Artykuł metodologiczny

Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63211

⸱

8 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Forcyte Biotechnologies, 2University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca przedstawia elastyczny protokół wykorzystania technologii fluorescencyjnie znakowanych elastomerowych powierzchni skurczowych (FLECS) w formacie mikrostudzienki do uproszczonej, bezobsługowej kwantyfikacji sił skurczu pojedynczej komórki na podstawie wizualizacji przemieszczeń mikrowzorów białek fluorescencyjnych.

Streszczenie

Generowanie siły skurczu komórek jest podstawową cechą wspólną dla praktycznie wszystkich komórek. Te siły skurczu mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozwoju, funkcjonują zarówno na poziomie komórkowym, jak i tkankowym oraz regulują systemy mechaniczne w organizmie. Wiele procesów biologicznych jest zależnych od siły, w tym ruchliwość, adhezja i podział pojedynczych komórek, a także skurcz i rozluźnienie narządów, takich jak serce, pęcherz moczowy, płuca, jelita i macica. Biorąc pod uwagę jej znaczenie w utrzymaniu prawidłowych funkcji fizjologicznych, kurczliwość komórkowa może również napędzać procesy chorobowe, gdy jest przesadzona lub zakłócona. Astma, nadciśnienie, przedwczesny poród, zwłóknienie i niedoczynność pęcherza moczowego to przykłady procesów chorobowych napędzanych mechanicznie, które można potencjalnie złagodzić dzięki odpowiedniej kontroli siły skurczu komórek. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy protokół wykorzystania nowatorskiej technologii oznaczania kurczliwości opartej na mikropłytkach, znanej jako fluorescencyjnie znakowane elastomerowe powierzchnie skurczowe (FLECS), która zapewnia uproszczoną i intuicyjną analizę kurczliwości pojedynczych komórek w sposób masowo skalowany. W niniejszym dokumencie przedstawiamy krok po kroku protokół uzyskiwania dwóch sześciopunktowych krzywych dawka-odpowiedź opisujących wpływ dwóch inhibitorów kurczliwości na skurcz pierwotnych komórek mięśni gładkich ludzkiego pęcherza moczowego w prostej procedurze wykorzystującej tylko pojedynczą mikropłytkę testową FLECS, aby zademonstrować właściwą technikę użytkownikom metody. Korzystając z technologii FLECS, wszyscy badacze posiadający podstawowe laboratoria biologiczne i systemy mikroskopii fluorescencyjnej uzyskują dostęp do badania tego podstawowego, ale trudnego do określenia funkcjonalnego fenotypu komórki, skutecznie obniżając barierę wejścia w dziedzinę biologii sił i fenotypowych badań przesiewowych siły skurczu komórek.

Wprowadzenie

Siły mechaniczne generowane przez komórki są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania wielu organów w całym organizmie, takich jak jelita, pęcherz moczowy, serce i inne. Organy te muszą generować stabilne wzorce skurczu i rozkurczu komórek, aby utrzymać wewnętrzny stan homeostazy. Nieprawidłowy skurcz komórek mięśni gładkich (SMC) może prowadzić do wystąpienia różnych zaburzeń, w tym na przykład dysmotoryki jelit, charakteryzującej się nieprawidłowymi wzorcami skurczu mięśni gładkich jelit1, a także schorzeń urologicznych, takich jak nadaktywny2 lub niedoczynny pęcherz moczowy3. W drogach oddechowych SMC wykazujące nieregularne wzorce skurczu mogą wywołać astmatyczną nadreaktywność4, co potencjalnie prowadzi do zwężenia dróg oddechowych i zmniejszenia przepływu tlenu do płuc. Innym powszechnym schorzeniem fizycznym jest nadciśnienie, wywołane wahaniami skurczu mięśni gładkich w naczyniach krwionośnych5. Wyraźnie widać, że mechanizmy kurczliwości w obrębie komórek i tkanek mogą prowadzić do chorób wymagających zastosowania metod leczenia. Ponieważ stany te bezsprzecznie wynikają z dysfunkcyjnych zachowań kurczliwych komórek, logiczne i konieczne staje się pomiar samej funkcji kurczliwej komórek podczas przesiewania potencjalnych kandydatów na leki.

