Artykuł metodologiczny

Mikroskopia fluorescencyjna trójfotonowa tkanek głębokich w nienaruszonym mózgu myszy i danio pręgowanego

4.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63213

⸱

13 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Applied and Engineering Physics, Cornell University, 2Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 3College of Veterinary Medicine, Cornell University, 4Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroskopia trójfotonowa umożliwia obrazowanie fluorescencyjne o wysokim kontraście głęboko w żywych tkankach biologicznych, takich jak mózgi myszy i danio pręgowanego, z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Streszczenie

Techniki mikroskopii wielofotonowej, takie jak mikroskopia dwufotonowa (2PM) i mikroskopia trójfotonowa (3PM), są potężnymi narzędziami do obrazowania tkanek głębokich in vivo z rozdzielczością subkomórkową. 3PM ma dwie główne zalety dla obrazowania tkanek głębokich w porównaniu z 2PM, które jest szeroko stosowane w laboratoriach biologicznych: (i) dłuższa długość tłumienia w tkankach rozpraszających dzięki zastosowaniu lasera wzbudzającego ~1,300 nm lub ~1,700 nm; (ii) mniejsze generowanie fluorescencji tła z powodu wzbudzenia nieliniowego wyższego rzędu. W rezultacie, 3PM umożliwia obrazowanie strukturalne i funkcjonalne o wysokim kontraście głęboko w tkankach rozproszonych, takich jak nienaruszony mózg myszy, od warstw korowych do hipokampa i całego przodomózgowia dorosłego danio pręgowanego.

Dzisiaj, źródła laserowe odpowiednie dla 3PM są dostępne na rynku, umożliwiając konwersję istniejącego systemu obrazowania dwufotonowego (2P) na system trójfotonowy (3P). Ponadto dostępnych jest wiele komercyjnych mikroskopów 3P, co sprawia, że technika ta jest łatwo dostępna dla laboratoriów badawczych zajmujących się biologią. Ten artykuł pokazuje optymalizację typowej konfiguracji 3PM, szczególnie ukierunkowanej na grupy biologiczne, które mają już konfigurację 2P, i demonstruje obrazowanie 3D w trybie przyżyciowym w nienaruszonych mózgach myszy i dorosłych danio pręgowanego. Protokół ten obejmuje pełną procedurę eksperymentalną obrazowania 3P, w tym wyrównanie mikroskopu, wstępne chirping impulsów laserowych ~1,300 i ~1,700 nm, przygotowanie zwierząt i przyżyciowe obrazowanie fluorescencyjne 3P głęboko w mózgach dorosłych danio pręgowanych i myszy.

Wprowadzenie

W naukach o życiu techniki mikroskopii wielofotonowej (MPM), takie jak 2PM i 3PM, stały się potężnymi narzędziami do głębokiego obrazowania in vivo z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną i wysokim kontrastem w tkankach rozpraszających. Dodatkowo metody te powodują mniejszy fotobleaching w porównaniu z konfokalną mikroskopią jednofotonową1,2,3,4. 3PM jest korzystniejsza w obrazowaniu głębszych warstw tkanki w porównaniu z 2PM ze względu na dwie główne cechy: (i) zastosowanie dłuższej długości fali wzbudzenia (~1,300 nm lub ~1,700 nm) redukuje rozpraszanie w tkance oraz (ii) proces wzbudzenia wyższego rzędu (tzn. sygnał fluorescencji w 3PM zależy od sześcianu mocy wzbudzenia, zamiast od kwadratu mocy wzbudzenia w 2PM), co tłumi niepożądaną fluorescencję tła3. W konsekwencji 3PM umożliwia obrazowanie o wysokim kontraście w głębszych obszarach żywych tkanek, takich jak hipokamp w nienaruszonym mózgu dorosłej myszy3,5,6,7,8,9,10,11 oraz cały przedmózg dorosłego danio pręgowanego12, w tym rejestrację aktywności Ca2+ i obserwacje wielokolorowe. Ponadto za pomocą 3PM uzyskano obrazy o wysokim kontraście poprzez nienaruszone czaszki myszy i dorosłego danio pręgowanego12,13.

Obecnie w sprzedaży dostępne są źródła laserów wzbudzających odpowiednie do wzbudzania trójfotonowego (3PE) przy długościach fali ~1,300 i ~1,700 nm. Ponieważ system skanowania laserowego jest w zasadzie taki sam dla 2PM i 3PM, w laboratoriach biologicznych możliwe jest przekształcenie istniejącego układu 2P w układ 3P poprzez instalację dostępnego komercyjnie lasera do 3PE. Sygnał fluorescencji 3P zależy od mocy lasera, czasu trwania impulsu, częstotliwości repetycji lasera oraz apertury numerycznej (NA) obiektywu. Przy założeniu ogniska ograniczonego dyfrakcyjnie (tj. gdy tylna apertura obiektywu jest przepełniona przez wiązkę wzbudzającą), równanie (1) opisuje średni w czasie strumień fotonów fluorescencji z objętości ogniskowej wynikający z 3PE.

Równanie optyki nieliniowej do badań w dziedzinie fotoniki i spektroskopii; reprezentacja wzoru matematycznego. (1)

Gdzie f częstotliwość powtarzania impulsu lasera, τ czas trwania impulsu lasera (pełna szerokość w połowie maksimum), ϕ wydajność zbierania układu, η jest wydajność kwantowa fluorescencji, σ3 jest to przekrój czynny na absorpcję 3-fotonową, C stężenie fluoroforu, n0 jest współczynnikiem załamania światła medium próbki (np. wody), λ czy długość fali wzbudzenia w próżni wynosi, ND jest aperturą numeryczną obiektywu, a3 jest stałą integracji przestrzennej objętości ogniskowej, Wzór na równowagę statyczną ⟨P(t)⟩ w kontekście analizy równań fizycznych. jest to uśredniony w czasie strumień fotonów wzbudzenia (fotony/s) pod obiektywem, z jest głębokością obrazowania, a EAL jest efektywną długością tłumienia14W tym przypadku przyjęto, że EAL (zazwyczaj > 100 µm) jest znacznie większa niż rozdzielczość osiowa mikroskopu (zazwyczaj < 10 µm). W przybliżeniu paraksjalnym, a3 wynosi 28,114. gp(3) Czy 3 jestrd-rzędową spójność czasową źródła wzbudzenia oraz gp(3) wynosi odpowiednio 0,41 dla impulsów o kształcie kwadratu sekansa hiperbolicznego oraz 0,51 dla impulsów gaussowskich. Wydajność zbierania ϕ można oszacować, biorąc pod uwagę zbieranie fluorescencji przez obiektyw, transmitancję obiektywu, odblaskowość lustra dichroicznego, transmitancję filtrów oraz wydajność detekcji detektora (np. fotopowielacza, PMT). Ponieważ intensywność fluorescencji 3P jest silnie zależna od wielu parametrów, optymalizacja układu 3P jest niezbędna w celu maksymalizacji sygnałów fluorescencji 3P.

Niniejszy protokół ilustruje proces optymalizacji typowego układu 3P, co będzie szczególnie przydatne dla laboratoriów biologicznych, które dysponują układem 2P i planują rozszerzyć jego możliwości o obrazowanie 3P lub chcą utrzymać komercyjny układ 3P na optymalnym poziomie wydajności. Ten artykuł wideo demonstruje również głębokie obrazowanie 3P w mózgach żywych zwierząt. Pierwsza sekcja dotyczy optymalizacji typowego układu 3P z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego źródła laserowego i mikroskopu wielofotonowego. Druga i trzecia sekcje opisują odpowiednio przygotowanie danio pręgowanego i myszy do 3PM struktur i aktywności neuronalnej. Operacja kraniotomii u myszy została wcześniej opisana w artykułach protokołowych15,16,17. Czwarta sekcja prezentuje obrazowanie 3P intravitalne w mózgach danio pręgowanego i myszy.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach oraz procedury dotyczące ich utrzymania w przypadku danio pręgowanych i myszy zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Cornell. Po zakończeniu eksperymentu danio pręgowane i myszy zostały poddane eutanazji odpowiednio za pomocą stężonego roztworu trikainy oraz poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla.

