Method Article

Mikroskopia fluorescencyjna trójfotonowa tkanek głębokich w nienaruszonym mózgu myszy i danio pręgowanego

DOI:

10.3791/63213

⸱

January 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Applied and Engineering Physics, Cornell University, 2Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 3College of Veterinary Medicine, Cornell University, 4Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia trójfotonowa umożliwia obrazowanie fluorescencyjne o wysokim kontraście głęboko w żywych tkankach biologicznych, takich jak mózgi myszy i danio pręgowanego, z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki mikroskopii wielofotonowej, takie jak mikroskopia dwufotonowa (2PM) i mikroskopia trójfotonowa (3PM), są potężnymi narzędziami do obrazowania tkanek głębokich in vivo z rozdzielczością subkomórkową. 3PM ma dwie główne zalety dla obrazowania tkanek głębokich w porównaniu z 2PM, które jest szeroko stosowane w laboratoriach biologicznych: (i) dłuższa długość tłumienia w tkankach rozpraszających dzięki zastosowaniu lasera wzbudzającego ~1,300 nm lub ~1,700 nm; (ii) mniejsze generowanie fluorescencji tła z powodu wzbudzenia nieliniowego wyższego rzędu. W rezultacie, 3PM umożliwia obrazowanie strukturalne i funkcjonalne o wysokim kontraście głęboko w tkankach rozproszonych, takich jak nienaruszony mózg myszy, od warstw korowych do hipokampa i całego przodomózgowia dorosłego danio pręgowanego.

Dzisiaj, źródła laserowe odpowiednie dla 3PM są dostępne na rynku, umożliwiając konwersję istniejącego systemu obrazowania dwufotonowego (2P) na system trójfotonowy (3P). Ponadto dostępnych jest wiele komercyjnych mikroskopów 3P, co sprawia, że technika ta jest łatwo dostępna dla laboratoriów badawczych zajmujących się biologią. Ten artykuł pokazuje optymalizację typowej konfiguracji 3PM, szczególnie ukierunkowanej na grupy biologiczne, które mają już konfigurację 2P, i demonstruje obrazowanie 3D w trybie przyżyciowym w nienaruszonych mózgach myszy i dorosłych danio pręgowanego. Protokół ten obejmuje pełną procedurę eksperymentalną obrazowania 3P, w tym wyrównanie mikroskopu, wstępne chirping impulsów laserowych ~1,300 i ~1,700 nm, przygotowanie zwierząt i przyżyciowe obrazowanie fluorescencyjne 3P głęboko w mózgach dorosłych danio pręgowanych i myszy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naukach przyrodniczych, techniki mikroskopii wielofotonowej (MPM), takie jak 2PM i 3PM, były potężnymi narzędziami do głębokiego obrazowania in vivo z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną i wysokim kontrastem w tkankach rozpraszających. Ponadto metody te powodują mniejsze fotowybielanie w porównaniu z jednofotonową mikroskopią konfokalną1,2,3,4. 3PM jest korzystny dla obrazowania głębszych tkanek w porównaniu z 2PM ze względu na dwie główne cechy: (i) zastosowanie wzbudzenia o większej długości fali (~1,300 nm lub ~1,700 nm) zmniejsza rozpraszanie tkanek, oraz (ii) proces wzbudzenia wyższego rzędu (tj. sygnał fluorescencyjny zależy od sześcianu mocy wzbudzenia w 3PM zamiast kwadratu mocy wzbudzenia w 2PM), który tłumi niepożądaną fluorescencję tła3. W związku z tym 3PM umożliwia obrazowanie o wysokim kontraście w głębszych obszarach żywych tkanek, takich jak hipokamp w nienaruszonym mózgu dorosłej myszy3,5,6,7,8,9,10,11 i całe przodomózgowie dorosłego danio pręgowanego12, w tym rejestrowanie aktywności Ca2+ i obserwacje wielokolorowe. Co więcej, za pomocą 3PM uzyskano obrazy o wysokim kontraście przez nienaruszone czaszki myszy i dorosłego danio pręgowanego12,13.

Dzisiaj, źródła lasera wzbudzającego odpowiednie do wzbudzenia 3P (3PE) przy ~1,300 i ~1,700 nm są dostępne na rynku. Ponieważ system skanowania laserowego jest zasadniczo taki sam dla 2PM i 3PM, konwersja istniejącej konfiguracji 2P na konfigurację 3P jest możliwa w laboratoriach biologicznych po zainstalowaniu dostępnego na rynku lasera dla 3PE. Sygnał fluorescencji 3P zależy od mocy lasera, czasu trwania impulsu, częstotliwości powtarzania lasera i apertury numerycznej (NA) soczewki obiektywu. Zakładając ognisko ograniczone dyfrakcją (tj. tylna apertura soczewki obiektywu jest przepełniona wiązką wzbudzenia), korektor (1) opisuje uśredniony w czasie strumień fotonów fluorescencji z objętości ogniskowej wynikający z 3PE.

figure-introduction-1 (1)

Gdzie f to częstotliwość powtarzania lasera, τ to czas trwania impulsu laserowego (pełna szerokość w połowie maksimum), φ to wydajność zbierania danych przez system, η to wydajność kwantowa fluorescencji, σ3 to przekrój absorpcyjny 3P, C to stężenie fluoroforu, n0 to wskaźnik odbicia medium próbki (np. wody), λ to długość fali wzbudzenia w próżni, NA to apertura numeryczna soczewki obiektywu, a 3 to stała całkowania przestrzennego objętości ogniskowej, figure-introduction-2 to uśredniony w czasie strumień fotonów wzbudzenia (fotony/s) pod soczewką obiektywu, z to obrazowana głębokość, a EAL to efektywna długość tłumienia14. Tutaj założyliśmy, że EAL (typowo > 100 μm) jest znacznie większa niż rozdzielczość osiowa mikroskopu (zwykle < 10 μm). W przybliżeniu paraosiowym liczba 3 jest równa 28,114. Gp (3) jest koherencją czasową trzeciego rzędu źródła wzbudzenia, a gp (3) wynosi odpowiednio 0,41 i 0,51 dla impulsów hiperboliczno-sekantowych i impulsów Gaussa. Skuteczność zbierania φ można oszacować, biorąc pod uwagę zbieranie fluorescencji przez soczewkę obiektywu, przepuszczalność soczewki obiektywu, współczynnik odbicia zwierciadła dichroicznego, transmitancję filtrów oraz skuteczność wykrywania detektora (np. lampy fotopowielacza lub PMT). Ponieważ intensywność fluorescencji 3P jest silnie zależna od różnych parametrów, konieczna jest optymalizacja konfiguracji 3P, aby zmaksymalizować sygnały fluorescencji 3P.

Ten protokół ilustruje proces optymalizacji typowej konfiguracji 3P, co będzie szczególnie przydatne dla laboratoriów biologicznych, które mają konfigurację 2P i planują rozszerzyć jej możliwości na obrazowanie 3P lub utrzymać swoją komercyjną konfigurację 3P na optymalnym poziomie. Ten artykuł wideo przedstawia również obrazowanie 3P tkanek głębokich w mózgach żywych zwierząt. Pierwsza sekcja dotyczy optymalizacji typowej konfiguracji 3P z dostępnym na rynku źródłem laserowym i mikroskopem wielofotonowym. Druga i trzecia sekcja opisują przygotowanie odpowiednio danio pręgowanego i myszy do 3PM struktur i aktywności neuronalnej. Operacja kraniotomii myszy została wcześniej opisana w dokumentach protokołowych15,16,17. Czwarta sekcja demonstruje przyżyciowe obrazowanie 3P w mózgach danio pręgowanego i myszy.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentów na zwierzętach i trzymania ryb i myszy zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Cornell University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Danio pręgowany i myszy zostały poddane eutanazji odpowiednio przez roztwór tricainy o wysokim stężeniu i uduszenie dwutlenkiem węgla po eksperymencie.

