Artykuł metodologiczny

Badanie projektowe i wdrożeniowe w celu opracowania i walidacji pacjenta w papierowej diagnostyce przełącznika Toehold

3.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63223

⸱

17 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 2Laboratory of Virology and Experimental Therapy (LAVITE), Department of Virology, Aggeu Magalhães Institute (IAM), Oswaldo Cruz Foundation (Fiocruz), 3Department of Biomedical Engineering, Boston University, 4Molecular Biology, Cell Biology & Biochemistry Program, Graduate School of Arts and Sciences, Boston University, 5Department of Mechanical and Industrial Engineering, University of Toronto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Dostęp do zdecentralizowanej, taniej i wydajnej diagnostyki, która może być wdrożona w społeczności do zdecentralizowanych testów, jest kluczowy dla walki z globalnymi kryzysami zdrowotnymi. W tym manuskrypcie opisano, jak zbudować papierową diagnostykę sekwencji wirusowego RNA, które można wykryć za pomocą przenośnego czytnika optycznego.

Streszczenie

Dostęp do niskoobciążającej diagnostyki molekularnej, która może być wykorzystana w społeczności do testowania, jest coraz ważniejszy i ma znaczące, szersze implikacje dla dobrobytu społeczeństw i stabilności ekonomicznej. W ostatnich latach pojawiło się kilka nowych izotermicznych metod diagnostycznych, które zaspokajają zapotrzebowanie na szybką i tanią diagnostykę molekularną. Przyczyniliśmy się do tego wysiłku poprzez opracowanie i walidację przez pacjentów diagnostyki opartej na przełączniku toehold, w tym diagnostyki wirusów Zika i chikungunya przenoszonych przez komary, które zapewniły wydajność porównywalną ze złotym standardem testów opartych na ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Te diagnostyki są niedrogie w opracowywaniu i produkcji, a także mają potencjał, aby zapewnić możliwości diagnostyczne w środowiskach o niskich zasobach. W tym przypadku protokół zapewnia wszystkie kroki niezbędne do opracowania testu opartego na przełącznikach do wykrywania wirusa Zika. Artykuł przeprowadza czytelnika przez etapowy proces rozwoju diagnostyki. Po pierwsze, sekwencje genomowe wirusa Zika służą jako dane wejściowe do projektowania obliczeniowego potencjalnych przełączników przy użyciu oprogramowania typu open source. Następnie przedstawiono montaż czujników do badań empirycznych z syntetycznymi sekwencjami RNA oraz optymalizację czułości diagnostycznej. Po zakończeniu walidacji przeprowadza się na próbkach od pacjentów równolegle z RT-qPCR i specjalnie zaprojektowanym czytnikiem optycznym PLUM. Prace te stanowią techniczną mapę drogową dla naukowców w zakresie opracowania tanich czujników opartych na przełącznikach do zastosowań w zdrowiu ludzkim, rolnictwie i monitorowaniu środowiska.

Wprowadzenie

RT-qPCR pozostaje złotym standardem w diagnostyce klinicznej ze względu na doskonałą czułość i swoistość. Mimo że metoda ta jest wysoce niezawodna, opiera się na kosztownym, specjalistycznym sprzęcie i odczynnikach, które wymagają dystrybucji i przechowywania w kontrolowanej temperaturze. Stanowi to znaczną barierę w powszechnym dostępie do wysokiej jakości diagnostyki, szczególnie w czasie wybuchów epidemii oraz w regionach z ograniczonym dostępem do dobrze wyposażonych laboratoriów1,2. Zaobserwowano to podczas epidemii wirusa Zika w Brazylii w latach 2015/2016. Dostępność zaledwie pięciu scentralizowanych laboratoriów wykonujących testy RT-qPCR doprowadziła do powstania znacznych wąskich gardeł, ograniczając dostęp do diagnostyki. Było to szczególnie uciążliwe dla osób z obszarów podmiejskich, które zostały dotknięte epidemią w najsilniejszym stopniu3,4. W celu poprawy dostępu do diagnostyki, w niniejszym protokole przedstawiono platformę opracowaną z myślą o zdecentralizowanej, niskokosztowej i wysokowydajnej diagnostyce w warunkach ograniczenia zasobów. W ramach tego przedsięwzięcia ustanowiono proces odkrywania narzędzi diagnostycznych, łącząc amplifikację izotermiczną i syntetyczne sensory oparte na przełącznikach RNA z bezkomórkowymi systemami ekspresyjnymi na podłożu papierowym5,6.

Systemy bezkomórkowej syntezy białek (CFPS), a w szczególności systemy bezkomórkowe oparte na E. coli, stanowią atrakcyjną platformę dla szerokiego zakresu zastosowań w biosensingu – od monitorowania środowiska7,8 po diagnostykę patogenów5,6,9,10,11,12. Zawierając komponenty niezbędne do transkrypcji i translacji, systemy CFPS oferują znaczące zalety w porównaniu z biosensorami opartymi na całych komórkach. W szczególności detekcja nie jest ograniczona przez ścianę komórkową, a systemy te są zazwyczaj modułowe, bezpieczne biologicznie, niedrogie i mogą być liofilizowane w celu zastosowań przenośnych. Możliwość liofilizacji reakcji opartych na obwodach genowych na podłożach takich jak papier czy tekstylia umożliwia transport, długoterminowe przechowywanie w temperaturze pokojowej5, a nawet integrację z technologiami ubieralnymi (wearables)13.

Wcześniejsze prace wykazały, że bezkomórkowe systemy E. coli mogą być wykorzystywane do wykrywania licznych analitów, na przykład metali toksycznych takich jak rtęć, antybiotyków takich jak tetracyklina7,14, substancji zaburzających gospodarkę hormonalną15,16, biomarkerów takich jak kwas hipurowy17, cząsteczek quorum sensing związanych z patogenami9,18 oraz substancji nielegalnych, takich jak kokaina17 i kwas gamma-hydroksymasłowy (GHB)19. W przypadku specyficznego sekwencyjnie wykrywania kwasów nukleinowych strategie opierały się w przeważającej mierze na zastosowaniu biosensorów opartych na przełącznikach sprzężonych z technikami amplifikacji izotermicznej. Przełączniki typu toehold są syntetycznymi riboregulatorami (w dalszej części tekstu nazywanymi po prostu „przełącznikami”), które zawierają strukturę spinki do włosów blokującą dalszą translację poprzez sekwestrację miejsca wiązania rybosomu (RBS) i kodonu startowego. Po wejściu w interakcję z docelowym RNA wyzwalającym struktura spinki zostaje zniesiona, co umożliwia późniejszą translację reporterowej otwartej ramki odczytu20.

Amplifikacja izotermiczna może być również wykorzystywana w diagnostyce molekularnej21; jednak metody te są podatne na niespecyficzną amplifikację, co może obniżyć swoistość, a tym samym dokładność testu poniżej poziomu uzyskiwanego w RT-qPCR 22. W pracy opisanej w niniejszym opracowaniu amplifikację izotermiczną przed czujnikami opartymi na przełącznikach wykorzystano w celu zapewnienia połączonej amplifikacji sygnału, która umożliwia wykrywanie kwasów nukleotowych na poziomach istotnych klinicznie (od femtomolarnego do attomolarnego). Połączenie tych dwóch metod zapewnia również dwa punkty kontrolne specyficzne dla sekwencji, które łącznie gwarantują wysoki poziom swoistości. Stosując to podejście, w poprzednich pracach wykazano możliwość wykrywania wirusów takich jak Zika6, Ebola5, Norowirus10, a także bakterii patogennych, takich jak C. difficile23 oraz antybiotykoopornego szczepu duru brzusznego12. Niedawno opracowano bezkomórkowe przełączniki toehold do wykrywania SARS-CoV-2 w ramach wysiłków mających na celu zapewnienie dostępnej diagnostyki w czasie pandemii COVID-1911,12,13.

Poniższy protokół opisuje opracowanie i walidację bezkomórkowego, papierowego testu opartego na syntetycznym przełączniku toehold do wykrywania wirusa Zika, od projektowania biosensora in silico, przez etapy montażu i optymalizacji, aż po walidację w terenie z wykorzystaniem próbek od pacjentów. Protokół rozpoczyna się od projektu in silico czujników opartych na przełączniku toehold RNA oraz starterów do amplifikacji izotermicznej specyficznych dla RNA wirusa Zika. Chociaż istnieje wiele metod amplifikacji izotermicznej, tutaj zademonstrowano zastosowanie amplifikacji opartej na sekwencji kwasów nukleinowych (NASBA) w celu zwiększenia stężenia docelowego RNA wirusa obecnego w reakcji, co pozwoliło na osiągnięcie istotnej klinicznie czułości. W praktyce metody amplifikacji izotermicznej mają tę zaletę, że działają w stałej temperaturze, co eliminuje potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu, takiego jak termocyklery, które zazwyczaj są dostępne jedynie w ośrodkach centralnych.

Następnie opisano proces składania syntetycznych sensorów przełącznikowych typu toehold z sekwencjami kodującymi białka raportowe za pomocą PCR z przedłużeniem nakładającym (overlap extension PCR) oraz przesiewanie syntetycznych sensorów przełącznikowych w celu uzyskania optymalnej wydajności w systemach bezkomórkowych z wykorzystaniem syntetycznego RNA. Dla tego zestawu sensorów wirusa Zika wybrano gen lacZ kodujący enzym β-galaktozydazę, który jest w stanie rozszczepić kolorymetryczny substrat, chlorofenolowy czerwony-β-D-galaktopiranozyd (CPRG), wywołując zmianę barwy z żółtej na purpurową, którą można wykryć wzrokowo lub za pomocą czytnika płytek. Po zidentyfikowaniu najlepiej działających syntetycznych przełączników opisano proces przesiewania starterów do izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych odpowiadającej sekwencji docelowej z wykorzystaniem syntetycznego RNA w celu znalezienia zestawów zapewniających najlepszą czułość.

