 g, Measuring Speed: 3 mm/min, Measuring Sensitivity: 0.001 g, Immersion Depth: 3 mm, Return Distance: 10%, korekcja: Harkins & Jordan, wartości maksymalne: 5. Kliknąć OK.
    12. W oknie pop-up należy wybrać bazę danych do przechowywania wyników i kliknąć OK.
      UWAGA: W tym miejscu można utworzyć nową bazę danych lub dodać nowe pomiary do istniejących danych.
    13. Następnie należy kliknąć przycisk Play znajdujący się w górnej środkowej części ekranu. System rozpocznie wykonywanie skryptu. Po ustabilizowaniu się system wykryje powierzchnię. Należy zanurzyć sondę w cieczy, przesuwać ją w przód i w tył oraz zmierzyć napięcie w utworzonej lamelce.
    14. Aby uzyskać wyniki, należy kliknąć ikonę Measurement pośrodku lewej strony ekranu. Kliknąć Data i zapisać wyznaczoną wartość napięcia powierzchniowego.
    15. Po zakończeniu pomiaru należy obniżyć platformę, a następnie odblokować i zdemontować sondę oraz naczynie z przyrządu.
      UWAGA: Aby określić spadek napięcia powierzchniowego spowodowany produkcją biosurfaktantu, jako kontrolę należy zastosować niezaszczepione podłoże LB.

3. Ekstrakcja biosurfaktantu

  1. Dostosować pH nadsączu wolnego od komórek do wartości 2, używając 2 N HCl. Przechowywać mieszaninę w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Dodać do nadsączu równą objętość mieszaniny chloroformu i metanolu (2:1) i energicznie mieszać przez 20 min.
  3. Pozostawić mieszaninę w spokoju do czasu rozwarstwienia faz.
  4. Usunąć górną fazę zawierającą wodę i metanol, a dolną fazę zawierającą biosurfaktant pozostawić do odparowania w dygestorium.
  5. Po odparowaniu fazy organicznej, rozpuścić ponownie miodowo-kolorowy surowy biosurfaktant w 3 mL chloroformu i wykorzystać tę mieszaninę do dalszej identyfikacji i charakterystyki biosurfaktantu.

4. Badania stabilności emulsji

  1. Stabilność emulsji w różnych temperaturach
    1. Odmierzyć 5 mL nadnadkładów bezkomórkowych do oddzielnych probówek.
    2. Do każdej probówki dodać 5 mL benzyny i wymieszać intensywnie w wstrząsarku typu vortex przez 3 min.
    3. Inkubować probówki przez noc w różnych łaźniach wodnych w różnych temperaturach (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C i 70 °C).
    4. Po 24 h określić indeksy emulsyfikacji zgodnie z wcześniejszym opisem.
  2. Stabilność emulsji przy różnych wartościach pH
    1. Odmierzyć 5 mL nadnadkładu bezkomórkowego do czystych probówek.
    2. Dostosować pH nadnadkładów bezkomórkowych (2, 4, 6, 8 i 10) za pomocą 1 N HCl i 1 N NaOH.
    3. Do probówek dodać taką samą ilość benzyny i wymieszać intensywnie w wstrząsarku typu vortex przez 3 min.
    4. Pozostawić probówki w spokoju w temperaturze pokojowej na 24 h.
    5. Określić indeks emulsyfikacji zgodnie z wcześniejszym opisem.
  3. Stabilność emulsji przy różnych stężeniach soli
    1. Odmierzyć 5 mL nadnadkładu bezkomórkowego do czystych probówek.
    2. Do nadnadkładów dodać różne ilości soli (NaCl) (0 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 60 g/L i 80 g/L).
