Artykuł metodologiczny

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63227

⸱

21 października 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems Neurobiology and Medicine, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology, 2Laboratory of Data-Driven Biology, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Streszczenie

Aby stworzyć funkcjonalne sieci, neurony muszą migrować do odpowiednich miejsc docelowych, a następnie rozszerzać aksony w kierunku swoich komórek docelowych. Procesy te zależą od postępów stożków wzrostu, które znajdują się na końcach neurytów. Stożki wzrostu aksonów generują siły napędowe, wyczuwając swoje lokalne mikrośrodowisko i modulując dynamikę cytoszkieletu oraz sprzężenie adhezyjne aktyna (sprzężenie sprzęgła). Dziesięciolecia badań doprowadziły do zidentyfikowania cząsteczek naprowadzających, ich receptorów i kaskad sygnalizacyjnych w celu regulacji migracji neuronów i prowadzenia aksonów; Jednak mechanizmy molekularne niezbędne do generowania sił napędzających postęp stożka wzrostu i nawigację dopiero zaczynają być wyjaśniane. Na przedniej krawędzi neuronalnych stożków wzrostu włókna aktyny podlegają przepływowi wstecznemu, który jest napędzany przez polimeryzację aktyny i skurcz aktomiozyny. Sprzężenie sprzęgła między przepływem wstecznym F-aktyny a podłożem adhezyjnym generuje siły trakcyjne dla wyprzedzenia stożka wzrostu. W niniejszym badaniu opisano szczegółowy protokół monitorowania wstecznego przepływu F-aktyny za pomocą obrazowania pojedynczej plamki. Co ważne, w połączeniu z markerem F-aktyny Lifeact, technika ta może określić ilościowo 1) szybkość polimeryzacji F-aktyny i 2) skuteczność sprzężenia sprzęgła między przepływem wstecznym F-aktyny a podłożem adhezyjnym. Obie są zmiennymi krytycznymi do generowania sił dla wzrostu stożka wyprzedzenia i nawigacji. Ponadto w niniejszym badaniu opisano szczegółowy protokół mikroskopii sił trakcyjnych, który może określić ilościowo 3) siłę trakcyjną generowaną przez stożki wzrostu. W ten sposób, łącząc analizy obrazowania pojedynczej plamki i mikroskopii siły pociągowej, badacze mogą monitorować mechanikę molekularną leżącą u podstaw wyprzedzenia stożka wzrostu i nawigacji.

Wprowadzenie

W rozwijającym się mózgu kręgowców neurony przechodzą misternie zorganizowane migracje i kierują aksony w kierunku odpowiednich partnerów synaptycznych w celu utworzenia funkcjonalnych sieci neuronowych1,2,3. Stożki wzrostu, które są czuciowymi i ruchliwymi strukturami znajdującymi się na czubku neurytów, określają prędkość i kierunek migracji neuronów oraz wzrostu aksonów3,4,5. Ponieważ neurony są otoczone ciasno upakowanymi środowiskami, stożki wzrostu muszą wywierać siły na swoje otoczenie, aby poruszać się naprzód6,7. Aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw migracji neuronów i przewodnictwa aksonów, niezbędne są analizy mechaniki molekularnej postępu stożka wzrostu.

Dziesięciolecia analiz wykazały, że siła pociągowa napędzająca postęp stożka wzrostu jest generowana przez mechanizm 'sprzęgła'; uważa się, że mechanizm ten działa nie tylko w stożku wzrostu aksonu, ale także w stożku wzrostu głównego procesu migrujących neuronów8,9,10,11,12. Mianowicie, filamenty aktynowe (F-aktyny) w stożkach wzrostu polimeryzują na krawędzi natarcia i depolimeryzują proksymalnie, wypychając membranę krawędzi natarcia13,14,15. Wynikowa siła, w połączeniu ze skurczem aktomiozyny, indukuje ruch F-aktyn do tyłu zwany przepływem wstecznym7,11,16,17,18,19,20,21. Cząsteczki adhezyjne sprzęgła i komórek pośredniczą w mechanicznym sprzężeniu między przepływem wstecznym F-aktyny a podłożem adhezyjnym i przenoszą siłę przepływu F-aktyny na podłoże, generując w ten sposób siłę pociągową dla wzrostu stożek natarcia 7,8,9,11,12,22. Jednocześnie sprzężenie aktyna-substrat zmniejsza prędkość przepływu F-aktyny i przekształca polimeryzację aktyny w siłę wystającą z membrany krawędzi natarcia9,10.

