Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

Siły mechaniczne generowane przez komórki są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania różnych organów w całym ciele, takich jak jelita, pęcherz moczowy, serce i inne. Narządy te muszą generować stabilne wzorce kurczenia się i rozluźniania komórek, aby utrzymać wewnętrzny stan homeostazy. Nieprawidłowy skurcz komórek mięśni gładkich (SMC) może prowadzić do wystąpienia różnych zaburzeń, w tym na przykład dysmotoryki jelit, charakteryzującej się nieprawidłowymi wzorcami skurczu mięśni gładkich jelit¹, a także stanów urologicznych nadaktywności² lub niedoczynności pęcherza³. W obrębie dróg oddechowych SMC, które wykazują nieregularne wzorce skurczów, mogą wywoływać nadreaktywność astmatyczną⁴, potencjalnie zwężając drogi oddechowe i zmniejszając przepływ tlenu do płuc. Inny powszechny stan fizyczny, nadciśnienie, jest spowodowany wahaniami skurczu mięśni gładkich w naczyniach krwionośnych⁵. Oczywiste jest, że mechanizmy skurczowe w komórkach i tkankach mogą prowadzić do chorób, które wymagają opcji leczenia. Ponieważ stany te niewątpliwie wynikają z dysfunkcyjnych zachowań kurczliwych komórek, logiczne i konieczne staje się zmierzenie samej funkcji kurczliwości komórki podczas badań przesiewowych potencjalnych kandydatów na leki.

Uznając potrzebę narzędzi do badania siły skurczu komórek, naukowcy akademiccy opracowali kilka metod ilościowego testowania skurczów, w tym mikroskopia siły trakcyjnej (TFM)⁶, mikrowzorzysty TFM⁷, pływające testy żelowe⁸, oraz testy mikropostów elastomerowych⁹. Technologie te zostały wykorzystane w wielu badaniach w formacie jednoczaszkowym, jak również w formacie wielodołkowym, a nawet zostały zaproponowane do trójwymiarowych pomiarów siły^{10,11,12,13,14}. Chociaż technologie te umożliwiły pionierskie badania w rozległej dziedzinie biologii sił komórkowych, wszystkie one były w dużej mierze ograniczone do laboratoriów posiadających określone możliwości i zasoby, w szczególności: zdolność do wytwarzania substratów TFM, zdolność do prawidłowego stosowania złożonych i nieintuicyjnych algorytmów do rozwiązywania map przemieszczeń TFM oraz stosunkowo precyzyjne systemy mikroskopowe, które mogą rejestrować obrazy wykonane przed i po usunięciu próbki ze stolika (w celu dysocjacji komórek). W związku z tym dla nieprzeszkolonego badacza bariera wejścia do stosowania tych metod może być dość wysoka, biorąc pod uwagę obszerny zestaw wymagań dotyczących stosowania tych technologii. Ponadto rozdzielczość obrazowania wymagana dla wielu istniejących technologii (obiektywy 40x lub większe) może znacznie ograniczyć przepustowość eksperymentalną, podczas gdy technologie pomiarów masowych mogą maskować wkład komórek odstających i zapobiegać wykrywaniu łagodniejszych różnic w kurczliwości. Warto zauważyć, że o ile są to świadomi autorzy, tylko niskoprzepustowe i półilościowe podejście do testowania pływającego żelu dojrzało na tyle, aby stało się dostępne dla badaczy (patrz Rysunek 1).