    3. Rozpuścić sole w nadnadkładach bezkomórkowych, mieszając w wstrząsarku typu vortex przez 3 min.
    4. Do probówek dodać taką samą ilość benzyny i wymieszać intensywnie w wstrząsarku typu vortex przez 3 min.
    5. Pozostawić probówki w spokoju w temperaturze pokojowej na 24 h.
    6. Określić indeks emulsyfikacji po 24 h.

5. Określanie charakteru biosurfaktantu

  1. TLC wyekstrahowanego biosurfaktantu
    1. Nanieś 20 µL biosurfaktantów na płytki TLC. Nakładaj po 2 µL jednorazowo.
    2. Nanieś biosurfaktanty na trzy różne płytki TLC.
    3. Przygotuj 100 mL mieszaniny eluenta zawierającej chloroform:metanol (2:1) i wlej eluent do komory TLC. Zamknij pokrywę komory i pozostaw ją do nasycenia na 20 min.
    4. Po wysuszeniu płytek umieść je w komorze nasyconej mieszaniną chloroformu i metanolu i przeprowadź analizę TLC.
    5. Gdy eluent dotrze do górnej krawędzi płytki TLC (1 cm od góry), wyjmij płytki i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu.
  2. Barwienie w celu wykrycia lipidów
    1. Użyj czystej komory TLC, wsyp do niej kilka (5-10) granulek jodu i nasycaj komorę przez 5 do 10 min.
    2. Umieść płytkę TLC w komorze i obserwuj pojawianie się żółtych plam. Jeśli plamy wystąpią, uznaj biosurfaktant za pozytywny pod kątem obecności komponentu lipidowego.
  3. Barwienie w celu wykrycia peptydów lub aminokwasów
    1. Przygotuj roztwór ninhydryny, rozpuszczając 0,4 g ninhydryny w 20 mL butanolu. Do mieszaniny dodaj 0,6 mL 100% lodowatego kwasu octowego.
    2. Spryskaj płytkę TLC roztworem ninhydryny i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 2 min. Podgrzej płytkę w temperaturze 110 °C i obserwuj zmianę barwy.
      UWAGA: Jeśli pojawią się niebieskie plamy, uznaj biosurfaktant za pozytywny pod kątem obecności łańcucha peptydowego lub aminokwasu.
  4. Barwienie w celu wykrycia węglowodanów
    1. Przygotuj roztwór p-anisaldehydu, dodając 2 mL p-anisaldehydu do 48 mL lodowatego kwasu octowego zawierającego 1 mL H2SO4. Do mieszaniny dodaj 0,6 mL kwasu octowego.
    2. Spryskaj równomiernie płytkę TLC mieszaniną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 2 min.
    3. Inkubuj płytkę w temperaturze 110 °C i monitoruj pojawianie się plam.
      UWAGA: Jeśli pojawią się zielone lub brązowe plamy, uznaj biosurfaktant za pozytywny pod kątem obecności węglowodanów.

6. Identyfikacja chemiczna biosurfaktantu

  1. Analiza LCMS biosurfaktantu
    1. Rozpuścić 25 mg wyekstrahowanego biosurfaktantu w 1 mL chloroformu.
    2. Przeprowadzić analizę LCMS (w konfiguracji lock spray z częstotliwością skanowania referencyjnego 10 s) przy użyciu kolumny C18.
    3. Jako fazę ruchomą zastosować mieszaninę chloroform:metanol (1:1) i wtrysnąć 2 µL próbki do kolumny przy szybkości przepływu 0,1 mL/min.
    4. Ustawić następujące parametry eksperymentalne: polarność: ES dodatnia, napięcie kapilarne: 3 kV, temperatura źródła: 80 °C, temperatura desolwatacji: 300 °C, szybkość przepływu gazu desolwatacyjnego: 7 000 L/h oraz szybkość przepływu gazu w pułapce: 0,40 mL/min.
    5. Skanować zakresy od 100 do 1 200 Da przez czas detekcji 20 min i analizować jony w dodatnim trybie ES.
    6. Wartości m/z przeanalizować przy użyciu dowolnego oprogramowania do ilościowej spektrometrii mas.
    7. W celu przeprowadzenia analizy zalogować się do oprogramowania.
    8. Kliknąć Batch Search i wprowadzić listę uzyskanych mas. Przejrzeć wyniki w trybie ładunku dodatniego, przyjmując M + H oraz M + Na jako addukty. Utrzymać dokładność na poziomie 10 PPM i zaznaczyć opcję Display Structure.
