Badanie projektowe i wdrożeniowe w celu opracowania i walidacji pacjenta w papierowej diagnostyce przełącznika Toehold

Summary

Dostęp do zdecentralizowanej, taniej i wydajnej diagnostyki, która może być wdrożona w społeczności do zdecentralizowanych testów, jest kluczowy dla walki z globalnymi kryzysami zdrowotnymi. W tym manuskrypcie opisano, jak zbudować papierową diagnostykę sekwencji wirusowego RNA, które można wykryć za pomocą przenośnego czytnika optycznego.

Abstract

Dostęp do niskoobciążającej diagnostyki molekularnej, która może być wykorzystana w społeczności do testowania, jest coraz ważniejszy i ma znaczące, szersze implikacje dla dobrobytu społeczeństw i stabilności ekonomicznej. W ostatnich latach pojawiło się kilka nowych izotermicznych metod diagnostycznych, które zaspokajają zapotrzebowanie na szybką i tanią diagnostykę molekularną. Przyczyniliśmy się do tego wysiłku poprzez opracowanie i walidację przez pacjentów diagnostyki opartej na przełączniku toehold, w tym diagnostyki wirusów Zika i chikungunya przenoszonych przez komary, które zapewniły wydajność porównywalną ze złotym standardem testów opartych na ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Te diagnostyki są niedrogie w opracowywaniu i produkcji, a także mają potencjał, aby zapewnić możliwości diagnostyczne w środowiskach o niskich zasobach. W tym przypadku protokół zapewnia wszystkie kroki niezbędne do opracowania testu opartego na przełącznikach do wykrywania wirusa Zika. Artykuł przeprowadza czytelnika przez etapowy proces rozwoju diagnostyki. Po pierwsze, sekwencje genomowe wirusa Zika służą jako dane wejściowe do projektowania obliczeniowego potencjalnych przełączników przy użyciu oprogramowania typu open source. Następnie przedstawiono montaż czujników do badań empirycznych z syntetycznymi sekwencjami RNA oraz optymalizację czułości diagnostycznej. Po zakończeniu walidacji przeprowadza się na próbkach od pacjentów równolegle z RT-qPCR i specjalnie zaprojektowanym czytnikiem optycznym PLUM. Prace te stanowią techniczną mapę drogową dla naukowców w zakresie opracowania tanich czujników opartych na przełącznikach do zastosowań w zdrowiu ludzkim, rolnictwie i monitorowaniu środowiska.

Introduction

RT-qPCR pozostał złotym standardem technologii w diagnostyce klinicznej ze względu na swoją doskonałą czułość i specyficzność. Chociaż metoda ta jest bardzo wytrzymała, opiera się na drogim, specjalistycznym sprzęcie i odczynnikach, które wymagają dystrybucji i przechowywania w kontrolowanej temperaturze. Stwarza to poważne bariery w dostępie do wysokiej jakości diagnostyki na całym świecie, szczególnie w czasach epidemii chorób i w regionach, w których dostęp do dobrze wyposażonych laboratoriów jest ograniczony^1,2. Zaobserwowano to podczas wybuchu epidemii wirusa Zika w Brazylii na przełomie 2015 i 2016 roku. Ze względu na to, że dostępnych jest tylko pięć scentralizowanych laboratoriów, które mogą wykonywać testy RT-qPCR, powstały znaczne wąskie gardła, które ograniczyły dostęp do diagnostyki. Było to szczególnie trudne dla osób mieszkających w środowiskach podmiejskich, które zostały bardziej dotknięte epidemią^3,4. Dążąc do poprawy dostępu do diagnostyki, protokół pokazuje platformę, która została opracowana z potencjałem do zapewnienia zdecentralizowanej, taniej i wydajnej diagnostyki w warunkach o niskich zasobach. W ramach tego procesu stworzono proces odkrywania diagnostyki, łącząc czujniki oparte na amplifikacji izotermicznej i syntetycznym RNA z papierowymi systemami ekspresji bezkomórkowej^5,6.

Systemy bezkomórkowej syntezy białek (CFPS), w szczególności systemy bezkomórkowe oparte na E. coli, są atrakcyjną platformą dla szerokiego zakresu zastosowań biosensorycznych, od monitorowania środowiska7^,8 do diagnostyki patogenów^{5,6,9,10,11,12}. Systemy CFPS, składające się z komponentów niezbędnych do transkrypcji i translacji, mają znaczną przewagę nad biosensorami działającymi w całych komórkach. W szczególności czujniki nie są ograniczone ścianą komórkową i ogólnie rzecz biorąc, mają konstrukcję modułową, są bezpieczne biologicznie, niedrogie i mogą być liofilizowane do użytku przenośnego. Zdolność do liofilizacji reakcji opartych na obwodach genowych na podłożach takich jak papier lub tekstylia, umożliwia transport, długotrwałe przechowywanie w temperaturze pokojowej⁵, a nawet włączenie do technologii ubieralnej¹³.

Poprzednie prace wykazały, że systemy bezkomórkowe E. coli mogą być używane do wykrywania wielu analitów, na przykład metali toksycznych, takich jak rtęć, antybiotyków takich jak tetracyklina7^,14, substancje chemiczne zaburzające gospodarkę hormonalną^15,16, biomarkery takie jak kwas hipurowy¹⁷, cząsteczki quorum sensing związane z patogenami^9,18 oraz nielegalne substancje, takie jak kokaina¹⁷, oraz hydroksymaślan gamma (GHB)¹⁹. W przypadku wykrywania kwasów nukleinowych w zależności od sekwencji, strategie opierały się w dużej mierze na wykorzystaniu bioczujników opartych na przełącznikach w połączeniu z technikami amplifikacji izotermicznej. Przełączniki Toehold to syntetyczne ryboregulatory (określane również jako po prostu "przełączniki" w dalszej części tekstu), które zawierają strukturę spinki do włosów, która blokuje dalszą translację poprzez sekwestrację miejsca wiązania rybosomalnego (RBS) i kodonu start. Po interakcji z docelowym RNA wyzwalającym, struktura spinki do włosów zostaje odciążona i włączona jest późniejsza translacja reporterowej otwartej ramki odczytu²⁰.

Amplifikacja izotermiczna może być również używana jako diagnostyka molekularna²¹; jednakże metody te są podatne na amplifikację niespecyficzną, co może zmniejszyć specyficzność, a tym samym dokładność testu poniżej RT-qPCR ²². W opisanych tutaj pracach wykorzystano wzmocnienie izotermiczne przed czujnikami opartymi na przełącznikach, aby zapewnić połączone wzmocnienie sygnału, które umożliwia klinicznie istotne wykrywanie kwasów nukleinowych (od femtomolowych do attomolowych). To połączenie tych dwóch metod zapewnia również dwa punkty kontrolne specyficzne dla sekwencji, które w połączeniu zapewniają wysoki poziom swoistości. Stosując to podejście, wcześniejsze prace wykazały wykrywanie wirusów, takich jak Zika⁶, Ebola⁵, Norovirus^10, a także bakterii chorobotwórczych, takich jak C. difficile²³ i odporny na antybiotyki Typhoid¹². Ostatnio zademonstrowano bezkomórkowe przełączniki palcowe do wykrywania SARS-CoV-2 w celu zapewnienia dostępnej diagnostyki pandemii COVID-19^11,12,13.

Poniższy protokół opisuje rozwój i walidację bezkomórkowego, papierowego syntetycznego testu przełącznika do wykrywania wirusa Zika, od projektu biosensora in silico, poprzez etapy montażu i optymalizacji, aż do walidacji w terenie z próbkami od pacjentów. Protokół rozpoczyna się od zaprojektowania in silico czujników opartych na przełącznikach RNA i izotermicznych starterów wzmacniających specyficznych dla RNA wirusa Zika. Chociaż istnieje wiele metod amplifikacji izotermicznej, w tym przypadku wykazano zastosowanie amplifikacji opartej na sekwencji kwasów nukleinowych (NASBA) w celu zwiększenia stężenia docelowego wirusowego RNA obecnego w reakcji, co umożliwiło klinicznie istotną czułość. W praktyce metody amplifikacji izotermicznej mają tę zaletę, że działają w stałej temperaturze, eliminując potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu, takiego jak termocyklery, które są na ogół ograniczone do scentralizowanych lokalizacji.

Następnie, opisany jest proces montażu syntetycznych czujników przełącznika toehold z sekwencjami kodowania reportera poprzez nakładanie się PCR i ekranowania syntetycznych czujników przełącznika toehold pod kątem optymalnej wydajności w systemach bezkomórkowych wykorzystujących syntetyczne RNA. Do tego zestawu czujników wirusa Zika wybraliśmy gen lacZ kodujący enzym β-galaktozydazę, który jest w stanie rozszczepić substrat kolorymetryczny, chlorofenol czerwony-β-D-galaktopiranozyd (CPRG), w celu wytworzenia zmiany koloru z żółtego na fioletowy, którą można wykryć za pomocą oka lub czytnika płytek. Po zidentyfikowaniu przełączników syntetycznych o najwyższej wydajności opisano proces przesiewowych starterów pod kątem izotermicznej amplifikacji odpowiedniej sekwencji docelowej opartej na sekwencji kwasów nukleinowych przy użyciu syntetycznego RNA w celu znalezienia zestawów zapewniających najlepszą czułość.