Rysunek 1: Ogólny schemat metody technologii FLECS. (A) Komórki są przylegające do adhezyjnych mikrowzorów białkowych, które są kowalencyjnie osadzone w cienkiej warstwie elastomerowej wspartej na szkle. (B) Widok z góry na różne możliwe kształty mikrowzorów i powiększenie komórki kurczącej się w kształcie mikrowzoru w kształcie litery "X". (C) Nakładanie fluorescencyjnych mikrowzorów i obrazów kontrastu fazowego kurczącej się komórki. (D) Obrazy przebiegu czasowego pojedynczej kurczącej się komórki. Podziałka = 25 μm. Ten rysunek został zaadaptowany za zgodą Pushkarsky et al¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podążając za ostatnimi postępami w mikrotechnologii, autorzy opracowali technologię opartą na mikropłytkach, umożliwiającą ilościowe pomiary skurczu pojedynczych komórek w setkach tysięcy komórek zwanych FLECS (fluorescencyjnie znakowane elastomerowe powierzchnie skurczalne)^{15,16,17,18,19,20}, jako alternatywa dla TFM. W tym podejściu mikrowzorce białek fluorescencyjnych są osadzane w miękkich warstwach, które odkształcają się i kurczą, gdy komórki przykładają do nich siły ciągnące, w intuicyjny i mierzalny sposób. Co ważne, mikrowzorce białek ograniczają pozycję, kształt i obszar rozprzestrzeniania się komórek, co prowadzi do jednolitych warunków testowych. Pozwalają one na proste pomiary oparte wyłącznie na ich zmianach wymiarowych, które są wysoce rozdzielcze przestrzennie nawet na obrazach o 4-krotnym powiększeniu. Metoda zawiera moduł analizy obrazu oparty na przeglądarce internetowej i umożliwia prostą analizę siły kurczliwej komórki bez konieczności stosowania delikatnych procedur obchodzenia się z nią lub rejestracji markerów powierniczych, dzięki czemu powinna być obsługiwana przez każdego badacza posiadającego podstawowe urządzenie do hodowli komórek i prosty mikroskop fluorescencyjny o małym powiększeniu (Rysunek 2). Ta technologia, która jest gotowa do użycia i dostępna na rynku, została zaprojektowana z myślą o użytkowniku końcowym i ma na celu zmniejszenie bariery wejścia dla każdego naukowca laboratoryjnego do badania biologii sił komórkowych.

Rysunek 2: Schemat formatu płytki 24-dołkowej do testu kurczliwości pojedynczych komórek. Format ten został wykorzystany w eksperymentach opisanych w niniejszym dokumencie i przedstawionych w części wideo artykułu. Podziałka = 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W tej pracy prezentujemy protokół zastosowania formatu płytki 24-dołkowej platformy technologicznej FLECS do ilościowego określenia wpływu leków modulujących siłę na kurczliwość komórkową w pierwotnych komórkach mięśni gładkich pęcherza moczowego. Ten protokół ogólnego przeznaczenia może być dostosowywany i modyfikowany w razie potrzeby, aby uwzględnić różne inne skale czasowe, typy komórek i warunki leczenia, a także skalowany w celu odpowiedzi na inne pytania w obowiązującej biologii.

1. Dzień 1: Przygotowanie płytki 24-dołkowej

1. Procedurę należy rozpocząć od dodania 20 ml pożywki do hodowli komórkowych do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. W tym eksperymencie użyto pożywki na bazie szynki F12 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
2. Uzyskać 24-dołkową płytkę przeznaczoną do oznaczania kurczliwości komórek. Ustawić pipetę na 500 μl i zaopatrzyć się w sitko do pasażowania komórek.
   UWAGA: Płyta jest dostępna u autorów na życzenie.
3. Podnieś i przytrzymaj talerz jedną ręką, a następnie delikatnie odklej plastikową folię od góry płytki. Następnie ostrożnie odłóż talerz z powrotem.
4. Włącz aspirator próżniowy i odessaj górną warstwę soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) ze studzienek, aby zapobiec rozlaniu. Usuwaj PBS po jednym wierszu na raz. Gdy studzienki nie są już całkowicie pełne, trzymaj płytkę w jednej ręce i ostrożnie wyjmij resztę PBS z dołków. Szybko napełnij 500 μl pożywki do hodowli komórkowych. Uważaj, aby uniknąć kontaktu aspiratora z dnem studzienki.
5. Delikatnie potrząśnij płytką i postukaj w bok, aby upewnić się, że całe dno studzienki jest pokryte roztworem. Gdy wszystkie studzienki zostaną wypełnione podłożem, odłóż płytkę na bok.