Uznając potrzebę stworzenia narzędzi do badania komórkowej siły skurczu, przez naukowców opracowano kilka ilościowych metod oceny skurczu, w tym mikroskopię sił trakcyjnych (TFM)6, TFM z mikrowzorowaniem7, testy z pływającymi żelami8 oraz testy z elastomerowymi mikrosłupkami9. Technologie te były wykorzystywane w licznych badaniach zarówno w formacie pojedynczych naczyń, jak i wielodobowych płytek, a nawet proponowano je do pomiarów sił w trzech wymiarach10,11,12,13,14. Choć technologie te umożliwiły pionierskie badania w szerokiej dziedzinie biologii sił komórkowych, większość z nich była ograniczona do laboratoriów posiadających specyficzne możliwości i zasoby, w szczególności: zdolność do wytwarzania podłoży TFM, umiejętność właściwego stosowania złożonych i nieintuicyjnych algorytmów do rozwiązywania map przemieszczeń TFM oraz stosunkowo precyzyjne systemy mikroskopowe, które potrafią zarejestrować obrazy wykonane przed i po zdjęciu próbki ze stolika (w celu dysocjacji komórek). W konsekwencji dla niewykwalifikowanego badacza bariera wejścia w stosowanie tych metod może być dość wysoka, biorąc pod uwagę szeroki zestaw wymagań niezbędnych do wdrożenia tych technologii. Ponadto rozdzielczość obrazowania wymagana dla wielu istniejących technologii (obiektywy 40x lub większe) może znacząco ograniczać przepustowość eksperymentalną, podczas gdy technologie pomiarów zbiorczych mogą maskować wkład komórek odstających i uniemożliwiać wykrycie subtelniejszych różnic w skurczu. Warto zauważyć, że z wiedzą autorów jedynie podejście o niskiej przepustowości i półilościowy test z pływającymi żelami osiągnął wystarczający stopień dojrzałości, aby stać się dostępnym dla badaczy (patrz Rycina 1).

Kurczenie się komórek na fluorescencyjnych mikrowzorach; schemat obrazujący adhezję i kurczenie się w czasie.
Rycina 1: Ogólny schemat metody technologii FLECS. (A) Komórki przylegają do adhezyjnych mikrowzorów białkowych, które są kowalencyjnie osadzone w cienkiej warstwie elastomerowej wspartej szklaną podstawką. (B) Widok z góry różnych możliwych kształtów mikrowzorów oraz powiększenie komórki kurczącej się na mikrowzorze w kształcie litery „X”. (C) Nałożenie fluorescencyjnych mikrowzorów na obrazy w kontraście fazowym kurczącej się komórki. (D) Obrazy przebiegu czasowego pojedynczej kurczącej się komórki. Paski skali = 25 µm. Rycina ta została opracowana za zgodą Pushkarsky'ego i wsp.15. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Kierując się ostatnimi postępami w mikrotechnologii, autorzy opracowali technologię opartą na mikropłytkach, umożliwiającą ilościowe pomiary skurczu pojedynczych komórek w setkach tysięcy komórek, nazwaną FLECS (fluorescently labelled elastomeric contractible surfaces)15,16,17,18,19,20, jako alternatywę dla TFM. W tym podejściu fluorescencyjne mikrowzory białkowe są osadzone w miękkich filmach, które odkształcają się i kurczą w intuicyjny i mierzalny sposób, gdy komórki wywierają na nie siły trakcyjne. Co istotne, mikrowzory białkowe ograniczają pozycję, kształt i powierzchnię rozprzestrzenienia się komórek, co prowadzi do jednolitych warunków testowych. Pozwala to na proste pomiary oparte wyłącznie na zmianach wymiarowych, które są bardzo dobrze rozdzielone przestrzennie, nawet na obrazach przy 4-krotnym powiększeniu. Metoda obejmuje moduł analizy obrazu działający w przeglądarce i umożliwia bezpośrednią analizę siły skurczu komórek bez konieczności stosowania delikatnych procedur manipulacyjnych lub rejestracji markerów referencyjnych, dzięki czemu może być ona obsługiwana przez każdego badacza dysponującego podstawowym zapleczem do hodowli komórek i prostym mikroskopem fluorescencyjnym z niskim powiększeniem (Rycina 2). Technologia ta, gotowa do użycia i dostępna komercyjnie, została zaprojektowana z myślą o użytkowniku końcowym i ma na celu obniżenie bariery wejścia dla każdego naukowca laboratoryjnego chcącego badać biologię sił komórkowych.