1. Optymalizacja konfiguracji mikroskopii trójfotonowej

UWAGA: Nosić okulary ochronne do ochrony oczu. Zablokuj wiązkę laserową za pomocą blokady wiązki, gdy optyka jest umieszczona lub przesunięta. Aby zobrazować laser, użyj przeglądarki podczerwieni lub karty detektora podczerwieni.

  1. Włącz laser i ustaw środkową długość fali wyjścia idlera niewspółliniowego optycznego wzmacniacza parametrycznego (NOPA) na ~1,300 nm lub ~1,700 nm.
  2. Umieść cienkie szkło nakrywkowe na linii badawczej od portu sygnałowego NOPA (tj. ~700-900 nm), aby odbić niewielką część wiązki laserowej do fotodiody Si w celu uzyskania sygnałów wyzwalających ( Rysunek 1). Umieść blokadę wiązki w ścieżce transmisji szkła osłonowego.
  3. Umieść kompresory impulsów na ścieżce światła, aby wstępnie ćwierkać laser femtosekundowy, aby zoptymalizować czas trwania impulsu o godzinie 15:00. Dla wiązki ~1,300 nm umieść kompresor pary pryzmatów18,19 (np. pary pryzmatów N-SF11). W przypadku lasera o długości fali ~1,700 nm umieść płytkę Si o grubości ~3 mm20. Ustaw kąt między płytką Si a ścieżką lasera pod kątem Brewstera (~73.9° dla 1,700 nm), aby zmaksymalizować przepuszczalność lasera. Obróć płytkę Si, aby uzyskać kąt Brewstera, minimalizując odbicie.
  4. Umieść lusterka flipper, aby umożliwić wygodne przełączanie między liniami wiązki ~1,300 nm i ~1,700 nm.
  5. Umieść płytkę półfalową (np. achromatyczną płytkę półfalową odpowiednią dla ~1,300 i ~1,700 nm) zamontowaną na stoliku obrotowym i rozdzielaczu wiązki polaryzacyjnej (PBS), aby kontrolować intensywność lasera. Umieść blokadę wiązki na ścieżce odbicia PBS.
    UWAGA: Laser musi przejść przez PBS prostopadle, aby osiągnąć wysoki współczynnik ekstynkcji. Moc lasera dla 3PM jest kontrolowana przez obracanie półpłytki falowej.
  6. Umieść cienką szklankę nakrywkową na ścieżce światła za kontrolerem mocy i przed migawką optyczną, aby odbić niewielką część wiązki laserowej do miernika mocy. Użyj miernika mocy jako "miernika mocy odniesienia" do obliczenia mocy lasera pod obiektywem podczas obrazowania (patrz krok 1.12).
  7. Wyrównaj ścieżkę lasera, regulując lustra tak, aby rozchodziła się wiązka do systemu 3PM.
  8. Zmierz rozmiar wiązki w miejscu tylnego otworu obiektywu za pomocą ostrza noża na stoliku translacyjnym i miernika mocy. Upewnij się, że rozmiar wiązki nie jest ani za mały, ani za duży.
    UWAGA: Zazwyczaj wiązka nieznacznie zasłania soczewkę obiektywu o wysokiej NA, aby osiągnąć wysoką przepustowość mocy do obrazowania głębokich tkanek. Na przykład rozmiar wiązki ~10-13 mm (1/e2) na tylnej aperturze obiektywu Olympus (~15 mm średnica tylnej apertury) pomaga osiągnąć efektywną wartość NA ~0,7-0,9. Gdy rozmiar wiązki jest zbyt mały, sygnał 3P staje się słaby, a rozdzielczość przestrzenna pogarsza się z powodu niskiego efektywnego NA. Gdy rozmiar wiązki jest zbyt duży, maksymalna dostępna moc wzbudzenia pod obiektywem staje się słaba z powodu utraty mocy w tylnej aperturze obiektywu. W przypadku obrazowania tkanek głębokich promienie brzeżne również ulegają większej utracie ze względu na dłuższą drogę w tkance.
  9. Jeśli rozmiar wiązki na tylnym otworze obiektywu nie jest odpowiedni, umieść odpowiednie elementy optyczne, takie jak soczewki wypukłe, na ścieżce wiązki laserowej, aby dostosować rozmiar wiązki.
    UWAGA: Upewnij się, że wiązka laserowa nie jest większa niż lustra galvo, aby zapobiec niepotrzebnej utracie mocy.
  10. Umieść soczewkę obiektywu na ustawieniu 3PM.
  11. Zmierz czas trwania impulsu po osiągnięciu celu za pomocą autokorelatora. Dostosuj kompresor impulsów, aby uzyskać krótsze impulsy, jeśli czas trwania impulsu jest zbyt długi (np. >70 fs). Użyj impulsów ~50-70 fs dla 3PM i interferometru Michelsona umieszczonego między laserem a obiektywem, aby zapewnić opóźnienie pomiarów autokorelacji.
    UWAGA: Fotodioda o odpowiedniej odpowiedzi spektralnej (np. fotodioda krzemowa o długości fali większej niż 1200 nm) umieszczona w ognisku obiektywu może wygodnie służyć jako detektor nieliniowy, a dwufotonowy prąd fotonowy z fotodiody może być wykorzystany do uzyskania śladów autokorelacji 20. Kompresor pary pryzmatów dla ~1,300 nm można regulować na dwa sposoby: (1) zmiana odległości między dwoma pryzmatami; (2) zmiana długości ścieżek wiązki laserowej w szkle pryzmatycznym poprzez przesuwanie pryzmatu (pryzmatów) prostopadle do linii podstawowej pryzmatu. Kompresor płytowy Si dla ~1,700 nm można regulować, zastępując płytę Si grubszą lub cieńszą płytą Si.
  12. Umieść miernik mocy na wyjściu soczewki obiektywu. Zmierz moc lasera pod obiektywem i odczytaj wartość referencyjnego miernika mocy (od kroku 1.6). Obliczyć stosunek mocy pod obiektywem i na referencyjnym mierniku mocy.
    UWAGA: Podczas obrazowania rzeczywistą moc lasera pod obiektywem można obliczyć na podstawie stosunku mocy i wartości referencyjnego miernika mocy.
  13. Wyjmij miernik mocy spod obiektywu.
  14. [Opcjonalnie] Sprawdź ograniczoną wydajność systemu obrazowania z powodu szumu wystrzeliwanego fotonów
    UWAGA: Do wykonania tego zadania potrzebne są następujące elementy: 1) jedna pula barwników fluoresceiny lub czerwieni teksańskiej (np. ~10 μM), 2) licznik fotonów oraz 3) oscyloskop.
    1. Umieść próbkę kałuży barwnika pod soczewką obiektywu 3PM.
    2. Ostrożnie opuść soczewkę obiektywu na basen barwnika, aż odległość będzie mniejsza niż odległość robocza soczewki obiektywu.
    3. Umieść wodę między soczewką a szkłem nakrywkowym basenu barwnika.
    4. Ustaw moc wyjściową mikroskopu na niewielką wartość (np. <1 mW z częstotliwością powtarzania impulsów ~1 MHz), aby zlokalizować powierzchnię basenu barwnika.
    5. Rozpocznij sesję na żywo mikroskopu i ustaw położenie z na zero.
    6. Powoli odsuń obiektyw od próbki, aby dotrzeć do górnej części puli barwnika (zgodnie z trzecią generacją harmonicznej (THG) wytwarzaną przez szkło nakrywkowe).
    7. Ustaw położenie z na zero w miejscu szkła nakrywkowego.
    8. Nieznacznie obniż obiektyw, aż w kanale fluorescencji będzie widoczny wyraźny sygnał fluorescencyjny.
    9. Podłącz wyjście PMT do rozgałęźnika BNC. Podłącz wyjścia dzielnika do licznika fotonów i systemu akwizycji obrazu.
    10. Ustaw moc lasera na wartość, w której liczba fotonów na sekundę jest mniejsza niż 5% częstotliwości powtarzania lasera (np. figure-protocol-150 000 fotonów/s, gdy używany jest laser 1 MHz).
    11. Zmniejsz pole widzenia do minimum możliwego za pomocą oprogramowania i upewnij się, że jasność jest jednolita na całym obrazie.
    12. Ustaw szybkość odświeżania na 1,0 klatki na sekundę.
    13. Ustaw okres akwizycji licznika fotonów na t = liczba pikseli na klatkę × czas przebywania pikseli i odpowiedni poziom dyskryminatora.
    14. Zbieraj liczbę fotonów i pikseli jednocześnie przez równoważny okres. Aby uzyskać liczbę pikseli, należy zebrać średnie wartości pikseli z całego obrazu, a także wartości średniej i odchylenia standardowego.
    15. Powtórz krok 1.14.14, blokując laser wzbudzający, aby uzyskać liczbę ciemnych fotonów i liczbę pikseli.
    16. Zatrzymaj pobieranie oprogramowania na żywo.
    17. Odejmij ciemne liczby (uzyskane w kroku 1.14.15) od liczby fotonów (uzyskanej w kroku 1.14.14) i całkowitej liczby pikseli (uzyskanej w kroku 1.14.14).
    18. Podziel całkowitą liczbę pikseli odjętą w ciemności przez liczbę odjętych w ciemności fotonów (uzyskaną w kroku 1.14.17). Uzyskaną wartość należy wykorzystać jako "współczynnik konwersji" (tj. wartości pikseli/foton) z wartości piksela na liczbę fotonów.
    19. Przelicz średnią i odchylenie standardowe liczby pikseli (uzyskane w kroku 1.14.14) na liczbę fotonów, tj. dzieląc je przez "współczynnik konwersji" (uzyskany w kroku 1.14.18). Porównaj średnią i odchylenie standardowe liczby fotonów. Upewnij się, że odchylenie standardowe jest w przybliżeniu równe pierwiastkowi kwadratowemu ze średniej liczby fotonów, jeśli wydajność systemu obrazowania jest bliska wartości granicznej szumu strzału.
  15. [Opcjonalnie] Sprawdź skuteczność wykrywania sygnału przez mikroskop.
    1. Aby przetestować działanie mikroskopu i skuteczność wykrywania sygnału, wykonaj kroki 1.14.1-1.14.17 w celu uzyskania liczby fotonów. W kroku 1.14.15 należy utworzyć ślepą próbkę wykonaną z rozpuszczalnika dla barwnika i uzyskać liczbę fotonów dla próbki ślepej przy włączonym laserze i z tą samą mocą, co w przypadku puli barwnika. Odejmij ślepe zliczenia od liczby fotonów z puli barwnika, aby uzyskać liczbę fotonów fluorescencji.
    2. Użyj znanych przekrojów 3P fluoresceiny lub Texas Red10,22 i równania (1) (z efektywnym NA, aby uwzględnić prawidłowe wypełnienie tylnej apertury), aby obliczyć oczekiwaną liczbę fotonów, a następnie porównaj obliczoną wartość z liczbą fotonów zmierzoną eksperymentalnie. Zapisz obie liczby fotonów w notatniku laboratoryjnym jako wyniki testów dla mikroskopu do wykorzystania w przyszłości.
      UWAGA: Upewnij się, że obliczone i zmierzone wartości są blisko siebie (np. w zakresie współczynnika 2). Takie testy ilościowe systemu są szczególnie przydatne w celu zapewnienia stałej wydajności obrazowania w czasie.