2. Dzień 1: Zasiewanie komórek

1. Pobrać kolbę hodowlaną z pasażowanymi przez 7 lub niższe pierwotne komórki mięśni gładkich ludzkiego pęcherza moczowego (BSM) z inkubatora o temperaturze 37 °C. Pod mikroskopem sprawdź morfologię komórek i upewnij się, że komórki osiągnęły co najmniej 90% konfluencji, ale mniej niż 100% konfluencji.
2. Przeprowadź protokół dysocjacji komórek. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego trypsynizuj komórki przez 2,5 minuty, aż komórki zostaną odłączone, a następnie schładzaj je pożywką uzupełnioną surowicą (10% FBS).
3. Po dysocjacji komórek użyj hemocytometru, aby policzyć komórki i rozcieńczyć zawiesinę komórek do około 50 000 komórek/ml w pożywce uzupełnionej surowicą. Co ważne, komórki wymagają co najmniej 2% surowicy, aby przyłączyć się do mikrowzorów.
4. Przed wysiewem należy szybko przecedzić zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 40 lub 100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z pipetą serologiczną, aby rozbić grudki komórek na pojedyncze komórki.
5. Ostrożnie dodać 500 μl zawiesiny komórek o objętości 50 000 komórek/ml do każdej z 24 studzienek na płytce za pomocą pipety P1000, dozując roztwór kroplami w różnych miejscach w studzienkach.
6. Po wysianiu komórek pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na 1 godzinę, aby komórki mogły osiąść bezpośrednio na mikrowzorach bez wpływu mikroprądów generowanych przez parowanie. Po upływie 1 godziny umieścić płytkę na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C. W tym czasie komórki samoorganizują się i rozprzestrzeniają po adhezyjnych mikrowzorach i zaczynają wywierać podstawowe poziomy skurczu.

3. Dzień 2: Dodanie testowanego leku

UWAGA: Końcowe stężenie dimetylosulfotlenku (DMSO) w studzienkach zawierających przylegające komórki nie może przekroczyć 1% i lek/DMSO nie może być dodany bezpośrednio do komórek, ale powinien być najpierw rozcieńczony i zmieszany z pośrednim roztworem pożywki komórkowej.

1. Stwórz sześcioetapową, ośmiokrotną serię rozcieńczania leku, przenosząc 30 μl leku podstawowego do kolejnych 210 μl objętości DMSO i dokładnie mieszając między każdym etapem przenoszenia. W niniejszej pracy przygotowano sześcioetapową, ośmiokrotną serię rozcieńczeń blebbitatyny w dawkach w zakresie od 40 μM do 1 nM, w DMSO.
2. Dla każdego podstawowego roztworu leku (z kroku 3.1) wymieszać 30 μl leku z 470 μl pożywki do hodowli komórkowych. Roztwór pośredni daje 16,7-krotne rozcieńczenie DMSO.
3. Przenieść 200 μl każdego roztworu pośredniego do odpowiedniego dołka na płytce 24-dołkowej (która zawiera już 100 μl pożywki w każdym dołku). Daje to dodatkowe sześciokrotne rozcieńczenie DMSO.
4. Kroki 3.2 i 3.3 łącznie dają 1% końcowe stężenie DMSO w odwiertach.
5. Umieścić poddaną działaniu substancji płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na odpowiedni czas. W tym eksperymencie stosuje się 30-minutową inkubację.
6. Bezpośrednio przed obrazowaniem dodać Hoechst 33342 żywego roztworu barwienia jądrowego do każdego dołka (końcowe rozcieńczenie 1:10 000). Pozostaw do inkubacji przez dodatkowe 15 minut, aby oznaczyć jądra komórkowe.

4. Dzień 2: Obrazowanie płytki studziennej

1. Uzyskaj dostęp do mikroskopu, który jest wyposażony w obrazowanie kanałów zarówno dla jąder komórkowych (DAPI), jak i mikrowzorów (TRITC).
2. Najpierw zobrazuj komórki tylko za pomocą DMSO.
3. Następnie skoncentruj się i zobrazuj zarówno mikrowzorce, jak i znakowane jądra komórkowe, aby zidentyfikować pojedyncze komórki i upewnić się, że oba kanały są idealnie wyrównane, aby umożliwić automatyczną analizę obrazu.
4. Powtórz w wielu pozycjach w każdym z 24 dołków na płytce. Zdjęcia mogą być wykonywane z obiektywem 4x (lub opcjonalnie wyższym, aby przyspieszyć obrazowanie i uzyskać maksymalną liczbę punktów danych na obraz).
5. Wyeksportuj obrazy jako pliki TIF i otwórz je na komputerze podłączonym do sieci za pomocą ImageJ, aby przeanalizować dane.

5. Po eksperymencie: Analiza obrazu

UWAGA: Analiza obrazu została przeprowadzona przy użyciu portalu Biodock.ai i oprogramowania do obrazowania.