Płytka FLEXplate 24-dołkowa z wzorowaniem komórek do mikroskopii; siatka, mikroskopia fluorescencyjna, obrazowanie komórkowe.
Rycina 2: Schemat formatu płytki 24-dołkowej dla testu kurczliwości pojedynczych komórek. Ten format został wykorzystany w opisanych tutaj eksperymentach i przedstawiony w części wideo artykułu. Paski skali = 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół zastosowania formatu płytek 24-dołkowych platformy technologicznej FLECS w celu ilościowego określenia wpływu leków modulujących siłę na kurczliwość komórkową w pierwotnych komórkach mięśni gładkich pęcherza moczowego. Ten ogólny protokół może być adaptowany i modyfikowany w zależności od potrzeb, aby uwzględnić różne ramy czasowe, typy komórek i warunki traktowania, a także skalowany w celu odpowiedzi na inne pytania z zakresu biologii siły.

Protokół

1. Dzień 1: Przygotowanie płytki 24-dołkowej

  1. Procedurę należy rozpocząć od dodania 20 ml pożywki do hodowli komórkowych do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. W tym eksperymencie użyto pożywki na bazie szynki F12 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
  2. Uzyskać 24-dołkową płytkę przeznaczoną do oznaczania kurczliwości komórek. Ustawić pipetę na 500 μl i zaopatrzyć się w sitko do pasażowania komórek.
    UWAGA: Płyta jest dostępna u autorów na życzenie.
  3. Podnieś i przytrzymaj talerz jedną ręką, a następnie delikatnie odklej plastikową folię od góry płytki. Następnie ostrożnie odłóż talerz z powrotem.
  4. Włącz aspirator próżniowy i odessaj górną warstwę soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) ze studzienek, aby zapobiec rozlaniu. Usuwaj PBS po jednym wierszu na raz. Gdy studzienki nie są już całkowicie pełne, trzymaj płytkę w jednej ręce i ostrożnie wyjmij resztę PBS z dołków. Szybko napełnij 500 μl pożywki do hodowli komórkowych. Uważaj, aby uniknąć kontaktu aspiratora z dnem studzienki.
  5. Delikatnie potrząśnij płytką i postukaj w bok, aby upewnić się, że całe dno studzienki jest pokryte roztworem. Gdy wszystkie studzienki zostaną wypełnione podłożem, odłóż płytkę na bok.

2. Dzień 1: Zasiewanie komórek

  1. Pobrać kolbę hodowlaną z pasażowanymi przez 7 lub niższe pierwotne komórki mięśni gładkich ludzkiego pęcherza moczowego (BSM) z inkubatora o temperaturze 37 °C. Pod mikroskopem sprawdź morfologię komórek i upewnij się, że komórki osiągnęły co najmniej 90% konfluencji, ale mniej niż 100% konfluencji.
  2. Przeprowadź protokół dysocjacji komórek. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego trypsynizuj komórki przez 2,5 minuty, aż komórki zostaną odłączone, a następnie schładzaj je pożywką uzupełnioną surowicą (10% FBS).
  3. Po dysocjacji komórek użyj hemocytometru, aby policzyć komórki i rozcieńczyć zawiesinę komórek do około 50 000 komórek/ml w pożywce uzupełnionej surowicą. Co ważne, komórki wymagają co najmniej 2% surowicy, aby przyłączyć się do mikrowzorów.
  4. Przed wysiewem należy szybko przecedzić zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 40 lub 100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z pipetą serologiczną, aby rozbić grudki komórek na pojedyncze komórki.
  5. Ostrożnie dodać 500 μl zawiesiny komórek o objętości 50 000 komórek/ml do każdej z 24 studzienek na płytce za pomocą pipety P1000, dozując roztwór kroplami w różnych miejscach w studzienkach.
  6. Po wysianiu komórek pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na 1 godzinę, aby komórki mogły osiąść bezpośrednio na mikrowzorach bez wpływu mikroprądów generowanych przez parowanie. Po upływie 1 godziny umieścić płytkę na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C. W tym czasie komórki samoorganizują się i rozprzestrzeniają po adhezyjnych mikrowzorach i zaczynają wywierać podstawowe poziomy skurczu.

3. Dzień 2: Dodanie testowanego leku

UWAGA: Końcowe stężenie dimetylosulfotlenku (DMSO) w studzienkach zawierających przylegające komórki nie może przekroczyć 1% i lek/DMSO nie może być dodany bezpośrednio do komórek, ale powinien być najpierw rozcieńczony i zmieszany z pośrednim roztworem pożywki komórkowej.