Wreszcie, działanie platformy diagnostycznej zostaje zwalidowane w warunkach terenowych w Ameryce Łacińskiej (Rysunek 1). Aby określić dokładność diagnostyki klinicznej, przeprowadzono bezkomórkowy test na podłożu papierowym z wykorzystaniem próbek wirusa Zika pobranych od pacjentów; równolegle, w celu porównania, wykonano złotym standardem test RT-qPCR. Aby monitorować kolorymetryczne testy bezkomórkowe, umożliwiamy ilościowe określanie wyników w regionach, w których nie ma dostępu do termocyklerów. Przedstawiono również montowany ręcznie czytnik płytek o nazwie Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; dalej określany jako przenośny czytnik płytek)24. Przenośny czytnik płytek, opracowany początkowo jako urządzenie towarzyszące diagnostyce opartej na bezkomórkowych syntetycznych przełącznikach typu toehold, oferuje przystępny sposób inkubacji i odczytu wyników w sposób wysokoprzepustowy, zapewniając użytkownikom zintegrowaną analizę oprogramowania opartą na komputerowym przetwarzaniu obrazu.

figure-introduction-1
Rycina 1: Schemat postępowania podczas testowania próbek pacjentów z wykorzystaniem papierowych reakcji przełącznika toehold bezkomórkowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi muszą być przeprowadzane zgodnie ze standardami etycznymi i odpowiednimi wytycznymi, w tym zasadami etycznymi dla badań medycznych z udziałem ludzi, ustalonymi przez Deklarację Światowego Stowarzyszenia Medycznego z Helsinek. To badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyczną ds. badań na ludziach na podstawie protokołu licencyjnego o numerze CAAE: 80247417.4.0000.5190. Świadoma zgoda wszystkich pacjentów włączonych do tego badania została uchylona przez Fiocruz-PE Institutional Review Board (IRB) w odniesieniu do próbek diagnostycznych.

UWAGA: Urządzenie PLUM będzie odtąd nazywane 'przenośnym czytnikiem płytek'.

1. Obliczeniowy projekt starterów amplifikacyjnych opartych na sekwencji kwasów nukleinowych

  1. Zeskanuj genom wirusa Zika, aby zidentyfikować zestaw regionów kandydujących do amplifikacji o długości około 200 nukleotydów (nt) do 300 nt, umieszczając sekwencję genomu w NCBI/Nucleotide BLAST25,26. Porównaj genom z referencyjnymi sekwencjami RNA (refseq_rna) i poszukaj miejsc, które pozostają wysoce konserwatywne i nie mają homologii z ludzkim genomem (inne parametry BLAST pozostają niezmienione). Wybierz co najmniej dwie lokalizacje, aby zaprojektować syntetyczny przełącznik zaczepu na palcach.
  2. Użyj kryteriów wyboru Deiman et al.27, aby wygenerować pary starterów amplifikacji opartych na sekwencji kwasów nukleinowych do przodu i do tyłu dla każdego kandydującego regionu amplifikacji. Krótko mówiąc, postępuj zgodnie z następującymi kryteriami projektowania podkładów: (1) zawartość GC między 40%-60%; (2) o długości od 20 do 24 nt i temperaturze topnienia DNA powyżej 41 °C; (3) brak serii czterech lub więcej identycznych nukleotydów; (4) końcowy nukleotyd 3' jest zasadą A; (5) niska struktura drugorzędowa startera i prawdopodobieństwo tworzenia dimerów. Przesiać 8-10 par starterów dla każdego regionu docelowego (zalecane).
  3. Dołącz sekwencję prefiksu zawierającą sekwencję promotora T7 AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG (podkreślona sekwencja promotora T7) do końca 5' starterów do przodu, aby umożliwić transkrypcję amplikonów przy użyciu polimerazy RNA T7 (RNAP). Zamów startery jako oligonukleotydy DNA w firmie zajmującej się syntezą DNA.

2. Obliczeniowy projekt przełączników toehold

  1. Zainstaluj NUPACK28 wersja 3.2 (pakiet do projektowania kwasów nukleinowych) w oparciu o instrukcje na stronie internetowej29. Użyj systemu operacyjnego UNIX i MATLAB (platforma obliczeń numerycznych) jako języka programowania (zalecane).
  2. Zidentyfikuj sekwencje docelowe (np. genom wirusa) specyficzne dla patogenu będącego przedmiotem zainteresowania dla konstrukcji przełącznika palcowego, jak w kroku 1.1. Wybierz docelowe sekwencje wirusa Zika z amplikonów opartych na sekwencjach kwasów nukleinowych wygenerowanych w kroku 1.2.
    UWAGA: W praktyce najpierw można zaprojektować i przetestować startery amplifikacyjne oparte na sekwencjach kwasów nukleinowych lub syntetyczne przełączniki palcowe, w zależności od potrzeb użytkowników. Jeśli określone obszary docelowe zainteresowania zostały już ustalone (np. na podstawie istniejących publikacji lub protokołów diagnostycznych), najpierw może nastąpić zaprojektowanie przełącznika toehold i badanie przesiewowe, a następnie zaprojektowanie i badanie przesiewowe starterów amplifikacyjnych opartych na sekwencji kwasów nukleinowych. Jeśli nie ma ustalonych regionów docelowych, najpierw przeprowadź badanie przesiewowe starterów amplifikacji opartych na sekwencji kwasów nukleinowych w stosunku do pełnego genomu, aby zawęzić wybrane cele podczas selekcji pod kątem wydajności amplifikacji starterów. Jeśli dostępnych jest wiele sekwencji patogenu, najlepiej jest zaprojektować startery amplifikacji oparte na sekwencjach kwasów nukleinowych, które koncentrują się na wysoce konserwatywnych regionach (zamiast przesiewać cały genom).
  3. Pobierz i zainstaluj wymagane oprogramowanie MATLAB na komputerze.
  4. Skonfiguruj zmienne środowiskowe, aby umożliwić wywoływanie funkcji zestawu projektowania kwasów nukleinowych w oprogramowaniu. Aby to zrobić, otwórz oprogramowanie, a następnie otwórz (lub utwórz) plik startup.m w domyślnym folderze roboczym. Następnie skopiuj następujące wiersze kodu do pliku startup.m, a na koniec dodaj folder zawierający pliki binarne pakietu projektowania kwasów nukleinowych do PATH:
    NUPACKINSTALL = '/Użytkownicy/[user_name]/.../nupack3.2.2';
    setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
    setenv('ŚCIEŻKA',[getenv('ŚCIEŻKA'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]);
  5. Otwórz oprogramowanie platformy obliczeń numerycznych i przejdź do folderu oprogramowania do projektowania. Uruchom algorytmy projektowania dostępne pod adresem https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN.
  6. Wprowadź sekwencje docelowe do design_input_file.csv znajdującej się w podfolderze wejściowym. Dane wejściowe obejmują nazwę, sekwencję zewnętrzną, sekwencję wewnętrzną, temperaturę, nazwę wyjścia i sekwencję wyjściową, zgodnie z definicją w tabeli 1. Jeśli nie określono jeszcze miejsc zalewania dla celu, należy zachować te same sekwencje wewnętrzne i zewnętrzne. Tylko pierwsze 29 nt reportera będzie brane pod uwagę w procesie projektowania. Po zakończeniu zapisz i zamknij zaktualizowany arkusz kalkulacyjny.
    UWAGA: Sekwencja wyjściowa to sekwencja białka reporterowego, które ma być użyte w teście (np. lacZ). Określenie sekwencji wewnętrznej i zewnętrznej gwarantuje, że algorytm nie wygeneruje syntetycznych przełączników toehold, które nakładają się na którykolwiek ze starterów. Zapewnia również, że test rozpoznaje trzy unikalne miejsca w genomie wirusa Zika, aby poprawić jego specyficzność.
  7. Wybierz parametry, które mają być używane dla funkcji obliczeniowej: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, opcje). Wypełnij wartości parametrów w następujący sposób:
    1. num_designs - liczba najlepszych projektów dla każdego docelowego wyjścia przez oprogramowanie. Wartość domyślna to 6 i można ją zmienić w razie potrzeby (zalecane jest co najmniej sześć wzorów dla każdego celu).
    2. input_file — ten parametr określa nazwę pliku, który dostarcza informacje o sekwencji wejściowej. Wartość domyślna to "design_input_file.csv" i można ją zmienić w razie potrzeby.
    3. Wybierz jedną z następujących opcji - (1) Seria A i Seria B: wersja przełącznika toehold, którą zostanie wygenerowany przez kod. Ustaw SeriesB na 1 i SeriesA na 0, aby wygenerować przełącznik toehold serii B, który jest formatem używanym w diagnostic6; (2) Równolegle: ustawione na 1, aby wykorzystać wiele rdzeni do obliczeń projektów; w przeciwnym razie ustaw wartość 0; (3) Antysens: ustawiony na 1, aby wygenerować przełączniki zbieżne, które hybrydyzują sekwencję antysensowną (tj. odwrotne dopełnienie) docelowego wejścia; w przeciwnym razie ustaw wartość 0.
  8. Uruchom funkcję projektowania przy użyciu wybranych parametrów: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). Algorytm zacznie następnie generować projekty przełączników toehold dla interesujących Cię celów.
  9. Po zakończeniu projektowania zlokalizuj sekwencje projektowe przełącznika górnego uchwytu palcowego i odpowiadające im sekwencje docelowe w folderze final_designs w postaci arkuszy kalkulacyjnych w formacie .csv. Sekwencje DNA przełącznika palca wygenerowane przez algorytm będą zawierać sekwencję promotora T7 na końcu 5' i konserwatywną sekwencję łącznika 21 nt AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG na końcu 3'.
  10. Przesiewaj powstałe sekwencje konstrukcyjne przełącznika górnego palca pod kątem innych powszechnych wirusów, umieszczając je w NCBI-BLAST i sprawdzając homologię sekwencji. Akceptuj sekwencje z homologią 40% lub mniejszą.
  11. Uporządkuj sekwencje spinki do włosów przełącznika palców jako oligonukleotydy DNA, a następnie złóż je z genem reporterowym w pełni funkcjonalne przełączniki. Zamów niezbędne startery PCR do późniejszego montażu czujnika w zależności od wybranego białka reporterowego.

parametrdefinicja
nazwaPożądane nazwy sekwencji przełączników wyjściowych typu toehold.
Sekwencja zewnętrznaPełna transkrypcja NASBA uzyskana z amplifikacji.
Sekwencja wewnętrznaSekwencja zewnętrzna z wyłączeniem miejsc wiązania startera. Jest on zgodny z sekwencją zewnętrzną, ale wyklucza części transkryptów, które wiążą się ze starterami do przodu i do tyłu.
temperaturaTemperatura używana przez algorytmy do obliczania struktur RNA.
Nazwa wyjściowaNazwa genu wyjściowego (np. lacZ, gfp).
Sekwencja wyjściowaSekwencja genu wyjściowego.