Na koniec, wydajność platformy diagnostycznej jest sprawdzana na miejscu w Ameryce Łacińskiej (Rysunek 1). Aby określić kliniczną dokładność diagnostyczną, przeprowadza się papierowy test bezkomórkowy przy użyciu próbek wirusa Zika od pacjentów; równolegle przeprowadzany jest złoty standard testu RT-qPCR w celu porównania. Aby monitorować kolorymetryczne testy bezkomórkowe, umożliwiamy ilościową ocenę wyników na miejscu w regionach, w których termocyklery nie są dostępne. Ręcznie montowany czytnik płytek o nazwie Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; zwany dalej przenośnym czytnikiem płytek) jest również wprowadzony tutaj²⁴. Początkowo opracowany jako urządzenie towarzyszące do bezkomórkowej diagnostyki syntetycznych przełączników palcowych, przenośny czytnik płytek oferuje przystępny sposób inkubacji i odczytu wyników w sposób wysokoprzepustowy, zapewniając użytkownikom zintegrowaną, opartą na widzeniu komputerowym analizę oprogramowania.

Rysunek 1: Przepływ pracy do testowania próbek pacjentów przy użyciu papierowych reakcji przełączania palców bez komórek.Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem ludzi muszą być przeprowadzane zgodnie ze standardami etycznymi i odpowiednimi wytycznymi, w tym zasadami etycznymi dla badań medycznych z udziałem ludzi, ustalonymi przez Deklarację Światowego Stowarzyszenia Medycznego z Helsinek. To badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyczną ds. badań na ludziach na podstawie protokołu licencyjnego o numerze CAAE: 80247417.4.0000.5190. Świadoma zgoda wszystkich pacjentów włączonych do tego badania została uchylona przez Fiocruz-PE Institutional Review Board (IRB) w odniesieniu do próbek diagnostycznych.

UWAGA: Urządzenie PLUM będzie odtąd nazywane 'przenośnym czytnikiem płytek'.

1. Obliczeniowy projekt starterów amplifikacyjnych opartych na sekwencji kwasów nukleinowych

1. Zeskanuj genom wirusa Zika, aby zidentyfikować zestaw regionów kandydujących do amplifikacji o długości około 200 nukleotydów (nt) do 300 nt, umieszczając sekwencję genomu w NCBI/Nucleotide BLAST^25,26. Porównaj genom z referencyjnymi sekwencjami RNA (refseq_rna) i poszukaj miejsc, które pozostają wysoce konserwatywne i nie mają homologii z ludzkim genomem (inne parametry BLAST pozostają niezmienione). Wybierz co najmniej dwie lokalizacje, aby zaprojektować syntetyczny przełącznik zaczepu na palcach.
2. Użyj kryteriów wyboru Deiman et al.²⁷, aby wygenerować pary starterów amplifikacji opartych na sekwencji kwasów nukleinowych do przodu i do tyłu dla każdego kandydującego regionu amplifikacji. Krótko mówiąc, postępuj zgodnie z następującymi kryteriami projektowania podkładów: (1) zawartość GC między 40%-60%; (2) o długości od 20 do 24 nt i temperaturze topnienia DNA powyżej 41 °C; (3) brak serii czterech lub więcej identycznych nukleotydów; (4) końcowy nukleotyd 3' jest zasadą A; (5) niska struktura drugorzędowa startera i prawdopodobieństwo tworzenia dimerów. Przesiać 8-10 par starterów dla każdego regionu docelowego (zalecane).
3. Dołącz sekwencję prefiksu zawierającą sekwencję promotora T7 AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG (podkreślona sekwencja promotora T7) do końca 5' starterów do przodu, aby umożliwić transkrypcję amplikonów przy użyciu polimerazy RNA T7 (RNAP). Zamów startery jako oligonukleotydy DNA w firmie zajmującej się syntezą DNA.

2. Obliczeniowy projekt przełączników toehold

1. Zainstaluj NUPACK²⁸ wersja 3.2 (pakiet do projektowania kwasów nukleinowych) w oparciu o instrukcje na stronie internetowej²⁹. Użyj systemu operacyjnego UNIX i MATLAB (platforma obliczeń numerycznych) jako języka programowania (zalecane).
2. Zidentyfikuj sekwencje docelowe (np. genom wirusa) specyficzne dla patogenu będącego przedmiotem zainteresowania dla konstrukcji przełącznika palcowego, jak w kroku 1.1. Wybierz docelowe sekwencje wirusa Zika z amplikonów opartych na sekwencjach kwasów nukleinowych wygenerowanych w kroku 1.2.
   UWAGA: W praktyce najpierw można zaprojektować i przetestować startery amplifikacyjne oparte na sekwencjach kwasów nukleinowych lub syntetyczne przełączniki palcowe, w zależności od potrzeb użytkowników. Jeśli określone obszary docelowe zainteresowania zostały już ustalone (np. na podstawie istniejących publikacji lub protokołów diagnostycznych), najpierw może nastąpić zaprojektowanie przełącznika toehold i badanie przesiewowe, a następnie zaprojektowanie i badanie przesiewowe starterów amplifikacyjnych opartych na sekwencji kwasów nukleinowych. Jeśli nie ma ustalonych regionów docelowych, najpierw przeprowadź badanie przesiewowe starterów amplifikacji opartych na sekwencji kwasów nukleinowych w stosunku do pełnego genomu, aby zawęzić wybrane cele podczas selekcji pod kątem wydajności amplifikacji starterów. Jeśli dostępnych jest wiele sekwencji patogenu, najlepiej jest zaprojektować startery amplifikacji oparte na sekwencjach kwasów nukleinowych, które koncentrują się na wysoce konserwatywnych regionach (zamiast przesiewać cały genom).
3. Pobierz i zainstaluj wymagane oprogramowanie MATLAB na komputerze.
4. Skonfiguruj zmienne środowiskowe, aby umożliwić wywoływanie funkcji zestawu projektowania kwasów nukleinowych w oprogramowaniu. Aby to zrobić, otwórz oprogramowanie, a następnie otwórz (lub utwórz) plik startup.m w domyślnym folderze roboczym. Następnie skopiuj następujące wiersze kodu do pliku startup.m, a na koniec dodaj folder zawierający pliki binarne pakietu projektowania kwasów nukleinowych do PATH:
   NUPACKINSTALL = '/Użytkownicy/[user_name]/.../nupack3.2.2';
   setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
   setenv('ŚCIEŻKA',[getenv('ŚCIEŻKA'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]);
5. Otwórz oprogramowanie platformy obliczeń numerycznych i przejdź do folderu oprogramowania do projektowania. Uruchom algorytmy projektowania dostępne pod adresem https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN.
6. Wprowadź sekwencje docelowe do design_input_file.csv znajdującej się w podfolderze wejściowym. Dane wejściowe obejmują nazwę, sekwencję zewnętrzną, sekwencję wewnętrzną, temperaturę, nazwę wyjścia i sekwencję wyjściową, zgodnie z definicją w tabeli 1. Jeśli nie określono jeszcze miejsc zalewania dla celu, należy zachować te same sekwencje wewnętrzne i zewnętrzne. Tylko pierwsze 29 nt reportera będzie brane pod uwagę w procesie projektowania. Po zakończeniu zapisz i zamknij zaktualizowany arkusz kalkulacyjny.
   UWAGA: Sekwencja wyjściowa to sekwencja białka reporterowego, które ma być użyte w teście (np. lacZ). Określenie sekwencji wewnętrznej i zewnętrznej gwarantuje, że algorytm nie wygeneruje syntetycznych przełączników toehold, które nakładają się na którykolwiek ze starterów. Zapewnia również, że test rozpoznaje trzy unikalne miejsca w genomie wirusa Zika, aby poprawić jego specyficzność.
7. Wybierz parametry, które mają być używane dla funkcji obliczeniowej: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, opcje). Wypełnij wartości parametrów w następujący sposób:
   1. num_designs - liczba najlepszych projektów dla każdego docelowego wyjścia przez oprogramowanie. Wartość domyślna to 6 i można ją zmienić w razie potrzeby (zalecane jest co najmniej sześć wzorów dla każdego celu).
   2. input_file — ten parametr określa nazwę pliku, który dostarcza informacje o sekwencji wejściowej. Wartość domyślna to "design_input_file.csv" i można ją zmienić w razie potrzeby.
   3. Wybierz jedną z następujących opcji - (1) Seria A i Seria B: wersja przełącznika toehold, którą zostanie wygenerowany przez kod. Ustaw SeriesB na 1 i SeriesA na 0, aby wygenerować przełącznik toehold serii B, który jest formatem używanym w diagnostic⁶; (2) Równolegle: ustawione na 1, aby wykorzystać wiele rdzeni do obliczeń projektów; w przeciwnym razie ustaw wartość 0; (3) Antysens: ustawiony na 1, aby wygenerować przełączniki zbieżne, które hybrydyzują sekwencję antysensowną (tj. odwrotne dopełnienie) docelowego wejścia; w przeciwnym razie ustaw wartość 0.
8. Uruchom funkcję projektowania przy użyciu wybranych parametrów: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). Algorytm zacznie następnie generować projekty przełączników toehold dla interesujących Cię celów.
9. Po zakończeniu projektowania zlokalizuj sekwencje projektowe przełącznika górnego uchwytu palcowego i odpowiadające im sekwencje docelowe w folderze final_designs w postaci arkuszy kalkulacyjnych w formacie .csv. Sekwencje DNA przełącznika palca wygenerowane przez algorytm będą zawierać sekwencję promotora T7 na końcu 5' i konserwatywną sekwencję łącznika 21 nt AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG na końcu 3'.
10. Przesiewaj powstałe sekwencje konstrukcyjne przełącznika górnego palca pod kątem innych powszechnych wirusów, umieszczając je w NCBI-BLAST i sprawdzając homologię sekwencji. Akceptuj sekwencje z homologią 40% lub mniejszą.
11. Uporządkuj sekwencje spinki do włosów przełącznika palców jako oligonukleotydy DNA, a następnie złóż je z genem reporterowym w pełni funkcjonalne przełączniki. Zamów niezbędne startery PCR do późniejszego montażu czujnika w zależności od wybranego białka reporterowego.