  1. Stwórz sześcioetapową, ośmiokrotną serię rozcieńczania leku, przenosząc 30 μl leku podstawowego do kolejnych 210 μl objętości DMSO i dokładnie mieszając między każdym etapem przenoszenia. W niniejszej pracy przygotowano sześcioetapową, ośmiokrotną serię rozcieńczeń blebbitatyny w dawkach w zakresie od 40 μM do 1 nM, w DMSO.
  2. Dla każdego podstawowego roztworu leku (z kroku 3.1) wymieszać 30 μl leku z 470 μl pożywki do hodowli komórkowych. Roztwór pośredni daje 16,7-krotne rozcieńczenie DMSO.
  3. Przenieść 200 μl każdego roztworu pośredniego do odpowiedniego dołka na płytce 24-dołkowej (która zawiera już 100 μl pożywki w każdym dołku). Daje to dodatkowe sześciokrotne rozcieńczenie DMSO.
  4. Kroki 3.2 i 3.3 łącznie dają 1% końcowe stężenie DMSO w odwiertach.
  5. Umieścić poddaną działaniu substancji płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na odpowiedni czas. W tym eksperymencie stosuje się 30-minutową inkubację.
  6. Bezpośrednio przed obrazowaniem dodać Hoechst 33342 żywego roztworu barwienia jądrowego do każdego dołka (końcowe rozcieńczenie 1:10 000). Pozostaw do inkubacji przez dodatkowe 15 minut, aby oznaczyć jądra komórkowe.

4. Dzień 2: Obrazowanie płytki studziennej

  1. Uzyskaj dostęp do mikroskopu, który jest wyposażony w obrazowanie kanałów zarówno dla jąder komórkowych (DAPI), jak i mikrowzorów (TRITC).
  2. Najpierw zobrazuj komórki tylko za pomocą DMSO.
  3. Następnie skoncentruj się i zobrazuj zarówno mikrowzorce, jak i znakowane jądra komórkowe, aby zidentyfikować pojedyncze komórki i upewnić się, że oba kanały są idealnie wyrównane, aby umożliwić automatyczną analizę obrazu.
  4. Powtórz w wielu pozycjach w każdym z 24 dołków na płytce. Zdjęcia mogą być wykonywane z obiektywem 4x (lub opcjonalnie wyższym, aby przyspieszyć obrazowanie i uzyskać maksymalną liczbę punktów danych na obraz).
  5. Wyeksportuj obrazy jako pliki TIF i otwórz je na komputerze podłączonym do sieci za pomocą ImageJ, aby przeanalizować dane.

5. Po eksperymencie: Analiza obrazu

UWAGA: Analiza obrazu została przeprowadzona przy użyciu portalu Biodock.ai i oprogramowania do obrazowania.

  1. Prześlij pozyskane obrazy do komputera.
    1. Upewnij się, że odpowiednie pary obrazów mikrowzorców i obrazów jądrowych są prawidłowo nazwane.
    2. Upewnij się, że wszystkie nazwy obrazów mikrowzorców mają postać "sharedCoreName_pt.tif".
    3. Upewnij się, że wszystkie nazwy obrazów jądr mają postać "sharedCoreName_dapi.tif".
  2. Konwertuj obrazy z TIF na PNG za pomocą ImageJ.
    1. Po otwarciu ImageJ ładuj po jednym kanale na raz. W tym eksperymencie najpierw załaduj obrazy mikrowzorców jako stos do ImageJ.
    2. Korzystając z opcji Image > Adjust > Brightness/Contrastness, dostosuj jasność obrazu, aby uwydatnić mikrowzorce i zredukować tło do czerni. Oprócz tego wygładź obrazy.
    3. Korzystając z opcji Typ > obrazu > 8-bitowej, przekonwertuj obrazy na 8-bitowe.
    4. Następnie wyeksportuj obraz do formatu PNG i zaznacz pole poziom plasterka jako nazwę pliku. Teraz utwórz nowy folder PNG i zapisz tam pliki PNG o tej samej nazwie.
    5. Powtórz ten proces dla obrazów jąder.
  3. Prześlij pary obrazów PNG do oprogramowania do przetwarzania obrazu w celu analizy.
    1. Utwórz i zweryfikuj konto. Autorzy posiadają konto umożliwiające otwarty dostęp dla użytkowników akademickich.
    2. Zweryfikuj konto, kontaktując się z autorami.
    3. Zaloguj się do oprogramowania.
    4. Na karcie Dane po lewej stronie kliknij opcję Prześlij partię.
    5. Zaimportuj obrazy, przeciągając i upuszczając pary obrazów do wyskakującego okna i nazwij partię. Kliknij przycisk OK.
    6. Zaznacz pole obok nazwy partii i kliknij przycisk Analizuj.
    7. Na następnym ekranie przewiń w dół i zaznacz pole obok Analiza kurczliwości i kliknij Wybierz. W dolnej części strony wybierz z menu rozwijanego 10x jako powiększenie, które zostało użyte do obrazowania.
      1. Kliknij przycisk Prześlij. Gdy analiza danych odczyta Zakończono, kliknij nazwę partii. Na następnym ekranie kliknij Pobierz dane po prawej stronie strony.
        UWAGA: Pobrane pliki będą zawierały obrazy, które zostały przeanalizowane, podsumowanie wyników informujące o średnim skurczu na każdym obrazie oraz szczegółową analizę każdego mikrowzoru, który został wykryty na dowolnym obrazie, podając ich rozmiary, pozycje, liczbę przylegających komórek i skurcz.
      2. Wykreśl wartości skurczu w stosunku do stężeń leku, aby wygenerować krzywą stężenie-odpowiedź i określić względne potencje różnych metod leczenia.