2. Przygotowanie ryb na godzinę 15:00

UWAGA: Do tej procedury należy nosić rękawice i fartuch laboratoryjny. Wybierz dorosłego danio pręgowanego zgodnie z eksperymentem. Zakończ całe przygotowanie (kroki od 2.1 do 2.7) w ciągu ~15 min.

  1. Przygotuj szalkę Petriego z ~0,5 cm 2% agaru o wysokiej temperaturze topnienia. Wytnij prostokątny otwór w agarze dłuższy i nieco szerszy niż ryba. Użyj wosku, aby przymocować cienką rurkę (do wtłaczania wody do pyska ryby) do szalki Petriego, tak aby jeden koniec znajdował się w prostokącie. Użyj wosku, aby przymocować rurkę o większej średnicy (do usuwania wody) do krawędzi szalki Petriego.
  2. Wybierz ryby do eksperymentu. Znieczulij rybę 0,2 mg/ml roztworu tricainy (pH 7,2) w roztworze Hanka, aż ryba całkowicie przestanie reagować i będzie głęboko znieczulona.
  3. Połóż rybę na boku na mokrej gąbce. Za pomocą mikrostrzykawki wstrzyknąć po ortopie 3 μl bromku pankuronium (0,4 μg/μl w roztworze Hanka), aby sparaliżować ryby. Umieść rybę na krótko w roztworze Hanka, aby upewnić się, że jest całkowicie sparaliżowana.
  4. Umieść rybę grzbietem do góry na szalce Petriego z głową skierowaną w stronę rurki. Używając kleszczy do manipulowania rurką, delikatnie otwórz pysk ryby i wsuń rurkę do ust. Delikatnie przesuń rybę w kierunku rurki, tak aby rurka znalazła się z tyłu pyska ryby.
  5. Szybko, ale delikatnie osusz agar wokół ryby i usuń wodę z wierzchu ryby. Zanurz mały kawałek tkanki laboratoryjnej w kleju laboratoryjnym i połóż tkankę na agarze po obu stronach ryby i na grzbiecie ryby ogonowo do skrzeli.
    UWAGA: Nie naciskaj na rybę ani nie wywieraj nacisku. Uważaj, aby nie dostać kleju na skrzela.
  6. Nałóż niewielką kroplę bupiwakainy bezpośrednio na powierzchnię głowy, aby znieczulić rybę podczas obrazowania w obszarze, w którym laser będzie stykał się ze skórą.
  7. Przynieś szalkę Petriego z rybą do mikroskopu i napełnij ją wodą z akwarium. Podłącz rurkę do pompy wodnej, aby pompować wodę z systemu z prędkością 2 ml/min do pyska ryby i jednocześnie usunąć roztwór perfuzyjny z naczynia z tą samą szybkością. Upewnij się, że woda jest natleniona bełkotką i ogrzana do ~30 °C za pomocą grzałki akwariowej.
    UWAGA: Ryba jest teraz gotowa do obrazowania. Monitorować stan zdrowia ryb, monitorując przepływ krwi w sygnale trzeciej harmonicznej generacji (THG) podczas obrazowania (patrz sekcja 4.1). Obrazowanie 3P powinno być również kompatybilne z bardziej wyrafinowanymi preparatami rybnymi, takimi jak te używane w obrazowaniu 2P do unieruchamiania głowy i umożliwiania ruchów ciała podczas obrazowania podczas rzeczywistości wirtualnej23. To całkowicie nieinwazyjne obrazowanie pozwala uniknąć konieczności usuwania czaszki, co jest typowe dla innych badań kręgowców i jest krokiem w kierunku zminimalizowania inwazyjnych badań i związanego z nimi bólu.

3. Przygotowanie myszy do godziny 15:00

UWAGA: Noś rękawiczki, maskę chirurgiczną i fartuch laboratoryjny podczas następujących procedur. Wybierz linię myszy zgodnie z eksperymentem. Mysz powinna być trzymana w cyklu 12:12 godzin światło-ciemność przed zabiegiem. Cała operacja (kroki 3.2-3.11) jest aseptyczna, a wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny być wysterylizowane przed użyciem. Kraniotomia trwa ~1 h.