parametr	definicja
nazwa	Pożądane nazwy sekwencji przełączników wyjściowych typu toehold.
Sekwencja zewnętrzna	Pełna transkrypcja NASBA uzyskana z amplifikacji.
Sekwencja wewnętrzna	Sekwencja zewnętrzna z wyłączeniem miejsc wiązania startera. Jest on zgodny z sekwencją zewnętrzną, ale wyklucza części transkryptów, które wiążą się ze starterami do przodu i do tyłu.
temperatura	Temperatura używana przez algorytmy do obliczania struktur RNA.
Nazwa wyjściowa	Nazwa genu wyjściowego (np. lacZ, gfp).
Sekwencja wyjściowa	Sekwencja genu wyjściowego.

Tabela 1: Definicja każdego parametru używanego w oprogramowaniu do projektowania przełączników typu toehold.

3. Budowa przełączników typu toehold metodą PCR

UWAGA: Te kroki opisują budowę przełączników LacZ za pomocą nakładania się PCR. Tutaj oligo DNA jest używany jako starter do przodu, a terminator T7 jest używany jako starter odwrotny. Używamy plazmidu pCOLADuet-LacZ jako matrycy dla genu lacZ (addgene: 75006). Wszelkie inne matryce DNA, które zawierają odpowiednią sekwencję, mogą być użyte jako matryce, pod warunkiem, że terminator T7 jest zawarty w ostatecznym konstrukcie.

1. Po otrzymaniu syntetycznych oligonukleotydów DNA od dostawcy komercyjnego należy przygotować roztwory syntetycznego DNA i startera do odwrotnej amplifikacji w stężeniu 10 μM w wodzie wolnej od nukleaz. Zebrać reakcje w probówkach PCR na lodzie zgodnie z tabelą 2.
   UWAGA: Woluminy PCR można skalować w zależności od potrzeb. Użyj minimalnej ilości (0,1-1 ng) matrycy DNA pCOLADuet-LacZ, aby uniknąć konieczności dodatkowego etapu usuwania plazmidu lub sygnału LacZ w tle. W przypadku większych ilości matryc DNA należy postępować zgodnie z PCR z trawieniem enzymu restrykcyjnego DpnI, aby usunąć pozostałą matrycę plazmidu.
2. Umieść reakcje w termocyklerze, postępując zgodnie z warunkami cyklicznymi wymienionymi w tabeli 3. Przeanalizuj produkty PCR na żelu agarozowym (Rysunek 2; patrz Protokół Uzupełniający i³⁰).
3. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR opartego na kolumnie wirowej i eluuj DNA w 15-30 μl wody wolnej od nukleaz, zgodnie z instrukcjami producenta. Określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru.

składnik	głośność	koncentracja
5X bufor reakcyjny Q5	10 μL	1x
10 mM dNTP	1 μL	200 μM
10 mM Forward Primer (syntetyczny przełącznik DNA FW)	2,5 μl	0,5 μM
10 mM Reverse Primer (terminator T7 RV)	2,5 μl	0,5 μM
Matrycowy DNA (pCOLADuet-LacZ)	zmienna	<1 ng
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności	0,5 μL	0,02 U/μL
Woda wolna od nukleaz	do 50 μL	-

Tabela 2: Komponenty PCR używane do budowy przełączników typu toehold.

Krok		temperatura	Godzina
Początkowa denaturacja		98 °C	30 sekund
35 cykli	denaturacja	98 °C	10 sekund
	Wyżarzanie	60 °C	20 sekund
	rozszerzenie	72 °C	Czas trwania: 1,45 min
Końcowe rozszerzenie		72 °C	Czas trwania: 5 min
Przytrzymaj		4 °C	-

Tabela 3: Warunki cykliczne stosowane podczas budowy przełączników typu toehold metodą PCR.

4. Przygotowanie celu syntetycznego RNA (Trigger)

1. Korzystając z oprogramowania do projektowania biologii molekularnej, zmodyfikuj matryce syntetycznego wyzwalającego RNA (wybrane w kroku 1.1), aby zawierały sekwencję promotora T7 przed etapem, upewniając się, że pełna matryca pozostaje krótka (<200 pz). Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu, aby wzmocnić starter sekwencji wyzwalającej (dla sekwencji oligo, patrz Protokół dodatkowy).
2. Uporządkuj sekwencje jako oligonukleotydy DNA. Po otrzymaniu rozpuść syntetyczne DNA wyzwalające i startery amplifikacyjne do 10 μM w wodzie wolnej od nukleaz. Zebrać odpowiednie PCR w cienkościennych probówkach na lodzie zgodnie z tabelą 2 i użyć 0,5 μl ultrameru wyzwalającego DNA (końcowe stężenie 0,1 μM) jako matrycowego DNA.
3. Umieść reakcje w termocyklerze i użyj warunków cyklicznych wymienionych w tabeli 3. Użyj czasu przedłużenia 15 s. Oceń jakość i oczyść produkty PCR wyzwalające zgodnie z opisem w kroku 3.3 i protokole dodatkowym.
   UWAGA: Aby przyspieszyć ten proces, produkty PCR z oczyszczonymi kolumnami mogą być również bezpośrednio używane do wstępnego przesiewania przełącznika palca
.

5. Transkrypcja in vitro wybranych sekwencji wyzwalających

1. Składniki reakcyjne montować na lodzie zgodnie z tabelą 4.
2. Inkubować reakcje transkrypcji invitro (IVT) w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, a następnie poddać działaniu DNazy I w celu usunięcia matrycowego DNA. W przypadku etapu DNazy I dodać 70 μl wody wolnej od nukleaz, 10 μl 10x buforu DNazy I i i 2 μl DNazy I (bez RNaz) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Jeśli nie przejdziesz natychmiast do kroku 5.4, dezaktywuj DNazę I z dodatkiem 50 mM EDTA i podgrzej inaktywację w temperaturze 65 °C przez 10 minut.
3. Opcjonalny krok: Przeprowadzić analizę elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (np. mocznik-PAGE) na produktach IVT w celu oceny jakości RNA, jak opisano w protokole dodatkowym.
4. Oczyść wyzwalające produkty IVT za pomocą zestawu do czyszczenia RNA opartego na kolumnach zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie określ ilościowo stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometrii. Patrz Protokół uzupełniający, aby uzyskać instrukcje dotyczące określania molowości i liczby kopii/μL RNA.

składnik	głośność	koncentracja
10X bufor reakcyjny	1,5 μL	0,75x
Mieszanka 25 mM NTP	6 μL	7,5 mM
DNA wyzwalacza matrycy	X μL	1 μg
Mieszanina polimerazy RNA T7	1,5 μL	-
Woda wolna od nukleaz	X μL	Do 20 μL

Tabela 4: Transkrypcja in vitro (IVT) wybranych sekwencji wyzwalających.

6. Wstępna kontrola przełączników

UWAGA: Ta sekcja opisuje kroki związane z ustawianiem bezkomórkowych, papierowych reakcji na zaczepy na palce, oraz jak sprawdzić przełączniki o wysokiej wydajności. Zablokowana bibuła filtracyjna BSA użyta w kroku 6.10 powinna być przygotowana z wyprzedzeniem, jak opisano w protokole dodatkowym.