1. Optymalizacja układu mikroskopii trójfotonowej

UWAGA: W celu ochrony oczu należy nosić okulary ochronne do pracy z laserem. Podczas rozmieszczania lub przesuwania elementów optycznych wiązkę lasera należy zasłonić blokadą wiązki. Do wizualizacji lasera należy użyć podglądacza podczerwieni lub karty detekcyjnej podczerwieni.

  1. Włącz laser i ustaw centralną długość fali wyjściowej idlera w nieliniowym optycznym wzmacniaczu parametrycznym (NOPA) na ~1 300 nm lub ~1 700 nm.
  2. Umieść cienkie szkło podstawowe na linii wiązki z portu sygnałowego NOPA (tj. ~700-900 nm), aby odbić niewielką część wiązki lasera do fotodiody krzemowej (Si) w celu uzyskania sygnałów wyzwalających (Rysunek 1). W ścieżce transmisji przez szkło podstawowe umieść blokadę wiązki.
  3. Umieść kompresory impulsów na drodze światła, aby wstępnie zuprechirpować laser femtosekundowy i zoptymalizować czas trwania impulsu dla 3PM. Dla wiązki ~1 300 nm zastosuj kompresor z parą pryzmatów18,19 (np. pary pryzmatów N-SF11). Dla lasera ~1 700 nm zastosuj płytkę Si o grubości ~3 mm20. Ustaw kąt między płytką Si a drogą lasera pod kątem Brewstera (~73,9° dla 1 700 nm), aby zmaksymalizować transmitancję lasera. Obracaj płytkę Si, aby uzyskać kąt Brewstera poprzez minimalizację odbicia.
  4. Zastosuj lustra flipowe, aby umożliwić wygodne przełączanie między liniami wiązek ~1 300 nm i ~1 700 nm.
  5. Umieść płytkę ćwierćfalową (np. achromatyczną płytkę półfalową odpowiednią dla ~1 300 i ~1 700 nm) zamontowaną na stoliku obrotowym oraz polaryzacyjny dzielnik wiązki (PBS) w celu kontroli intensywności lasera. W ścieżce odbicia PBS umieść blokadę wiązki.
    UWAGA: Wiązka lasera musi przechodzić przez PBS prostopadle, aby uzyskać wysoki współczynnik ekstynkcji. Moc lasera dla 3PM kontroluje się poprzez obracanie płytki półfalowej.
  6. Umieść cienkie szkło podstawowe na drodze światła za kontrolerem mocy i przed migawką optyczną, aby odbić niewielką część wiązki lasera do miernika mocy. Użyj miernika mocy jako „referencyjnego miernika mocy” do obliczenia mocy lasera pod obiektywem podczas obrazowania (patrz krok 1.12).
  7. Wyrównaj drogę lasera, regulując lustra tak, aby wiązka propagowała się do systemu 3PM.
  8. Zmierz rozmiar wiązki w pozycji tylnej apertury obiektywu, używając krawędzi noża na stoliku translacyjnym i miernika mocy. Upewnij się, że rozmiar wiązki nie jest zbyt mały ani zbyt duży.
    UWAGA: Zazwyczaj wiązka nieco niedopełnia obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej (NA), aby uzyskać wysoką przepustowość mocy przy obrazowaniu głębokich tkanek. Na przykład rozmiar wiązki ~10-13 mm (1/e2) na tylnej aperturze obiektywu Olympus (średnica tylnej apertury ~15 mm) pomaga uzyskać efektywną NA rzędu ~0,7-0,9. Gdy rozmiar wiązki jest zbyt mały, sygnał 3P staje się słaby, a rozdzielczość przestrzenna pogarsza się z powodu niskiej efektywnej NA. Gdy rozmiar wiązki jest zbyt duży, maksymalna dostępna moc wzbudzenia pod obiektywem staje się słaba z powodu strat mocy na tylnej aperturze obiektywu. W obrazowaniu głębokich tkanek promienie brzegowe ulegają również większym stratom ze względu na dłuższą drogę w tkance.
  9. Jeśli rozmiar wiązki na tylnej aperturze obiektywu jest niewłaściwy, umieść odpowiednie elementy optyczne, takie jak soczewki wypukłe, na drodze wiązki lasera, aby skorygować rozmiar wiązki.
    UWAGA: Upewnij się, że wiązka lasera nie jest większa niż lustra galwanometryczne, aby zapobiec niepotrzebnym stratom mocy.
  10. Zamontuj obiektyw w układzie 3PM.
  11. Zmierz czas trwania impulsu za obiektywem za pomocą autokorelatora. Jeśli czas trwania impulsu jest zbyt długi (np. >70 fs), wyreguluj kompresor impulsów, aby uzyskać krótsze impulsy. Do 3PM używaj impulsów ~50-70 fs oraz interferometru Michelsona umieszczonego między laserem a obiektywem, aby zapewnić opóźnienie dla pomiarów autokorelacji.
    UWAGA: Fotodioda z odpowiednią odpowiedzią spektralną (np. fotodioda krzemowa dla długości fali większej niż 1 200 nm) umieszczona w ogniskowej obiektywu może wygodnie służyć jako detektor nieliniowy, a dwufotonowy prąd z fotodiody może zostać wykorzystany do uzyskania przebiegów autokorelacji20. Kompresor z parą pryzmatów dla ~1 300 nm można regulować na dwa sposoby: (1) zmieniając odległość między dwoma pryzmatami; (2) zmieniając długość drogi wiązki lasera w szkle pryzmatu poprzez przesuwanie pryzmatu(ów) prostopadle do linii bazowej pryzmatu. Kompresor z płytką Si dla ~1 700 nm można regulować poprzez zastąpienie płytki Si płytką grubszą lub cieńszą.
  12. Umieść miernik mocy na wyjściu obiektywu. Zmierz moc lasera pod obiektywem i odczytaj wartość z referencyjnego miernika mocy (z kroku 1.6). Oblicz stosunek mocy pod obiektywem do mocy na referencyjnym mierniku mocy.
    UWAGA: Podczas obrazowania rzeczywistą moc lasera pod obiektywem można obliczyć na podstawie stosunku mocy i wartości z referencyjnego miernika mocy.
  13. Usuń miernik mocy spod obiektywu.
  14. [Opcjonalnie] Zweryfikuj wydajność systemu obrazowania ograniczoną szumem śrutowym fotonów
    UWAGA: Do wykonania tego zadania potrzebne są następujące elementy: 1) próbka barwnika fluoresceiny lub Texas Red (np. ~10 µM), 2) licznik fotonów i 3) oscyloskop.
    1. Umieść próbkę z barwnikiem pod obiektywem 3PM.
    2. Ostrożnie obniż obiektyw nad próbką, aż odległość będzie mniejsza niż robocza odległość obiektywu.
    3. Umieść wodę między soczewką a szkłem podstawowym próbki z barwnikiem.
    4. Ustaw moc wyjściową mikroskopu na niską wartość (np. <1 mW przy częstotliwości powtarzania impulsów ~1 MHz), aby zlokalizować powierzchnię próbki z barwnikiem.
    5. Uruchom sesję Live mikroskopu i ustaw położenie z na zero.
    6. Powoli odsuwaj obiektyw od próbki, aż osiągniesz górną powierzchnię próbki z barwnikiem (co zostanie zasygnalizowane przez generację trzeciej harmonicznej (THG) powstającą na szkle podstawowym).
    7. Ustaw położenie z na zero w pozycji szkła podstawowego.
    8. Obniż nieco obiektyw, aż w kanale fluorescencji pojawi się wyraźny sygnał fluorescencji.
    9. Podłącz wyjście PMT do rozdzielacza BNC. Wyjścia rozdzielacza podłącz do licznika fotonów oraz systemu akwizycji obrazu.
    10. Ustaw moc lasera na wartość, przy której liczba zliczeń fotonów na sekundę jest mniejsza niż 5% częstotliwości powtarzania lasera (np. Statyczna równowaga; ΣFx≤0; schemat; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności.50 000 fotonów/s przy użyciu lasera 1 MHz).
    11. Zredukuj pole widzenia do minimalnej możliwej wartości za pomocą oprogramowania i upewnij się, że jasność jest jednolita na całym obrazie.
    12. Ustaw częstotliwość klatek na 1,0 klatki na sekundę.
    13. Ustaw okres akwizycji licznika fotonów na t = liczba pikseli na klatkę × czas przebywania piksela oraz odpowiedni poziom dyskryminatora.
    14. Jednocześnie zbierz liczbę fotonów i liczbę pikseli przez ten sam okres. Aby uzyskać liczbę pikseli, zbierz średnie wartości pikseli z całego obrazu, a także wartości średniej i odchylenia standardowego.
    15. Powtórz krok 1.14.14, blokując laser wzbudzający, aby uzyskać liczbę fotonów i pikseli dla tła (dark count).
    16. Zatrzymaj akwizycję Live w oprogramowaniu.
    17. Odejmij zliczenia tła (uzyskane w kroku 1.14.15) od zliczeń fotonów (uzyskanych w kroku 1.14.14) oraz od całkowitej liczby pikseli (uzyskanej w kroku 1.14.14).
    18. Podziel całkowitą liczbę pikseli po odjęciu tła przez liczbę fotonów po odjęciu tła (uzyskaną w kroku 1.14.17). Użyj otrzymanej wartości jako „współczynnika konwersji” (tj. wartości pikseli/foton) z wartości piksela na liczbę fotonów.
    19. Przelicz średnią i odchylenie standardowe liczby pikseli (uzyskane w kroku 1.14.14) na liczbę fotonów, dzieląc je przez „współczynnik konwersji” (uzyskany w kroku 1.14.18). Porównaj średnią i odchylenie standardowe liczby fotonów. Upewnij się, że odchylenie standardowe jest w przybliżeniu równe pierwiastkowi kwadratowemu ze średniej liczby fotonów, jeśli wydajność systemu obrazowania jest bliska granicy szumu śrutowego.
  15. [Opcjonalnie] Zweryfikuj wydajność detekcji sygnału mikroskopu.
    1. Aby przetestować wydajność mikroskopu i wydajność detekcji sygnału, wykonaj kroki 1.14.1-1.14.17 w celu uzyskania zliczeń fotonów. W kroku 1.14.15 przygotuj ślepą próbkę składającą się z rozpuszczalnika barwnika i uzyskaj zliczenia fotonów dla próbki ślepej przy włączonym laserze i tej samej mocy, co dla próbki z barwnikiem. Odejmij zliczenia z próby ślepej od zliczeń fotonów z próbki z barwnikiem, aby uzyskać liczbę fotonów fluorescencji.
    2. Użyj znanych przekrojów 3P fluoresceiny lub Texas Red10,22 oraz Równania (1) (z efektywną NA uwzględniającą prawidłowe wypełnienie tylnej apertury), aby obliczyć oczekiwaną liczbę fotonów, a następnie porównaj obliczoną wartość z liczbą fotonów zmierzoną eksperymentalnie. Zapisz obie wartości w dzienniku laboratoryjnym jako wyniki testów mikroskopu do przyszłych odniesień.
      UWAGA: Upewnij się, że wartości obliczone i zmierzone są bliskie sobie (np. w granicach współczynnika 2). Takie ilościowe testy systemu są szczególnie przydatne dla zapewnienia spójnej wydajności obrazowania w czasie.