Stożki wzrostu aksonów wyczuwają lokalne sygnały chemiczne i przekształcają je w kierunkową siłę napędową dla nawigacji po stożku wzrostu3,23,24,25. Na przykład cząsteczka prowadząca aksony netrin-1 stymuluje swój receptor deleczowany w raku jelita grubego (DCC) i aktywuje białko kontrolujące podział komórek 42 (Cdc42) wiążące trifosforan guanozyny (GTP) i substrat 1 toksyny botulinowej C3 związany z Ras (Rac1) oraz ich kinazę aktywowaną przez p21 (Pak1)26. Cdc42 i Rac1 promują 1) polimeryzację aktyny, a Pak1 fosforyluje cząsteczkę sprzęgła shootin122,26. Shootin1 oddziałuje z przepływem wstecznym F-aktyny poprzez białko wiążące aktynę cortactin27. Shootin1 oddziałuje również z cząsteczką adhezyjną komórek L1 (L1-CAM)20,24. Fosforylacja Shootin1 zwiększa powinowactwo wiązania kortaktyny i L1-CAM oraz wzmacnia sprzężenie sprzęgła za pośrednictwem shootin1 2) sprzęgło sprzęgła24,27. W obrębie stożka wzrostu asymetryczne aktywacje polimeryzacji aktyny i sprzężenia sprzęgła zwiększają 3) siłę uciągu po stronie źródła netryny-1, generując w ten sposób kierunkową siłę napędową do obracania stożka wzrostu (Rysunek 1)24. Intensywne badania prowadzone w ciągu ostatnich kilku dekad w odniesieniu do migracji neuronów i kierowania aksonami poszerzyły wiedzę na temat cząsteczek naprowadzających, ich receptorów i związanych z nimi kaskad sygnałowych2,10,28,29,30. Jednak mechanizmy molekularne generujące siły powodujące postęp stożka wzrostu dopiero zaczynają być wyjaśniane; Można to przypisać ograniczonemu wykorzystaniu protokołów do analiz mechanobiologicznych.

Niniejsze badanie opisuje szczegółowy protokół monitorowania wstecznego przepływu F-aktyny za pomocą obrazowania pojedynczej plamki16,18. Monitorowanie przepływu wstecznego F-aktyny zostało szeroko przeprowadzone przy użyciu mikroskopii superrozdzielczej, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i mikroskopii fluorescencji refleksyjnej (TIRF) 25,31,32,33,34,35,36,37,38. Protokół w niniejszym badaniu wykorzystuje jednak standardowy mikroskop epifluorescencyjny, dzięki czemu można go łatwo zaadoptować11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. W połączeniu z znakowaniem F-aktyny przez Lifeact43, obrazowanie pojedynczej plamki pozwala na ilościowe określenie szybkości polimeryzacji aktyny i wydajności sprzężenia sprzęgła między przepływem wstecznym F-aktyny a podłożem adhezyjnym39,42. W niniejszym badaniu opisano szczegółowy protokół mikroskopii siły trakcyjnej przy użyciu żelu poliakrylamidowego (PAA) zatopionego we fluorescencyjnym kulkach11,22,23,24,27,39,41,42,44. Ta metoda wykrywa i określa ilościowo siłę uciągu pod stożkiem wzrostu, monitorując ruchy ściegu wywołane siłą44,45. Dostępny jest kod analizy siły pociągowej o otwartym kodzie źródłowym, a metoda ilościowego określania siły uciągu podczas migracji stożka wzrostu jest szczegółowo wyjaśniona. Dzięki obrazowaniu pojedynczych plamek i mikroskopii sił trakcyjnych łatwiej będzie zrozumieć mechanikę molekularną leżącą u podstaw migracji stożków wzrostu i nawigacji. Techniki te mają również zastosowanie do analizy mechaniki molekularnej leżącej u podstaw dendrytycznego powiększania kręgosłupa, o którym wiadomo, że jest ważne w uczeniu się i pamięci42.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Nara Institute of Science and Technology. Badacze powinni stosować ustalone wytyczne swoich instytucjonalnych i krajowych komitetów regulacyjnych ds. zwierząt w zakresie opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie roztworów i pożywek