    9. Kliknąć Search i z listy związków wybrać ten o najniższym poziomie PPM.
  2. Analiza 1H NMR biosurfaktantu
    UWAGA: Analizę 1H NMR biosurfaktantu przeprowadzono przy użyciu spektrometru NMR 400 MHz (patrz Tabela materiałów).
    1. Rozpuścić 5 mg biosurfaktantu w 1 mL chloroformu deuterowanego (CdCl3).
    2. Przenieść mieszaninę do probówki NMR. Prawidłowo zakorkować probówkę i umieścić ją w uchwycie. Dostosować wysokość probówki za pomocą rurki regulacyjnej.
    3. Umieścić probówkę wraz z uchwytem w urządzeniu NMR i wykonać poniższe kroki w celu uzyskania widma NMR.
    4. Aby wybrać typ probówki z próbką: wpisać sx N, gdzie N to pozycja, w której umieszczono probówkę (np. sx 13, jeśli probówka znajdowała się na 13tej pozycji) w powiązanym oprogramowaniu.
    5. Wpisać edc i nacisnąć Enter, aby utworzyć nowy folder do przechowywania danych.
    6. Pojawi się okno pop-up. Wybrać rozpuszczalnik, klikając CdCl 3 na liście, i wprowadzić nazwę próbki.
    7. Aby rozpocząć protokół, wpisać „getprosol”; aby zablokować rozpuszczalnik, wpisać „lock cdcl3”.
    8. Wpisać „topshim”, aby przeprowadzić shimming próbki, a na koniec wpisać „rga;zgefp” w celu akwizycji danych. Rozpocznie to protokół.
    9. Po uzyskaniu widma wpisać „apk;abs n” i nacisnąć enter w celu korekcji fazy i linii bazowej.
    10. Aby wybrać główne piki, wpisać „pp” i nacisnąć Enter. Aby wybrać tylko intensywne piki, wpisać „mi” i podać wartość intensywności, powyżej której piki mają być wybierane. Wartość domyślna to 0,2.
    11. Aby zintegrować piki, kliknąć Integrate , umieścić kursor po lewej stronie piku do integracji, a następnie, trzymając kursor, kliknąć i przeciągnąć go wokół piku.
    12. Zapisywać dane, klikając File w lewym górnym rogu, a następnie klikając Save.
    13. Próbkę można wysunąć z urządzenia, wpisując „sx ej”.
    14. Przeanalizować piki i określić otoczenie atomów H.
  3. Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR) biosurfaktantu
    UWAGA: Analizę FT-IR wyekstrahowanego biosurfaktantu przeprowadzono przy użyciu dostępnego komercyjnie spektrofotometru w trybie ATR (patrz Tabela materiałów).
    1. Włączyć spektrofotometr i sprawdzić przepłukiwanie, osuszacz oraz detektor.
    2. Aby zarejestrować widmo, najpierw zarejestrować widmo tła bez umieszczonej próbki.
    3. Wziąć wyekstrahowany biosurfaktant i całkowicie go wysuszyć. Umieścić wysuszony biosurfaktant bezpośrednio na kryształku diamentowym, przyłożyć nacisk i docisnąć w punkcie styku ATR.
    4. W oprogramowaniu wybrać liczbę skanów (wpisać 30) i zeskanować widmo w zakresie od 400 cm-1 do 4 000 cm-1.
    5. Kliknąć OK , aby dodać widmo próbki do okna widma.
    6. Kliknąć Files > Save > Save As , wprowadzić nazwę pliku wraz z rozszerzeniem .spa i kliknąć OK.

7. Zastosowanie biosurfaktantów (wzmocnione odzyskiwanie ropy naftowej)

UWAGA: W tym doświadczeniu wodę dwukrotnie destylowaną zastosowano jako kontrolę negatywną, natomiast 10% SDS, 10% Tween 80 oraz 10% komercyjnej saponiny wykorzystano jako kontrole pozytywne.