2. Przygotowanie ryb do 3PM

UWAGA: Podczas tej procedury należy nosić rękawiczki i fartuch laboratoryjny. Wybrać dorosłe rybki danio w zależności od projektu eksperymentu. Całe przygotowanie (kroki od 2.1 do 2.7) należy ukończyć w czasie ok. 15 min.

  1. Przygotować szalkę Petri z warstwą ~0,5 cm 2% agaru wysokotopliwego. W agarze wyciąć prostokątny otwór, który jest dłuższy i nieco szerszy niż ryba. Za pomocą wosku przymocować cienką rurkę (do perfuzji wody do pyska ryby) do szalki Petri, umieszczając jeden koniec w prostokącie. Za pomocą wosku przymocować rurkę o większej średnicy (do odprowadzania wody) do krawędzi szalki Petri.
  2. Wybrać ryby do eksperymentu. Znieczulić ryby roztworem trikainy 0,2 mg/mL (pH 7,2) w roztworze Hank'a, aż ryby staną się całkowicie nieodczuwalne i głęboko znieczulone.
  3. Położyć rybę na boku na wilgotnej gąbce. Za pomocą mikroszydrzyki wstrzyknąć zaocznie 3 µL bromku pankuronium (0,4 µg/µL w roztworze Hank'a), aby sparaliżować rybę. Umieścić rybę na krótko w roztworze Hank'a, aby upewnić się, że jest całkowicie sparaliżowana.
  4. Umieścić rybę grzbietem do góry w szalce Petri, głową w stronę rurki. Używając pęsety do manipulowania rurką, delikatnie otworzyć pysk ryby i wsunąć rurkę do środka. Delikatnie przesunąć rybę w stronę rurki tak, aby rurka znajdowała się w tylnej części pyska.
  5. Szybko, lecz delikatnie osuszyć agar wokół ryby i usunąć wodę z powierzchni ciała ryby. Zamoczyć mały kawałek chusteczki laboratoryjnej w kleju laboratoryjnym i przykleić chusteczkę do agaru po obu stronach ryby oraz nad grzbietem, za skrzelami.
    UWAGA: Nie naciskać ryby ani nie wywierać na nią nacisku. Należy uważać, aby klej nie dostał się na skrzela.
  6. Nanieść małą kroplę bupiwakainy bezpośrednio na powierzchnię głowy, aby znieczulić rybę podczas obrazowania w miejscu, w którym laser będzie stykał się ze skórą.
  7. Przenieść szalkę Petri z rybą pod mikroskop i napełnić ją wodą z hodowli ryb. Podłączyć rurkę do pompy wodnej, aby pompować wodę systemową z prędkością 2 mL/min do pyska ryby, jednocześnie odprowadzając roztwór perfuzyjny z szalki z tą samą prędkością. Upewnić się, że woda jest natleniona za pomocą napowietrzacza i podgrzana do ~30 °C za pomocą grzałki akwariowej.
    UWAGA: Ryba jest teraz gotowa do obrazowania. Monitorować stan zdrowia ryby poprzez obserwację przepływu krwi w sygnale generacji trzeciej harmonicznej (THG) podczas obrazowania (patrz sekcja 4.1). Obrazowanie 3P powinno być również kompatybilne z bardziej zaawansowanymi preparatami ryb, takimi jak te stosowane w obrazowaniu 2P do unieruchomienia głowy i umożliwienia ruchów ciała podczas obrazowania w wirtualnej rzeczywistości23. To całkowicie nieinwazyjne obrazowanie eliminuje konieczność usuwania czaszki, co jest typowe w innych badaniach nad kręgowcami, i stanowi krok w stronę minimalizacji inwazyjności badań oraz związanego z nimi bólu.

3. Przygotowanie myszy do 3PM

UWAGA: Podczas poniższych procedur należy nosić rękawiczki, maskę chirurgiczną i fartuch laboratoryjny. Wybierz linię myszy zgodnie z eksperymentem. Przed operacją mysz powinna być utrzymywana w 12:12 h cyklu światło-ciemność. Cały zabieg chirurgiczny (kroki 3.2-3.11) jest aseptyczny, a wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny zostać wysterylizowane przed użyciem. Kraniotomia trwa około 1 h.