  1. Umieść szkiełko nakrywkowe w kształcie pączka (średnica 4,5-6,5 mm) i krążek szkiełka nakrywkowego (średnica 5 mm) na czystym parafolii. Za pomocą igły nałóż niewielką ilość kleju optycznego, aby przykleić szkiełko nakrywkowe w kształcie pączka do krążka szkiełka nakrywkowego. Utwardź szkiełko nakrywkowe w kształcie pierścienia na parafilmie w świetle ultrafioletowym przez 10-20 minut. Usuń całe szkiełko nakrywkowe w kształcie pączka z parafilmu i użyj pęsety, aby zeskrobać nadmiar kleju i 70% etanolu, aby usunąć zanieczyszczenia.
    UWAGA: Szkiełka nakrywkowe mają grubość ~0,17 mm. Szkiełko nakrywkowe w kształcie pączka służy do wywierania odpowiedniego nacisku na mózg w przypadku przewlekłego obrazowania.
  2. Znieczulić mysz mieszaniną 3% izofluranu i 20%O2 gazów w komorze indukcyjnej. Zważ mysz. Umieść mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej. Ustaw temperaturę poduszki grzewczej na ~37 °C.
  3. Zamocuj górne zęby w otworze ustnym aparatu stereotaktycznego z umieszczeniem maski znieczulającej. Przymocuj nauszniki do uszu. Podczas zabiegu należy utrzymać znieczulenie za pomocą mieszaniny 2% izofluranu i 20% gazówO2.
    UWAGA: Dostosuj stężenie izofluranu, monitorując reakcję myszy. Sprawdź poziom znieczulenia, obserwując częstość oddechów (~1 Hz dla głębokiego snu) i szczypiąc stopy, aby sprawdzić, czy nie ma reakcji przed operacją.
  4. Nałóż maść na oczy w celu nawilżenia. Zamknij powieki. Włącz wszystkie lampy chirurgiczne. Podskórnie wstrzyknąć ketoprofen, deksametazon i glikopirolan w zależności od masy ciała myszy przed operacją.
    UWAGA: Dawki leku wynoszą odpowiednio 2 mg/ml, 0,1 mg/ml i 0,1 mg/ml odpowiednio dla ketoprofenu, deksametazonu i glikopironianu. Objętości wstrzyknięć ketoprofenu, deksametazonu i glikopironanu zależą od masy ciała i wynoszą odpowiednio 2,5 μl/g, 2 μl/g i 2 μl/g.
  5. Usuń włosy na czubku głowy i w pobliżu uszu.
    1. Przytnij jak najwięcej włosów nożyczkami lub maszynką do strzyżenia włosów i usuń przycięte włosy z pola operacyjnego.
    2. Nałóż odpowiednią ilość kremu do depilacji. Odczekaj 1 minutę.
    3. Usuń włosy i krem za pomocą bawełnianego wacika nasączonego solą fizjologiczną.
    4. Powtarzaj kroki 3.5.2 i 3.5.3, aż włosy zostaną całkowicie usunięte.
    5. Nałóż 5% roztwór jodu powidonu, a następnie 70% etanol na skórę, aby oczyścić obszar. Powtórz proces trzy razy.
  6. Wykonać podskórne wstrzyknięcie atropiny (dawka w zależności od masy ciała, 0,02-0,05 mg/kg) w głowę. Odczekaj 1 minutę.
  7. Przetnij skórę na czubku głowy, aby odsłonić czaszkę. Upewnij się, że zarówno punkt bregma, jak i punkt lambda są odsłonięte. Przyklej pozostałą tkankę skórną na krawędzi do czaszki za pomocą biokompatybilnego kleju, aby uniknąć przedostawania się pyłu wiertniczego pod skórę (co może wywołać odpowiedź immunologiczną).
  8. Użyj markera chirurgicznego, aby narysować okrąg o średnicy 5 mm nad obszarem zainteresowania. Na przykład wybierz środek obszaru ~2,5 mm boczny i 2 mm ogonowy do bregmy, który obejmuje większość kory somatosensorycznej i kory wzrokowej.
  9. Powoli wiercić wzdłuż okręgu i nałóż sól fizjologiczną, aby nawodnić czaszkę po zakończeniu w połowie. Zwolnij prędkość wiercenia przez ostatnią połowę i przykryj czaszkę solą fizjologiczną przed wyjęciem czaszki. Delikatnie otwórz czaszkę kleszczami i nałóż mały kawałek sterylnej pianki żelowej nasączonej solą fizjologiczną, aby natychmiast zatrzymać krwawienie w mózgu. Utrzymuj nawodnienie mózgu za pomocą soli fizjologicznej.
  10. Nałóż kroplę soli fizjologicznej na stronę przygotowanego szkiełka nakrywkowego w kształcie pączka skierowaną w stronę tkanki mózgowej. Umieść wystającą część dysku szkiełka nakrywkowego w kształcie pierścienia w oknie czaszki. Użyj długiego pręta trzymanego przez aparat stereotaktyczny, aby delikatnie docisnąć część krążkową okna czaszki szkiełka nakrywkowego do powierzchni mózgu, upewniając się, że część pączkowa szczelnie zakrywa czaszkę. Osusz obszar wokół szkiełka nakrywkowego z krążkiem bawełnianym wacikiem.
  11. Nałóż warstwę biokompatybilnego kleju pod krawędź w kształcie pączka. Nałóż warstwę mieszanki cementu dentystycznego pod i wokół pączkowej części szkiełka nakrywkowego w kształcie pączka. Nałóż kolejną warstwę kleju na cement dentystyczny. 5% glukozy (dawka w zależności od masy ciała, 10 μL/g) można wstrzykiwać podskórnie co godzinę podczas operacji, aby zapewnić zwierzęciu energię.
  12. Wyłącz system znieczulający. Odłącz mysz od aparatu stereotaktycznego. Natychmiast przenieś mysz do dostosowanego do potrzeb klienta kompaktowego aparatu stereotaktycznego z poduszką grzewczą o temperaturze ~37 °C i aparatem anestezjologicznym.
  13. Umieść mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej dostosowanego kompaktowego aparatu stereotaktycznego. Ustaw temperaturę na ~37 °C. Przymocuj górne zęby do otworu gębowego aparatu stereotaktycznego, a paski douszne do uszu myszy. Załóż rurki znieczulające i utrzymuj znieczulenie mieszaniną 1,5% izofluranu i 20%O2 gazów.
    UWAGA: Mysz jest teraz gotowa do obrazowania. Utrzymuj mysz w znieczuleniu podczas następujących procedur obrazowania. Dostosuj stężenie izofluranu, monitorując reakcję myszy.