Tabela 1: Definicja każdego parametru używanego w oprogramowaniu do projektowania przełączników typu toehold.

3. Budowa przełączników typu toehold metodą PCR

UWAGA: Te kroki opisują budowę przełączników LacZ za pomocą nakładania się PCR. Tutaj oligo DNA jest używany jako starter do przodu, a terminator T7 jest używany jako starter odwrotny. Używamy plazmidu pCOLADuet-LacZ jako matrycy dla genu lacZ (addgene: 75006). Wszelkie inne matryce DNA, które zawierają odpowiednią sekwencję, mogą być użyte jako matryce, pod warunkiem, że terminator T7 jest zawarty w ostatecznym konstrukcie.

  1. Po otrzymaniu syntetycznych oligonukleotydów DNA od dostawcy komercyjnego należy przygotować roztwory syntetycznego DNA i startera do odwrotnej amplifikacji w stężeniu 10 μM w wodzie wolnej od nukleaz. Zebrać reakcje w probówkach PCR na lodzie zgodnie z tabelą 2.
    UWAGA: Woluminy PCR można skalować w zależności od potrzeb. Użyj minimalnej ilości (0,1-1 ng) matrycy DNA pCOLADuet-LacZ, aby uniknąć konieczności dodatkowego etapu usuwania plazmidu lub sygnału LacZ w tle. W przypadku większych ilości matryc DNA należy postępować zgodnie z PCR z trawieniem enzymu restrykcyjnego DpnI, aby usunąć pozostałą matrycę plazmidu.
  2. Umieść reakcje w termocyklerze, postępując zgodnie z warunkami cyklicznymi wymienionymi w tabeli 3. Przeanalizuj produkty PCR na żelu agarozowym (Rysunek 2; patrz Protokół Uzupełniający i30).
  3. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR opartego na kolumnie wirowej i eluuj DNA w 15-30 μl wody wolnej od nukleaz, zgodnie z instrukcjami producenta. Określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru.

składnikgłośnośćkoncentracja
5X bufor reakcyjny Q510 μL1x
10 mM dNTP1 μL200 μM
10 mM Forward Primer (syntetyczny przełącznik DNA FW)2,5 μl0,5 μM
10 mM Reverse Primer (terminator T7 RV)2,5 μl0,5 μM
Matrycowy DNA (pCOLADuet-LacZ)zmienna<1 ng
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności0,5 μL0,02 U/μL
Woda wolna od nukleazdo 50 μL-

Tabela 2: Komponenty PCR używane do budowy przełączników typu toehold.

KroktemperaturaGodzina
Początkowa denaturacja98 °C30 sekund
35 cyklidenaturacja98 °C10 sekund
Wyżarzanie60 °C20 sekund
rozszerzenie72 °CCzas trwania: 1,45 min
Końcowe rozszerzenie72 °CCzas trwania: 5 min
Przytrzymaj4 °C-

Tabela 3: Warunki cykliczne stosowane podczas budowy przełączników typu toehold metodą PCR.

4. Przygotowanie celu syntetycznego RNA (Trigger)

  1. Korzystając z oprogramowania do projektowania biologii molekularnej, zmodyfikuj matryce syntetycznego wyzwalającego RNA (wybrane w kroku 1.1), aby zawierały sekwencję promotora T7 przed etapem, upewniając się, że pełna matryca pozostaje krótka (<200 pz). Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu, aby wzmocnić starter sekwencji wyzwalającej (dla sekwencji oligo, patrz Protokół dodatkowy).
  2. Uporządkuj sekwencje jako oligonukleotydy DNA. Po otrzymaniu rozpuść syntetyczne DNA wyzwalające i startery amplifikacyjne do 10 μM w wodzie wolnej od nukleaz. Zebrać odpowiednie PCR w cienkościennych probówkach na lodzie zgodnie z tabelą 2 i użyć 0,5 μl ultrameru wyzwalającego DNA (końcowe stężenie 0,1 μM) jako matrycowego DNA.
  3. Umieść reakcje w termocyklerze i użyj warunków cyklicznych wymienionych w tabeli 3. Użyj czasu przedłużenia 15 s. Oceń jakość i oczyść produkty PCR wyzwalające zgodnie z opisem w kroku 3.3 i protokole dodatkowym.
    UWAGA: Aby przyspieszyć ten proces, produkty PCR z oczyszczonymi kolumnami mogą być również bezpośrednio używane do wstępnego przesiewania przełącznika palca
    4. .

5. Transkrypcja in vitro wybranych sekwencji wyzwalających

  1. Składniki reakcyjne montować na lodzie zgodnie z tabelą 4.
  2. Inkubować reakcje transkrypcji invitro (IVT) w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, a następnie poddać działaniu DNazy I w celu usunięcia matrycowego DNA. W przypadku etapu DNazy I dodać 70 μl wody wolnej od nukleaz, 10 μl 10x buforu DNazy I i i 2 μl DNazy I (bez RNaz) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Jeśli nie przejdziesz natychmiast do kroku 5.4, dezaktywuj DNazę I z dodatkiem 50 mM EDTA i podgrzej inaktywację w temperaturze 65 °C przez 10 minut.
  3. Opcjonalny krok: Przeprowadzić analizę elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (np. mocznik-PAGE) na produktach IVT w celu oceny jakości RNA, jak opisano w protokole dodatkowym.
  4. Oczyść wyzwalające produkty IVT za pomocą zestawu do czyszczenia RNA opartego na kolumnach zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie określ ilościowo stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometrii. Patrz Protokół uzupełniający, aby uzyskać instrukcje dotyczące określania molowości i liczby kopii/μL RNA.
składnikgłośnośćkoncentracja
10X bufor reakcyjny1,5 μL0,75x
Mieszanka 25 mM NTP6 μL7,5 mM
DNA wyzwalacza matrycyX μL1 μg
Mieszanina polimerazy RNA T71,5 μL-
Woda wolna od nukleazX μLDo 20 μL

Tabela 4: Transkrypcja in vitro (IVT) wybranych sekwencji wyzwalających.

6. Wstępna kontrola przełączników

UWAGA: Ta sekcja opisuje kroki związane z ustawianiem bezkomórkowych, papierowych reakcji na zaczepy na palce, oraz jak sprawdzić przełączniki o wysokiej wydajności. Zablokowana bibuła filtracyjna BSA użyta w kroku 6.10 powinna być przygotowana z wyprzedzeniem, jak opisano w protokole dodatkowym.

  1. Przygotować roztwór podstawowy CPRG, rozpuszczając 25 mg proszku w 1 ml wody wolnej od nukleaz. Roztwór należy zawsze przechowywać na lodzie i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania.
  2. Określ liczbę reakcji do skonfigurowania. Dla każdego ocenianego przełącznika podsłuchu należy uwzględnić kontrolę bez matrycy (bez przełącznika i bez docelowego RNA - inaczej znaną jako kontrola bez samej komórki), aby uwzględnić wszelkie sygnały tła, które mogą powstać z miksu głównego. Uwzględnij kontrolę tylko przełącznika, aby ocenić nieszczelność przełącznika tła lub wskaźnik wyłączania w przypadku braku docelowego RNA.
  3. Sporządzić bezkomórkową mieszaninę wzorcową reakcji roztworu A, roztworu B, inhibitora RNazy i CPRG na lodzie zgodnie ze standardowym protokołem wymienionym w tabeli 5.
    UWAGA: Opisane tutaj kroki dotyczą mieszanki wzorcowej, która będzie wystarczająca do trzykrotnego zestawu 1,8 μl reakcji z dodanymi 10% objętością, aby uwzględnić błąd pipetowania. Objętość mieszanki głównej należy dostosować w razie potrzeby w zależności od liczby ekranowanych przełączników typu toehold.
  4. Dla każdej potrójnej reakcji bezkomórkowej należy dozować mieszaninę wzorcową do probówki do PCR, trzymając wszystkie probówki na lodzie. W przypadku probówki odłożonej na bok jako sama kontrola bezkomórkowa, dodaj wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 5,84 μl, wymieszaj pipetując w górę iw dół i krótko odwiruj. Do pozostałej części probówek dodać oczyszczone DNA przełącznika palca u nogi PCR do końcowego stężenia 33 nM.
  5. W przypadku probówek odłożonych na bok jako samodzielne elementy sterujące, dodaj wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 5,84 μl. W przypadku probówek odłożonych na bok do badania kombinacji przełącznika palcowego i docelowego RNA, dodać transkrybowany in vitro docelowy RNA do końcowego stężenia 1 μM. Następnie dodaj wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 5,84 μl. Dokładnie wymieszaj wszystkie reakcje, pipetując w górę i w dół, i krótko odwiruj.
  6. Dodaj 30 μl wody wolnej od nukleaz do studzienek otaczających dołki reakcyjne na 384-dołkowej czarnej płytce z przezroczystym dnem. Minimalizuje to parowanie w trakcie eksperymentu i poprawia odtwarzalność.
    UWAGA: Jeśli korzystasz z przenośnego czytnika płytek, umieść folię PCR na płytce i użyj precyzyjnego noża, aby wyciąć dołki przeznaczone do reakcji, a także każdy z czterech dołków narożnych. Folia PCR zapobiega prześwietleniu kamery przenośnego czytnika płytek z pustych studzienek.
  7. Za pomocą stemple do biopsji o średnicy 2 mm i pęsety przeciąć krążki z bibuły filtracyjnej zablokowane przez BSA i umieścić je w studzienkach reakcyjnych, wysuwając dziurkacz lub używając pęsety (patrz Protokół uzupełniający dotyczący przygotowania bibuły filtracyjnej z zatkanym BSA). Dozować trzykrotnie 1,8 μl objętości z każdej probówki reakcyjnej na krążki z bibuły filtracyjnej w płytce 384-dołkowej, utrzymując wszystkie próbki, jak również płytkę 384-dołkową, na lodzie przez cały czas.
    UWAGA: W przypadku korzystania z przenośnego czytnika płytek dodaj 1,8 μl CPRG (0,6 mg/ml) do każdego z czterech rogów płytki 384-dołkowej. Żółty kolor z CPRG zapewnia rozpoznawanie wzorca przez przenośny czytnik płytek w celu wyrównania cyfrowego szablonu płytki wielodołkowej w analizie obrazu. Przykryj dołki płytki folią PCR, aby zapobiec parowaniu.
  8. Umieścić płytkę w czytniku płytek, odczytywać OD570 w temperaturze 37 °C co minutę przez 130 minut.