1. Prześlij pozyskane obrazy do komputera.
   1. Upewnij się, że odpowiednie pary obrazów mikrowzorców i obrazów jądrowych są prawidłowo nazwane.
   2. Upewnij się, że wszystkie nazwy obrazów mikrowzorców mają postać "sharedCoreName_pt.tif".
   3. Upewnij się, że wszystkie nazwy obrazów jądr mają postać "sharedCoreName_dapi.tif".
2. Konwertuj obrazy z TIF na PNG za pomocą ImageJ.
   1. Po otwarciu ImageJ ładuj po jednym kanale na raz. W tym eksperymencie najpierw załaduj obrazy mikrowzorców jako stos do ImageJ.
   2. Korzystając z opcji Image > Adjust > Brightness/Contrastness, dostosuj jasność obrazu, aby uwydatnić mikrowzorce i zredukować tło do czerni. Oprócz tego wygładź obrazy.
   3. Korzystając z opcji Typ > obrazu > 8-bitowej, przekonwertuj obrazy na 8-bitowe.
   4. Następnie wyeksportuj obraz do formatu PNG i zaznacz pole poziom plasterka jako nazwę pliku. Teraz utwórz nowy folder PNG i zapisz tam pliki PNG o tej samej nazwie.
   5. Powtórz ten proces dla obrazów jąder.
3. Prześlij pary obrazów PNG do oprogramowania do przetwarzania obrazu w celu analizy.
   1. Utwórz i zweryfikuj konto. Autorzy posiadają konto umożliwiające otwarty dostęp dla użytkowników akademickich.
   2. Zweryfikuj konto, kontaktując się z autorami.
   3. Zaloguj się do oprogramowania.
   4. Na karcie Dane po lewej stronie kliknij opcję Prześlij partię.
   5. Zaimportuj obrazy, przeciągając i upuszczając pary obrazów do wyskakującego okna i nazwij partię. Kliknij przycisk OK.
   6. Zaznacz pole obok nazwy partii i kliknij przycisk Analizuj.
   7. Na następnym ekranie przewiń w dół i zaznacz pole obok Analiza kurczliwości i kliknij Wybierz. W dolnej części strony wybierz z menu rozwijanego 10x jako powiększenie, które zostało użyte do obrazowania.
      1. Kliknij przycisk Prześlij. Gdy analiza danych odczyta Zakończono, kliknij nazwę partii. Na następnym ekranie kliknij Pobierz dane po prawej stronie strony.
         UWAGA: Pobrane pliki będą zawierały obrazy, które zostały przeanalizowane, podsumowanie wyników informujące o średnim skurczu na każdym obrazie oraz szczegółową analizę każdego mikrowzoru, który został wykryty na dowolnym obrazie, podając ich rozmiary, pozycje, liczbę przylegających komórek i skurcz.
      2. Wykreśl wartości skurczu w stosunku do stężeń leku, aby wygenerować krzywą stężenie-odpowiedź i określić względne potencje różnych metod leczenia.

Regiony obrazów uzyskanych z odwiertów, które były traktowane tylko DMSO, oraz te, które były traktowane 40 μM blebbistatyną, są pokazane obok siebie w Rysunek 3. Można wyraźnie zaobserwować, że komórki traktowane wyłącznie DMSO wykazują znaczny poziom skurczu w oparciu o bardzo wyraźne deformacje mikrowzorów przylegających do komórek mięśni gładkich pęcherza moczowego (BSMC) w tej studni. I odwrotnie, na obrazie dobrze potraktowanego 40 μM blebbistatyną obserwuje się znaczne rozluźnienie komórek7, ponieważ mikrowzorce przylegające do BSMC są prawie nie do odróżnienia pod względem wielkości od mikrowzorów, które nie są przestrzegane przez komórki, co wskazuje na minimalny skurcz. Obrazy te pokazują intuicyjną i przejrzystą wizualną reprezentację kurczliwości pojedynczych komórek oferowaną przez metodę mikrowzorców fluorescencyjnych. W przeciwieństwie do metod opartych na TFM, w których dookólny ruch wielu cząstek fluorescencyjnych losowo rozmieszczonych pod gęstą monowarstwą komórki ma na celu przeniesienie względnej siły skurczu, tutaj jednolite i wyraźnie zawężone geometrie mikrowzorów dostarczają natychmiastowych i łatwych do interpretacji informacji jakościowych o kurczeniu się poszczególnych komórek. Można je bezpośrednio określić ilościowo, stosując standardowe operacje na obiektach binarnych na obrazach.