1. Przygotować roztwór podstawowy CPRG, rozpuszczając 25 mg proszku w 1 ml wody wolnej od nukleaz. Roztwór należy zawsze przechowywać na lodzie i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania.
2. Określ liczbę reakcji do skonfigurowania. Dla każdego ocenianego przełącznika podsłuchu należy uwzględnić kontrolę bez matrycy (bez przełącznika i bez docelowego RNA - inaczej znaną jako kontrola bez samej komórki), aby uwzględnić wszelkie sygnały tła, które mogą powstać z miksu głównego. Uwzględnij kontrolę tylko przełącznika, aby ocenić nieszczelność przełącznika tła lub wskaźnik wyłączania w przypadku braku docelowego RNA.
3. Sporządzić bezkomórkową mieszaninę wzorcową reakcji roztworu A, roztworu B, inhibitora RNazy i CPRG na lodzie zgodnie ze standardowym protokołem wymienionym w tabeli 5.
   UWAGA: Opisane tutaj kroki dotyczą mieszanki wzorcowej, która będzie wystarczająca do trzykrotnego zestawu 1,8 μl reakcji z dodanymi 10% objętością, aby uwzględnić błąd pipetowania. Objętość mieszanki głównej należy dostosować w razie potrzeby w zależności od liczby ekranowanych przełączników typu toehold.
4. Dla każdej potrójnej reakcji bezkomórkowej należy dozować mieszaninę wzorcową do probówki do PCR, trzymając wszystkie probówki na lodzie. W przypadku probówki odłożonej na bok jako sama kontrola bezkomórkowa, dodaj wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 5,84 μl, wymieszaj pipetując w górę iw dół i krótko odwiruj. Do pozostałej części probówek dodać oczyszczone DNA przełącznika palca u nogi PCR do końcowego stężenia 33 nM.
5. W przypadku probówek odłożonych na bok jako samodzielne elementy sterujące, dodaj wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 5,84 μl. W przypadku probówek odłożonych na bok do badania kombinacji przełącznika palcowego i docelowego RNA, dodać transkrybowany in vitro docelowy RNA do końcowego stężenia 1 μM. Następnie dodaj wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 5,84 μl. Dokładnie wymieszaj wszystkie reakcje, pipetując w górę i w dół, i krótko odwiruj.
6. Dodaj 30 μl wody wolnej od nukleaz do studzienek otaczających dołki reakcyjne na 384-dołkowej czarnej płytce z przezroczystym dnem. Minimalizuje to parowanie w trakcie eksperymentu i poprawia odtwarzalność.
   UWAGA: Jeśli korzystasz z przenośnego czytnika płytek, umieść folię PCR na płytce i użyj precyzyjnego noża, aby wyciąć dołki przeznaczone do reakcji, a także każdy z czterech dołków narożnych. Folia PCR zapobiega prześwietleniu kamery przenośnego czytnika płytek z pustych studzienek.
7. Za pomocą stemple do biopsji o średnicy 2 mm i pęsety przeciąć krążki z bibuły filtracyjnej zablokowane przez BSA i umieścić je w studzienkach reakcyjnych, wysuwając dziurkacz lub używając pęsety (patrz Protokół uzupełniający dotyczący przygotowania bibuły filtracyjnej z zatkanym BSA). Dozować trzykrotnie 1,8 μl objętości z każdej probówki reakcyjnej na krążki z bibuły filtracyjnej w płytce 384-dołkowej, utrzymując wszystkie próbki, jak również płytkę 384-dołkową, na lodzie przez cały czas.
   UWAGA: W przypadku korzystania z przenośnego czytnika płytek dodaj 1,8 μl CPRG (0,6 mg/ml) do każdego z czterech rogów płytki 384-dołkowej. Żółty kolor z CPRG zapewnia rozpoznawanie wzorca przez przenośny czytnik płytek w celu wyrównania cyfrowego szablonu płytki wielodołkowej w analizie obrazu. Przykryj dołki płytki folią PCR, aby zapobiec parowaniu.
8. Umieścić płytkę w czytniku płytek, odczytywać OD₅₇₀ w temperaturze 37 °C co minutę przez 130 minut.

.

składnik	głośność	Stężenie końcowe na reakcję
Rozwiązanie A	2,38 μl	40 proc
Rozwiązanie B	1,78 μl	30%
Inhibitor RNazy	0,03 μl	0,5% v/v
CPRG (25 mg/ml)	0,14 μl	0,6 mg/ml
Przełącznik palcowy	X μL	33 nM
Docelowy RNA	X μL	1 μM
Woda wolna od nukleaz	do 5,94 μL	-
Całkowita objętość:		5,94 μl

Tabela 5: PURExpress bezkomórkowe składniki reakcji transkrypcyjno-translacyjnej.

7. Identyfikacja wysokowydajnych przełączników zaczepowych

UWAGA: Ta sekcja opisuje, jak analizować dane z kroku 6 w celu wybrania najlepiej działających przełączników do dalszego działania.

1. Rozpocznij analizę danych, najpierw normalizując absorbancję OD₅₇₀ do tła. Aby to zrobić, odejmij pomiary OD₅₇₀ reakcji, które nie mają żadnego przełącznika ani docelowego RNA (tj. Same studzienki bezkomórkowe) od innych pomiarów OD₅₇₀.
2. Wygładź znormalizowane dane za pomocą trzypunktowej średniej ruchomej i dostosuj minimalną wartość każdego dołka do zera. Zobacz Rysunek 3 dla przykładu znormalizowanych danych o przebiegu czasu zebranych dla przełączników 27B, 33B i 47B.
3. Korzystając z tych przetworzonych danych, oblicz zmianę zagięcia (lub współczynnik ON/OFF), określając różnicę w szybkości zmiany koloru (tj. zmiany OD₅₇₀ w czasie) między przełącznikiem toehold a dołkami docelowymi i samymi przełącznikami (patrz Protokół dodatkowy do obliczania stosunku; Rysunek 4).
4. Wybierz przełączniki z najwyższą zmianą zagięcia ON/OFF w celu dalszej charakterystyki. Pomiń słabo działające przełączniki podtrzymania palców, które wyświetlają najniższą zmianę zagięcia.

8. Badania przesiewowe i czułość starterów amplifikacji opartych na sekwencji kwasów nukleinowych

UWAGA: W następujących krokach najpierw przeprowadza się badanie przesiewowe funkcjonalnych izotermicznych starterów amplifikacyjnych, a następnie ocenia się ich czułość poprzez określenie liczby docelowych kopii RNA na μL syntetycznego RNA, które dany przełącznik palcowy może niezawodnie wykryć w połączeniu z amplifikacją izotermiczną. Po amplifikacji izotermicznej przeprowadź reakcje bezkomórkowe, aby zidentyfikować udane zestawy starterów amplifikacji oparte na sekwencji kwasów nukleinowych. Jednak bardziej opłacalne może być zastosowanie żeli poliakrylamidowych lub agarozowych w reakcjach amplifikacji opartych na sekwencji kwasów nukleinowych, aby najpierw zawęzić pulę kandydujących zestawów starterów. W takim przypadku zestawy starterów amplifikacji oparte na sekwencji kwasów nukleinowych, które generują pasmo na żelu o odpowiednim rozmiarze amplikonu, mogą zostać umieszczone na krótkiej liście do późniejszych badań przesiewowych bez komórek.