  1. Umieścić pokrywkę w kształcie pierścienia (średnica 4,5-6,5 mm) oraz dysk szkiełka nakrywkowe (średnica 5 mm) na czystym parafilmie. Za pomocą igły nanieść niewielką ilość kleju optycznego, aby przykleić pokrywkę w kształcie pierścienia do dysku szkiełka. Utwardzać tak przygotowany element na parafilmie pod światłem ultrafioletowym przez 10-20 min. Zdjąć cały element z parafilmu, a następnie za pomocą pęsety zdrapać nadmiar kleju i usunąć zanieczyszczenia przy użyciu 70% etanolu.
    UWAGA: Pokrywki mają grubość ~0,17 mm. Pokrywka w kształcie pierścienia służy do wywierania odpowiedniego nacisku na mózg podczas obrazowania chronicznego.
  2. Zanestetyzować mysz mieszaniną gazową 3% izofluranu i 20% O2 w komorze indukcyjnej. Zważyć mysz. Umieścić mysz w pozycji brzusznej na macie grzewczej. Ustawić temperaturę maty grzewczej na ~37 °C.
  3. Umoćować górne zęby w otworze gębowym aparatu stereotaktycznego, zakładając maskę anestetyczną. Umoćować pręty uszne w uszach. Podczas zabiegu utrzymywać znieczulenie mieszaniną gazową 2% izofluranu i 20% O2.
    UWAGA: Dostosować stężenie izofluranu, monitorując reakcję myszy. Poziom znieczulenia sprawdzić, obserwując częstość oddechów (~1 Hz dla głębokiego snu) oraz uciskając łapki w celu sprawdzenia reakcji przed rozpoczęciem operacji.
  4. Nanieść maść do oczu w celu nawilżenia. Zamknąć powieki. Włączyć wszystkie lampy zabiegowe. Przed operacją wstrzyknąć podskórnie ketoprofen, deksametazon i glikopirrolan w dawkach zależnych od masy ciała myszy.
    UWAGA: Stężenia leków wynoszą odpowiednio 2 mg/mL dla ketoprofenu, 0,1 mg/mL dla deksametazonu i 0,1 mg/mL dla glikopirrolanu. Objętości iniekcji dla ketoprofenu, deksametazonu i glikopirrolanu zależą od masy ciała i wynoszą odpowiednio 2,5 µL/g, 2 µL/g i 2 µL/g.
  5. Usunąć owłosienie z ciemienia głowy i okolic uszu.
    1. Wyciąć jak najwięcej sierści nożyczkami lub maszynką do strzyżenia i usunąć ją z pola operacyjnego.
    2. Nanieść odpowiednią ilość kremu do depilacji. Odczekać 1 min.
    3. Usunąć sierść i krem za pomocą patyczka watnego nasączonego solą fizjologiczną.
    4. Powtarzać kroki 3.5.2 i 3.5.3 aż do całkowitego usunięcia owłosienia.
    5. Nanieść 5% roztwór powidonu z jodem, a następnie 70% etanol na skórę w celu oczyszczenia obszaru. Powtórzyć ten proces trzy razy.
  6. Wykonać podskórny zastrzyk atropiny (dawka zależna od masy ciała, 0,02-0,05 mg/kg) w okolicy głowy. Odczekać 1 min.
  7. Naciąć skórę na ciemieniu głowy, aby odsłonić czaszkę. Upewnić się, że odsłonięto punkty bregma i lambda. Pozostałą tkankę skórną na krawędzi przykleić do czaszki za pomocą kleju biokompatybilnego, aby zapobiec przedostawaniu się pyłu z wiercenia pod skórę (co mogłoby wywołać odpowiedź immunologiczną).
  8. Używając markera chirurgicznego, narysować okrąg o średnicy 5 mm nad obszarem zainteresowania. Na przykład wybrać centrum obszaru położone ~2,5 mm bocznie i 2 mm kudaudalnie od punktu bregma, co obejmie większość kory somatosensorycznej i kory wzrokowej.
  9. Powoli wiercić wzdłuż okręgu, aplikując sól fizjologiczną w celu nawilżenia czaszki w połowie procesu. Zwolnić prędkość wiercenia w drugiej połowie i pokryć czaszkę solą fizjologiczną przed jej usunięciem. Ostrożnie otworzyć czaszkę pęsetą i przyłożyć mały kawałek sterylnej gąbki kolagenowej nasączonej solą fizjologiczną, aby natychmiast zatamować ewentualne krwawienie w mózgu. Utrzymywać nawilżenie mózgu za pomocą soli fizjologicznej.
  10. Nanieść kroplę soli fizjologicznej na stronę przygotowanego elementu (dysk-pierścień) skierowaną w stronę tkanki mózgowej. Umieścić wystającą część dysku w oknie czaszkowym. Używając długiego pręta zamocowanego w aparacie stereotaktycznym, delikatnie docisnąć dysk okna czaszkowego do powierzchni mózgu, upewniając się, że pierścień ściśle przylega do czaszki. Osuszyć obszar wokół elementu patyczkiem watnym.
  11. Nanieść warstwę kleju biokompatybilnego pod krawędź pierścienia. Nałożyć warstwę mieszanki cementu dentystycznego pod pierścień i wokół niego. Nałożyć kolejną warstwę kleju na cement dentystyczny. W celu dostarczenia energii zwierzęciu można co godzinę wstrzykiwać podskórnie 5% glukozę (dawka zależna od masy ciała, 10 µL/g) podczas operacji.
  12. Wyłączyć system anestezjologiczny. Zwolnić mysz z aparatu stereotaktycznego. Niezwłocznie przenieść mysz do dostosowanego, kompaktowego aparatu stereotaktycznego z matą grzewczą ustawioną na ~37 °C i aparaturą do znieczulenia.
  13. Umieścić mysz w pozycji brzusznej na macie grzewczej kompaktowego aparatu stereotaktycznego. Ustawić temperaturę na ~37 °C. Umoćować górne zęby w otworze gębowym aparatu stereotaktycznego oraz pręty uszne w uszach myszy. Podłączyć rurki anestetyczne i utrzymywać znieczulenie mieszaniną gazową 1,5% izofluranu i 20% O2.
    UWAGA: Mysz jest teraz gotowa do obrazowania. Przez cały czas trwania procedur obrazowania utrzymywać mysz w stanie znieczulenia. Dostosować stężenie izofluranu, monitorując reakcję myszy.