Wyniki

Obszary obrazów uzyskanych z studni traktowanych wyłącznie DMSO oraz tych traktowanych 40 µM blebbistatyną przedstawiono obok siebie na Rysunku 3. Można wyraźnie zaobserwować, że komórki traktowane wyłącznie DMSO wykazują znaczny stopień skurczu, co wynika z bardzo wyraźnych deformacji mikrowzorców, do których przylegają komórki mięśni gładkich pęcherza moczowego (BSMCs) w tej studni. Przeciwnie, na obrazie studni traktowanej 40 µM blebbistatyną obserwuje się znaczną relaksację komórek7, ponieważ mikrowzorce, do których przylegają BSMCs, są niemal nieodróżnialne pod względem rozmiaru od mikrowzorców, do których nie przylegają komórki, co wskazuje na minimalny skurcz. Obrazy te demonstrują intuicyjną i przejrzystą wizualną reprezentację kurczliwości pojedynczych komórek, oferowaną przez metodę fluorescencyjnego mikrowzorowania. W przeciwieństwie do metod opartych na TFM, w których wielokierunkowy ruch licznych cząsteczek fluorescencyjnych rozproszonych losowo pod gęstą monowarstwą komórek ma przekazywać względną siłę skurczu, tutaj jednorodne i wyraźne skurczone geometrie mikrowzorców dostarczają bezpośrednich i łatwych do zinterpretowania informacji jakościowych o skurczu poszczególnych komórek. Można je bezpośrednio ilościowo określić, stosując standardowe binarne operacje na obiektach obrazu.

Porównanie obrazowania fluorescencyjnego, lewo: DMSO, prawo: blebbistatyna; analiza morfologii komórek.
Rycina 3: Porównanie obrazów pobranych z dołków zawierających wyłącznie 1% DMSO (lewo) lub 40 µM blebbistatyny (prawo). Wyraźnie widać, że zastosowanie blebbistatyny znacząco zmniejsza kurczliwość pojedynczych komórek, na co wskazują większe, nieskurczone mikowzory. Niebieskie jądra wskazują, które mikowzory są związane z komórkami. Pasek skali = 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Poprzez zastosowanie przeglądarkowego modułu analizy do badania uzyskanych par obrazów mikrowzorców i jąder komórkowych, otrzymano rozkłady kurczliwości pojedynczych komórek dla każdej populacji, jak pokazano na Rysunku 4. Analiza ta, szczegółowo opisana w poprzednim raporcie dotyczącym metodologii FLECS15, polega na lokalizacji pozycji i orientacji każdego mikrowzorca w kształcie litery „X”, przeliczeniu liczby jąder przywierających bezpośrednio nad centrum każdego mikrowzorca, obliczeniu średniej długości każdego mikrowzorca oraz wyznaczeniu odległości w pikselach skurczu każdego mikrowzorca w stosunku do średniej długości pustych mikrowzorców (referencja zerowego skurczu). W związku z tym puste mikrowzorce służą do ważnego celu, jakim jest normalizacja danych o skurczu. Co istotne, komórki, które nie wiążą się z mikrowzorcami, będą gromadzić się na krawędziach studzienki z powodu mikroprądów, gdzie nie będą wpływać na analizę obrazu. Jak widać na tych wykresach, niezakłócona kurczliwość populacji komórek traktowanych wyłącznie kontrolnie DMSO obejmuje szeroki zakres, sięgający aż 20 pikseli, z centrum znajdującym się w okolicy 10 pikseli. Tymczasem komórki traktowane blebbistatyną kurczą się znacznie mniej, a ich rozkład jest przesunięty w dół, do centrum wynoszącego nieco ponad 6 pikseli. Ważne jest to, że każdy pojedynczy mikrowzorzec znaleziony na obrazie, do którego przywiązała się dokładnie jedna komórka, jest reprezentowany w tych rozkładach. Dowodzi to zdolności tej metody do przekazywania różnicowych odpowiedzi komórkowych na działanie leków.