1. Sporządzić roztwór podstawowy o stężeniu 25 μM ze wszystkich zestawów starterów do przodu i do tyłu w wodzie wolnej od nukleaz (patrz protokół dodatkowy). Określ liczbę reakcji amplifikacji opartych na sekwencji kwasów nukleinowych i następujących po nich reakcji bezkomórkowych, które należy skonfigurować. Będzie to zależało od liczby przełączników toehold i odpowiednich zestawów starterów.
   UWAGA: Podczas przesiewania starterów ważne jest, aby zawsze dołączać kontrolkę bez szablonu dla każdego zestawu starterów, aby uwzględnić wszelkie artefakty tła, które mogą powstać z powodu niespecyficznego wzmocnienia związanego ze starterem.
2. Ustaw jedną reakcję 5 μl w następujący sposób (skaluj to w razie potrzeby). Rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie. Zebrać główną mieszaninę reakcji buforu reakcyjnego, mieszaniny nukleotydów i inhibitora RNazy zgodnie z tabelą 6. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, aż biały osad zostanie rozpuszczony, a następnie dozować porcje do probówek PCR.
   1. Jeśli mieszanka główna jest przeznaczona do badania przesiewowego starterów amplifikacyjnych opartych na sekwencji kwasów nukleinowych, należy najpierw wykluczyć startery z mieszanki głównej (dozować 2,55 μl mieszanki głównej). W przeciwnym razie, jeśli przeprowadzana jest analiza wrażliwości podkładu, startery można dodać do mieszanki głównej (w takim przypadku należy dozować 2,75 μl podwielokrotności). Dodaj mieszaninę enzymów po etapach denaturacji i równoważenia.
3. W przypadku badań przesiewowych starterów amplifikacyjnych opartych na sekwencji kwasów nukleinowych, dodaj startery do przodu i do tyłu do odpowiednich probówek. Na termocyklerze ustaw protokół inkubacji zgodnie z opisem w tabeli 7.
4. Dodaj 1 μl wody wolnej od nukleaz lub 1 μl docelowego wyzwalającego RNA w temperaturze 2 pM lub około 10⁶ kopii/μl, upewniając się, że probówki są odpowiednio oznaczone. Wymieszać delikatnie pipetując i krótko odwirować probówki.
   UWAGA: Do badań przesiewowych zestawu starterów należy użyć stężenia docelowego RNA wyzwalającego, które jest wystarczająco wysokie, aby nie wpływać na dolną granicę wykrywalności metody amplifikacji izotermicznej, ale nie wystarczająco wysokie, aby zapewnić aktywację przełącznika toehold, jeśli nie wystąpiłaby amplifikacja.
5. Przenieś probówki do termocyklera i rozpocznij inkubację. Po 12 minutach wyjmij probówki i dodaj 1,25 μl mieszanki enzymów do każdej probówki. Mieszać pipetując w górę i w dół i krótko odwirować probówki.
   UWAGA: W tym momencie probówki można przechowywać w temperaturze pokojowej; Jednak mieszanina enzymów powinna być przechowywana na lodzie do czasu dodania do probówek.
6. Umieścić probówki z powrotem w termocyklerze, pomijając etap podtrzymania 41 °C, aby rozpocząć 1-godzinną inkubację reakcji.
   UWAGA: Po inkubacji reakcje można umieścić na lodzie w celu przetworzenia tego samego dnia lub zamrozić w temperaturze -20 °C w celu późniejszego przetworzenia.
7. Wykonaj kroki 6.2-6.7 i Tabelę 8, aby zebrać papierowe, bezkomórkowe reakcje przełącznika palcowego w celu oceny wydajności startera. Analizuj dane zgodnie z opisem w krokach 7.1-7.2 i Rysunek 3.
   UWAGA: Oprócz wcześniej wymienionych kontroli, ważne jest, aby uwzględnić również kontrolę ujemną, aby uwzględnić wszelkie sygnały tła, które mogą powstać w wyniku reakcji. Dodatkowo ważne jest, aby uwzględnić również kontrolę z przełącznikiem i 2 pM (stężenie końcowe) docelowego RNA, jako kontrolę amplifikacji bez NASBA.
8. Zidentyfikuj potencjalne pary starterów, aby przejść do przodu z analizą wrażliwości. Pary starterów są wybierane na podstawie tego, czy aktywacja przełącznika toehold następuje po dodaniu inkubowanej reakcji. W razie potrzeby powtórz przesiewanie podkładu z większą liczbą kombinacji podkładów.
9. Trzymając próbki RNA na lodzie przez cały czas, należy wykonać następujący zestaw seryjnych rozcieńczeń docelowych RNA w wodzie wolnej od nukleaz: 10⁴, 10³, 10², 10¹ i 10⁰ kopii RNA/μL. Powtórz amplifikację opartą na sekwencji kwasów nukleinowych i reakcje bezkomórkowe z wybranymi zestawami starterów (kroki 8.2-8.7), testując serię seryjnych rozcieńczeń w celu zidentyfikowania zestawów starterów, które zapewniają najlepszą czułość. Zobacz Rysunek 5 dla przykładu wyników określania czułości zestawu starterów.
   UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby wybrany przełącznik palcowy i para starterów wykrywały zaledwie 1-100 docelowych kopii RNA na μl RNA (stężenie roztworu podstawowego).
10. Powtórz eksperyment czułości amplifikacji opartej na sekwencji kwasów nukleinowych w potrójnym biologicznym trilikacie. Ten krok służy potwierdzeniu odtwarzalności wyników przed przejściem do eksperymentów na próbkach od pacjentów.
11. Opcjonalnie: Aby mieć wiarygodne źródło DNA przełącznika do długotrwałego użytku i transportu, należy sklonować wybrane sekwencje przełącznika do plazmidu przy użyciu dowolnej konwencjonalnej metody klonowania. Podobnie, docelowa sekwencja wyzwalającego RNA może być również sklonowana do wybranego plazmidu do przechowywania.

składnik	Objętość na reakcję	Stężenie końcowe
Bufor reakcyjny NASBA	1,67 μl	1x
Mieszanka nukleotydów NASBA	0,833 μl	1x
Podkład 25 μM do przodu	0,1 μl	0,5 μM
Podkład odwrotny 25 μM	0,1 μl	0,5 μM
Inhibitor RNazy (40 U/μL)	0,05 μL	0,4 U/μL
Docelowy RNA	1 μL
Mieszanka enzymów NASBA	1,25 μL	1x
Całkowita objętość	5 μL

Tabela 6: Składniki reakcji NASBA.

.

krok	temperatura	Godzina
denaturacja	65 °C	Czas trwania: 2 min
Równowagi	41 °C	Czas trwania: 10 min
trzymać	41 °C	∞
Inkubacja	41 °C	1 godz
trzymać	4 °C	-

Tabela 7: Warunki reakcji dla NASBA.

.

składnik	głośność	Stężenie końcowe na reakcję
Rozwiązanie A	2,38 μl	40 proc
Rozwiązanie B	1,78 μl	30%
Inhibitor RNazy	0,03 μl	0,5% v/v
CPRG (25 mg/ml)	0,14 μl	0,6 mg/ml
Przełącznik palcowy	X μL	33 nM
Docelowe RNA (jeśli dotyczy)	X μL	1 μM
NASBA (jeśli dotyczy)	0,85 μl	1:7
Woda wolna od nukleaz	do 5,94 μL	-
Całkowita objętość:		5,94 μl

Tabela 8: Papierowe składniki reakcji bezkomórkowej.

9. Pobieranie próbek od pacjentów i ekstrakcja wirusowego RNA

UWAGA: Ta sekcja opisuje protokół pobierania próbek od pacjentów i ekstrakcji RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA. Poniższy protokół służy do pozyskiwania surowicy z krwi obwodowej. Próbki użyte w tym badaniu zostały pobrane od pacjentów z gorączką, wysypką, bólem stawów lub innymi powiązanymi objawami infekcji arbowirusem w stanie Pernambuco w Brazylii.

1. Pobranie próbek krwi obwodowej od pacjentów z podejrzeniem zakażenia arbowirusem. Wykonaj nakłucie żyły (probówkę z krwią pełną) przy użyciu standardowej techniki aseptycznej. Oznacz probówki z próbkami anonimowym kodem i datą pobrania próbki.
2. Odwirować krew w celu oddzielenia surowicy w ilości 2 300 x g przez 10 minut. Za pomocą pipety przygotować porcje surowicy (200 μl), które zostaną użyte do ekstrakcji RNA w probówkach o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Jeśli nie jest możliwe przeprowadzenie ekstrakcji RNA wkrótce po pobraniu próbki, próbki surowicy należy przechowywać w temperaturze -80 °C przed dalszymi aplikacjami.
3. Odpipetować 560 μl przygotowanego buforu AVL (bufor do lizy wirusa) zawierającego nośnik RNA do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 140 μl surowicy do mieszaniny buforu AVL/nośnego RNA w probówce. Mieszać przez wirowanie pulsacyjne przez 15 sekund.
4. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie krótko odwirować próbkę w celu zebrania zawartości na dnie probówki. Dodać 560 μl etanolu (96%-100%) do próbki i mieszać przez wirowanie impulsowe przez 15 s. Po wymieszaniu odwirować próbkę, aby zebrać zawartość na dnie probówki.
5. Ostrożnie dodać 630 μl roztworu z kroku 9.4 do kolumny wirowej, nie zwilżając obręczy. Wykonując ten krok, zamknij nakrętkę i odwiruj przy 6 000 x g przez 1 minutę. Umieścić kolumnę wirową w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić zużytą probówkę zbiorczą zawierającą filtrat.
6. Ostrożnie otwórz kolumnę wirującą i powtórz krok 9.5. Ostrożnie otworzyć kolumnę wirową i dodać 500 μl buforu AW1 (bufor do płukania 1). Zamknij nakrętkę i odwiruj przy 6 000 x g przez 1 minutę. Umieścić kolumnę wirową w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić zużytą probówkę zbiorczą zawierającą filtrat.
7. Ostrożnie otworzyć kolumnę wirową i dodać 500 μl buforu AW2 (bufor płuczący 2). Zamknij nakrętkę i odwiruj przy 20 000 x g przez 3 minuty. Umieścić kolumnę wirową w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić zużytą probówkę zbiorczą zawierającą filtrat.
8. Aby uniknąć zanieczyszczenia resztkowym buforem AW2, który mógłby powodować problemy w dalszych reakcjach enzymatycznych, należy umieścić kolumnę wirową w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić zużytą probówkę zbiorczą wraz z filtratem. Wirować przy 20 000 x g przez 1 min.
9. Umieść kolumnę wirową w czystej probówce o pojemności 1,5 ml i wyrzuć zużytą probówkę zbiorczą wraz z filtratem. Ostrożnie otworzyć kolumnę wirową i dodać 60 μl buforu AVE (buforu elucyjnego) w zrównoważeniu do temperatury pokojowej. Wykonując ten krok, zamknij nakrętkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
10. Wirować przy 6 000 x g przez 1 min. Uwolniony RNA może być następnie wykorzystany jako dane wejściowe dla równoległych NASBA i RT-qPCR.
11. Wykonaj kroki od 8.3 do 8.11, aby przeprowadzić amplifikację opartą na sekwencji kwasów nukleinowych i reakcje bezkomórkowe na papierze przy użyciu 1 μl wyekstrahowanego RNA pacjenta, upewniając się, że obejmują one negatywne i pozytywne reakcje kontrolne. Po przeprowadzeniu reakcji należy przygotować 384-dołkową płytkę reakcyjną i uruchomić test w przenośnym czytniku płytek w temperaturze 37 °C (patrz szczegóły w protokole dodatkowym).
    UWAGA: Dwa stężenia RNA 10⁴ i 10² PFU/ml, wyekstrahowane z hodowlanego wirusa Zika, są używane jako kontrole pozytywne we wszystkich eksperymentach podczas walidacji klinicznej. Oprócz wcześniej wymienionych kontroli ważne jest, aby uwzględnić również wskaźnik spustowy (10 ng/μl) jako kontrolę dodatnią.
12. Na koniec każdego eksperymentu surowe dane (plik .csv) z czytnika płyt można przesłać do bezpiecznej bazy danych online. Dodatkowo przenośny czytnik płytek generuje raport wskazujący, czy próbki są dodatnie, czy ujemne na obecność wirusa Zika (Rysunek 6); zobacz sekcję reprezentatywnych wyników, aby zapoznać się z przykładami wszystkich wykresów uzyskanych podczas inkubacji (Rysunek 7).
    UWAGA: Użytkownicy mogą również przesyłać pliki z przenośnego czytnika płytek na własny komputer przez USB.