4. Obrazowanie intravitalne w mózgach ryb i myszy

  1. Obrazowanie intravitalne mózgu rybki danio (
    UWAGA: Aby prawidłowo zlokalizować mózg ryby pod obiektywem, do obrazowania w szerokim polu wykorzystuje się drugą kamerę o ładunku sprzężonym (CCD) w tej samej ścieżce co światło wzbudzenia.
    1. Przygotować mikroskop i skalibrować moc (zgodnie z opisem w sekcji 1).
    2. Zastosować w mikroskopie obiektyw o małym powiększeniu (zazwyczaj 4x).
    3. Umieścić pod mikroskopem szalkę Petriego z rybą oraz probówki.
    4. Do oświetlenia szalki Petriego użyć źródła światła LED.
    5. Otworzyć tryb Camera w oprogramowaniu do akwizycji obrazu (Rycina 2).
    6. Kliknąć Live.
    7. Wybrać channel A po prawej stronie ekranu.
    8. Dostosować ustawienia histogramu, aby obraz był wyraźny.
      UWAGA: Ustawienia te należy aktualizować w razie potrzeby.
    9. Ustawić motor setting na kontrolerze silnika na Base.
    10. Obniżać obiektyw, aż ryba stanie się widoczna.
      UWAGA: Należy upewnić się, że soczewka obiektywu nie styka się fizycznie z głową.
    11. Umieścić środek głowy ryby w centrum pola widzenia.
    12. Przesunąć obiektyw w górę, oddalając go od głowy ryby.
    13. Zastąpić obiektyw o małym powiększeniu obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej (NA) do 3PM.
      UWAGA: Obiektyw o małym powiększeniu i obiektyw o wysokim NA nie muszą być parfokalne, ale muszą być wystarczająco blisko, aby ryba znajdowała się w polu widzenia obiektywu o wysokim NA.
    14. Powoli obniżać soczewkę obiektywu, upewniając się, że obiektyw nie styka się fizycznie z głową. W oprogramowaniu kamery CCD przestać przesuwać obiektyw, gdy widoczna będzie góra głowy. Ustawić z location na 0 μm.
      UWAGA: W przypadku stosowania obiektywu imersyjnego wodnego należy upewnić się, że pod soczewką obiektywu nie ma pęcherzyków powietrza.
    15. Wyłączyć źródło światła LED i zamknąć ciemną zasłonę wokół systemu.
    16. Ustawić oprogramowanie do akwizycji obrazu w trybie Multiphoton GG do obrazowania 3P i ustawić moc pod obiektywem na mniej niż 1 mW (przy częstotliwości powtarzania impulsów ~1 MHz).
    17. Zmienić przycisk motor setting z Base na Objective na kontrolerze silnika.
    18. Przyciemnić światła w pomieszczeniu.
    19. Włączyć PMT i otworzyć migawkę źródła wzbudzenia 3PM. Upewnić się, że obrys kości pojawia się w kanale sygnału fluorescencji z powodu autofluorescencji oraz w kanale sygnału THG z powodu generowania trzeciej harmoniki (THG) kości (Rycina 2C).
    20. Wykonaj obrazowanie na różnych głębokościach, zwiększając poziomy mocy przy obrazowaniu głębszych warstw.
  2. Obrazowanie intravitalne mózgu myszy
    UWAGA: Wstrzykiwać 5% glukozy znieczulonej myszy co godzinę podczas obrazowania; dawkę dobiera się na podstawie masy ciała (10 µL/g).
    1. Ustawić oprogramowanie do akwizycji obrazu w trybie Multiphoton GG do obrazowania 3P i ustawić moc pod obiektywem na mniej niż 1 mW (przy częstotliwości powtarzania impulsów ~1 MHz).
      UWAGA: Należy upewnić się, że okno chirurgiczne jest umieszczone prostopadle do soczewki obiektywu, aby zredukować aberrację. Precyzyjną regulację wykonuje się poprzez przechylanie aparatu stereotaktycznego.
    2. Przesunąć soczewkę obiektywu blisko okna i nanieść wodę pomiędzy obiektyw a okno czaszkowe; ustawić wartości osi wszystkich silników na zero.
      UWAGA: Absorpcja światła w H2O przy ~1,700 nm jest duża, co znacznie redukuje moc lasera ~1,700 nm po głębokości ~1-2 mm wody. Dla wzbudzenia przy ~1,700 nm należy użyć D2O do imersji wodnej, ponieważ wykazuje ona znacznie mniejszą absorpcję przy 1,700 nm, co ogranicza absorpcję przez wodę.
    3. Kliknąć przycisk Live w oprogramowaniu do akwizycji obrazu i otworzyć PMT channels, np. jeden kanał sygnału fluorescencji i jeden kanał sygnału THG. Dostosować PMT gain oraz background level w razie potrzeby.
    4. Powoli przesuwać obiektyw w górę, aby zlokalizować powierzchnię okna, monitorując kanał THG z dużych naczyń krwionośnych i powierzchni szkła okna. W razie potrzeby dostosować orientację okna (patrz uwaga w kroku 4.2.12). Wyzerować silniki, aby zdefiniować powierzchnię mózgu.
    5. Wykonaj obrazowanie i dostosuj poziom mocy w zależności od głębokości obrazowania.

Wyniki

Prawidłowe wykonanie niniejszego protokołu pozwoli na właściwe skalibrowanie mikroskopu z optymalnymi parametrami światła (np. czas trwania impulsu, NA) oraz przygotowanie zwierząt odpowiednie do in vivo 3PM. Dostępny komercyjnie zestaw 3P zawiera odpowiednie lustra i soczewki zarówno dla długości fali ~1,300 nm, jak i ~1,700 nm; w związku z tym zmiana długości fali wzbudzenia między 1,300 nm a 1,700 nm nie wymaga modyfikacji optyki. Jeśli soczewki w zestawie 3P nie posiadają odpowiedniej powłoki dla 1,300 i 1,700 nm, należy je zastąpić właściwymi elementami w celu zminimalizowania strat mocy lasera. Dzięki zoptymalizowanemu 3PM i właściwemu przygotowaniu zwierząt możliwe jest uzyskanie wysokokontrastowych obrazów fluorescencji in vivo oraz obrazów THG z głębokich struktur mózgu.

Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne obrazy 3P nienaruszonych dorosłych rybek danio pręgowanych. Dzięki 3PM uzyskano wysokorozdzielcze, nieinwazyjne i głębokie obrazowanie genetycznie znakowanych neuronów w mózgu dorosłej rybki danio pręgowanej. Chociaż w literaturze opisano obrazowanie obszaru telencefalonu w mózgu dorosłych rybek danio pręgowanych z użyciem 2PM24,25,26,27, 3PM umożliwia dostęp do całego telencefalonu oraz obszarów, których obserwacja za pomocą innych technik jest trudniejsza lub niemożliwa. Rozkład warstw komórkowych w tekcie optycznym i móżdżku można zaobserwować na Rysunku 3C. W przypadku udanej sesji obrazowania kość jest widoczna w kanale THG, a neurony w kanale fluorescencji. Do obrazowania dorosłych rybek danio pręgowanych wykorzystano funkcję kamery mikroskopu w celu zlokalizowania ryby (Rysunek 3A). Krok ten nie jest konieczny przy obrazowaniu mózgu myszy, ponieważ szklane okno jest wystarczająco duże, aby mózg był łatwo dostępny. Wysokorozdzielcze obrazy strukturalne mózgu dorosłych rybek danio pręgowanych uzyskano przy użyciu systemu opisanego w poprzednich sekcjach. Czaszka jest widoczna w kanale THG (Rysunek 3B), co ułatwia nawigację po mózgu i odnalezienie jego powierzchni górnej. Jak pokazano na Rysunku 3C, neurony są możliwe do rozróżnienia z wysokim stosunkiem sygnału do tła (SBR) głęboko w mózgu dorosłej ryby. Tkanka nad mózgiem jest widoczna w kanale fluorescencji ze względu na autofluorescencję.

Rysunek 4 przedstawia wielokolorowe obrazy 3P neuronów znakowanych GCaMP6s (zielony) i naczyń krwionośnych znakowanych Texas Red (czerwony) wraz z sygnałami THG (niebieski) w mózgu dorosłej myszy przy wzbudzeniu 1 340 nm10. Obrazy zostały powtórzone z poprzedniej pracy10. Na Rysunku 4 energia impulsu w ognisku była utrzymywana na poziomie ~1,5 nJ w całej głębokości w celu uzyskania wystarczających sygnałów fluorescencji i THG, a maksymalna średnia moc lasera wynosiła ~70 mW. Czas trwania impulsu został dostrojony do ~60 fs, a efektywna NA wynosiła ~0,8. Dzięki optymalizacji układu 3PM pomyślnie uzyskano obrazy o wysokim kontraście do głębokości 1,2 mm od powierzchni mózgu, w regionie CA1 hipokampa (Rysunek 4A,B). Rysunek 4C,D przedstawia przebiegi aktywności Ca2+ neuronów znakowanych GCaMP6s na głębokości 750 µm podczas 10-minutowej sesji rejestracji, co wykazuje wysoką wierność zapisu.

Jeśli laser wzbudzający jest źle ustawiony, może zostać zaobserwowana nierównomierność jasności sygnału w polu widzenia. Ponadto, jeśli parametry lasera, takie jak czas trwania impulsu, energia impulsu wzbudzenia w ognisku oraz efektywna NA, nie są zoptymalizowane, obraz THG czaszki ryby lub okna kraniotomii mózgu myszy nie będzie widoczny i/lub będzie wymagał wysokiej energii impulsu wzbudzenia (np. >2 nJ/pulse w ognisku). Zatem sygnały THG na powierzchni mózgu mogą służyć jako wskaźnik zoptymalizowanego układu 3PM przed rozpoczęciem obrazowania głębokich tkanek.