4. Obrazowanie przyżyciowe w mózgach ryb i myszy

  1. Obrazowanie przyżyciowe w mózgu danio pręgowanego
    UWAGA: Aby prawidłowo zlokalizować mózg ryby pod soczewką obiektywu, na tej samej ścieżce, co światło wzbudzenia do obrazowania szerokokątnego, używana jest kamera z wtórnym urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD).
    1. Ustaw mikroskop i skalibruj moc (zgodnie z opisem w rozdziale 1).
    2. Umieść obiektyw o małym powiększeniu (zwykle 4x) na mikroskopie.
    3. Umieścić szalkę Petriego zawierającą rybę i probówki pod mikroskopem.
    4. Użyj źródła światła z diodą elektroluminescencyjną (LED), aby oświetlić szalkę Petriego.
    5. Otwórz tryb aparatu w oprogramowaniu do akwizycji obrazów (Rysunek 2).
    6. Kliknij opcję Na żywo.
    7. Wybierz kanał A po prawej stronie ekranu.
    8. Dostosuj ustawienia histogramu, aby obraz był wyraźnie widoczny.
      UWAGA: Należy je zaktualizować w razie potrzeby.
    9. Ustaw ustawienie silnika w sterowniku silnika na Base.
    10. Opuść obiektyw, aż ryba będzie widoczna.
      UWAGA: Upewnij się, że soczewka obiektywu nie styka się fizycznie z głowicą.
    11. Umieść środek głowy ryby w środku pola widzenia.
    12. Przesuń cel w górę i odsuń go od głowy ryby.
    13. Wymień soczewkę obiektywu o małym powiększeniu na soczewkę obiektywową o wysokim NA, aby uzyskać 3PM.
      UWAGA: Soczewka o małym powiększeniu i soczewka obiektywowa o wysokim NA nie muszą być parafokalne, ale muszą być wystarczająco blisko, aby ryba znajdowała się w polu widzenia soczewki obiektywu o wysokiej NA.
    14. Powoli opuść soczewkę obiektywu, upewniając się, że obiektyw nie ma żadnego fizycznego kontaktu z głowicą. W oprogramowaniu kamery CCD przestań przesuwać obiektyw, gdy widoczny jest czubek głowy. Ustaw położenie z na 0 μm.
      UWAGA: Upewnij się, że pod soczewką obiektywu nie ma pęcherzyków powietrza podczas korzystania z obiektywu zanurzonego w wodzie.
    15. Wyłącz źródło światła LED i zamknij ciemną kurtynę wokół systemu.
    16. Ustaw oprogramowanie do akwizycji obrazu w trybie Multiphoton GG dla obrazowania 3P i ustaw moc pod soczewką obiektywu na mniej niż 1 mW (z częstotliwością powtarzania impulsów ~1 MHz).
    17. Zmień przycisk ustawień silnika z podstawy na obiektyw na sterowniku silnika.
    18. Zgaś światło w pokoju.
    19. Włącz PMT i otwórz migawkę źródła wzbudzenia 3PM. Upewnij się, że kontur kości pojawia się w kanale sygnału fluorescencji z powodu autofluorescencji oraz w kanale sygnału THG z powodu THG kości (Rysunek 2C).
    20. Wykonuj obrazowanie na różnych głębokościach, zwiększając poziomy mocy podczas głębszego obrazowania.
  2. Obrazowanie przyżyciowe w mózgu myszy
    UWAGA: Wstrzykiwaj 5% glukozy znieczulonej myszy co godzinę podczas obrazowania; Dawka zależy od masy ciała (10 μl/g).
    1. Ustaw oprogramowanie do akwizycji obrazu w trybie Multiphoton GG dla obrazowania 3P i ustaw moc pod soczewką obiektywu na mniej niż 1 mW (z częstotliwością powtarzania impulsów ~1 MHz).
      UWAGA: Upewnij się, że okienko operacyjne jest umieszczone prostopadle do soczewki obiektywu, aby zmniejszyć aberrację. Precyzyjna regulacja odbywa się poprzez przechylenie aparatu stereotaktycznego.
    2. Przesuń soczewkę obiektywu blisko okienka i nałóż wodę między obiektyw a okienko czaszki; ustaw wartości osi wszystkich silników na zero.
      UWAGA: Absorpcja światła wH2Oprzy ~1,700 nm jest duża, co znacznie zmniejsza moc lasera ~1,700 nm po głębokości ~1-2 mm wody. Dla wzbudzenia ~1,700 nm użyj D2O, który ma znacznie mniejszą absorpcję przy 1,700 nm, do zanurzenia w wodzie, aby zmniejszyć absorpcję przez wodę.
    3. Kliknij przycisk Live w oprogramowaniu do akwizycji obrazu i otwórz kanały PMT, np. jeden kanał sygnału fluorescencji i jeden kanał sygnału THG. W razie potrzeby dostosuj wzmocnienie PMT i poziom tła.
    4. Powoli przesuwaj soczewkę obiektywu w górę, aby zlokalizować powierzchnię okna, monitorując kanał THG z dużych naczyń krwionośnych i powierzchni szyby okiennej. W razie potrzeby dostosuj orientację okna (patrz uwaga w kroku 4.2.12). Wyzeruj silniki, aby zdefiniować powierzchnię mózgu.
    5. Wykonaj obrazowanie i dostosuj poziom mocy do głębokości obrazowania.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne zakończenie tego protokołu zaowocuje odpowiednio ustawionym mikroskopem o optymalnych parametrach światła (np. czas trwania impulsu, NA) i preparatach zwierzęcych odpowiednich do in vivo 3PM. Dostępny na rynku zestaw 3P składa się z odpowiednich luster i soczewek zarówno dla ~1,300 nm, jak i ~1,700 nm; Dlatego zmiana optyki nie jest wymagana, gdy długość fali wzbudzenia jest przełączana między 1 300 nm a 1 700 nm. Jeśli soczewki w konfiguracji 3P nie mają odpowiedniej powłoki dla 1,300 i 1,700 nm, należy je wymienić na odpowiednie, aby zmniejszyć straty mocy lasera. Dzięki zoptymalizowanej godzinie 3PM i odpowiedniemu przygotowaniu zwierząt, obrazy fluorescencji in vivo i THG o wysokim kontraście mogą być zbierane głęboko w mózgu.

Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne obrazy 3P nienaruszonego dorosłego danio pręgowanego. Nieinwazyjne i głębokie obrazowanie genetycznie znakowanych neuronów w mózgu dorosłego danio pręgowanego o wysokiej rozdzielczości uzyskuje się przy użyciu 3PM. Chociaż obrazowanie w obszarze kresomózgowia zostało zgłoszone w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą 2PM24,25,26,27, 3PM umożliwia dostęp do całego kresomózgowia i regionów, które są trudniejsze lub niemożliwe do zaobserwowania przy użyciu innych technik. Rozkład warstw komórkowych w tektum nerwu wzrokowego i móżdżku można zaobserwować w Rysunek 3C. W udanej sesji obrazowania kość jest widoczna w kanale THG, a neurony widoczne w kanale fluorescencyjnym. W przypadku obrazowania dorosłych ryb danio pręgowanego, do zlokalizowania ryby wykorzystano funkcję kamery w mikroskopie (Rysunek 3A). Ten krok nie jest konieczny do obrazowania mózgu myszy, ponieważ szklane okno jest wystarczająco duże, aby mózg był łatwo dostępny. Obrazy strukturalne o wysokiej rozdzielczości mózgu dorosłego danio pręgowanego uzyskano przy użyciu systemu opisanego w poprzednich sekcjach. Czaszka jest widoczna w kanale THG (Ryc. 3B), który pomaga poruszać się po mózgu i znaleźć górną powierzchnię. Jak zaobserwowano w Rysunek 3C, neurony można odróżnić dzięki wysokiemu stosunkowi sygnału do tła (SBR) głęboko w dorosłym mózgu. Tkanka nad mózgiem jest widoczna w kanale fluorescencji z powodu autofluorescencji.

Rysunek 4 pokazuje wielokolorowe obrazy 3P neuronów znakowanych GCaMP6s (zielony) i naczyń krwionośnych oznaczonych Texas Red (czerwony) wraz z sygnałami THG (niebieski) w mózgu dorosłej myszy z wzbudzeniem 1,340 nm10. Obrazy są reprodukowane z poprzedniej pracy10. W Rysunek 4, energia impulsu w ognisku była utrzymywana na poziomie ~1,5 nJ na całej głębokości, aby uzyskać wystarczającą ilość sygnałów fluorescencyjnych i THG, a maksymalna średnia moc lasera wynosiła ~70 mW. Czas trwania impulsu został ustawiony na ~60 fs, a efektywny NA wynosił ~0,8. Dzięki optymalizacji konfiguracji 3PM udało się uzyskać obrazy o wysokim kontraście do 1,2 mm od powierzchni mózgu, w regionie hipokampa CA1 (Ryc. 4A,B). Rysunek 4C,D pokazuje ślady aktywności Ca2+ neuronów znakowanych GCaMP6s na głębokości 750 μm przez 10-minutową sesję nagraniową, wykazując wysoką wierność nagrywania.