Wykres kurczliwości komórek, histogram skurczu mikrowzorców w komórkach traktowanych DMSO lub 40μM blebbistatyną.
Rycina 4: Histogramy przedstawiające dane dotyczące kurczliwości pojedynczych komórek otrzymane z analizy obrazów studzienek zawierających tylko 1% DMSO (kolor niebieski) lub 40µM blebbistatyny. Rozkład komórek traktowanych DMSO jest szeroki i skupiony wokół znacznie większej wartości skurczu (~10 pikseli) niż rozkład komórek traktowanych blebbistatyną, co wykazuje ilościowe efekty traktowania komórek blebbistatyną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykorzystując wszystkie dołki na jednej płytce 24-dołkowej i obrazując co najmniej 3 miejsca na dołek, jednocześnie generowane są sześciopunktowe krzywe zależności odpowiedzi od dawki dla dwóch związków leków. Rycina 5 przedstawia dane dotyczące zależności odpowiedzi od stężenia dla BSMC traktowanych tym samym zakresem dawek blebbistatyny lub cytochalazyny D (obu znanych inhibitorów kurczliwości). Z profili zależności odpowiedzi od stężenia wynika, że cytochalazyna D jest silniejszym inhibitorem skurczu tonicznego w tych komórkach. Poprzez dopasowanie krzywej sigmoidalnej do punktów danych można obliczyć wartości IC50 dla każdego leku. Nasze eksperymenty wskazują, że wartości IC50 wynoszą odpowiednio 7,9 µM dla blebbistatyny i 100 nM dla cytochalazyny D po około 30 min ekspozycji na leki. Co istotne, wartości te są ogólnie zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, co potwierdza dokładność ilościową metody wyznaczania siły działania inhibitorów skurczu7,21.

Wykres zależności odpowiedzi od dawki z 6 punktami; skurcz vs stężenie (µM); Blebbistatyna i Cytochalazyna D.
Rysunek 5: Krzywe zależności odpowiedzi od stężenia przedstawiające wpływ blebbistatyny i cytochalazyny D na kurczliwość komórkową w pojedynczych komórkach. Każdy punkt danych składa się z trzech obrazów dla danego warunku. Do każdego zestawu danych dopasowano krzywą sigmoidalną. Wyniki wskazują, że cytochalazyna D jest silniejsza, wykazując niższą wartość IC50. Dane te można zebrać z jednej 24-dołkowej płytki FLECS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ta uproszczona metoda ilościowego pomiaru skurczu setek tysięcy komórek jednocześnie w różnych warunkach leczenia i przy użyciu wyłącznie standardowych instrumentów mikroskopowych stanowi dostępną alternatywę dla tradycyjnego TFM dla naukowców zajmujących się biologią sił komórkowych. Ponieważ prezentowana technologia zapewnia wizualne przedstawienie skurczu komórek poprzez analizę zmian w mikrowzorcach fluorescencyjnych o regularnym kształcie, wielkość skurczu wytwarzanego przez daną komórkę jest intuicyjnie rozumiana - im mniejszy mikrowzór, tym większa siła skurczu wywierana przez komórkę.

Warto zauważyć, że oferując kontrolę nad takimi czynnikami, jak kształt, obszar rozprzestrzeniania się i cząsteczka adhezyjna składająca się na mikrowzorce (wszystkie znane czynniki regulujące kurczliwość komórek 22,23,24), prezentowana technologia systematycznie eliminuje dodatkowe zmienne, które mogą zakłócać interpretacje badań skurczu komórek.

W tym eksperymencie zastosowano sztywność 10 kPa w żelu i zastosowano mikrowzór 70 μm (długość przekątnej) złożony z kolagenu typu IV. Oprócz tych parametrów cząsteczkę adhezji można zastąpić różnymi kolagenami, fibronektyną, żelatyną i innymi macierzami zewnątrzkomórkowymi (ECM). Sztywność żelu można zmniejszyć do 0,1 kPa, a nawet do zakresu MPa. Geometria mikrowzoru może być zaprojektowana de novo tak, aby miała dowolny kształt przy minimalnym rozmiarze elementu ~5 μm. Parametry te są oddzielone i mogą być niezależnie optymalizowane dla określonego kontekstu biologicznego.