  1. Wziąć rurkę szklaną i uszczelnić dolny wylot wełną szklaną oraz kuleczkami szklanymi.
  2. Wypełnić kolumnę glebą piaszczystą w taki sposób, aby na górze gleby można było dodać ciecz, a przelew zebrać na dole. Zamocować kolumnę w uchwycie i dodać kilka kuleczek szklanych na wierzchu gleby.
  3. Przepłukać kolumnę 50 mL roztworu solanki i zebrać przelew w celu określenia objętości porów.
    objętość porów = objętość dodanej solanki - objętość zebranego przelewu.
  4. Usunąć solankę z kolumny poprzez wymuszenie przepływu ropy naftowej, dodając ją od góry kolumny. Zebrać objętość solanki i ropy wypływającej z kolumny, aby określić początkową objętość nasycenia ropą. Objętość solanki uwolnionej z kolumny będzie odpowiadać początkowej objętości nasycenia ropą lub pierwotnej ilości ropy w złożu.
  5. Pozostawić kolumnę w spokoju na 24 h.
  6. Po 24 h przepłukać kolumnę 10 objętościami porów solanki i zebrać ropę wypływającą z kolumny, aby oszacować wtórny odzysk ropy. Ropa pozostała w kolumnie po wtórnym odzysku odpowiada ropie rezydualnej.
  7. Przygotować mieszaninę biosurfaktantów, dodając równe objętości wyekstrahowanego biosurfaktantu (wyekstrahowanego po kroku 3.5) do zlewki szklanej. Dodać biosurfaktanty na górę kolumny i inkubować kolumnę przez 24 h.
  8. Po 24 h zmierzyć ilość ropy i wody, aby określić dodatkowy lub wspomagany odzysk ropy. Objętość ropy uwolnionej z kolumny będzie odpowiadać odzyskanej ropie rezydualnej.
  9. Oszacować wspomagany odzysk ropy za pomocą następującego równania:
    Równanie wspomaganego odzysku ropy, formuła; obliczanie procentowego dodatkowego odzysku ropy, zastosowanie badawcze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Trzy szczepy bakteryjne (Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 oraz Paenibacillus sp. IITD108) poddano przesiewowej ocenie w kierunku produkcji biosurfaktantów za pomocą różnych testów, które obejmowały test zapadania się kropli (drop collapse assay), test przemieszczania oleju (oil displacement assay), test indeksu emulsyjnego oraz pomiar obniżenia napięcia powierzchniowego. Nadnadstątki wolne od komórek wszystkich trzech szczepów bakteryjnych oraz roztwór surfaktantu chemicznego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Biosurfaktanty to jedna z najbardziej wszechstronnych grup biologicznie aktywnych składników, które stają się atrakcyjną alternatywą dla chemicznych środków powierzchniowo czynnych. Mają szeroki zakres zastosowań w wielu gałęziach przemysłu, takich jak detergenty, farby, kosmetyki, żywność, farmaceutyki, rolnictwo, ropa naftowa i uzdatnianie wody ze względu na lepszą zwilżalność, niższy CMC, zróżnicowaną strukturę i przyjazność dla środowiska18. Doprowadziło to do wzrostu zainteresowania odkrywani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Departamentowi Biotechnologii Rządu Indii za wsparcie finansowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta 1 mlEppendorf, NiemcyG54412G
1H Spektrometr NMRBruker Avance AV-III typ, USA
Pipeta 20 ulThermo scientific, USAH69820
AutoklawJAISBO, IndieNr seryjny 5923Jain Scientific
Palnik z niebieskim płomieniemRocker scientific, smok tajwański200
Innowacje ButanoluGLR, IndieGLR09.022930
Kolumna C18Agilent Technologies, USA770995-902
WirówkaEppendorf, Niemcy5810R
ChloroformMerck, Indie1.94506.2521
Chloroform-dSRL, Indie57034
Rurki FalconTarsons, Indie546041Polipropylen sterylizowany promieniowaniem
FT-IRThermo Fisher Scientific, USA  Nicolet iS50