.
składnikgłośnośćStężenie końcowe na reakcję
Rozwiązanie A2,38 μl40 proc
Rozwiązanie B1,78 μl30%
Inhibitor RNazy0,03 μl0,5% v/v
CPRG (25 mg/ml)0,14 μl0,6 mg/ml
Przełącznik palcowyX μL33 nM
Docelowy RNAX μL1 μM
Woda wolna od nukleazdo 5,94 μL-
Całkowita objętość:5,94 μl

Tabela 5: PURExpress bezkomórkowe składniki reakcji transkrypcyjno-translacyjnej.

7. Identyfikacja wysokowydajnych przełączników zaczepowych

UWAGA: Ta sekcja opisuje, jak analizować dane z kroku 6 w celu wybrania najlepiej działających przełączników do dalszego działania.

  1. Rozpocznij analizę danych, najpierw normalizując absorbancję OD570 do tła. Aby to zrobić, odejmij pomiary OD570 reakcji, które nie mają żadnego przełącznika ani docelowego RNA (tj. Same studzienki bezkomórkowe) od innych pomiarów OD570.
  2. Wygładź znormalizowane dane za pomocą trzypunktowej średniej ruchomej i dostosuj minimalną wartość każdego dołka do zera. Zobacz Rysunek 3 dla przykładu znormalizowanych danych o przebiegu czasu zebranych dla przełączników 27B, 33B i 47B.
  3. Korzystając z tych przetworzonych danych, oblicz zmianę zagięcia (lub współczynnik ON/OFF), określając różnicę w szybkości zmiany koloru (tj. zmiany OD570 w czasie) między przełącznikiem toehold a dołkami docelowymi i samymi przełącznikami (patrz Protokół dodatkowy do obliczania stosunku; Rysunek 4).
  4. Wybierz przełączniki z najwyższą zmianą zagięcia ON/OFF w celu dalszej charakterystyki. Pomiń słabo działające przełączniki podtrzymania palców, które wyświetlają najniższą zmianę zagięcia.

8. Badania przesiewowe i czułość starterów amplifikacji opartych na sekwencji kwasów nukleinowych

UWAGA: W następujących krokach najpierw przeprowadza się badanie przesiewowe funkcjonalnych izotermicznych starterów amplifikacyjnych, a następnie ocenia się ich czułość poprzez określenie liczby docelowych kopii RNA na μL syntetycznego RNA, które dany przełącznik palcowy może niezawodnie wykryć w połączeniu z amplifikacją izotermiczną. Po amplifikacji izotermicznej przeprowadź reakcje bezkomórkowe, aby zidentyfikować udane zestawy starterów amplifikacji oparte na sekwencji kwasów nukleinowych. Jednak bardziej opłacalne może być zastosowanie żeli poliakrylamidowych lub agarozowych w reakcjach amplifikacji opartych na sekwencji kwasów nukleinowych, aby najpierw zawęzić pulę kandydujących zestawów starterów. W takim przypadku zestawy starterów amplifikacji oparte na sekwencji kwasów nukleinowych, które generują pasmo na żelu o odpowiednim rozmiarze amplikonu, mogą zostać umieszczone na krótkiej liście do późniejszych badań przesiewowych bez komórek.

  1. Sporządzić roztwór podstawowy o stężeniu 25 μM ze wszystkich zestawów starterów do przodu i do tyłu w wodzie wolnej od nukleaz (patrz protokół dodatkowy). Określ liczbę reakcji amplifikacji opartych na sekwencji kwasów nukleinowych i następujących po nich reakcji bezkomórkowych, które należy skonfigurować. Będzie to zależało od liczby przełączników toehold i odpowiednich zestawów starterów.
    UWAGA: Podczas przesiewania starterów ważne jest, aby zawsze dołączać kontrolkę bez szablonu dla każdego zestawu starterów, aby uwzględnić wszelkie artefakty tła, które mogą powstać z powodu niespecyficznego wzmocnienia związanego ze starterem.
  2. Ustaw jedną reakcję 5 μl w następujący sposób (skaluj to w razie potrzeby). Rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie. Zebrać główną mieszaninę reakcji buforu reakcyjnego, mieszaniny nukleotydów i inhibitora RNazy zgodnie z tabelą 6. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, aż biały osad zostanie rozpuszczony, a następnie dozować porcje do probówek PCR.
    1. Jeśli mieszanka główna jest przeznaczona do badania przesiewowego starterów amplifikacyjnych opartych na sekwencji kwasów nukleinowych, należy najpierw wykluczyć startery z mieszanki głównej (dozować 2,55 μl mieszanki głównej). W przeciwnym razie, jeśli przeprowadzana jest analiza wrażliwości podkładu, startery można dodać do mieszanki głównej (w takim przypadku należy dozować 2,75 μl podwielokrotności). Dodaj mieszaninę enzymów po etapach denaturacji i równoważenia.
  3. W przypadku badań przesiewowych starterów amplifikacyjnych opartych na sekwencji kwasów nukleinowych, dodaj startery do przodu i do tyłu do odpowiednich probówek. Na termocyklerze ustaw protokół inkubacji zgodnie z opisem w tabeli 7.
  4. Dodaj 1 μl wody wolnej od nukleaz lub 1 μl docelowego wyzwalającego RNA w temperaturze 2 pM lub około 106 kopii/μl, upewniając się, że probówki są odpowiednio oznaczone. Wymieszać delikatnie pipetując i krótko odwirować probówki.
    UWAGA: Do badań przesiewowych zestawu starterów należy użyć stężenia docelowego RNA wyzwalającego, które jest wystarczająco wysokie, aby nie wpływać na dolną granicę wykrywalności metody amplifikacji izotermicznej, ale nie wystarczająco wysokie, aby zapewnić aktywację przełącznika toehold, jeśli nie wystąpiłaby amplifikacja.
  5. Przenieś probówki do termocyklera i rozpocznij inkubację. Po 12 minutach wyjmij probówki i dodaj 1,25 μl mieszanki enzymów do każdej probówki. Mieszać pipetując w górę i w dół i krótko odwirować probówki.
    UWAGA: W tym momencie probówki można przechowywać w temperaturze pokojowej; Jednak mieszanina enzymów powinna być przechowywana na lodzie do czasu dodania do probówek.
  6. Umieścić probówki z powrotem w termocyklerze, pomijając etap podtrzymania 41 °C, aby rozpocząć 1-godzinną inkubację reakcji.
    UWAGA: Po inkubacji reakcje można umieścić na lodzie w celu przetworzenia tego samego dnia lub zamrozić w temperaturze -20 °C w celu późniejszego przetworzenia.
  7. Wykonaj kroki 6.2-6.7 i Tabelę 8, aby zebrać papierowe, bezkomórkowe reakcje przełącznika palcowego w celu oceny wydajności startera. Analizuj dane zgodnie z opisem w krokach 7.1-7.2 i Rysunek 3.
    UWAGA: Oprócz wcześniej wymienionych kontroli, ważne jest, aby uwzględnić również kontrolę ujemną, aby uwzględnić wszelkie sygnały tła, które mogą powstać w wyniku reakcji. Dodatkowo ważne jest, aby uwzględnić również kontrolę z przełącznikiem i 2 pM (stężenie końcowe) docelowego RNA, jako kontrolę amplifikacji bez NASBA.
  8. Zidentyfikuj potencjalne pary starterów, aby przejść do przodu z analizą wrażliwości. Pary starterów są wybierane na podstawie tego, czy aktywacja przełącznika toehold następuje po dodaniu inkubowanej reakcji. W razie potrzeby powtórz przesiewanie podkładu z większą liczbą kombinacji podkładów.
  9. Trzymając próbki RNA na lodzie przez cały czas, należy wykonać następujący zestaw seryjnych rozcieńczeń docelowych RNA w wodzie wolnej od nukleaz: 104, 103, 102, 101 i 100 kopii RNA/μL. Powtórz amplifikację opartą na sekwencji kwasów nukleinowych i reakcje bezkomórkowe z wybranymi zestawami starterów (kroki 8.2-8.7), testując serię seryjnych rozcieńczeń w celu zidentyfikowania zestawów starterów, które zapewniają najlepszą czułość. Zobacz Rysunek 5 dla przykładu wyników określania czułości zestawu starterów.
    UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby wybrany przełącznik palcowy i para starterów wykrywały zaledwie 1-100 docelowych kopii RNA na μl RNA (stężenie roztworu podstawowego).
  10. Powtórz eksperyment czułości amplifikacji opartej na sekwencji kwasów nukleinowych w potrójnym biologicznym trilikacie. Ten krok służy potwierdzeniu odtwarzalności wyników przed przejściem do eksperymentów na próbkach od pacjentów.
  11. Opcjonalnie: Aby mieć wiarygodne źródło DNA przełącznika do długotrwałego użytku i transportu, należy sklonować wybrane sekwencje przełącznika do plazmidu przy użyciu dowolnej konwencjonalnej metody klonowania. Podobnie, docelowa sekwencja wyzwalającego RNA może być również sklonowana do wybranego plazmidu do przechowywania.
składnikObjętość na reakcjęStężenie końcowe
Bufor reakcyjny NASBA1,67 μl1x
Mieszanka nukleotydów NASBA0,833 μl1x
Podkład 25 μM do przodu0,1 μl0,5 μM
Podkład odwrotny 25 μM0,1 μl0,5 μM
Inhibitor RNazy (40 U/μL)0,05 μL0,4 U/μL
Docelowy RNA1 μL
Mieszanka enzymów NASBA1,25 μL1x
Całkowita objętość5 μL