Rysunek 3: Porównanie obok siebie zdjęć wykonanych studni zawierających tylko 1% DMSO (po lewej) lub zawierających 40 μM bróbstatyny (po prawej). Można wyraźnie zaobserwować, że leczenie blebbistatyną znacznie zmniejsza kurczliwość pojedynczych komórek, na co wskazują większe, nieskurczone mikrowzorce. Niebieskie jądra wskazują, które mikrowzory są związane przez komórki. Podziałka = 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Stosując moduł analizy oparty na przeglądarce do analizy uzyskanych par obrazów mikrowzorów i jąder komórkowych, uzyskuje się rozkłady kurczliwości pojedynczych komórek dla każdej populacji, jak pokazano na Rysunek 4. Opisana szczegółowo w poprzednim raporcie na temat metodologii FLECS15, analiza polega na zlokalizowaniu pozycji i orientacji każdego mikrowzoru w kształcie litery "X", zliczeniu liczby jąder przylegających bezpośrednio do środka każdego mikrowzoru, obliczeniu średniej długości każdego mikrowzoru i obliczeniu odległości pikseli skurczu każdego mikrowzoru w odniesieniu do średniej długości pustych mikrowzorów (odniesienie do zerowego skurczu). Dlatego puste mikrowzorce służą ważnemu celowi normalizacji danych skurczu. Co ważne, komórki, które nie wiążą się z mikrowzorcami, będą gromadzić się na granicach studni z powodu mikroprądów, gdzie nie wpłyną na analizę obrazu. Jak widać na tych wykresach, niezakłócona kurczliwość populacji komórek traktowanej tylko kontrolami DMSO obejmuje szeroki zakres nawet 20 pikseli, z centrum znajdującym się na około 10 pikselach. Tymczasem komórki traktowane blebbistatyną kurczą się znacznie mniej, a ich dystrybucja jest zepchnięta do środka nieco ponad 6 pikseli. Co ważne, każdy pojedynczy mikrowzór znaleziony na obrazie, który wiąże się dokładnie na komórce, jest reprezentowany w tych rozkładach. Pokazuje to zdolność metody do przekazywania zróżnicowanych odpowiedzi komórkowych na leczenie farmakologiczne.

Rysunek 4: Histogramy przedstawiające dane dotyczące kurczliwości pojedynczych komórek uzyskane z analizy zdjęć wykonanych na studniach zawierających tylko 1% DMSO (niebieski) lub 40μM blebbistatyny. Dystrybucja komórek traktowanych DMSO jest szeroka i wyśrodkowana przy znacznie większej wartości skurczu (~10 pikseli) niż dystrybucja traktowana blebbistatyną, co pokazuje ilościowe efekty leczenia komórek blebbistatyną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykorzystując wszystkie dołki na pojedynczej płytce 24-dołkowej i obrazując co najmniej 3 miejsca na dołek, sześciopunktowe krzywe dawka-odpowiedź są generowane jednocześnie dla dwóch związków leczniczych. Rysunek 5 pokazuje dane dotyczące stężenia-odpowiedzi dla BSMC leczonych tym samym zakresem dawek bróbstatyny lub cytochalazyny D (oba znane inhibitory kurczliwości). Jak wynika z profili stężenie-odpowiedź, cytochalazyna D jest silniejszym inhibitorem skurczu tonicznego w tych komórkach. Dopasowując krzywą sigmoidalną do punktów danych, można obliczyć wartości IC50 dla każdego leku. Nasze eksperymenty wskazują, że IC50 wynoszą odpowiednio 7,9 μM i 100 nM dla bróbstatyny i cytochalazyny D, po ~30 minutach ekspozycji na leki. Co ważne, ogólnie rzecz biorąc, wartości te są zgodne z wcześniejszymi raportami, potwierdzającymi ilościową dokładność metody określania siły działania inhibitorów skurczu7,21.

Rysunek 5: Krzywe stężenie-odpowiedź przedstawiające wpływ blabistatyny i cytochalazyny D na kurczliwość komórek w pojedynczych komórkach. Każdy punkt danych składa się z trzech obrazów dla tego warunku. Krzywa sigmoidalna została dopasowana do każdego zestawu danych. Wyniki wskazują, że cytochalazyna D jest silniejsza, ma niższą wartość IC50. Dane te można zebrać z pojedynczej 24-dołkowej płytki FLECS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

I.P. jest wynalazcą w rodzinie patentów chroniących metody i systemy technologii FLECS. I.P., Y.W., J.Z., E.C. i R.H. są pracownikami Forcyte Biotechnologies, Inc. R.D. jest profesorem na UCLA i współzałożycielem Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z. i R.D. posiadają udziały finansowe w Forcyte Biotechnologies, Inc., która jest wyłącznym licencjobiorcą powyższych patentów i komercjalizuje technologię FLECS.