WyciągKhera, Indie47408Dostosowany
lodowaty kwas octowyMerck, Indie1.93002
Koraliki szklaneMerck, Indie104014
Szkiełkaszklane Polar industrial Corporation, USABlue Star75 mm * 25 mm
Wełna szklanaMerk, Indie104086
Kwas solnyMerck, Indie1003170510
InkubatorThermo Scientific, USAMaxQ600Inkubator z wytrząsaniem
InkubatorKhera, IndieSunbim
Jod resublimowanyMerck, Indie231-442-4  resublimowany granulat
K12 – Tensjometr KrussKruss Scientific, NiemcyK100
Kabina z laminarnym przepływem powietrzaThermo Scientific, ChinySeria 1300 A2
LCMSAgilent Technologies, USA1260 Infinity II
Bulion LuriaHIMEDIA, IndieM575-500GMetanol w proszku
Merck, Indie107018
NinhydrinTitan Biotech Limited, Indie1608
aldehyd an- anisaldehydSigma, USA204-602-6
Płytka PetriegoTarsons, Indie460090-90 MMSaponina polipropylenowa sterylizowana promieniowaniem
Merck, Indie232-462-6
Chlorek soduMerck, Indie231-598-3
ProbówkiBorosil, Indie9800U06Szklane rurki
Płytki TLCMerck, Indie1055540007
VortexGeNei, Indie2006114318
Kąpiel wodnaJulabo, IndieSW21C

Bibliografia

  1. Desai, J. D., Banat, I. M. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 61 (1), 47-64 (1997).
  2. Banat, I. M. Biosurfactants production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation: a review. Bioresource Technology. 51 (1), 1-12 (1995).
  3. Singh, A., Van Hamme, J. D., Ward, O. P. Surfactants in microbiology and biotechnology: Part 2. Application aspects. Biotechnology Advances. 25 (1), 99-121 (2007).
  4. Shah, N., Nikam, R., Gaikwad, S., Sapre, V., Kaur, J. Biosurfactant: types, detection methods, importance and applications. Indian Journal of Microbiology Research. 3 (1), 5-10 (2016).
  5. McClements, D. J., Gumus, C. E. Natural emulsifiers-Biosurfactants, phospholipids, biopolymers, and colloidal particles: Molecular and physicochemical basis of functional performance. Advances in Colloid and Interface Science. 234, 3-26 (2016).
  6. Nguyen, T. T., Youssef, N. H., McInerney, M. J., Sabatini, D. A. Rhamnolipid biosurfactant mixtures for environmental remediation. Water Research. 42 (6-7), 1735-1743 (2008).
  7. Maier, R. M., Soberon-Chavez, G. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 54 (5), 625-633 (2000).
  8. Banat, I. M., Makkar, R. S., Cameotra, S. S. Potential commercial applications of microbial surfactants. Applied Microbiology and Biotechnology. 53 (5), 495-508 (2000).
  9. Mulugeta, K., Kamaraj, M., Tafesse, M., Aravind, J. A review on production, properties, and applications of microbial surfactants as a promising biomolecule for environmental applications. Strategies and Tools for Pollutant Mitigation: Avenues to a Cleaner Environment. , 3-28 (2021).
  10. Sharma, J., Sundar, D., Srivastava, P. Biosurfactants: Potential agents for controlling cellular communication, motility, and antagonism. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 727070(2021).
  11. Vijayakumar, S., Saravanan, V. Biosurfactants-types, sources and applications. Research Journal of Microbiology. 10 (5), 181-192 (2015).
  12. Curiel-Maciel, N. F., et al. Characterization of enterobacter cloacae BAGM01 producing a thermostable and alkaline-tolerant rhamnolipid biosurfactant from the Gulf of Mexico. Marine Biotechnology. 23 (1), 106-126 (2021).
  13. Nikolova, C., Gutierrez, T. Biosurfactants and their applications in the oil and gas industry: current state of knowledge and future perspectives. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).