  1. Przygotować roztwory i pożywki hodowlane zgodnie z podsumowaniem w Pliku uzupełniającym 1

2. Przygotowanie podłoży powlekanych poli-D-lizyną (PDL)/lamininą

  1. Szalki ze szklanym dnem o średnicy 14 mm pokryć roztworem PDL o stężeniu 10 µg/mL, rozpuszczonym w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS, pH 7.4), i inkubować przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Nie wysuszać szklanych powierzchni po tym kroku
  2. Usunąć roztwór PDL i trzykrotnie nanieść pipetą 1 mL PBS na szkło, pozostawiając go na 10 s.
  3. Szalki pokryć lamininą o stężeniu 5 µg/mL, rozpuszczoną w PBS, i inkubować przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  4. Usunąć roztwór lamininy i trzykrotnie nanieść pipetą 1 mL PBS na szkło, pozostawiając go na 10 s.
  5. Usunąć PBS i nanieść na szklane powierzchnie 0,5 mL pożywki neurobasalnej. Przechowywać szalki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    ​UWAGA: Szalki pokryte PDL/lamininą można przechowywać przez 2-3 dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.

3. Disekcja i dysocjacja hipokampa

  1. Uśmierć ciężarną mysz poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych.
    UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano myszy dostępne w handlu (patrz Tabela materiałów). Badacze powinni stosować myszy hodowane i traktowane w sposób humanitarny w środowisku sterylnym.
  2. Wypreparuj embriony myszy w 16. dniu rozwoju (E16) i umieść je na lodzie.
  3. W komorze z laminarnym przepływem powietrza wypreparuj mózgi za pomocą nożyczek i umieść je na sterylnej szalce 10 cm zawierającej 10 mL lodowatego roztworu do sekcji.
  4. Przy użyciu stereomikroskopu sekcyjnego ostrożnie usuń opony półkul mózgu, a następnie wypreparuj hipokampy za pomocą pincety.
  5. Przenieś hipokampy do 5 mL lodowatego roztworu do trawienia w probówce 15 mL. Inkubuj hipokampy w kąpieli wodnej przez 20 min w temperaturze 37 °C.
  6. Usuń roztwór do trawienia i dodaj 3 mL roztworu do sekcji.
  7. Delikatnie pipetuj hipokampy czterokrotnie za pomocą pipety Pasteura.
  8. Inkubuj hipokampy w kąpieli wodnej przez 20 min w temperaturze 37 °C.
  9. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej 50 mL. Dodaj 3 mL nowego roztworu do sekcji do niedysocjowanej tkanki.
  10. Powtarzaj kroki 3.7-3.9, aż hipokampy zostaną całkowicie zdysocjowane.
  11. Usuń pływające agregaty DNA z zawiesiny komórkowej poprzez zamieszanie i odessanie pipetą Pasteura. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 180 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: DNA pochodzące z uszkodzonych komórek zakłóca proces wirowania. Jeśli w nad precipitatesie pozostaną neurony, ponownie odwiruj zawiesinę komórkową po dokładnym usunięciu DNA.
  12. Równoważ podłoże neurobasal zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), penicylinę (10 U/mL) i streptomycynę (10 µg/mL) w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.