Technologia ta została szeroko zwalidowana pod kątem kompatybilności z wysoce adhezyjnymi i kurczliwymi typami komórek fenotypu mezenchymalnego, w tym różnymi typami komórek mięśni gładkich (pierwotny ludzki pęcherz, jelita, tchawicy, oskrzela, macicy, aorty i tętnicy), mezenchymalnymi komórkami macierzystymi i ich zróżnicowanym potomstwem, różnymi fibroblastami (płucnymi, skórnymi i sercowymi), miofibroblastami i komórkami śródbłonka. Ponadto makrofagi pochodzące z monocytów będą również wytwarzać dużą mierzalną siłę fagocytarną na mikrowzorce, szczególnie jeśli mikrowzór składa się ze znanej opsoniny. Za pomocą tej metody można również oznaczyć różne linie nowotworowe.

Metoda ta może stanowić pewne wyzwanie w przypadku komórek, które są albo stosunkowo małe, takie jak limfocyty T i neutrofile, albo typów komórek o fenotypie z przewagą nabłonka. Głównym tego powodem jest to, że metoda opiera się na silnej adhezji i całkowitym rozprowadzeniu komórek po mikrowzorze w celu wygenerowania mierzalnego sygnału skurczowego. Komórki, które wiążą się słabo, wiążą się ze sobą lub nie rozprzestrzeniają się całkowicie, nie wytwarzają mierzalnych sygnałów skurczowych. Te zachowania, które są stosunkowo rzadkie, można złagodzić, dostosowując rozmiar mikrowzoru, aby był mniejszy, lub stosując alternatywne cząsteczki kleju w mikrowzorcach, które będą lepiej promować adhezję i rozprzestrzenianie się w tych komórkach.

Użytkownicy tej technologii muszą dokładnie ocenić różne możliwe formuły pożywek do hodowli komórkowych dla konkretnego typu komórek, ponieważ różne składniki, czynniki wzrostu, poziomy surowicy i wrażliwość pH mogą wpływać na różne zachowania w różnych komórkach. Optymalizacja protokołu powinna poprzedzać skalowanie wszelkich eksperymentalnych przepływów pracy, a komponenty pożywek powinny być zawsze świeże, sterylne i spójne z poprzednimi partiami.

Ostatecznie, jeśli rozdzielczość pojedynczej komórki nie jest konieczna do celów użytkownika lub jeśli docelowy typ komórki ma minimalną zdolność rozprowadzania, wówczas tradycyjny TFM może być równie lub bardziej odpowiedni do takich eksperymentów. Celem i nadzieją autorów jest to, że narzędzie to zapewni biologom komórkowym dodatkową drogę do badania skurczu komórek, szczególnie w kontekście zautomatyzowanych, wysokoprzepustowych fenotypowych badań przesiewowych leków.

Specyficzne dla przyszłych zastosowań w badaniach przesiewowych leków, mogą być stosowane płytki o większej przepustowości, takie jak 384-dołkowa płytka FLECS. Na takich płytach obiektywy 4x w wielu mikroskopach mogą uchwycić całą pojedynczą studzienkę w swoim polu widzenia, zapewniając uchwycenie wszystkich komórkowych reakcji skurczowych. Dzięki zastosowaniu wysokoprzepustowego systemu obrazowania, cała 384-dołkowa płytka może zostać zobrazowana w ciągu około 5 minut, co czyni ten system znacznie szybszym niż inne opcje, a zatem nadaje się do wysokoprzepustowego odkrywania leków fenotypowych. Rzeczywiście, autorzy rutynowo przeprowadzają cotygodniowe badania przesiewowe narkotyków na ~50 384-dołkowych płytkach (w sumie ponad 19 000 dołków) przy użyciu automatyzacji.

Oświadczenia

I.P. jest wynalazcą w rodzinie patentów chroniących metody i systemy technologii FLECS. I.P., Y.W., J.Z., E.C. i R.H. są pracownikami Forcyte Biotechnologies, Inc. R.D. jest profesorem na UCLA i współzałożycielem Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z. i R.D. posiadają udziały finansowe w Forcyte Biotechnologies, Inc., która jest wyłącznym licencjobiorcą powyższych patentów i komercjalizuje technologię FLECS.