Jeśli laser wzbudzający jest źle ustawiony, można zaobserwować niejednorodność jasności sygnału w całym polu widzenia. Dodatkowo, jeśli parametry lasera, takie jak czas trwania impulsu, energia impulsu wzbudzenia w ognisku i efektywna NA, nie zostaną zoptymalizowane, obraz THG z czaszki ryby lub okienka kraniotomii mózgu myszy nie będzie widoczny i/lub będzie wymagał wysokiej energii impulsu wzbudzenia (np. >2 nJ/impuls w ognisku). W związku z tym sygnały THG na powierzchni mózgu mogą być wykorzystane jako wskaźnik zoptymalizowanej konfiguracji 3PM przed rozpoczęciem obrazowania tkanek głębokich.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja konfiguracji o godzinie 3PM. Długość fali lasera wzbudzającego jest ustawiona na ~1,300 nm lub ~1,700 nm, wyprowadzana z portu luźnego NOPA. Kompresor pary pryzmatów i kompresor płytowy Si są używane odpowiednio w laserze ~1,300 nm i ~1,700 nm do wstępnego ćwierkania impulsu lasera wzbudzenia. Wiązki laserowe ~1.300 nm i ~1.700 nm mogą być przełączane za pomocą lusterek flipper. Port sygnałowy NOPA służy do uzyskania sygnału wyzwalającego. Półpłytka falowa i PBS służą do sterowania mocą wzbudzenia. Fluorescencja i THG są wykrywane przez PMT GaAsP. Do rozdzielenia sygnałów fluorescencji i THG stosuje się odpowiednie kombinacje zwierciadeł dichroicznych i filtrów pasmowoprzepustowych. Skróty: 3PM = mikroskopia trójfotonowa; NOPA = niewspółliniowy optyczny wzmacniacz parametryczny; PBS = rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej; THG = generacja trzeciej harmonicznej; DAQ = akwizycja danych; PMT = lampa fotopowielacza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne zrzuty ekranu dla obrazowania przyżyciowego u ryb (sekcja 4.1 protokołu). (A) Widok oprogramowania do akwizycji obrazu w trybie kamery z założoną soczewką obiektywu 4x. Kluczowe funkcje oprogramowania są opisane i ponumerowane w następujący sposób: 1. Tryb obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Dostępne opcje trybów to Aparat, Wielofotonowy i Multifotonowy GG. W przypadku obrazowania światłem białym za pomocą kamery CCD wybierany jest tryb aparatu. 2. Kliknięcie przycisku Live włącza kamerę (lub PMT, jeśli jest w opcji wielofotonowej) i można obserwować widok mikroskopu w czasie rzeczywistym. 3. W zakładce Capture Setup (Ustawienia przechwytywania) ustawia się żądane parametry obrazowania (moc, lokalizacja, głębokość). 4. Na karcie Przechwytywanie przypisana jest lokalizacja folderu, w którym mają zostać zapisane obrazy. Obrazowanie można rozpocząć w tej zakładce. 5. Ustawienie Z Control steruje głębokością obrazowania, przesuwając silnik stolika z. 6. Reprezentatywny obraz głowy danio pręgowanego. Rostralna strona głowy znajduje się po lewej stronie. (B) Reprezentatywny widok trybu kamery z obiektywem 25x. (C) Reprezentatywny widok trybu Multiphoton GG zawierający obraz THG obrazu widzianego w (B). Skróty: CCD = urządzenie sprzężone z ładunkiem; PMT = lampa fotopowielacza; THG = generacja trzeciej harmonicznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy mózgu dorosłego danio pręgowanego uzyskane za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów. (A) Zdjęcie głowy dorosłego danio pręgowanego wykonane za pomocą obiektywu o powiększeniu 4x. Górna część obrazu to kierunek rostralny. Płaty OT i CB są zarysowane. (B) Reprezentatywny obraz uzyskany w trybie Multiphoton GG za pomocą soczewki obiektywu o powiększeniu 25x, zawierający obraz THG (A). (C) Obrazy fluorescencyjne mózgu dorosłego danio pręgowanego na przecięciu móżdżku i tektum nerwu wzrokowego, gdzie GFP ulega ekspresji w cytoplazmie neuronów na różnych głębokościach. Podziałka = 100 μm. Skróty: OT = tectam optyczny; CB = móżdżek; THG = generacja trzeciej harmonicznej; GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wielokolorowa 3PM neuronów znakowanych GCaMP6 s (zielony), naczynia krwionośne znakowane Texas Red (czerwony) i generacja trzeciej harmonicznej (niebieska) po wzbudzeniu 1,340 nm w mózgu myszy. (A) Obrazy Z-stack do 1,200 μm od powierzchni mózgu z polem widzenia 270 x 270 μm (512 x 512 pikseli na klatkę). Moc lasera zmieniała się w zależności od głębokości obrazowania, aby utrzymać energię impulsu ~1,5 nJ w ognisku. Maksymalna średnia moc w ramach celu wynosiła 70 mW. (B) Wybrane obrazy 2D na różnych głębokościach obrazowania. (C) Miejsce rejestracji aktywności na głębokości 750 μm pod oponą twardą o polu widzenia 270 x 270 μm (256 x 256 pikseli). (D) Spontaniczne ślady aktywności mózgu zarejestrowane u obudzonej myszy z oznakowanych neuronów wskazanych w (C). Liczba klatek na sekundę wynosiła 8,3 Hz, a czas przebywania pikseli wynosił 0,51 μs. Częstotliwość powtarzania lasera wynosiła 2 MHz, a średnia moc pod soczewką obiektywu wynosiła 56 mW. Każdy ślad został znormalizowany do swojej linii bazowej i przefiltrowany dolnoprzepustowy przy użyciu okna Hamminga o stałej czasowej 0,72 s. Podziałka = 50 μm. Ten rysunek i legenda rysunku są odtworzone z 10. Skrót: 3PM = mikroskopia trójfotonowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Efektywna długość tłumienia w korze nowej mózgu myszy. EAL (linia magenta) oblicza się na podstawie rozpraszania tkanek (czerwona linia) i absorpcji wody w tkance (niebieska linia), przy założeniu 75% składu wody. Czarne gwiazdki oznaczają zgłoszone dane eksperymentalne EAL w korze nowej mózgu myszy3,21,28,29. Należy pamiętać, że EAL różni się w różnych tkankach. Skrót: EAL = efektywna długość tłumienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. szt. szt. szt.
Długość fali wzbudzenia
(nm)		Zanurzenie w wodzieMaksymalna moc lasera
(mW)		Maksymalna energia impulsu przy ognisku*
(nJ) Panie przewodniczący, panie i panowie!		Typowy EAL w korze myszy
(μm)		Głębokość obrazowania w korze myszy**
(mm)		Energia impulsu pod obiektywem***
(nJ) Panie przewodniczący, panie i panowie!		Maksymalna częstotliwość powtarzania lasera****
(MHz)
1300H2O lub D2Ofigure-results-6100figure-results-72~3000,8~14~7
Rozdział 1.2~55~cyfra arabska
1.6~210~0,5
2.1~1100~0,1
1700D2Ofigure-results-850figure-results-93~4000,8~7~7
Rozdział 1.2~20~2,5
1.6~55~1
2.1~190~0,3

Tabela 1: Typowe warunki wzbudzenia 3 P dla obrazowania kory myszy.
*Z obiektywem o wysokim współczynniku NA (~1,0), szerokością impulsu ~50 fs i typowymi fluoroforami, takimi jak białka fluorescencyjne (np. GFP i RFP).
** Przy założeniu, że EAL jest jednorodny w całej korze mózgowej.
Aby osiągnąć ~1 nJ/impuls przy ostrości, obliczony na podstawie EAL i głębokości obrazowania.
Obliczana na podstawie energii impulsu pod obiektywem i maksymalnej dopuszczalnej mocy lasera.
Skróty: 3P = trójfoton; NA = apertura numeryczna; GFP = białko zielonej fluorescencji; RFP = czerwone białko fluorescencyjne; EAL = efektywna długość tłumienia.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten wyjaśnia krok po kroku procedury konfiguracji obrazowania 3P za pomocą komercyjnego mikroskopu i źródła laserowego. W porównaniu z godziną 2PM, godzina 3PM ma przewagę w zastosowaniach wymagających dostępu optycznego w głębszych regionach, takich jak hipokamp mózgu myszy. Chociaż 3PM jest najczęściej stosowany w neurobiologii, 3PM może być potencjalnie stosowany w innych tkankach, takich jak węzły chłonne, kości i nowotwory do obserwacji tkanek głębokich.