  14. Rastogi, S., Tiwari, S., Ratna, S., Kumar, R. Utilization of agro-industrial waste for biosurfactant production under submerged fermentation and its synergistic application in biosorption of Pb2. Bioresource Technology Reports. 15, 100706(2021).
  15. Zargar, A. N., Lymperatou, A., Skiadas, I., Kumar, M., Srivastava, P. Structural and functional characterization of a novel biosurfactant from Bacillus sp. IITD106. Journal of Hazardous Materials. 423, Pt B 127201(2022).
  16. Adnan, M., et al. Functional and structural characterization of pediococcus pentosaceus-derived biosurfactant and its biomedical potential against bacterial adhesion, quorum sensing, and biofilm formation. Antibiotics. 10 (11), 1371(2021).
  17. Du Nouy, P. L. A new apparatus for measuring surface tension. The Journal of General Physiology. 1 (5), 521-524 (1919).
  18. Akbari, S., Abdurahman, N. H., Yunus, R. M., Fayaz, F., Alara, O. R. Biosurfactants-a new frontier for social and environmental safety: a mini review. Biotechnology Research and Innovation. 2 (1), 81-90 (2018).
  19. Bicca, F. C., Fleck, L. C., Ayub, M. A. Z. Production of biosurfactant by hydrocarbon degrading Rhodococcus ruber and Rhodococcus erythropolis. Revista de Microbiologia. 30 (3), 231-236 (1999).
  20. Kuyukina, M. S., et al. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiary-butyl ether extraction. Journal of Microbiological Methods. 46 (2), 149-156 (2001).
  21. Philp, J., et al. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer. Applied Microbiology and Biotechnology. 59 (2), 318-324 (2002).
  22. Mutalik, S. R., Vaidya, B. K., Joshi, R. M., Desai, K. M., Nene, S. N. Use of response surface optimization for the production of biosurfactant from Rhodococcus spp. MTCC 2574. Bioresource Technology. 99 (16), 7875-7880 (2008).
  23. Shavandi, M., Mohebali, G., Haddadi, A., Shakarami, H., Nuhi, A. Emulsification potential of a newly isolated biosurfactant-producing bacterium, Rhodococcus sp. strain TA6. Colloids and Surfaces B, Biointerfaces. 82 (2), 477-482 (2011).
  24. White, D., Hird, L., Ali, S. Production and characterization of a trehalolipid biosurfactant produced by the novel marine bacterium Rhodococcus sp., strain PML026. Journal of Applied Microbiology. 115 (3), 744-755 (2013).
  25. Najafi, A., et al. Interactive optimization of biosurfactant production by Paenibacillus alvei ARN63 isolated from an Iranian oil well. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 82 (1), 33-39 (2011).
  26. Bezza, F. A., Chirwa, E. M. N. Pyrene biodegradation enhancement potential of lipopeptide biosurfactant produced by Paenibacillus dendritiformis CN5 strain. Journal of Hazardous Materials. 321, 218-227 (2017).
  27. Jimoh, A. A., Lin, J. Biotechnological applications of Paenibacillus sp. D9 lipopeptide biosurfactant produced in low-cost substrates. Applied Biochemistry and Biotechnology. 191 (3), 921-941 (2020).
  28. Liang, T. -W., et al. Exopolysaccharides and antimicrobial biosurfactants produced by Paenibacillus macerans TKU029. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (2), 933-950 (2014).
  29. Mesbaiah, F. Z., et al. Preliminary characterization of biosurfactant produced by a PAH-degrading Paenibacillus sp. under thermophilic conditions. Environmental Science and Pollution Research. 23 (14), 14221-14230 (2016).
  30. Quinn, G. A., Maloy, A. P., McClean, S., Carney, B., Slater, J. W. Lipopeptide biosurfactants from Paenibacillus polymyxa inhibit single and mixed species biofilms. Biofouling. 28 (10), 1151-1166 (2012).
  31. Gudiña, E. J., et al. Novel bioemulsifier produced by a Paenibacillus strain isolated from crude oil. Microbial Cell Factories. 14 (1), 1-11 (2015).