Tabela 6: Składniki reakcji NASBA.

.
kroktemperaturaGodzina
denaturacja65 °CCzas trwania: 2 min
Równowagi41 °CCzas trwania: 10 min
trzymać41 °C∞
Inkubacja41 °C1 godz
trzymać4 °C-

Tabela 7: Warunki reakcji dla NASBA.

.
składnikgłośnośćStężenie końcowe na reakcję
Rozwiązanie A2,38 μl40 proc
Rozwiązanie B1,78 μl30%
Inhibitor RNazy0,03 μl0,5% v/v
CPRG (25 mg/ml)0,14 μl0,6 mg/ml
Przełącznik palcowyX μL33 nM
Docelowe RNA (jeśli dotyczy)X μL1 μM
NASBA (jeśli dotyczy)0,85 μl1:7
Woda wolna od nukleazdo 5,94 μL-
Całkowita objętość:5,94 μl

Tabela 8: Papierowe składniki reakcji bezkomórkowej.

9. Pobieranie próbek od pacjentów i ekstrakcja wirusowego RNA

UWAGA: Ta sekcja opisuje protokół pobierania próbek od pacjentów i ekstrakcji RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA. Poniższy protokół służy do pozyskiwania surowicy z krwi obwodowej. Próbki użyte w tym badaniu zostały pobrane od pacjentów z gorączką, wysypką, bólem stawów lub innymi powiązanymi objawami infekcji arbowirusem w stanie Pernambuco w Brazylii.

  1. Pobranie próbek krwi obwodowej od pacjentów z podejrzeniem zakażenia arbowirusem. Wykonaj nakłucie żyły (probówkę z krwią pełną) przy użyciu standardowej techniki aseptycznej. Oznacz probówki z próbkami anonimowym kodem i datą pobrania próbki.
  2. Odwirować krew w celu oddzielenia surowicy w ilości 2 300 x g przez 10 minut. Za pomocą pipety przygotować porcje surowicy (200 μl), które zostaną użyte do ekstrakcji RNA w probówkach o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Jeśli nie jest możliwe przeprowadzenie ekstrakcji RNA wkrótce po pobraniu próbki, próbki surowicy należy przechowywać w temperaturze -80 °C przed dalszymi aplikacjami.
  3. Odpipetować 560 μl przygotowanego buforu AVL (bufor do lizy wirusa) zawierającego nośnik RNA do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 140 μl surowicy do mieszaniny buforu AVL/nośnego RNA w probówce. Mieszać przez wirowanie pulsacyjne przez 15 sekund.
  4. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie krótko odwirować próbkę w celu zebrania zawartości na dnie probówki. Dodać 560 μl etanolu (96%-100%) do próbki i mieszać przez wirowanie impulsowe przez 15 s. Po wymieszaniu odwirować próbkę, aby zebrać zawartość na dnie probówki.
  5. Ostrożnie dodać 630 μl roztworu z kroku 9.4 do kolumny wirowej, nie zwilżając obręczy. Wykonując ten krok, zamknij nakrętkę i odwiruj przy 6 000 x g przez 1 minutę. Umieścić kolumnę wirową w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić zużytą probówkę zbiorczą zawierającą filtrat.
  6. Ostrożnie otwórz kolumnę wirującą i powtórz krok 9.5. Ostrożnie otworzyć kolumnę wirową i dodać 500 μl buforu AW1 (bufor do płukania 1). Zamknij nakrętkę i odwiruj przy 6 000 x g przez 1 minutę. Umieścić kolumnę wirową w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić zużytą probówkę zbiorczą zawierającą filtrat.
  7. Ostrożnie otworzyć kolumnę wirową i dodać 500 μl buforu AW2 (bufor płuczący 2). Zamknij nakrętkę i odwiruj przy 20 000 x g przez 3 minuty. Umieścić kolumnę wirową w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić zużytą probówkę zbiorczą zawierającą filtrat.
  8. Aby uniknąć zanieczyszczenia resztkowym buforem AW2, który mógłby powodować problemy w dalszych reakcjach enzymatycznych, należy umieścić kolumnę wirową w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić zużytą probówkę zbiorczą wraz z filtratem. Wirować przy 20 000 x g przez 1 min.
  9. Umieść kolumnę wirową w czystej probówce o pojemności 1,5 ml i wyrzuć zużytą probówkę zbiorczą wraz z filtratem. Ostrożnie otworzyć kolumnę wirową i dodać 60 μl buforu AVE (buforu elucyjnego) w zrównoważeniu do temperatury pokojowej. Wykonując ten krok, zamknij nakrętkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
  10. Wirować przy 6 000 x g przez 1 min. Uwolniony RNA może być następnie wykorzystany jako dane wejściowe dla równoległych NASBA i RT-qPCR.
  11. Wykonaj kroki od 8.3 do 8.11, aby przeprowadzić amplifikację opartą na sekwencji kwasów nukleinowych i reakcje bezkomórkowe na papierze przy użyciu 1 μl wyekstrahowanego RNA pacjenta, upewniając się, że obejmują one negatywne i pozytywne reakcje kontrolne. Po przeprowadzeniu reakcji należy przygotować 384-dołkową płytkę reakcyjną i uruchomić test w przenośnym czytniku płytek w temperaturze 37 °C (patrz szczegóły w protokole dodatkowym).
    UWAGA: Dwa stężenia RNA 104 i 102 PFU/ml, wyekstrahowane z hodowlanego wirusa Zika, są używane jako kontrole pozytywne we wszystkich eksperymentach podczas walidacji klinicznej. Oprócz wcześniej wymienionych kontroli ważne jest, aby uwzględnić również wskaźnik spustowy (10 ng/μl) jako kontrolę dodatnią.
  12. Na koniec każdego eksperymentu surowe dane (plik .csv) z czytnika płyt można przesłać do bezpiecznej bazy danych online. Dodatkowo przenośny czytnik płytek generuje raport wskazujący, czy próbki są dodatnie, czy ujemne na obecność wirusa Zika (Rysunek 6); zobacz sekcję reprezentatywnych wyników, aby zapoznać się z przykładami wszystkich wykresów uzyskanych podczas inkubacji (Rysunek 7).
    UWAGA: Użytkownicy mogą również przesyłać pliki z przenośnego czytnika płytek na własny komputer przez USB.

10. Przenośny czytnik płytek

  1. Przenośny czytnik płytek (Rysunek 8) może być używany jako alternatywa dla konwencjonalnego czytnika płytek24. W celu zapoznania się z protokołem i reprezentatywnymi wynikami zob. Protokół dodatkowy.

11. RT-qPCR do wykrywania wirusa Zika

UWAGA: Ta sekcja opisuje kroki, które należy wykonać, aby przeprowadzić test RT-qPCR do wykrywania wirusa Zika z próbek pobranych od pacjentów (patrz Protokół Uzupełniający).

  1. Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy zamontować komponenty RT-qPCR w miejscu odizolowanym od procesu amplifikacji (np. w czystym kapturze). Umieść bufor RT-qPCR, enzymy i starter/sondy na lodzie lub zimnym bloku. Następnie dodać reakcje do 384-dołkowej płytki na lodzie zgodnie z tabelą 9.
    UWAGA: Dla wszystkich eksperymentów zalecana jest kontrola ujemna (kontrola ekstrakcji i kontrola bez matrycy [NTC]) oraz kontrola pozytywna (104 PFU/ml).
  2. Po dodaniu odczynników do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, wymieszaj reakcję, pipetując w górę iw dół (nie wirować) i dozuj 6,5 μl do każdej studzienki. Dodać 3,5 μl każdej matrycy RNA w trzech powtórzeniach.
  3. Umieść folię PCR na wierzchu płytki. Odwirować 384-dołkową płytkę o masie 600 x g przez 2 minuty.
  4. Umieścić płytkę w maszynie RT-qPCR, stosując następujące warunki cykliczne opisane w Tabeli 10. Aby przeanalizować wyniki, należy skorzystać z oprogramowania do projektowania i analizy maszyny RT-qPCR i wziąć pod uwagę automatyczny próg i linię bazową (patrz szczegóły w Protokole Dodatkowym).
składnikgłośnośćkoncentracja
2X Sonda QuantiNova RT-PCR Master Mix5 μL1 X
Podkład 100 μM do przodu0,08 μl0,8 μM
100 μM Podkład odwrotny0,08 μl0,8 μM
Sonda 25 μM0,04 μl0,1 μM
QuantiNova ROX Barwnik referencyjny0,05 μL1 X
Sonda QuantiNova RT Mix0,1 μl1 X
Matryca RNA3,5 μl-
Woda wolna od nukleazdo 10 μL-

Tabela 9: Komponenty RT-qPCR do amplifikacji RNA wirusa Zika w oparciu o protokół Centers for Disease Control and Prevention-CDC USA do wykrywania wirusa Zika w próbkach pobranych od pacjentów31.