Podziękowania

Praca laboratoryjna została przeprowadzona dzięki wsparciu UCLA Molecular Shared Screening Resource (MSSR), gdzie Forcyte sponsoruje działalność badawczą, oraz Magnify Incubator w California NanoSystems Institute (CNSI), gdzie Forcyte Biotechnologies, Inc. jest rezydentem. Autorzy udzielą na żądanie dostępu do modułu analizy Biodock.ai FLECS wszystkim badaczom akademickim. L.H. i I.P. wnieśli równy wkład w tę pracę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hodowla komórek mięśni gładkich pęcherza moczowegoSciencell#4310
BlebbistatynaSigma-AldrichB0560
Pożywka do hodowli komórkowychThermofisher11765054Pożywka F12 szynki uzupełniona 10% FBS i 1% p/s
Sitko do komórekFisher Scientific7201432
RurkastożkowaFisher Scientific05-539-13
Kolba hodowlanaFisher Scientific 
Cytochalazyna DSigma-AldrichC8273
DMSO (dimetylosulfotlenek)Fisher ScientificD1284
Probówki EppendorfaFisher Scientific05-402-31
Mikroskop fluorescencyjnyUrządzenia molekularneImageXpress Confocal
Forcyte wyprodukowana przez Forcyte 24-dołkowa płytkaForcyte Biotechnologies24-HC4R-X1-QB12
Hoescht 3342 Żywa plama jądrowaThermofisher62249
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Fisher ScientificBP39920
FB012941

Bibliografia

  1. Ohama, T., Hori, M., Ozaki, H. Mechanism of abnormal intestinal motility in inflammatory bowel disease: How smooth muscle contraction is reduced. Journal of Smooth Muscle Research. 43 (2), 43-54 (2007).
  2. Peyronnet, B., et al. A comprehensive review of overactive bladder pathophysiology: On the way to tailored treatment. European Urology. 75 (6), 988-1000 (2019).
  3. Aldamanhori, R., Osman, N. I., Chapple, C. R. Underactive bladder: Pathophysiology and clinical significance. Asian Journal of Urology. 5 (1), 17-21 (2018).
  4. Sanderson, M. J., Delmotte, P., Bai, Y., Perez-Zogbhi, J. F. Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+ signaling and sensitivity. Proceedings of the American Thoracic Society. 5 (1), 23-31 (2008).
  5. Brozovich, F. V., et al. Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders. Pharmacological Reviews. 68 (2), 476-532 (2016).
  6. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  7. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  8. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  9. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  10. Rokhzan, R., et al. high-throughput measurements of cell contraction and endothelial barrier function. Laboratory Investigation. 99 (1), 138-145 (2019).
  11. Park, C. Y., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative Biology. 7 (10), 1318-1324 (2015).
  12. Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. A high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces. Journal of Visualized Experiments. (121), e55362(2017).
  13. Huang, Y., et al. Traction force microscopy with optimized regularization and automated Bayesian parameter selection for comparing cells. Scientific Reports. 9, 539(2019).
  14. Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLOS ONE. 6, 17833(2011).
  15. Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).
  16. Pushkarsky, I. FLECS technology for high-throughput single-cell force biology and screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 16 (1), 7-11 (2017).
  17. Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of PI3K promotes dilation of human small airways in a rho kinase-dependent manner. British Journal of Pharmacology. 173 (18), 2726-2738 (2016).
  18. Orfanos, S., et al. Obesity increases airway smooth muscle responses to contractile agonists. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (5), 673-681 (2018).
  19. Tseng, P., Pushkarsky, I., Carlo, D. D. Metallization and biopatterning on ultra-flexible substrates via dextran sacrificial layers. PLOS ONE. 9, 106091(2014).
  20. Yoo, E. J., et al. Gα12 facilitates shortening in human airway smooth muscle by modulating phosphoinositide 3-kinase-mediated activation in a RhoA-dependent manner. British Journal of Pharmacology. 174 (4), 4383-4395 (2017).
  21. MacGlashan, D., Vilariño, N. Polymerization of actin does not regulate desensitization in human basophils. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 627-637 (2009).
  22. Hocking, D. C., Sottile, J., Langenbach, K. J. Stimulation of integrin-mediated cell contractility by fibronectin polymerization. Journal of Biological Chemistry. 275 (14), 10673-10682 (2000).
  23. Tolić-Nørrelykke, I. M., Wang, N. Traction in smooth muscle cells varies with cell spreading. Journal of Biomechanics. 38 (7), 1405-1412 (2005).
  24. Ye, G. J. C., et al. The contractile strength of vascular smooth muscle myocytes is shape dependent. Integrative Biology. 6 (2), 152-163 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test kurczliwo cig adkie mi nie p cherza moczowegomikroskopia fluorescencyjnakrzywa zale no ci dawka odpowiedpomiar si y kom rekmikroskopia si trakcyjnychprzesiewanie lek wanaliza skurczu kom rek
Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.