  32. Pradhan, A. K., Pradhan, N., Sukla, L. B., Panda, P. K., Mishra, B. K. Inhibition of pathogenic bacterial biofilm by biosurfactant produced by Lysinibacillus fusiformis S9. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (2), 139-149 (2014).
  33. Manchola, L., Dussán, J. Lysinibacillus sphaericus and Geobacillus sp biodegradation of petroleum hydrocarbons and biosurfactant production. Remediation Journal. 25 (1), 85-100 (2014).
  34. Bhardwaj, G., Cameotra, S. S., Chopra, H. K. Biosurfactant from Lysinibacillus chungkukjangi from rice bran oil sludge and potential applications. Journal of Surfactants and Detergents. 19 (5), 957-965 (2016).
  35. Gaur, V. K., et al. Rhamnolipid from a Lysinibacillus sphaericus strain IITR51 and its potential application for dissolution of hydrophobic pesticides. Bioresource Technology. 272, 19-25 (2019).
  36. Habib, S., et al. Production of lipopeptide biosurfactant by a hydrocarbon-degrading Antarctic Rhodococcus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6138(2020).
  37. Shao, P., Ma, H., Zhu, J., Qiu, Q. Impact of ionic strength on physicochemical stability of o/w emulsions stabilized by Ulva fasciata polysaccharide. Food Hydrocolloids. 69, 202-209 (2017).
  38. Trefalt, G., Borkovec, M. Overview of DLVO theory. , Available from: https://archive-ouverte.unige.ch/unige:148595 (2014).
  39. Kazemzadeh, Y., Ismail, I., Rezvani, H., Sharifi, M., Riazi, M. Experimental investigation of stability of water in oil emulsions at reservoir conditions: Effect of ion type, ion concentration, and system pressure. Fuel. 243, 15-27 (2019).
  40. Chong, H., Li, Q. Microbial production of rhamnolipids: opportunities, challenges and strategies. Microbial Cell Factories. 16 (1), 1-12 (2017).
  41. Zeng, G., et al. Co-degradation with glucose of four surfactants, CTAB, Triton X-100, SDS and Rhamnolipid, in liquid culture media and compost matrix. Biodegradation. 18 (3), 303-310 (2007).
  42. Liu, G., et al. Advances in applications of rhamnolipids biosurfactant in environmental remediation: a review. Biotechnology and Bioengineering. 115 (4), 796-814 (2018).
  43. John, W. C., Ogbonna, I. O., Gberikon, G. M., Iheukwumere, C. C. Evaluation of biosurfactant production potential of Lysinibacillus fusiformis MK559526 isolated from automobile-mechanic-workshop soil. Brazilian Journal of Microbiology. 52 (2), 663-674 (2021).
  44. Naing, K. W., et al. Isolation and characterization of an antimicrobial lipopeptide produced by Paenibacillus ehimensis MA2012. Journal of Basic Microbiology. 55 (7), 857-868 (2015).
  45. Wittgens, A., et al. Novel insights into biosynthesis and uptake of rhamnolipids and their precursors. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (7), 2865-2878 (2017).
  46. Rahman, K., Rahman, T. J., McClean, S., Marchant, R., Banat, I. M. Rhamnolipid biosurfactant production by strains of Pseudomonas aeruginosa using low-cost raw materials. Biotechnology Progress. 18 (6), 1277-1281 (2002).
  47. Bahia, F. M., et al. Rhamnolipids production from sucrose by engineered Saccharomyces cerevisiae. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
  48. Kim, C. H., et al. Desorption and solubilization of anthracene by a rhamnolipid biosurfactant from Rhodococcus fascians. Water Environment Research. 91 (8), 739-747 (2019).
  49. Nalini, S., Parthasarathi, R. Optimization of rhamnolipid biosurfactant production from Serratia rubidaea SNAU02 under solid-state fermentation and its biocontrol efficacy against Fusarium wilt of eggplant. Annals of Agrarian Science. 16 (2), 108-115 (2018).