10. Przenośny czytnik płytek

1. Przenośny czytnik płytek (Rysunek 8) może być używany jako alternatywa dla konwencjonalnego czytnika płytek²⁴. W celu zapoznania się z protokołem i reprezentatywnymi wynikami zob. Protokół dodatkowy.

11. RT-qPCR do wykrywania wirusa Zika

UWAGA: Ta sekcja opisuje kroki, które należy wykonać, aby przeprowadzić test RT-qPCR do wykrywania wirusa Zika z próbek pobranych od pacjentów (patrz Protokół Uzupełniający).

1. Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy zamontować komponenty RT-qPCR w miejscu odizolowanym od procesu amplifikacji (np. w czystym kapturze). Umieść bufor RT-qPCR, enzymy i starter/sondy na lodzie lub zimnym bloku. Następnie dodać reakcje do 384-dołkowej płytki na lodzie zgodnie z tabelą 9.
   UWAGA: Dla wszystkich eksperymentów zalecana jest kontrola ujemna (kontrola ekstrakcji i kontrola bez matrycy [NTC]) oraz kontrola pozytywna (10⁴ PFU/ml).
2. Po dodaniu odczynników do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, wymieszaj reakcję, pipetując w górę iw dół (nie wirować) i dozuj 6,5 μl do każdej studzienki. Dodać 3,5 μl każdej matrycy RNA w trzech powtórzeniach.
3. Umieść folię PCR na wierzchu płytki. Odwirować 384-dołkową płytkę o masie 600 x g przez 2 minuty.
4. Umieścić płytkę w maszynie RT-qPCR, stosując następujące warunki cykliczne opisane w Tabeli 10. Aby przeanalizować wyniki, należy skorzystać z oprogramowania do projektowania i analizy maszyny RT-qPCR i wziąć pod uwagę automatyczny próg i linię bazową (patrz szczegóły w Protokole Dodatkowym).

składnik	głośność	koncentracja
2X Sonda QuantiNova RT-PCR Master Mix	5 μL	1 X
Podkład 100 μM do przodu	0,08 μl	0,8 μM
100 μM Podkład odwrotny	0,08 μl	0,8 μM
Sonda 25 μM	0,04 μl	0,1 μM
QuantiNova ROX Barwnik referencyjny	0,05 μL	1 X
Sonda QuantiNova RT Mix	0,1 μl	1 X
Matryca RNA	3,5 μl	-
Woda wolna od nukleaz	do 10 μL	-

Tabela 9: Komponenty RT-qPCR do amplifikacji RNA wirusa Zika w oparciu o protokół Centers for Disease Control and Prevention-CDC USA do wykrywania wirusa Zika w próbkach pobranych od pacjentów³¹.

Krok		temperatura	Godzina
Odwrotna transkrypcja		45 °C	Czas trwania: 15 min
Etap wstępnej aktywacji PCR		95 °C	Czas trwania: 5 min
45 cykli	denaturacja	95 °C	5 sekund
	Kombinowane wyżarzanie/przedłużanie	60 °C	45 sekund

Tabela 10: Warunki cykliczne dla RT-qPCR.

Results

Po procesie projektowania obliczeniowego, PCR przeprowadził budowę trzech przełączników typu toehold. Produkty PCR analizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Rysunek 2). Obecność wyraźnego pasma około 3000 pz, mniej więcej wielkości genu lacZ sprzężonego z przełącznikiem palcowym, zwykle wskazuje na udaną reakcję. Alternatywnie, tor bez opaski, wiele prążków lub pasek o niewłaściwym rozmiarze wskazuje na nieudany PCR. W przypadku nieudanego testu PCR należy zoptymalizować warunki reakcji i/lub sekwencje starterów.

Zmontowane przełączniki zostały przebadane, aby ocenić każdy czujnik pod kątem odpowiedniego RNA wyzwalającego transkrybowanego in vitro (Rysunek 3). Podczas gdy wszystkie trzy czujniki wykazywały zwiększoną absorbancję OD₅₇₀, przełącznik 27B (Rysunek 3A) miał najszybszą szybkość włączania. Przełączniki 33B i, w mniejszym stopniu, 47B wykazały zwiększoną absorbancję OD₅₇₀ przy braku docelowego RNA wyzwalającego, co wskazuje, że przełączniki te mają pewną aktywność tła lub nieszczelność (Rysunek 3B, C) - cecha niepożądana w czujniku kandydującym, ponieważ może zmniejszyć specyficzność. Aby wyraźniej zidentyfikować czujnik o najwyższym stosunku sygnału ON/OFF, obliczono zmianę zagięcia absorbancji OD₅₇₀ (patrz sekcja 5 informacji uzupełniających) i wykreślono (Rysunek 4). Z tej analizy jasno wynika, że przełącznik 27B jest czujnikiem, który ma najlepszą wydajność ze stosunkiem ON/OFF wynoszącym około 60.

Czułość najlepiej działającego przełącznika toehold (27B) została następnie oceniona poprzez określenie najniższego stężenia RNA wymaganego do aktywacji przełącznika toehold w połączeniu z reakcją NASBA. Wykres ilustruje, że najbardziej wydajne czujniki Zika mogą wykrywać RNA w stężeniach tak niskich, jak 1,24 cząsteczki na μl (co odpowiada ~2 aM; Rysunek 5).

Po zidentyfikowaniu i zatwierdzeniu przełącznika 27B, materiały z czujników zostały rozdane członkom zespołu w Recife w stanie Pernambuco w Brazylii. W Brazylii kliniczną dokładność diagnostyczną platformy diagnostycznej wirusa Zika oceniono przy użyciu próbek pobranych od pacjentów z wirusem Zika, równolegle z RT-qPCR w celu porównania. Do walidacji papierowej platformy diagnostycznej Zika wykorzystano przenośny czytnik płytek, który jest w stanie inkubować i odczytywać dane kolorymetryczne z czujników papierowych. Zmiana koloru z żółtego na fioletowy służy do identyfikacji próbki dodatniej, podczas gdy próbka ujemna pozostaje żółta (Rysunek 6). Dodatkową opcją wizualizacji wyników generowanych przez przenośny czytnik płytek (Rysunek 8) jest wykreślenie odpowiedzi kolorymetrycznej dla każdej reakcji na papierze w czasie. Próbki zostały przetestowane w trzech egzemplarzach, a te, które przekroczyły próg (czerwona linia ustawiona na 1) zostały uznane za pozytywne, podczas gdy próbki poniżej progu zostały uznane za negatywne (Rysunek 6 i Rysunek 7).

Na koniec, aby ocenić i porównać kliniczną skuteczność czujnika Zika z aktualnym złotym standardem diagnozowania infekcji wirusem Zika, wszystkie próbki pacjentów zostały przetestowane równolegle z RT-qPCR. Wykres amplifikacji dwóch reprezentatywnych próbek pacjentów został przetestowany trzykrotnie w celu wykrycia wirusa Zika za pomocą RT-qPCR (Rysunek 9). Próbki uznaje się za dodatnie, gdy wartość progowa cyklu (Ct) wynosi ≤38; czerwona linia oznacza próbkę dodatnią, a niebieska linia oznacza próbkę ujemną na obecność wirusa Zika.