KroktemperaturaGodzina
Odwrotna transkrypcja45 °CCzas trwania: 15 min
Etap wstępnej aktywacji PCR95 °CCzas trwania: 5 min
45 cyklidenaturacja95 °C5 sekund
Kombinowane wyżarzanie/przedłużanie60 °C45 sekund

Tabela 10: Warunki cykliczne dla RT-qPCR.

Wyniki

Zgodnie z potokiem projektowania komputerowego, konstrukcja trzech przełączników typu toehold została przeprowadzona za pomocą PCR. Produkty PCR przeanalizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Rycina 2). Obecność wyraźnego prążka w okolicach 3 000 bp, co odpowiada mniej więcej wielkości genu lacZ sprzęgniętego z przełącznikiem toehold, zazwyczaj wskazuje na prawidłowy przebieg reakcji. Z kolei brak prążka w ścieżce, obecność wielu prążków lub prążka o niewłaściwej wielkości świadczy o niepowodzeniu reakcji PCR. W przypadku nieudanego PCR należy zoptymalizować warunki reakcji i/lub sekwencje starterów.

Zmontowane przełączniki typu toehold poddano przesiewowi, aby ocenić każdy sensor względem odpowiadającego mu transkrybowanego in vitro trigger RNA (Rycyna 3). Choć wszystkie trzy sensory wykazały zwiększoną absorbancję OD570, przełącznik 27B (Rycina 3A) charakteryzował się najszybszą szybkością aktywacji. Przełączniki 33B oraz, w mniejszym stopniu, 47B wykazały zwiększoną absorbancję OD570 w przypadku braku docelowego trigger RNA, co wskazuje, że przełączniki te posiadają pewną aktywność tła lub nieszczelność (Rycina 3B,C) – cechę niepożądaną w potencjalnym sensorze, ponieważ może ona obniżyć specyficzność. Aby dokładniej zidentyfikować sensor o najwyższym stosunku sygnału ON/OFF, obliczono krotność zmiany absorbancji OD570 (patrz sekcja 5 informacji uzupełniających) i przedstawiono ją na wykresie (Rycina 4). Z tej analizy jasno wynika, że przełącznik 27B jest sensorem o najlepszych parametrach, ze stosunkiem ON/OFF wynoszącym około 60.

Następnie oceniono czułość najlepiej działającego przełącznika toehold (27B), wyznaczając najniższe stężenie RNA wymagane do aktywacji przełącznika toehold w połączeniu z reakcją NASBA. Wykres pokazuje, że najskuteczniejsze sensory Zika mogą wykrywać RNA przy stężeniach tak niskich jak 1,24 cząsteczki na µL (co odpowiada ok. 2 aM; Rycina 5).

Po zidentyfikowaniu i walidacji przełącznika 27B, materiały sensorowe zostały przekazane członkom zespołu w Recife w stanie Pernambuco w Brazylii. W Brazylii oceniono kliniczną dokładność diagnostyczną platformy diagnostycznej wirusa Zika z wykorzystaniem próbek pobranych od pacjentów zakażonych wirusem Zika, równolegle z testem RT-qPCR w celu porównania wyników. Aby zwalidować papierową platformę diagnostyczną wirusa Zika, zastosowano przenośny czytnik płytek, który umożliwia inkubację oraz odczyt sygnału kolorymetrycznego sensorów papierowych. Zmiana barwy z żółtej na purpurową służy do identyfikacji próbki dodatniej, podczas gdy próbka ujemna pozostaje żółta (Rysunek 6). Dodatkową opcją wizualizacji wyników generowanych przez przenośny czytnik płytek (Rysunek 8) jest wykreślenie odpowiedzi kolorymetrycznej dla każdej reakcji na podłożu papierowym w funkcji czasu. Próbki badano w trzech powtórzeniach; te, które przekroczyły próg (czerwona linia ustawiona na 1), uznano za dodatnie, natomiast próbki poniżej progu uznano za ujemne (Rysunek 6 oraz Rysunek 7).

Na koniec, aby ocenić i porównać wydajność kliniczną sensora opartego na przełączniku toehold dla wirusa Zika z obecną złotą normą diagnostyki zakażeń tym wirusem, wszystkie próbki pacjentów przebadano równolegle metodą RT-qPCR. Wykres amplifikacji dwóch reprezentatywnych próbek pacjentów został wykonany w trzech powtórzeniach w celu wykrycia wirusa Zika za pomocą RT-qPCR (Rysunek 9). Próbki uznaje się za pozytywne, gdy wartość progu cyklu (Ct) wynosi ≤38; czerwona linia oznacza próbkę pozytywną, a niebieska linia próbkę negatywną pod kątem obecności wirusa Zika.

figure-results-1
Rysunek 2: Elektroforeza w żelu agarozowym w celu oceny jakości produktów PCR. Produkty PCR są analizowane w 1% żelu agarozowym w 1X TAE, przy napięciu 80 V przez 90 min. Pojedynczy wyraźny prążek zazwyczaj wskazuje na prawidłowy przebieg reakcji. Ścieżka 1: drabina DNA 1 kb; ścieżki 2-4: odpowiednio DNA przełącznika 27B, DNA wyzwalacza 33B i DNA wyzwalacza 47B. Liczby po lewej stronie reprezentują wielkość prążka w bp. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Prototypowanie trzech przełączników typu toehold dla papierowych czujników wirusa Zika. Wydajność trzech papierowych czujników opartych na RNA toehold switch mierzono w 37 °C przez ponad 130 min. Każny wykres zawiera dwa ślady: jeden reprezentuje kontrolę z samym przełącznikiem, a drugi przełącznik wraz z wyzwalaczem. Trzy wykresy przedstawiają dane uzyskane przy użyciu czujników toehold switch 27B (A), 33B (B) oraz 47B (C). Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej (SEM) z trzech powtórzeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 4: Najskuteczniejsze sensory zostają zidentyfikowane poprzez obliczenie krotności zmiany absorbancji przy 570 nm. Krotność zmiany (lub maksymalny stosunek ON/OFF) jest obliczana poprzez pomiar stosunku absorbancji (OD570) w 130 min między kontrolą zawierającą tylko przełącznik a testem CFPS z przełącznikiem i wyzwalaczem. Słupki błędu reprezentują SEM z trzech powtórzeń. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

figure-results-4
Rysunek 5: Ocena czułości najlepiej działającego przełącznika. In vitro transkrybowane RNA wirusa Zika jest miareczkowane do reakcji NASBA. Po 1 h inkubacji reakcje dodano do bezkomórkowych reakcji PURExpress na dyskach papierowych w stosunku 1:7. Wykreślono krotność zmiany po 130 min w 37 °C. Rysunek ten został powielony z24. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 6: Strona przechwytywania danych przenośnego czytnika płytek z załadowanym obrazem danych. Na tym rysunku przedstawiono przykładowy obraz końcowy zarejestrowany przez przenośny czytnik płytek podczas serii gromadzenia danych. Oryginalna sygnatura daty i godziny jest widoczna w górnej części obrazu. Kolor żółty oznacza reakcje kontrolne lub negatywne, a kolor fioletowy oznacza reakcję pozytywną. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 7: Tryb analizy danych. Po lewej stronie użytkownicy wybierają zestawy danych, które chcą wykreślić; następnie po prawej stronie wyświetlane są wykresy z unikalnymi kolorami dla każdej próbki lub zestawu kontrolnego. Czerwona przerywana linia służy jako próg wyznaczania próbek pozytywnych i negatywnych. Próbki badane w trzech powtórzeniach, które przekraczają próg, uznaje się za pozytywne, natomiast próbki poniżej progu uznaje się za negatywne. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (SD) z trzech powtórzeń. Ctrl 1 do Ctrl 5 oznacza kontrole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 8. PLUM, przenośny czytnik płytek. Ten przenośny czytnik płytek pełni funkcję przenośnego laboratorium i służy jako czytnik płytek z kontrolą temperatury do inkubacji i monitorowania reakcji kolorymetrycznych. To przenośne urządzenie umożliwia ilościowe i wysokoprzepustowe pomiary papierowych sensorów wirusa Zika bezpośrednio w miejscu badania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 9: Wykres RT-qPCR amplifikacji dwóch próbek pacjentów przebadanych w trzech powtórzeniach w celu wykrycia wirusa Zika. Próbki uznaje się za dodatnie, gdy wartość progu cyklu (Ct) wynosi ≤38. Czerwona przerywana linia służy jako próg wyznaczania próbek dodatnich i ujemnych. Czerwka krzywa oznacza próbkę dodatnią, a niebieska krzywa oznacza próbkę ujemną. Wartość ΔRn (delta Rn) reprezentuje znormalizowaną wielkość sygnału fluorescencji wykrytego przez urządzenie RT-qPCR dla wszystkich badanych próbek. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Uzupełniający plik z protokołem. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Ryciny uzupełniające. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać te ryciny.