  50. Wang, Q., et al. Engineering bacteria for production of rhamnolipid as an agent for enhanced oil recovery. Biotechnology and Bioengineering. 98 (4), 842-853 (2007).
  51. Câmara, J., Sousa, M., Neto, E. B., Oliveira, M. Application of rhamnolipid biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa in microbial-enhanced oil recovery (MEOR). Journal of Petroleum Exploration and Production Technology. 9 (3), 2333-2341 (2019).
  52. Amani, H., Mehrnia, M. R., Sarrafzadeh, M. H., Haghighi, M., Soudi, M. R. Scale up and application of biosurfactant from Bacillus subtilis in enhanced oil recovery. Applied Biochemistry and Biotechnology. 162 (2), 510-523 (2010).
  53. Gudiña, E. J., et al. Bioconversion of agro-industrial by-products in rhamnolipids toward applications in enhanced oil recovery and bioremediation. Bioresource Technology. 177, 87-93 (2015).
  54. Sun, G., Hu, J., Wang, Z., Li, X., Wang, W. Dynamic investigation of microbial activity in microbial enhanced oil recovery (MEOR). Petroleum Science and Technology. 36 (16), 1265-1271 (2018).
  55. Jha, S. S., Joshi, S. J., SJ, G. Lipopeptide production by Bacillus subtilis R1 and its possible applications. Brazilian Journal of Microbiology. 47 (4), 955-964 (2016).
  56. Darvishi, P., Ayatollahi, S., Mowla, D., Niazi, A. Biosurfactant production under extreme environmental conditions by an efficient microbial consortium, ERCPPI-2. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 84 (2), 292-300 (2011).
  57. Al-Wahaibi, Y., et al. Biosurfactant production by Bacillus subtilis B30 and its application in enhancing oil recovery. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 114, 324-333 (2014).
  58. Moutinho, L. F., Moura, F. R., Silvestre, R. C., Romão-Dumaresq, A. S. Microbial biosurfactants: A broad analysis of properties, applications, biosynthesis, and techno-economical assessment of rhamnolipid production. Biotechnology Progress. 37 (2), 3093(2021).
  59. Youssef, N., Simpson, D. R., McInerney, M. J., Duncan, K. E. In-situ lipopeptide biosurfactant production by Bacillus strains correlates with improved oil recovery in two oil wells approaching their economic limit of production. International Biodeterioration & Biodegradation. 81, 127-132 (2013).
  60. Ruckenstein, E., Nagarajan, R. Critical micelle concentration and the transition point for micellar size distribution. The Journal of Physical Chemistry. 85 (20), 3010-3014 (1981).
  61. de Araujo, L. L., et al. Microbial enhanced oil recovery using a biosurfactant produced by Bacillus safensis isolated from mangrove microbiota-Part I biosurfactant characterization and oil displacement test. Journal of Petroleum Science and Engineering. 180, 950-957 (2019).
  62. Banat, I. M., De Rienzo, M. A. D., Quinn, G. A. Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (24), 9915-9929 (2014).
  63. Klosowska-Chomiczewska, I., Medrzycka, K., Karpenko, E. Biosurfactants-biodegradability, toxicity, efficiency in comparison with synthetic surfactants. Research and Application of New Technologies in Wastewater Treatment and Municipal Solid Waste Disposal in Ukraine, Sweden, and Poland. 17, 141-149 (2013).
  64. Fernandes, P. A. V., et al. Antimicrobial activity of surfactants produced by Bacillus subtilis R14 against multidrug-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (4), 704-709 (2007).
  65. Santos, D. K. F., Rufino, R. D., Luna, J. M., Santos, V. A., Sarubbo, L. A. Biosurfactants: multifunctional biomolecules of the 21st century. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 401(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Produkcja biosurfaktantówobniżanie napięcia powierzchniowegoprzesiew mikrobiologicznytest kolapsu kroplitest rozprzestrzeniania olejutest indeksu emulsjicienkowarstwowa chromatografiaidentyfikacja ramnolipidówkolumna z wypełnieniem piaskowym
Zwiększony odzysk oleju dzięki połączeniu biosurfaktantów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.