Rysunek 2: Elektroforeza w żelu agarozowym w celu oceny jakości produktów PCR. Produkty PCR są analizowane na 1% żelu agarozowym w 1X TAE, uruchamiane przy 80 V przez 90 min. Pojedynczy wyraźny pasek zazwyczaj wskazuje na udaną reakcję. Tor 1: 1 kb drabinka DNA; Pasy 2-4: odpowiednio 27B przełącza DNA, 33B wyzwala DNA i 47B wyzwala DNA. Liczby po lewej stronie reprezentują rozmiar pasma w bp. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Prototypowanie trzech przełączników typu toehold dla papierowych czujników Zika. Wydajność trzech papierowych czujników RNA toehold switch mierzono w temperaturze 37 °C przez ponad 130 minut. Każdy wykres zawiera dwie ścieżki, z których jedna reprezentuje kontrolkę tylko przełącznika, a druga reprezentuje przełącznik i spust. Trzy wykresy przedstawiają dane uzyskane za pomocą czujników przełącznika toehold 27B (A), 33B (B) i 47B (C). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej (SEM) z trzech powtórzeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Czujniki o najwyższej wydajności są identyfikowane poprzez obliczenie zmiany absorbancji przy 570 nm. Zmianę krotności (lub maksymalny współczynnik ON/OFF) oblicza się, mierząc stosunek absorbancji (OD₅₇₀) w 130 minucie między kontrolą tylko przełącznika a testem CFPS przełącznika i spustu. Słupki błędów reprezentują SEM z trzech powtórzeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Ocena wrażliwości przełącznika o najwyższej wydajności. Transkrybowane in vitro RNA wirusa Zika jest miareczkowane do reakcji NASBA. Po 1 godzinnej inkubacji reakcje dodano do bezkomórkowych reakcji PURExpress na krążkach papierowych w stosunku 1:7. Wykreśla się zmianę zagięcia po 130 minutach w temperaturze 37 °C. Ten rysunek został odtworzony z²⁴. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Strona przechwytywania przenośnego czytnika płyt załadowana danymi przechwyconego obrazu. Na tym rysunku przedstawiono przykładowy obraz końcowego obrazu przechwyconego przez przenośny czytnik płytek podczas zbierania danych. Oryginalny znacznik daty/godziny jest widoczny w górnej części obrazu. Kolor żółty oznacza reakcję kontrolną lub negatywną, a kolor fioletowy oznacza reakcję pozytywną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Tryb analizy danych. Po lewej stronie użytkownicy wybierają zestawy danych, które chcieliby wykreślić; Wykresy są następnie wyświetlane po prawej stronie z unikalnymi kolorami dla każdej próbki lub zestawu kontrolnego. Przerywana czerwona linia służy jako próg do oznaczania próbek dodatnich i ujemnych. Próbki badane w trzech egzemplarzach, które przekraczają próg, uznaje się za dodatnie, natomiast próbki poniżej progu uznaje się za ujemne. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (SD) od trzech powtórzeń. od Ctrl 1 do Ctrl 5 wskazują elementy sterujące. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8. PLUM, przenośny czytnik płytek. Ten przenośny czytnik płytek działa jak laboratorium w pudełku i służy jako czytnik płytek z kontrolowaną temperaturą do inkubacji i monitorowania reakcji kolorymetrycznych. To przenośne urządzenie może zapewnić ilościowe i wysokoprzepustowe pomiary papierowych czujników Zika na miejscu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Wykres RT-qPCR amplifikacji dwóch próbek pacjentów testowanych trzykrotnie pod kątem wykrycia wirusa Zika. Próbki uważa się za dodatnie, gdy wartość progu cyklu (Ct) wynosi ≤38. Przerywana czerwona linia służy jako próg do oznaczania próbek dodatnich i ujemnych. Czerwony ślad oznacza próbkę dodatnią, a niebieski ślad oznacza próbkę ujemną. Wartość ΔRn (delta Rn) reprezentuje znormalizowaną wielkość sygnału fluorescencji wykrytego przez przyrząd RT-qPCR dla wszystkich badanych próbek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik protokołu dodatkowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunki uzupełniające.Kliknij tutaj, aby pobrać te rysunki.

Discussion

Opisany tutaj połączony system oparty na dokumentach papierowych może doprowadzić do klinicznie istotnej diagnostyki molekularnej, z wydajnością funkcjonalnie porównywalną z RT-qPCR, do punktu potrzebnego⁶. Co ważne, w przypadku ustawień zdalnych dostępność diagnostyki na miejscu może skrócić czas oczekiwania na wyniki z dni do godzin. Podkreślając programowalność tego podejścia, opisany potok może być wykorzystany do wykrywania praktycznie każdego celu patogenu. Połączyliśmy narzędzia molekularne ze specjalnie zaprojektowanym przenośnym czytnikiem płytek, który jest kompaktowy i kompatybilny z zasilaniem bateryjnym (8–9 godzin) oraz zapewnia wbudowaną analizę danych w celu umożliwienia aplikacji rozproszonych. W ramach innych prac przeprowadziliśmy walidację połączonego sprzętu i platformy diagnostycznej wirusa Zika z 268 próbkami pacjentów, równolegle z RT-qPCR, i uzyskaliśmy dokładność diagnostyczną na poziomie 98,5%²⁴. Podsumowując, naszym celem jest umożliwienie transferu technologii tej platformy do naukowców, tak aby mogła ona zostać ponownie wykorzystana i ulepszona przez społeczność w celu zaspokojenia niezaspokojonych potrzeb diagnostycznych.

Proces projektowania przełącznika in silico toehold został zintegrowany i zautomatyzowany w potok, który można podzielić na trzy etapy. Pierwszy etap generuje pulę projektów przełączników toehold, które hybrydyzują z sekwencją docelową w jednym przyrostu nukleotydowym. Drugi etap bada strukturę wtórną i dostępność przełącznika podtrzymania palcowego oraz eliminuje czujniki z przedwczesnymi kodonami stop w ramie. Funkcja punktacji, która uwzględnia wiele czynników (np. poziom defektu przełącznika toehold, dostępność przełącznika toehold i dostępność miejsca docelowego), jest następnie implementowana w celu wyboru projektów przełączników górnego zaczepu na podstawie ogólnych wyników. W ostatnim etapie generowana jest lista sekwencji dla projektów przełączników górnego uchwytu palcowego i odpowiadających im docelowych wyzwalaczy. Sekwencje najlepszych czujników powinny być badane pod kątem swoistości wobec ludzkiego transkryptomu i blisko spokrewnionych genomów wirusowych przy użyciu NCBI/Primer-BLAST²⁵. Najlepszą praktyką jest również badanie przesiewowe miejsc docelowych czujników pod kątem zachowania sekwencji w genomie wirusa Zika, aby zapewnić, że czujniki zapewnią szeroką i niezawodną detekcję. Opracowano kilka wersji oprogramowania do projektowania przełączników toehold, a algorytm projektowania pozwala użytkownikom na wygenerowanie dwóch wersji, przełączników toehold serii A⁶ lub serii B^6. W tym artykule skupiono się na konstrukcji przełącznika palcowego serii B.

Po komercyjnej syntezie DNA, przełączniki palcowe mogą być szybko złożone, a następnie przetestowane, wykonując wstępne badanie przesiewowe pod kątem syntetycznej sekwencji wyzwalającej celu, która odpowiada krótkim regionom (200-300 nt) docelowego genomu. W celu sprawdzenia wydajności czujników opartych na przełączniku toehold idealnie jest dodać sekwencję docelową w postaci RNA. W tym artykule przedstawiono kroki wymagane do dodania transkrybowanego wyzwalającego RNA in vitro . Jeśli jednak są dostępne, można zastosować pełnowymiarowe matryce genomu, takie jak ilościowe ekstrakty wirusowego RNA lub komercyjne syntetyczne genomy lub standardy RNA. Wykorzystanie genomów RNA o pełnej długości do początkowego badania przesiewowego przełącznika palca u nogi jest korzystne, ponieważ może informować, czy dodatkowe czynniki, takie jak struktura drugorzędowa RNA, wpłyną na działanie czujnika. Aby zoptymalizować stosunek ON/OFF potencjalnych przełączników, DNA przełącznika palcowego można miareczkować do reakcji bezkomórkowej. Ten krok może również służyć do identyfikacji wysokowydajnych przełączników typu toehold (wzmocnienie fałdowe lub wysoki współczynnik ON/OFF) i pominięcia nieszczelnych przełączników toehold (wysoki sygnał przy braku docelowego RNA) na dalszych etapach charakteryzacji.

Aby poprawić granicę wykrywalności najskuteczniejszych kandydatów na przełączniki typu toehold, NASBA stosuje się w celu zwiększenia klinicznie istotnych stężeń docelowego RNA wirusa Zika do poziomu, który może być wykryty przez przełączniki toehold⁶. Różne kombinacje zestawów starterów do przodu i do tyłu są badane w celu określenia najlepszych kombinacji startera NASBA i przełącznika palcowego, aby umożliwić wykrywanie w klinicznie istotnych stężeniach. Po zidentyfikowaniu idealnej kombinacji zestawu starterów i przełącznika palcowego, test jest przekazywany do walidacji klinicznej. Ważne jest, aby pamiętać, że etapy przełącznika toehold i badań przesiewowych NASBA mogą być pracochłonne i zasobożerne, dlatego opracowywanie testów najlepiej nadaje się do dobrze wyposażonych ośrodków badawczych. Chociaż nie zastosowaliśmy automatyzacji procesów, jest prawdopodobne, że może to przyspieszyć iteracyjny cykl projektowania, budowania i testowania³². Na szczęście czas realizacji od zaprojektowania i przetestowania czujnika do wdrożenia może być niezwykle krótki (mniej niż tydzień), co czyni tę strategię idealną w sytuacjach krytycznych czasowo, takich jak wybuchy epidemii⁶.