Dyskusja

Opisany tutaj połączony system oparty na dokumentach papierowych może doprowadzić do klinicznie istotnej diagnostyki molekularnej, z wydajnością funkcjonalnie porównywalną z RT-qPCR, do punktu potrzebnego6. Co ważne, w przypadku ustawień zdalnych dostępność diagnostyki na miejscu może skrócić czas oczekiwania na wyniki z dni do godzin. Podkreślając programowalność tego podejścia, opisany potok może być wykorzystany do wykrywania praktycznie każdego celu patogenu. Połączyliśmy narzędzia molekularne ze specjalnie zaprojektowanym przenośnym czytnikiem płytek, który jest kompaktowy i kompatybilny z zasilaniem bateryjnym (8–9 godzin) oraz zapewnia wbudowaną analizę danych w celu umożliwienia aplikacji rozproszonych. W ramach innych prac przeprowadziliśmy walidację połączonego sprzętu i platformy diagnostycznej wirusa Zika z 268 próbkami pacjentów, równolegle z RT-qPCR, i uzyskaliśmy dokładność diagnostyczną na poziomie 98,5%24. Podsumowując, naszym celem jest umożliwienie transferu technologii tej platformy do naukowców, tak aby mogła ona zostać ponownie wykorzystana i ulepszona przez społeczność w celu zaspokojenia niezaspokojonych potrzeb diagnostycznych.

Proces projektowania przełącznika in silico toehold został zintegrowany i zautomatyzowany w potok, który można podzielić na trzy etapy. Pierwszy etap generuje pulę projektów przełączników toehold, które hybrydyzują z sekwencją docelową w jednym przyrostu nukleotydowym. Drugi etap bada strukturę wtórną i dostępność przełącznika podtrzymania palcowego oraz eliminuje czujniki z przedwczesnymi kodonami stop w ramie. Funkcja punktacji, która uwzględnia wiele czynników (np. poziom defektu przełącznika toehold, dostępność przełącznika toehold i dostępność miejsca docelowego), jest następnie implementowana w celu wyboru projektów przełączników górnego zaczepu na podstawie ogólnych wyników. W ostatnim etapie generowana jest lista sekwencji dla projektów przełączników górnego uchwytu palcowego i odpowiadających im docelowych wyzwalaczy. Sekwencje najlepszych czujników powinny być badane pod kątem swoistości wobec ludzkiego transkryptomu i blisko spokrewnionych genomów wirusowych przy użyciu NCBI/Primer-BLAST25. Najlepszą praktyką jest również badanie przesiewowe miejsc docelowych czujników pod kątem zachowania sekwencji w genomie wirusa Zika, aby zapewnić, że czujniki zapewnią szeroką i niezawodną detekcję. Opracowano kilka wersji oprogramowania do projektowania przełączników toehold, a algorytm projektowania pozwala użytkownikom na wygenerowanie dwóch wersji, przełączników toehold serii A6 lub serii B6. W tym artykule skupiono się na konstrukcji przełącznika palcowego serii B.

Po komercyjnej syntezie DNA, przełączniki palcowe mogą być szybko złożone, a następnie przetestowane, wykonując wstępne badanie przesiewowe pod kątem syntetycznej sekwencji wyzwalającej celu, która odpowiada krótkim regionom (200-300 nt) docelowego genomu. W celu sprawdzenia wydajności czujników opartych na przełączniku toehold idealnie jest dodać sekwencję docelową w postaci RNA. W tym artykule przedstawiono kroki wymagane do dodania transkrybowanego wyzwalającego RNA in vitro . Jeśli jednak są dostępne, można zastosować pełnowymiarowe matryce genomu, takie jak ilościowe ekstrakty wirusowego RNA lub komercyjne syntetyczne genomy lub standardy RNA. Wykorzystanie genomów RNA o pełnej długości do początkowego badania przesiewowego przełącznika palca u nogi jest korzystne, ponieważ może informować, czy dodatkowe czynniki, takie jak struktura drugorzędowa RNA, wpłyną na działanie czujnika. Aby zoptymalizować stosunek ON/OFF potencjalnych przełączników, DNA przełącznika palcowego można miareczkować do reakcji bezkomórkowej. Ten krok może również służyć do identyfikacji wysokowydajnych przełączników typu toehold (wzmocnienie fałdowe lub wysoki współczynnik ON/OFF) i pominięcia nieszczelnych przełączników toehold (wysoki sygnał przy braku docelowego RNA) na dalszych etapach charakteryzacji.

Aby poprawić granicę wykrywalności najskuteczniejszych kandydatów na przełączniki typu toehold, NASBA stosuje się w celu zwiększenia klinicznie istotnych stężeń docelowego RNA wirusa Zika do poziomu, który może być wykryty przez przełączniki toehold6. Różne kombinacje zestawów starterów do przodu i do tyłu są badane w celu określenia najlepszych kombinacji startera NASBA i przełącznika palcowego, aby umożliwić wykrywanie w klinicznie istotnych stężeniach. Po zidentyfikowaniu idealnej kombinacji zestawu starterów i przełącznika palcowego, test jest przekazywany do walidacji klinicznej. Ważne jest, aby pamiętać, że etapy przełącznika toehold i badań przesiewowych NASBA mogą być pracochłonne i zasobożerne, dlatego opracowywanie testów najlepiej nadaje się do dobrze wyposażonych ośrodków badawczych. Chociaż nie zastosowaliśmy automatyzacji procesów, jest prawdopodobne, że może to przyspieszyć iteracyjny cykl projektowania, budowania i testowania32. Na szczęście czas realizacji od zaprojektowania i przetestowania czujnika do wdrożenia może być niezwykle krótki (mniej niż tydzień), co czyni tę strategię idealną w sytuacjach krytycznych czasowo, takich jak wybuchy epidemii6.

Nawet po opracowaniu biosensora o klinicznie istotnej czułości istnieją wyzwania techniczne, którymi należy się zająć. Ponieważ protokół ten obejmuje obsługę ręczną i jest procedurą wieloetapową, istnieje ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami. Dokładamy wszelkich starań, aby zmniejszyć to ryzyko poprzez staranną praktykę laboratoryjną. W niedawnym badaniu klinicznym obejmującym 268 próbek pobranych od pacjentów nie napotkaliśmy żadnych problemów związanych z zanieczyszczeniem; Jest to jednak istotna kwestia24. Mając to na uwadze, protokół pozostaje testem laboratoryjnym i wymaga wykwalifikowanego użytkownika posiadającego wiedzę na temat odpowiednich technik biologii molekularnej. Dodatkowym czynnikiem branym pod uwagę przy wdrażaniu jest izolacja RNA od próbek pobranych od pacjentów. Tutaj opisujemy izolację RNA przy użyciu zestawów do ekstrakcji kwasów nukleinowych opartych na kolumnach. Jednak w innych pracach zademonstrowaliśmy skuteczną i prostą metodę lizy wrzenia (95 °C przez 2 minuty) do przetwarzania próbek od pacjentów o niskim obciążeniu6. Strategia ta prawie eliminuje koszty związane z ekstrakcją RNA i pozwala uniknąć stosowania zestawów do ekstrakcji kwasów nukleinowych opartych na kolumnach, co może stanowić wyzwanie logistyczne w warunkach niskich zasobów lub problemów z łańcuchem dostaw podczas kryzysów, takich jak pandemia COVID-1933.

Jak widzieliśmy podczas pandemii COVID-19, instrumenty używane do przeprowadzania RT-qPCR mogą same w sobie służyć jako wąskie gardło i ograniczać dostęp pacjentów do testów. Ten czynnik, który jest również w dużej mierze finansowy, prowadzi do scentralizowanego trybu testowania, który może ograniczyć dostęp diagnostyczny. Na przykład podczas wybuchu epidemii wirusa Zika w latach 2015/2016 w Brazylii dostępnych było tylko pięć krajowych laboratoriów referencyjnych, co spowodowało opóźnienia w testowaniu pacjentów. Nie biorąc pod uwagę potencjalnych korzyści wynikających z ekonomii skali, obecny koszt towarów dla przenośnego czytnika płytek wynosi ~500 USD, co nawet jeśli wzrosło pięciokrotnie w celu uwzględnienia marży pracy i handlowej, nadal zapewnia przystępne cenowo narzędzie. Wypada to dobrze w porównaniu z instrumentami RT-qPCR, których koszt waha się od 15 000 do 90 000 USD34. Co więcej, szacowany koszt testu bezkomórkowego w Ameryce Łacińskiej wynosi około 5,48 USD, podczas gdy koszt testu RT-qPCR w Brazylii wynosił ~10-11 USD w momencie wybuchu epidemii Zika36. Poza kosztem sprzętu, przenośny czytnik płytek ma niewielkie rozmiary (20 cm3), automatyczną analizę, przesyłanie danych do chmury przez Internet i może być zasilany bateryjnie. Funkcje te znacznie rozszerzają potencjalne ustawienia, w których można wdrożyć testy, a jednocześnie rozszerzają populację pacjentów, którzy mogą być obsługiwani.

Do tej pory najpopularniejszymi komercyjnymi platformami CFPS dla E. coli są systemy S30 i PURE37; Jednak kluczowym czynnikiem wpływającym na poprawę dostępu do diagnostyki w krajach o niskich i średnich dochodach jest ograniczona krajowa dostępność tych odczynników. Ważnym krokiem w kierunku rozwiązania tego problemu jest rozwój lokalnej produkcji CFPS. Laboratorium Federici poczyniło ostatnio znaczne postępy w kierunku opracowania niekomercyjnej platformy do wdrażania czujników opartych na przełącznikach toehold w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie, osiągając poziom 2,7 fM LOD z RNA14 wirusa Zika. Osiągnięcie to nie tylko pozwala na wytwarzanie odczynników w kraju użytkowania, unikając ceł importowych i opóźnień, ale koszty pracy można również skalować do stawek lokalnych, a tym samym można znacznie obniżyć całkowity koszt. W pracach przedstawionych przez grupę Federici koszt wytworzenia reakcji ekspresji CFPS (5 μl) w Chile wyniósł 6,9 centa (USD)35,38, co stanowi podwójną zachętę (poprawa logistyki i kosztów) do wdrożenia systemów opartych na lizacie 35,38.