Układ mikroskopii tróbfotonowej; NOPA z laserem pompującym, kompresorem pryzmatycznym, schemat systemu obrazowania 3PM.
Rysunek 1: Schematyczny rysunek układu 3PM. Długość fali lasera wzbudzającego jest ustawiona na ~1,300 nm lub ~1,700 nm, z wyjściem z portu idler NOPA. Kompresor z pary pryzmatów oraz kompresor z płytki Si są używane odpowiednio dla lasera ~1,300 nm i ~1,700 nm w celu wstępnej kompresji (prechirp) impulsu lasera wzbudzającego. Wiązki laserowe ~1,300 nm i ~1,700 nm można przełączać za pomocą luster odchylających (flipper mirrors). Port sygnałowy NOPA jest wykorzystywany do uzyskania sygnału wyzwalającego. Do kontroli mocy wzbudzenia użyto płytki ćwierćfalowej i PBS. Fluorescencję oraz THG wykrywają PMT z GaAsP. Odpowiednie kombinacje luster dichroicznych i filtrów pasmowych są stosowane do oddzielenia sygnałów fluorescencji i THG. Skróty: 3PM = mikroskopia tróbfotonowa; NOPA = niekolinearny optyczny wzmacniacz parametryczny; PBS = polaryzacyjny dzielnik wiązki; THG = generowanie trzeciej harmonicznej; DAQ = akwizycja danych; PMT = fotopowielacz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat interfejsu oprogramowania do mikroskopii fluorescencyjnej; wyświetlone ustawienia przechwytywania i analizy obrazu.
Rysunek 2: Reprezentatywne zrzuty ekranu dla obrazowania intravitalnego u ryb (sekcja protokołu 4.1). (A) Widok trybu kamery w oprogramowaniu do akwizycji obrazu z zainstalowanym obiektywem 4x. Kluczowe funkcje oprogramowania są obrysowane i ponumerowane w następujący sposób: 1. Tryb obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Opcje trybów to Camera, Multiphoton oraz Multiphoton GG. Do obrazowania w świetle białym z kamerą CCD wybierany jest tryb Camera. 2. Kliknięcie przycisku Live włącza kamerę (lub PMT w opcjach wielofotonowych), co umożliwia obserwację podglądu mikroskopu w czasie rzeczywistym. 3. W zakładce Capture Setup ustawiane są pożądane parametry obrazowania (moc, lokalizacja, głębokość). 4. W zakładce Capture przypisuje się lokalizację folderu, w którym mają zostać zapisane obrazy. W tej zakładce można rozpocząć obrazowanie. 5. Ustawienie Z Control kontroluje głębokość obrazowania poprzez przesuwanie silnika stolika w osi z. 6. Reprezentatywny obraz głowy danio pręgowanego. Strona rostralna głowy znajduje się po lewej stronie. (B) Reprezentatywny widok trybu Camera z obiektywem 25x. (C) Reprezentatywny widok trybu Multiphoton GG zawierający obraz THG obszaru widocznego na zdjęciu (B). Skróty: CCD = charge-coupled device; PMT = photomultiplier tube; THG = third-harmonic generation. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat obrazowania nerwowego z regionami OT i CB, przedstawiony w mikroskopii fluorescencyjnej na różnych głębokościach.
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy mózgu dorosłego danio pręgowanego uzyskane za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów. (A) Obraz głowy dorosłego danio pręgowanego w trybie kamery, wykonany przy użyciu obiektywu 4x. Górna część obrazu wskazuje kierunek rostralny. Obrysowano płaty OT oraz CB. (B) Reprezentatywny obraz uzyskany w trybie Multiphoton GG przy użyciu obiektywu 25x, zawierający obraz THG obszaru z (A). (C) Obrazy fluorescencyjne mózgu dorosłego danio pręgowanego na styku móżdżku i wzgórza optycznego, gdzie GFP jest ekspresowane w cytoplazmie neuronów na różnych głębokościach. Paski skali = 100 µm. Skróty: OT = wzgórze optyczne; CB = móżdżek; THG = generacja trzeciej harmonicznej; GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazowanie tkanki mózgowej przedstawiające profile głębokości, mikroskopię fluorescencyjną i wykresy natężenia sygnału.
Rycina 4: Wielokolorowa 3PM neuronów znakowanych GCaMP6s (zielone), naczyń krwionośnych znakowanych Texas Red (czerwone) oraz generacji trzeciej harmonicznej (niebieskie) przy podbudzeniu 1,340 nm w mózgu myszy. (A) Obrazy Z-stack do głębokości 1,200 µm od powierzchni mózgu z polem widzenia 270 x 270 µm (512 x 512 pikseli na klatkę). Moc lasera była zmieniana w zależności od głębokości obrazowania, aby utrzymać energię impulsu ~1.5 nJ w ognisku. Maksymalna moc średnia pod obiektywem wynosiła 70 mW. (B) Wybrane obrazy 2D na różnych głębokościach obrazowania. (C) Miejsce rejestracji aktywności na głębokości 750 µm pod oponą twardą z polem widzenia 270 x 270 µm (256 x 256 pikseli). (D) Ślady spontanicznej aktywności mózgu zarejestrowane u budzącej się myszy z neuronów znakowanych wskazanych na (C). Częstotliwość klatek wynosiła 8.3 Hz, a czas przebywania piksela 0.51 µs. Częstotliwość repetycji lasera wynosiła 2 MHz, a moc średnia pod soczewką obiektywu 56 mW. Każdy ślad został znormalizowany do poziomu bazowego i przefiltrowany dolnoprzepustowo przy użyciu okna Hamminga o stałej czasowej 0.72 s. Paski skali = 50 µm. Rycina i legenda zostały powtórzone z 10. Skrót: 3PM = mikroskopia trójfotonowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres spektroskopowy; długość tłumienia w funkcji długości fali; analiza absorpcji wody i rozpraszania w tkankach.
Rysunek 5: Efektywna długość tłumienia w neocortex mózgu myszy. EAL (linia purpurowa) została obliczona na podstawie rozpraszania w tkance (linia czerwona) i absorpcji wody w tkance (linia niebieska), przy założeniu 75% zawartości wody. Czarne gwiazdki wskazują zgłoszone dane eksperymentalne dotyczące EAL w neocortex mózgu myszy3,21,28,29. Należy zauważyć, że EAL różni się w zależności od tkanki. Skrót: EAL = efektywna długość tłumienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Długość fali wzbudzenia
(nm)		Woda immersyjnaMaksymalna moc lasera
(mW)		Maksymalna energia impulsu w ognisku*
(nJ)		Typowy EAL w korze mózgu myszy
(µm)		Głębokość obrazowania w korze mysiej
(mm)		Energia impulsu pod obiektywem
(nJ)		Maksymalna częstotliwość powtarzania impulsu lasera
(MHz)
1300H2O lub D2ORównowaga statyczna; ΣFx≤0; diagram; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności.100Równowaga statyczna; ΣFx≤0; diagram; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności.2~3000.8~14~7
1.2~55~2
1.6~210~0.5
2.1~1100~0.1
1700D2ORównowaga statyczna; ΣFx≤0; schemat; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności.50Równowaga statyczna; ΣFx≤0; diagram; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności.3~4000.8~7~7
1.2~20~2.5
1.6~55~1
2.1~190~0.3

Tabela 1: Typowe warunki wzbudzenia 3P dla obrazowania kory mózgu myszy.
*Przy użyciu obiektywu o wysokiej NA (~1.0), szerokości impulsu ~50 fs i typowych fluoroforów, takich jak białka fluorescencyjne (np. GFP i RFP).
** Przy założeniu, że EAL jest jednorodna w całej korze.
*** Aby uzyskać ~1 nJ/impuls w ognisku, obliczone na podstawie EAL i głębokości obrazowania.
**** Obliczone na podstawie energii impulsu pod obiektywem i maksymalnej dopuszczalnej mocy lasera.
Skróty: 3P = tróbfotonowe; NA = apertura numeryczna; GFP = zielone białko fluorescencyjne; RFP = czerwone białko fluorescencyjne; EAL = efektywna długość tłumienia.

Dyskusja

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje procedury konfiguracji obrazowania 3P z wykorzystaniem komercyjnego mikroskopu i źródła laserowego. W porównaniu do 2PM, 3PM wykazuje przewagę w zastosowaniach wymagających dostępu optycznego do głębszych obszarów, takich jak hipokamp mózgu myszy. Choć 3PM jest stosowane głównie w neuronauce, może ono potencjalnie znaleźć zastosowanie w innych tkankach, takich jak węzły chłonne, kości i guzy, w celu obserwacji głębokich warstw tkanki.