Nawet po opracowaniu biosensora o klinicznie istotnej czułości istnieją wyzwania techniczne, którymi należy się zająć. Ponieważ protokół ten obejmuje obsługę ręczną i jest procedurą wieloetapową, istnieje ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami. Dokładamy wszelkich starań, aby zmniejszyć to ryzyko poprzez staranną praktykę laboratoryjną. W niedawnym badaniu klinicznym obejmującym 268 próbek pobranych od pacjentów nie napotkaliśmy żadnych problemów związanych z zanieczyszczeniem; Jest to jednak istotna kwestia²⁴. Mając to na uwadze, protokół pozostaje testem laboratoryjnym i wymaga wykwalifikowanego użytkownika posiadającego wiedzę na temat odpowiednich technik biologii molekularnej. Dodatkowym czynnikiem branym pod uwagę przy wdrażaniu jest izolacja RNA od próbek pobranych od pacjentów. Tutaj opisujemy izolację RNA przy użyciu zestawów do ekstrakcji kwasów nukleinowych opartych na kolumnach. Jednak w innych pracach zademonstrowaliśmy skuteczną i prostą metodę lizy wrzenia (95 °C przez 2 minuty) do przetwarzania próbek od pacjentów o niskim obciążeniu⁶. Strategia ta prawie eliminuje koszty związane z ekstrakcją RNA i pozwala uniknąć stosowania zestawów do ekstrakcji kwasów nukleinowych opartych na kolumnach, co może stanowić wyzwanie logistyczne w warunkach niskich zasobów lub problemów z łańcuchem dostaw podczas kryzysów, takich jak pandemia COVID-19³³.

Jak widzieliśmy podczas pandemii COVID-19, instrumenty używane do przeprowadzania RT-qPCR mogą same w sobie służyć jako wąskie gardło i ograniczać dostęp pacjentów do testów. Ten czynnik, który jest również w dużej mierze finansowy, prowadzi do scentralizowanego trybu testowania, który może ograniczyć dostęp diagnostyczny. Na przykład podczas wybuchu epidemii wirusa Zika w latach 2015/2016 w Brazylii dostępnych było tylko pięć krajowych laboratoriów referencyjnych, co spowodowało opóźnienia w testowaniu pacjentów. Nie biorąc pod uwagę potencjalnych korzyści wynikających z ekonomii skali, obecny koszt towarów dla przenośnego czytnika płytek wynosi ~500 USD, co nawet jeśli wzrosło pięciokrotnie w celu uwzględnienia marży pracy i handlowej, nadal zapewnia przystępne cenowo narzędzie. Wypada to dobrze w porównaniu z instrumentami RT-qPCR, których koszt waha się od 15 000 do 90 000 USD³⁴. Co więcej, szacowany koszt testu bezkomórkowego w Ameryce Łacińskiej wynosi około 5,48 USD, podczas gdy koszt testu RT-qPCR w Brazylii wynosił ~10-11 USD w momencie wybuchu epidemii Zika³⁶. Poza kosztem sprzętu, przenośny czytnik płytek ma niewielkie rozmiary (20 cm³), automatyczną analizę, przesyłanie danych do chmury przez Internet i może być zasilany bateryjnie. Funkcje te znacznie rozszerzają potencjalne ustawienia, w których można wdrożyć testy, a jednocześnie rozszerzają populację pacjentów, którzy mogą być obsługiwani.

Do tej pory najpopularniejszymi komercyjnymi platformami CFPS dla E. coli są systemy S30 i PURE³⁷; Jednak kluczowym czynnikiem wpływającym na poprawę dostępu do diagnostyki w krajach o niskich i średnich dochodach jest ograniczona krajowa dostępność tych odczynników. Ważnym krokiem w kierunku rozwiązania tego problemu jest rozwój lokalnej produkcji CFPS. Laboratorium Federici poczyniło ostatnio znaczne postępy w kierunku opracowania niekomercyjnej platformy do wdrażania czujników opartych na przełącznikach toehold w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie, osiągając poziom 2,7 fM LOD z RNA¹⁴ wirusa Zika. Osiągnięcie to nie tylko pozwala na wytwarzanie odczynników w kraju użytkowania, unikając ceł importowych i opóźnień, ale koszty pracy można również skalować do stawek lokalnych, a tym samym można znacznie obniżyć całkowity koszt. W pracach przedstawionych przez grupę Federici koszt wytworzenia reakcji ekspresji CFPS (5 μl) w Chile wyniósł 6,9 centa (USD)^35,38, co stanowi podwójną zachętę (poprawa logistyki i kosztów) do wdrożenia systemów opartych na lizacie ^35,38.

Umieszczenie testów porównywalnych z RT-qPCR w rozproszonych sieciach diagnostycznych może przynieść znaczące korzyści w porównaniu z obecnymi praktykami, które są zależne od transportu próbek do scentralizowanych obiektów RT-qPCR. W warunkach podmiejskich, gdzie skoncentrowane były przypadki wirusa Zika, fizyczna odległość między pacjentem a placówką diagnostyczną spowalnia diagnozę i zwiększa ryzyko, że wyniki nie dotrą do pacjenta w klinicznie istotnym czasie. Mamy nadzieję, że zaprezentowane tu prace mogą przyczynić się do umożliwienia społeczności naukowej, poprzez transfer wiedzy, tworzenia zdecentralizowanych biotechnologii i przenośnego sprzętu do monitorowania zdrowia ludzkiego, rolnictwa i środowiska.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pokrywy płytek 384-dołkowych -	aluminiowe Sarstedt	95.1995	Służą do zakrywania płytek 384-dołkowych przed ich włożeniem do czytnika PLUM
Pokrywy płytek 384-dołkowych - przezroczyste	Sarstedt	95.1994	Służą do zakrywania płytek 384-dołkowych przed ich włożeniem do czytnika płytek BioTek
Płytki 384-dołkowe	VWR	CA11006-180	Diagnostyka papierowa o średnicy 2 mm jest umieszczana w studzienkach tych płytek w celu ilościowego określenia
Agarose	BioShop Canada	AGA001.500	Elektroforeza żelowa
BSA	BioShop Canada	ALB001.500	Środek blokujący do bibuły filtracyjnej Whatman
Reakcje bezkomórkowe	New England Biolabs	E6800L	PURExpress
CPRG	Roche	10884308001	Chlorofenol red-b-D-galaktopiranozyd
Jednorazowe sterylne stemple do biopsji	Integra Miltex	23233-31	Służy do tworzenia 2 mm krążków papierowych, które mieszczą się w 384-dołkowej płytce
DNAza I	Thermo Scientific	K2981	Trawi matrycę DNA po inkubacji reakcji transkrypcji in vitro
Zestaw DNAse I	Thermo Scientific	74104	DNase I Kit Do usuwania matrycowego DNA z RNA IVT
dNTPs	New England Biolabs	N0446S	Używany do
systemu elektroforezy	Bio-Rad	1704487	Służy do uruchamiania żeli agarozowych
Stacja obrazowania	żeli Bio-Rad	1708265	ChemiDoc XRS+ Zestaw do obrazowania
IVT	New England Biolabs	E2040S	Używany do transkrypcji in vitro matrycy (wyzwalacza) RNA do przesiewania przełącznika
Nanodrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W	Służy do oznaczania stężeń kwasów nukleinowych
Zestaw NASBA	Nauki przyrodnicze Zaawansowane technologie	NWK-1	Składniki reakcji amplifikacji izotermicznej
Invitrogen	H20 bez nukleaz		10977015 Dodawany do mieszanin reakcyjnych
System elektroforezy PAGE	Biorad	1658001FC	Służy do odlewania i uruchamiania żeli poliakrylamidowych
pCOLADuet-LacZ DNA	Addgene	75006	https://www.addgene.org/75006/
Bufor polimerazy/reaktioiny Phusion	New England Biolabs	M0530L	Używany do PCR
Czytnik płytek	BioTek	BioTek NEO2	Multi Mode Plate, Synergy
Neo2 Primers	Zintegrowane technologie		Niestandardowa synteza oligo
Polimeraza Q5/ Bufor reakcyjny	New England Biolabs	M0491L	Używany do PCR
Qiagen PCR Puriifcation Kit	QIAGEN	27106	QIAprep Spin Miniprep
Kit Barwnik ładujący RNA	New England Biolabs	B0363S	2X Barwnik ładujący RNA
Zestaw do oczyszczania RNA	QIAGEN	EN0521	QIAamp Zestaw do ekstrakcji wirusowego
RNA Inhibitor RNazy	New England Biolabs	M0314S	Służy do zapobiegania zanieczyszczeniu RNaz A, B i C
Zestaw RT-qPCR	QIAGEN	208352	Sonda QuantiNova Zestaw RT-PCR
SYBR Gold	Invitrogen S11494	S11494	PAGE barwnik żelowy do kwasów nukleinowych
TAE	Buffer Kanada	TAE222.4	Żelowy bufor do elektroforezy
Thermal Cycler	Applied Biosystems	4484073	Służy do cyklicznych zmian temperatury i reakcji inkubacyjnych
Bibuła filtracyjna Whatman 42	GE Healthcare	1442-042	Służy do osadzania komponentów molekularnych do diagnostyki papierowej