Ważne jest, aby sprawdzić, czy system obrazowania działa blisko limitu szumów strzału, co zapewnia, że elektronika detekcji i akwizycji danych przyczynia się do znikomego szumu na obrazie po PMT. Niepewność co do liczby wykrytych fotonów jest zasadniczo ograniczona przez szum wystrzeliwanych fotonów. Wydajność ograniczoną pod względem szumu strzału można osiągnąć w typowym mikroskopie wielofotonowym przy użyciu fotodetektora o wysokim wzmocnieniu (np. PMT). Szum wystrzeliwany fotonami jest zgodny z rozkładem statystycznym Poissona, w którym odchylenie standardowe rozkładu jest równe pierwiastkowi kwadratowemu ze średniej rozkładu. Aby sprawdzić ograniczoną wydajność dźwięku strzału, wykonaj krok 1.14 w sekcji protokołu.

Aby uniknąć tłumienia światła przezH2O, pomocne jest użycie D2O do zanurzenia, szczególnie dla wzbudzenia ~1,700 nm. W przypadku stosowania D2O konieczne jest odświeżanie D2O co ~ 10 minut lub użycie dużej objętości D2O, aby uniknąć wymiany D2O/H2O podczas obrazowania. Można również uszczelnić D2O od otoczenia pomieszczenia3. Jeśli do obrazowania używana jest soczewka obiektywowa o dużej odległości roboczej (WD) (np. WD przy 4 mm lub większej), grubość cieczy zanurzeniowej może przekraczać 2-3 mm. Zwiększona grubość sprawia, że absorpcjaH2Ojest niebagatelna nawet przy ~1,300 nm21. Dlatego D2O może być konieczne nawet dla 1 300 nm 3PM przy użyciu długiej soczewki obiektywowej WD.

Ponieważ intensywność fluorescencji 3P zależy od sześcianu energii impulsu wzbudzenia w ognisku (równanie (1)), ustawienie odpowiedniej mocy lasera jest szczególnie ważne dla uzyskania odpowiednich sygnałów fluorescencji 3P przy jednoczesnym uniknięciu uszkodzeń termicznych i nieliniowych w żywych tkankach. Średnia moc lasera powinna być utrzymywana poniżej progu uszkodzenia termicznego. Na przykład w mózgu myszy, aby uniknąć termicznego uszkodzenia tkanki, średnia moc na powierzchni mózgu myszy powinna być utrzymywana na poziomie ~100 mW lub poniżej dla wzbudzenia ~1,300 nm na głębokości 1 mm i przy polu widzenia (FOV) 230 μm x 230 μm21. Podobnie, średnia moc przy ~1,700 nm powinna być utrzymywana na poziomie ~50 mW lub poniżej na głębokości ~1 mm i polu widzenia ~230 μm x 230 μm (dane niepublikowane). Ponadto, aby uniknąć nasycenia wzbudzeniem i potencjalnego nieliniowego uszkodzenia, energia impulsu wzbudzenia powinna być utrzymywana na poziomie figure-discussion-12 nJ i figure-discussion-23 nJ dla ~1,300 nm i ~1,700 nm wzbudzenia, odpowiednio30.

Ze względu na absorpcję i rozpraszanie światła w tkankach, energia impulsu w ognisku jest tłumiona do 1/e (~37%) po penetracji tkanek przez 1 EAL. EAL różni się w różnych tkankach i przy długościach fal wzbudzenia, np. w korze nowej mózgu myszy, EAL wynosi ~300 μm i ~400 μm przy ~1,300 nm i ~1,700 nm, odpowiednio 3,29 (ryc. 5). Dlatego, aby utrzymać tę samą energię impulsu w ognisku (np. 1 nJ/impuls) na głębokości n EAL, energię impulsu powierzchniowego należy pomnożyć przez 1 nJ × en. Do szybkiego obrazowania dynamiki strukturalnej i funkcjonalnej pożądany jest laser wzbudzający o wysokiej częstotliwości powtarzania (1 MHz lub wyższej), aby osiągnąć wysoką liczbę klatek na sekundę 5,6,7,10. Jednak zapotrzebowanie na energię impulsu i średnia granica mocy lasera ograniczają odpowiednią częstotliwość powtarzania.

Na przykład, gdy obrazujemy umiarkowanie głęboki obszar przy 4 EAL (tj. ~1,2 mm w korze myszy z wzbudzeniem 1,300 nm), ~55 nJ/impuls na powierzchni jest wymagany, aby utrzymać 1 nJ/impuls w ostrości. Gdy średnie ograniczenie mocy wynosi 100 mW, możemy zastosować częstotliwość powtarzania lasera ~2 MHz. Jednak, aby obrazować głębiej na głębokości 7 EAL, wymagane jest ~1,100 nJ/impuls na powierzchni, aby utrzymać 1 nJ/impuls w ostrości. Zakładając, że maksymalna średnia moc wynosi 100 mW, aby uniknąć uszkodzeń termicznych, częstotliwość powtarzania lasera powinna zostać zmniejszona do 0,1 MHz, aby osiągnąć 1,100 nJ/impuls na powierzchni. Tabela 1 podsumowuje typowe warunki obrazowania w korze mózgowej myszy. Należy zauważyć, że głębokości obrazowania w Tabeli 1 zakładają, że EAL jest jednorodny w całej korze myszy.

Co więcej, ze względu na ograniczenie mocy lasera w głębokich tkankach 3PM, istnieje kompromis między liczbą klatek na sekundę a rozmiarem piksela obrazu, co jest szczególnie ważne w przypadku obrazowania funkcjonalnego, takiego jak obrazowanie wapniowe. Maksymalna dostępna częstotliwość powtarzania lasera jest ustalana na każdej głębokości w oparciu o wymaganą energię impulsu w ognisku i mającą zastosowanie średnią moc lasera, jak omówiono powyżej, np. 2 MHz na głębokości odpowiadającej ~4 EAL ze wzbudzeniem 1,300 nm. Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie wymaga co najmniej jednego impulsu na piksel. W związku z tym minimalny dostępny czas przebywania piksela jest określany przez częstotliwość powtarzania lasera, np. 0,5 μs/piksel ze wzbudzeniem 2 MHz.

Aby zachować wysoką rozdzielczość przestrzenną (~1 μm w linii bocznej) na obrazach 3P, idealnie jest ustawić 1 piksel na obszar ~1 μm2, np. 256 x 256 pikseli dla pola widzenia 250 x 250 μm2. W związku z tym, aby wykonać szybkie obrazowanie ze znacznie dużym polem widzenia (np. 250 x 250μm2 z 256 x 256 pikselami), częstotliwości powtarzania impulsów 0,5 MHz, 1 MHz i 2 MHz dają teoretyczną maksymalną liczbę klatek na sekundę wynoszącą odpowiednio ~7,6, ~15 i ~30 klatek/s. Podobnie, optymalizacja częstotliwości powtarzania lasera jest niezbędna, w zależności od głębokości celu, prędkości skanowania i pola widzenia, aby zastosować odpowiednią energię impulsu poniżej progu uszkodzenia termicznego. Aby zwiększyć szybkość obrazowania, można użyć adaptacyjnego źródła wzbudzenia, aby skoncentrować wszystkie impulsy wzbudzenia na neuronach (tj. obszarach zainteresowania) poprzez dostarczanie impulsów laserowych na żądanie do neuronów31.