Ważne jest, aby zweryfikować, czy system obrazowania pracuje blisko limitu szumu śrutowego, co gwarantuje, że elektronika detekcji i akwizycji danych wnosi pomijalny szum do obrazu za PMT. Niepewność liczby wykrytych fotonów jest fundamentalnie ograniczona przez szum śrutowy fotonów. Wydajność ograniczoną szumem śrutowym można osiągnąć w typowym mikroskopie wielofotonowym, stosując fotodetektor o dużym wzmocnieniu (np. PMT). Szum śrutowy fotonów podlega rozkładowi statystycznemu Poissona, w którym odchylenie standardowe rozkładu jest równe pierwiastkowi kwadratowemu z jego średniej. Aby zweryfikować wydajność ograniczoną szumem śrutowym, należy wykonać krok 1.14 w sekcji protokołu.

Aby uniknąć tłumienia światła przez H2O, pomocne jest zastosowanie D2O do imersji, szczególnie przy pobudzeniu ok. 1,700 nm. W przypadku użycia D2O niezbędne jest odświeżanie D2O co ok. 10 min lub zastosowanie dużej objętości D2O, aby zapobiec wymianie D2O/H2O podczas obrazowania. Można również odizolować D2O od otoczenia3. Jeśli do obrazowania używany jest obiektyw z dużą odległością roboczą (WD) (np. WD wynosząca 4 mm lub więcej), grubość cieczy imersyjnej może przekraczać 2-3 mm. Zwiększona grubość sprawia, że absorpcja H2O staje się niepomijalna nawet przy ok. 1,300 nm21. W związku z tym D2O może być niezbędne nawet w przypadku 3PM przy 1,300 nm podczas korzystania z obiektywu z dużą WD.

Ponieważ intensywność fluorescencji 3P zależy od sześcianu energii impulsu wzbudzenia w ognisku (Równanie (1)), ustawienie odpowiedniej mocy lasera jest szczególnie istotne dla uzyskania odpowiednich sygnałów fluorescencji 3P przy jednoczesnym uniknięciu uszkodzeń termicznych i nieliniowych w żywych tkankach. Średnia moc lasera powinna być utrzymywana poniżej progu uszkodzeń termicznych. Przykładowo, w mózgu myszy, aby uniknąć termicznego uszkodzenia tkanki, średnia moc na powierzchni mózgu myszy powinna wynosić około 100 mW lub mniej dla wzbudzenia przy ~1,300 nm na głębokości 1 mm i polu widzenia (FOV) 230 µm x 230 µm21. Podobnie, średnia moc przy ~1,700 nm powinna wynosić około 50 mW lub mniej na głębokości ~1 mm i przy FOV ~230 µm x 230 µm (dane nieopublikowane). Ponadto, aby uniknąć nasycenia wzbudzenia i potencjalnych uszkodzeń nieliniowych, energia impulsu wzbudzenia powinna być utrzymywana poniżej Równowaga statyczna; ΣFx≤0; schemat; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności.2 nJ oraz Równowaga statyczna; ΣFx≤0; schemat; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności.3 nJ odpowiednio dla wzbudzenia ~1,300 nm i ~1,700 nm30.

Ze względu na absorpcję i rozpraszanie światła w tkankach, energia impulsu w ognisku ulega osłabieniu do 1/e (~37%) po penetracji tkanek przez 1 EAL. EAL różni się w zależności od rodzaju tkanki i długości fali wzbudzenia, np. w neocortex mózgu myszy EAL wynosi ~300 µm oraz ~400 µm odpowiednio przy ~1300 nm i ~1700 nm3,29 (Rycina 5). W związku z tym, aby zachować tę samą energię impulsu w ognisku (np. 1 nJ/impuls) na głębokości n W przypadku EAL, energię impulsu powierzchniowego należy pomnożyć przez 1 nJ × enW celu szybkiego obrazowania dynamiki strukturalnej i funkcjonalnej pożądane jest zastosowanie lasera wzbudzającego o wysokiej częstotliwości repetycji (1 MHz lub więcej), aby uzyskać wysoką liczbę klatek na sekundę.5,6,7,10Jednakże wymagana energia impulsu oraz limit średniej mocy lasera ograniczają możliwą do zastosowania częstotliwość repetycji.

Na przykład, podczas obrazowania regionu o umiarkowanej głębokości na poziomie 4 EAL (tj. ~1,2 mm w korze mózgu myszy przy pobudzeniu 1 300 nm), wymagane jest ~55 nJ/impuls na powierzchni, aby utrzymać 1 nJ/impuls w ognisku. Przy ograniczeniu mocy średniej do 100 mW możemy zastosować częstotliwość repetycji lasera ~2 MHz. Jednakże, aby obrazować głębiej, na poziomie 7 EAL, na powierzchni wymagane jest ~1 100 nJ/impuls, aby utrzymać 1 nJ/impuls w ognisku. Przy założeniu, że maksymalna moc średnia wynosi 100 mW w celu uniknięcia uszkodzeń termicznych, częstotliwość repetycji lasera powinna zostać zredukowana do 0,1 MHz, aby uzyskać 1 100 nJ/impuls na powierzchni. Tabela 1 podsumowuje typowe warunki obrazowania w korze mózgu myszy. Należy zauważyć, że głębokości obrazowania w Tabeli 1 zakładają, że EAL jest jednorodna w całej korze mózgu myszy.

Ponadto, ze względu na ograniczenia mocy lasera w 3PM w głębokich tkankach, istnieje kompromis między częstotliwością odświeżania klatek a rozmiarem piksela obrazu, co jest szczególnie istotne w obrazowaniu funkcjonalnym, takim jak obrazowanie wapnia. Maksymalna dostępna częstotliwość repetycji lasera jest określana dla każdej głębokości na podstawie wymaganej energii impulsu w ognisku oraz dopuszczalnej średniej mocy lasera, o czym mowa powyżej, np. 2 MHz na głębokości odpowiadającej ~4 EALs przy wzbudzeniu 1 300 nm. Generalnie obrazowanie wymaga co najmniej jednego impulsu na piksel. W związku z tym minimalny dostępny czas przebywania wiązki w pikselu jest determinowany przez częstotliwość repetycji lasera, np. 0,5 µs/pixel przy wzbudzeniu 2 MHz.

Aby zachować wysoką rozdzielczość przestrzenną (~1 µm w płaszczyźnie bocznej) w obrazach 3P, idealnie jest przypisać 1 piksel do obszaru ~1 µm2, np. 256 x 256 pikseli dla pola widzenia (FOV) o wymiarach 250 x 250 µm2. W związku z tym, aby przeprowadzić szybkie obrazowanie przy znacznie dużym FOV (np. 250 x 250 µm2 przy 256 x 256 pikselach), częstotliwości powtarzania impulsów 0,5 MHz, 1 MHz i 2 MHz zapewniają teoretyczne maksymalne prędkości obrazowania wynoszące odpowiednio ~7,6, ~15 i ~30 klatek/s. Podobnie, w zależności od docelowej głębokości, prędkości skanowania i FOV, niezbędna jest optymalizacja częstotliwości powtarzania laserowego, aby zastosować odpowiednią energię impulsu poniżej progu uszkodzeń termicznych. W celu zwiększenia prędkości obrazowania można zastosować adaptacyjne źródło wzbudzenia, aby skoncentrować wszystkie impulsy wzbudzenia na neuronach (tj. w obszarach zainteresowania), dostarczając impulsy laserowe do neuronów na żądanie31.

Mikroskopia 3-fotonowa (3PM) wykazuje przewagę nad mikroskopią 2-fotonową (2PM) w obrazowaniu głębokim w żywych tkankach oraz przez media silnie rozpraszające, takie jak czaszka, kości i warstwa białej istoty (np. torebka zewnętrzna) mózgu myszy. Dłuższa efektywna długość tłumienia (EAL) oraz nieliniowe wzbudzenie wyższego rzędu w procesie 3-fotonowej absorpcji (3PE) sprzyjają obrazowaniu w głębokich tkankach. Na przykład, podczas obrazowania GCaMP6 w korze mózgu myszy, sygnał fluorescencji 2P przy wzbudzeniu 920 nm jest silniejszy niż sygnał fluorescencji 3P przy wzbudzeniu 1,300 nm w regionach płytkich na głębokości Równowaga statyczna; ΣFx≤0; schemat; fizyka; analiza równowagi; wektory sił; warunki stabilności.690 µm (tj. ~2,3 EAL przy 1,300 nm)21. Jednak ze względu na dłuższą EAL przy 1,300 nm w porównaniu do 920 nm, 3PE generuje silniejszą fluorescencję niż wzbudzenie 2-fotonowe (2PE) na głębokości ~690 µm i większej21. Głębokość ta jest definiowana jako „głębokość przecięcia sygnałów” (signal crossover depth), przy której natężenia sygnałów fluorescencji 2PE i 3PE są identyczne przy tej samej częstotliwości repetycji i tej samej maksymalnej dopuszczalnej mocy średniej21. Głębokość przecięcia sygnałów zależy od długości fal wzbudzenia dla 2PE i 3PE oraz od rodzaju fluoroforu.