Umieszczenie testów porównywalnych z RT-qPCR w rozproszonych sieciach diagnostycznych może przynieść znaczące korzyści w porównaniu z obecnymi praktykami, które są zależne od transportu próbek do scentralizowanych obiektów RT-qPCR. W warunkach podmiejskich, gdzie skoncentrowane były przypadki wirusa Zika, fizyczna odległość między pacjentem a placówką diagnostyczną spowalnia diagnozę i zwiększa ryzyko, że wyniki nie dotrą do pacjenta w klinicznie istotnym czasie. Mamy nadzieję, że zaprezentowane tu prace mogą przyczynić się do umożliwienia społeczności naukowej, poprzez transfer wiedzy, tworzenia zdecentralizowanych biotechnologii i przenośnego sprzętu do monitorowania zdrowia ludzkiego, rolnictwa i środowiska.

Oświadczenia

K.P. i A.A.G. są współtwórcami technologii związanych z czujnikami palców na papierze. Y.G., S.C. i K.P. są współzałożycielami LSK Technologies, Inc. i są współtwórcami technologii związanych z PLUM. M.K., K.P. i A.A.G. są współzałożycielami En Carta Diagnostics Ltd. Pozostali autorzy nie pozostają w konflikcie interesów. Patenty: Urządzenie PLUM: Wniosek patentowy Y.G., S.C. i K.P. został złożony przez University of Toronto i przypisany do LSK Technologies Inc. Tymczasowy wniosek patentowy USA nr 62/982,323 złożony 27 lutego 2020 r.; Patent na przełącznik Toehold: A.A.G., P.Y. i J.J. C. "Kompozycje ryboregulatorów i metody użycia", Patent. WO2014074648A3 złożony 6 listopada 2012 r.; Patent diagnostyczny oparty na papierze: K.P. i J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" Patent w USA zgłoszony nr US15/963,831 złożony 6 grudnia 2013 r.; Patent na Zika 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. i J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", U. S. Provisional Patent Application No. 62/403,778 złożony 4 października 2016 r.; Patent na Zika 2: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. i J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", U.S. Provisional Patent Application No. 62/341,221 złożony 25 maja 2016 r.

Podziękowania

Autorzy dziękują wszystkim członkom laboratoriów Green, Pardee i Pena, a także wszystkim współautorom poprzednich manuskryptów odnoszących się do pracy ujawnionej w tym manuskrypcie. S.J.R.d.S. był wspierany przez stypendium doktoranckie sponsorowane przez Foundation for Science and Technology of Pernambuco (FACEPE), numer referencyjny IBPG-1321-2.12/18, a obecnie jest wspierany przez stypendium podoktorskie sponsorowane przez University of Toronto, Kanada. P.B. jest wspierany przez Nagrodę Williama Knappa Buckleya przyznawaną przez Wydział Farmacji Uniwersytetu w Toronto. M.K. był wspierany przez Inicjatywę Medycyny Precyzyjnej (PRiME) na Uniwersytecie w Toronto w ramach wewnętrznego stypendium nr PRMF2019-002. Praca ta została wsparta funduszami dla K.P z Canada Research Chairs Program (pliki 950-231075 i 950-233107), Funduszu Zarządzania Głównymi Projektami Badawczymi Uniwersytetu w Toronto, Programu Grantowego Fundacji CIHR (201610FDN-375469) oraz dla L.P, A.A.G. i K.P za pośrednictwem CIHR/IDRC Team Grant: Canada-Latin/America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783), a także poprzez środki na rzecz K.P. z Kanadyjskiego Centrum Badań nad Rozwojem Międzynarodowym (grant 109434-001) w ramach kanadyjskiego programu 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Rapid Research Funding Opportunity. Praca ta była również wspierana przez fundusze dla A.A.G. z nagrody Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), Fundacji Gatesów (OPP1160667), nagrody NIH Director's New Innovator Award (1DP2GM126892), nagrody NIH R21 (1R21AI136571-01A1) dla K.P./A.A.G. oraz stypendium Alfreda P. Sloana (FG-2017-9108). Rysunek 1 został stworzony z Biorender.com na podstawie licencji akademickiej K.P.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pokrywy płytek 384-dołkowych -aluminiowe Sarstedt95.1995Służą do zakrywania płytek 384-dołkowych przed ich włożeniem do czytnika PLUM
Pokrywy płytek 384-dołkowych - przezroczysteSarstedt95.1994Służą do zakrywania płytek 384-dołkowych przed ich włożeniem do czytnika płytek BioTek
Płytki 384-dołkoweVWRCA11006-180Diagnostyka papierowa o średnicy 2 mm jest umieszczana w studzienkach tych płytek w celu ilościowego określenia
AgaroseBioShop CanadaAGA001.500Elektroforeza żelowa
BSABioShop CanadaALB001.500Środek blokujący do bibuły filtracyjnej Whatman
Reakcje bezkomórkoweNew England BiolabsE6800LPURExpress
CPRGRoche10884308001Chlorofenol red-b-D-galaktopiranozyd
Jednorazowe sterylne stemple do biopsjiIntegra Miltex23233-31Służy do tworzenia 2 mm krążków papierowych, które mieszczą się w 384-dołkowej płytce
DNAza IThermo ScientificK2981Trawi matrycę DNA po inkubacji reakcji transkrypcji in vitro
Zestaw DNAse IThermo Scientific74104DNase I Kit Do usuwania matrycowego DNA z RNA IVT
dNTPsNew England BiolabsN0446SUżywany do
systemu elektroforezyBio-Rad1704487Służy do uruchamiania żeli agarozowych
Stacja obrazowaniażeli Bio-Rad1708265ChemiDoc XRS+ Zestaw do obrazowania
IVTNew England BiolabsE2040SUżywany do transkrypcji in vitro matrycy (wyzwalacza) RNA do przesiewania przełącznika
Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-WSłuży do oznaczania stężeń kwasów nukleinowych
Zestaw NASBANauki przyrodnicze Zaawansowane technologieNWK-1Składniki reakcji amplifikacji izotermicznej
InvitrogenH20 bez nukleaz10977015 Dodawany do mieszanin reakcyjnych
System elektroforezy PAGEBiorad1658001FCSłuży do odlewania i uruchamiania żeli poliakrylamidowych
pCOLADuet-LacZ DNAAddgene75006https://www.addgene.org/75006/
Bufor polimerazy/reaktioiny PhusionNew England BiolabsM0530LUżywany do PCR
Czytnik płytekBioTekBioTek NEO2Multi Mode Plate, Synergy
Neo2 PrimersZintegrowane technologieNiestandardowa synteza oligo
Polimeraza Q5/ Bufor reakcyjnyNew England BiolabsM0491LUżywany do PCR
Qiagen PCR Puriifcation KitQIAGEN27106QIAprep Spin Miniprep
Kit Barwnik ładujący RNANew England BiolabsB0363S2X Barwnik ładujący RNA
Zestaw do oczyszczania RNAQIAGENEN0521QIAamp Zestaw do ekstrakcji wirusowego
RNA Inhibitor RNazyNew England BiolabsM0314SSłuży do zapobiegania zanieczyszczeniu RNaz A, B i C
Zestaw RT-qPCRQIAGEN208352Sonda QuantiNova Zestaw RT-PCR
SYBR GoldInvitrogen S11494S11494PAGE barwnik żelowy do kwasów nukleinowych
TAEBuffer KanadaTAE222.4Żelowy bufor do elektroforezy
Thermal CyclerApplied Biosystems4484073Służy do cyklicznych zmian temperatury i reakcji inkubacyjnych
Bibuła filtracyjna Whatman 42GE Healthcare1442-042Służy do osadzania komponentów molekularnych do diagnostyki papierowej
PCR DNA

Bibliografia

  1. Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1 73-79 (2006).
  2. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).
  3. Faria, N. R., et al. Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil. Genome Medicine. 8 (1), 97(2016).
  4. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  5. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  6. Pardee, K., et al. Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  7. Duyen, T. T. M., et al. Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis. Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).
  8. Jung, J. K., et al. Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants. Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).
  9. Yang, Y. H., et al. Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor. Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367(2009).
  10. Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
  11. Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).
  12. Amalfitano, E., et al. A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
  13. Nguyen, P. Q., et al. Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection. Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).
  14. Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter. Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).
  15. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
  16. Salehi, A. S. M., et al. Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach. Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).
  17. Voyvodic, P. L., et al. Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
  18. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  19. Gräwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLOS One. 14 (3), 0210940(2019).
  20. Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression. Cell. 159 (4), 925-939 (2014).
  21. Craw, P., Balachandran, W. Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review. Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).
  22. Zyrina, N. V., Antipova, V. N. Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification. Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).
  23. Takahashi, M. K., et al. A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers. Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).
  24. Karlikow, M., et al. Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples. Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).
  25. Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).
  26. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. , Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2022).
  27. Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).
  28. Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization. Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).
  29. NUPACK: Nucleic Acid Package. , Available from: http://www.nupack.org/ (2022).
  30. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , Cambridge, MA. (2021).
  31. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232(2008).
  32. Walsh, D. I., et al. Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots. SLAS Technology. 24 (3), 282(2019).
  33. Silva, S. J. R., de Magalhães, J. J. F., de Pena, L. Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth. One Health. 12, 100205(2021).
  34. Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso. Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).
  35. Arce, A., et al. Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584(2021).
  36. Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
  37. Shimizu, Y. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  38. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Diagnostyka oparta na papierzewykrywanie wirusa Zikasensory bezkom rkoweamplifikacja NASBApor wnanie z RT qPCRwalidacja pr bek pacjent wtest kolorymetrycznyprzeno ny czytnik p ytekdiagnostyka molekularna
Badanie projektowe i wdrożeniowe w celu opracowania i walidacji pacjenta w papierowej diagnostyce przełącznika Toehold
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.