3PM jest korzystny w porównaniu z 2PM w głębokim obrazowaniu w żywych tkankach i przez silnie rozpraszające media, takie jak czaszka, kości i warstwa istoty białej (tj. Zewnętrzna torebka) mózgu myszy. Dłuższy EAL i nieliniowe wzbudzenie 3PE wyższego rzędu korzystnie wpływa na obrazowanie tkanek głębokich. Na przykład, aby zobrazować GCaMP6 w korze myszy, sygnał fluorescencyjny 2P o wzbudzeniu 920 nm jest wyższy niż sygnał fluorescencyjny 3P o wzbudzeniu 1300 nm w płytkich obszarach przy figure-discussion-3690 μm (tj. ~2,3 EAL przy 1300 nm)21. Jednak ze względu na dłuższy EAL przy 1,300 nm w porównaniu do 920 nm, 3PE daje silniejszą fluorescencję niż wzbudzenie 2P (2PE) na głębokości ~690 μm i głębszej21. Głębokość tę definiuje się jako "głębokość skrzyżowania sygnału", przy której siły sygnału fluorescencji 2PE i 3PE są identyczne z tą samą częstotliwością powtarzania i tymi samymi maksymalnymi dopuszczalnymi średnimi mocami21. Głębokość skrzyżowania sygnału zależy od długości fal wzbudzenia dla 2PE i 3PE oraz fluoroforu.

W praktyce wzbudzenie 920 nm pozwala na wyższą średnią moc lasera niż wzbudzenie 1 300 nm ze względu na mniejszą absorpcję wody. Jednak wyższa średnia moc 2PE zwiększyłaby głębokość zwrotnicy sygnału tylko o 0,9 EAL4. Ponadto, gdy próbka jest gęsto oznakowana, 3PE ma dodatkową zaletę w postaci znacznie wyższego SBR. Dlatego nawet przed osiągnięciem długości zwrotnicy sygnału, 3PM może być lepszy do obrazowania niż 2PM. Na przykład podczas obrazowania układu naczyniowego mózgu myszy, który ma ułamek objętościowy (tj. gęstość znakowania) ~ 2%, 1,300 nm 3PM z mocą wzbudzenia 100 mW przewyższa 920 nm 2PM z mocą wzbudzenia 200 mW na głębokości ~ 700 μm dla fluoresceiny.

3PM ma również przewagę podczas obrazowania przez cienką, ale silnie rozpraszającą warstwę, która może zniekształcać funkcję rozproszenia punktowego wiązki wzbudzenia i generować rozmyte tło4. Na przykład, przez nienaruszoną czaszkę mózgu myszy, obrazy 2PM cierpią z powodu rozmytego tła nawet na płytkiej głębokości <100 μm od powierzchni mózgu13. Podobne rozogniskowane tło zaobserwowano w godzinie 2PM z wzbudzeniem 1280 nm przez istotę białą w mózgu myszy32. Dlatego, gdy tkanki są obrazowane przez mętne warstwy, 3PM jest preferowane niż 2PM w przypadku obrazowania o wysokim kontraście, niezależnie od gęstości znakowania.

Niedawno informowaliśmy o fantomie koralików i analizie teoretycznej pokazującej, że limit głębokości obrazowania 3PM wynosi ponad 8 EAL33; 8 EAL odpowiada ~3 mm ze wzbudzeniem ~1,700 nm w korze myszy. Jednak obecnie dostępny laser nie ma wystarczającej energii impulsu, aby osiągnąć 8 EAL w mózgu myszy. Dalszy rozwój silniejszych laserów przesunie obecny limit głębokości obrazowania wynoszący 3PM.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub i NIH 1U01NS103516.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5% powidon-jodAmazonNDC 67818-155-32Aceptyczne czyszczenie obszarów chirurgicznych
70% EtanolThermo Fisher ScientificCAS 64-17-5Aceptyczne czyszczenie obszarów chirurgicznych
AgarozaSigmaA4718-256Przygotowanie komory danio pręgowanego
AtropineCornell Veterinary Care
Bergamo IIThorlabsMikroskop do obrazowania wielofotonowego
BupiwakainaCornell Veterinary Care
DeksametazonCornell Veterinary Care
Szkło w kształcie pączka (ID4.5, OD6.5)Potomac PhotonicsSzkło nakrywkowe używane do maści do oczu kraniotomii
(lub miejscowej maści okulistycznej)Puralube Maść weterynaryjnaNDC 17033-211-38Stosowany jako lubrykant zapobiegający podrażnieniom lub łagodzący suchość oka podczas operacji i znieczulenia
GaAsP Amplified PMTThorlabsPMT2100detektor PMT
GlukozaCornell Veterinary Care
GlycopyrrolateCornell Veterinary Care
Heater (800 W)FinnexGrzejnik akwariowy do wody danio pręgowanego)
Isoflurane USP 250 mLPiramalNDC 66794-0013-25Do znieczulenia myszy
KetoprofenCornell Veterinary Care
KimwipesKimtechTkanka laboratoryjna do przygotowania danio pręgowanego
Strzykawka Nanofil (10 mikrometrów) z igłą 36 GWPINANOFIL + NF36BVStrzykawka i igła do wstrzykiwań bromku pankuronium
Klej optycznyNorlandNOA 68Do sklejania ze sobą okrągłego szkiełka nakrywkowego i szkła w kształcie pączka.
Bromek pankuroniumCornell Veterinary Care
Pompa perystaltycznaElemental ScienceESI MP2Pompa wodna do konfiguracji danio pręgowanego
Rurki polietylenowe (ID 0,58 mm., OD 0,965 mm.)Elemental ScienceRurka pompy MP2Rurka, która wchodzi do pyska danio pręgowanego
Okrągłe szkiełko nakrywkowe Niemieckie szkło #1,5, 5 mmMikroskopia elektronowa Nauki7229605Szkło nakrywkowe używane do kraniotomii
Spirit-NOPASpectra PhysicsPrzestrajalny optyczny wzmacniacz parametryczny
SR400Stanford Research SystemsSR400Licznik fotonów
Standardowy czujnik mocy fotodiodyThorlabsS122CDetektor mocy
Sterylizowany bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)Millipore SigmaSKU 806552-500mlUżywany podczas operacji mózgu myszy
Serweta chirurgicznaJednorazowa serweta na ręcznik Dynarex4410Do chirurgii myszy
Cienki pasek wosku bokserskiegoCorning Rubber Co., Inc.Rurki przytrzymujące na miejscu w komorze danio pręgowanego
ThorImageThorlabsOprogramowanie do akwizycji obrazu
Trikaina (sól metanosulfonianu etylu)MP103106Danio pręgowany anestezjologiczne i eutanazyjne
Rurki Tygon (ID 1/16 cala, OD 1/8 cala)TygonRurka do przepływu wody do przygotowania danio pręgowanego
VaporGuardVetEquip931401Do recyklingu kleju tkankowego izofluranu
Vetbond3M1469SBDo przyklejenia szklanego okienka na czaszce myszy oraz do przyklejenia tkanki laboratoryjnej podczas przygotowywania ryby.
XLPLN25XWMP2OlympusDedykowany cel wzbudzenia wielofotonowego

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  3. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).
  4. Wang, T., Xu, C. Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain. Optica. 7 (8), 947-960 (2020).
  5. Ouzounov, D. G., et al. In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain. Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).
  6. Weisenburger, S., et al. Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy. Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).
  7. Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy. Nature Communications. 10, 177(2019).
  8. Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 7 (1), (2020).
  9. Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light, Science & Applications. 7, 12(2018).
  10. Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain. Science Advances. 7 (12), 3531(2021).
  11. Liu, H., et al. In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots. Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).
  12. Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
  13. Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
  14. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , Springer. Boston, MA. 471-540 (2002).
  15. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680(2008).
  16. Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł, Radwanska, K., Czajkowski, R. Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528(2016).
  17. Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642(2017).
  18. Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).
  19. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  20. Horton, N. G., Xu, C. Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm. Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).
  21. Wang, T., et al. Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain. eLife. 9, 53205(2020).
  22. Cheng, L. -C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -J., Xu, C. Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).
  23. Huang, K. -H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
  24. Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish. Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).
  25. Li, J., et al. Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).
  26. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  27. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  28. Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  29. Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain. Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).
  30. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
  31. Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy. Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).
  32. Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014(2011).
  33. Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Three Photon MicroscopyDeep Tissue ImagingIn Vivo ImagingMouse Brain ImagingZebrafish Brain ImagingMultiphoton MicroscopyHigh Resolution ImagingNeuronal Activity ImagingCalcium ImagingBrain Function Analysis

Related Articles