W praktyce wzbudzanie przy 920 nm pozwala na zastosowanie wyższej średniej mocy lasera niż wzbudzanie przy 1300 nm ze względu na mniejszą absorpcję wody. Jednak wyższa średnia moc 2PE przesunęłaby głębokość przecięcia sygnałów jedynie o 0,9 EALs4. Ponadto, gdy próbka jest gęsto znakowana, 3PE oferuje dodatkową zaletę w postaci znacznie wyższego SBR. Zatem, nawet przed osiągnięciem długości przecięcia sygnałów, 3PM może być lepsze do obrazowania niż 2PM. Na przykład podczas obrazowania naczyń krwionośnych mózgu myszy, które mają ułamek objętości (tj. gęstość znakowania) wynoszący ~2%, 3PM przy 1300 nm i mocy wzbudzenia 100 mW przewyższa 2PM przy 920 nm i mocy wzbudzenia 200 mW na głębokości ~700 µm dla fluoresceiny.

3PM ma również przewagę podczas obrazowania przez cienką, lecz silnie rozpraszającą warstwę, która może zniekształcić funkcję rozproszenia punktowego (PSF) wiązki wzbudzenia i generować tło wynikające z defokusowania4. Na przykład w przypadku obrazowania przez nienaruszoną czaszkę mózgu myszy, obrazy 2PM są obarczone tłem z defokusowania nawet przy niewielkiej głębokości <100 µm od powierzchni mózgu13. Podobne tło z defokusowania zaobserwowano w 2PM przy wzbudzeniu 1,280 nm przez białą istotę mózgu myszy32. Zatem w przypadku obrazowania tkanek przez warstwy mętne, 3PM jest preferowaną metodą względem 2PM dla uzyskania obrazowania o wysokim kontraście, niezależnie od gęstości znakowania.

Niedawno przedstawiliśmy fantom z kuleczkami oraz analizę teoretyczną wykazującą, że limit głębokości obrazowania w 3PM przekracza 8 EALs33; 8 EALs odpowiada ok. 3 mm przy wzbudzeniu ok. 1,700 nm w korze mózgu myszy. Jednak obecnie dostępne lasery nie posiadają wystarczającej energii impulsu, aby osiągnąć 8 EALs w mózgu myszy. Dalszy rozwój mocniejszych laserów pozwoli przesunąć obecny limit głębokości obrazowania w 3PM.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub i NIH 1U01NS103516.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5% powidon-jodAmazonNDC 67818-155-32Aceptyczne czyszczenie obszarów chirurgicznych
70% EtanolThermo Fisher ScientificCAS 64-17-5Aceptyczne czyszczenie obszarów chirurgicznych
AgarozaSigmaA4718-256Przygotowanie komory danio pręgowanego
AtropineCornell Veterinary Care
Bergamo IIThorlabsMikroskop do obrazowania wielofotonowego
BupiwakainaCornell Veterinary Care
DeksametazonCornell Veterinary Care
Szkło w kształcie pączka (ID4.5, OD6.5)Potomac PhotonicsSzkło nakrywkowe używane do maści do oczu kraniotomii
(lub miejscowej maści okulistycznej)Puralube Maść weterynaryjnaNDC 17033-211-38Stosowany jako lubrykant zapobiegający podrażnieniom lub łagodzący suchość oka podczas operacji i znieczulenia
GaAsP Amplified PMTThorlabsPMT2100detektor PMT
GlukozaCornell Veterinary Care
GlycopyrrolateCornell Veterinary Care
Heater (800 W)FinnexGrzejnik akwariowy do wody danio pręgowanego)
Isoflurane USP 250 mLPiramalNDC 66794-0013-25Do znieczulenia myszy
KetoprofenCornell Veterinary Care
KimwipesKimtechTkanka laboratoryjna do przygotowania danio pręgowanego
Strzykawka Nanofil (10 mikrometrów) z igłą 36 GWPINANOFIL + NF36BVStrzykawka i igła do wstrzykiwań bromku pankuronium
Klej optycznyNorlandNOA 68Do sklejania ze sobą okrągłego szkiełka nakrywkowego i szkła w kształcie pączka.
Bromek pankuroniumCornell Veterinary Care
Pompa perystaltycznaElemental ScienceESI MP2Pompa wodna do konfiguracji danio pręgowanego
Rurki polietylenowe (ID 0,58 mm., OD 0,965 mm.)Elemental ScienceRurka pompy MP2Rurka, która wchodzi do pyska danio pręgowanego
Okrągłe szkiełko nakrywkowe Niemieckie szkło #1,5, 5 mmMikroskopia elektronowa Nauki7229605Szkło nakrywkowe używane do kraniotomii
Spirit-NOPASpectra PhysicsPrzestrajalny optyczny wzmacniacz parametryczny
SR400Stanford Research SystemsSR400Licznik fotonów
Standardowy czujnik mocy fotodiodyThorlabsS122CDetektor mocy
Sterylizowany bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)Millipore SigmaSKU 806552-500mlUżywany podczas operacji mózgu myszy
Serweta chirurgicznaJednorazowa serweta na ręcznik Dynarex4410Do chirurgii myszy
Cienki pasek wosku bokserskiegoCorning Rubber Co., Inc.Rurki przytrzymujące na miejscu w komorze danio pręgowanego
ThorImageThorlabsOprogramowanie do akwizycji obrazu
Trikaina (sól metanosulfonianu etylu)MP103106Danio pręgowany anestezjologiczne i eutanazyjne
Rurki Tygon (ID 1/16 cala, OD 1/8 cala)TygonRurka do przepływu wody do przygotowania danio pręgowanego
VaporGuardVetEquip931401Do recyklingu kleju tkankowego izofluranu
Vetbond3M1469SBDo przyklejenia szklanego okienka na czaszce myszy oraz do przyklejenia tkanki laboratoryjnej podczas przygotowywania ryby.
XLPLN25XWMP2OlympusDedykowany cel wzbudzenia wielofotonowego

Bibliografia

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  3. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).
  4. Wang, T., Xu, C. Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain. Optica. 7 (8), 947-960 (2020).
  5. Ouzounov, D. G., et al. In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain. Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).
  6. Weisenburger, S., et al. Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy. Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).
  7. Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy. Nature Communications. 10, 177(2019).
  8. Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 7 (1), (2020).
  9. Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light, Science & Applications. 7, 12(2018).
  10. Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain. Science Advances. 7 (12), 3531(2021).
  11. Liu, H., et al. In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots. Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).
  12. Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
  13. Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
  14. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , Springer. Boston, MA. 471-540 (2002).
  15. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680(2008).
  16. Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł, Radwanska, K., Czajkowski, R. Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528(2016).
  17. Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642(2017).
  18. Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).
  19. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  20. Horton, N. G., Xu, C. Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm. Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).
  21. Wang, T., et al. Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain. eLife. 9, 53205(2020).
  22. Cheng, L. -C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -J., Xu, C. Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).
  23. Huang, K. -H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
  24. Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish. Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).
  25. Li, J., et al. Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).
  26. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  27. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  28. Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  29. Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain. Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).
  30. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
  31. Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy. Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).
  32. Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014(2011).
  33. Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia trójfotonowaobrazowanie głębokich tkanekobrazowanie in vivoobrazowanie mózgu myszyobrazowanie mózgu danio pręgowanegomikroskopia wielofotonowaobrazowanie o wysokiej rozdzielczościobrazowanie aktywności neuronalnejobrazowanie wapniaanaliza funkcji mózgu
Mikroskopia fluorescencyjna trójfotonowa tkanek głębokich w nienaruszonym mózgu myszy i danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.