4. Transfekcja i hodowla neuronów

  1. Usunąć supernatant i dodać 5 mL lodowatego PBS do probówki 50 mL. Resuspendować osad komórkowy poprzez delikatne pipetowanie.
  2. Przenieść 10 µL zawiesiny komórkowej do probówki do mikrowirówki, dodać 10 µL 0,5% roztworu błękitu trypanowego, a następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  3. Odwirować zawiesinę komórkową w probówce 50 mL przy 180 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C.
  4. W międzyczasie odmierzyć do probówki do mikrowirówki porcje do transfekcji: 1 µg pFN21A-HaloTag-actin oraz 3 µg pmNeonGreen-N1-Lifeact na 1 x 106 komórek.
  5. Po wirowaniu usunąć supernatant i dodać 10 µL medium do elektroporacji (załączonego do zestawu do transfekcji) do probówki 50 mL. Resuspendować osad komórkowy poprzez pipetowanie.
  6. Zmieszać zawiesinę komórkową z odmierzoną porcją roztworu DNA i przenieść mieszaninę do kuwety (załączonej do zestawu do transfekcji).
    UWAGA: Ponieważ pęcherzyki powietrza zakłócają elektroporację, należy usunąć je z zawiesiny komórkowej.
  7. Włożyć kuwetę do urządzenia do elektroporacji (Tabela materiałów) i przeprowadzić elektroporację korzystając z programu O-05.
  8. Bezzwłocznie dodać do kuwety 1 mL uprzednio ogrzanego i wyrównanego medium neurobasal zawierającego 10% FBS, penicylinę (10 U/mL) i streptomycynę (10 µg/mL).
  9. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki do wirowania 15 mL za pomocą plastikowej pipety (załączonej do zestawu do transfekcji).
  10. Przenieść 10 µL zawiesiny komórkowej do mikroprobówki, dodać 10 µL 0,5% roztworu błękitu trypanowego, a następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  11. Wyjąć z inkubatora szalki z szklanym dnem pokryte PDL/lamininą i usunąć medium neurobasal.
  12. Pipetować 0,5 mL zawiesiny komórkowej zawierającej 2,0 x 105 komórek na szalkę i inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 3 h.
  13. Wymienić medium na 0,5 mL medium neurobasal zawierającego 2% suplementu B-27, glutaminę (1 mM), penicylinę (10 U/mL) i streptomycynę (10 µg/mL). Hodować neurony w wilgotnym inkubatorze przez 3 dni w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.

5. Obrazowanie pojedynczego plamka (single speckle imaging) w stożkach wzrostu neuronów

  1. W 3. dniu hodowli in vitro (DIV) potraktuj neurony ligandem tetrametylo-rhodaminy (TMR) w rozcieńczeniu 1:200 w pożywce hodowlanej. Inkubuj neurony przez 1 h w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
  2. Przemyj neurony z ligandem TMR trzykrotnie uprzednio ogrzanym PBS.
  3. Usuń PBS i nanieś pipetą 0,5 mL ogrzanej pożywki Leibovitz's L-15 zawierającej 2% suplement B-27, glutaminę (1 mM), penicylinę (10 U/mL) i streptomycynę (10 µg/mL).
  4. Inkubuj neurony przez 1 h w temperaturze 37 °C.
  5. Włącz mikroskop epifluorescencyjny i ustaw inkubator nadstolikowy na 37 °C.
    UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w kamerę CMOS (complementary metal-oxide semiconductor), obiektyw imersyjny olejowy 100x/1,40 NA, lampę rtęciową oraz oprogramowanie do akwizycji obrazu (patrz Tabela materiałów). Do analizy można użyć innych mikroskopów epifluorescencyjnych o równoważnych specyfikacjach.
  6. Umieść neurony potraktowane ligandem TMR w naczyniu z szklanym dnem w ogrzanym inkubatorze nadstolikowym.
  7. Ustaw parametry akwizycji obrazu w następujący sposób: czas ekspozycji 500 ms dla kanałów fluorescencyjnych Lifeact i HaloTag-actin; binning 1 x 1 (0,065 µm × 0,065 µm na piksel); odstęp czasowy 3 s; czas trwania 50 klatek.
  8. Wybierz stożek wzrostu wykazujący silną ekspresję Lifeact i słabą ekspresję HaloTag-actin.
    UWAGA: Ekspresja Lifeact powinna być na tyle silna, aby umożliwić wizualizację morfologii stożka wzrostu. Ekspresja HaloTag-actin powinna być słaba, niemal niewykrywalna (Rysunek 2A). Poziomy ekspresji białek fluorescencyjnych można regulować poprzez zmianę ilości DNA użytego do transfekcji.
  9. Zmniejsz pole przysłony tak, aby oświetlić minimalny obszar obejmujący stożek wzrostu (Rysunek 2B).
    UWAGA: Oświetlenie minimalnego obszaru redukuje sygnał tła i zwiększa stosunek sygnału fluorescencji do szumu (S/N), co umożliwia wykrycie plamek aktynowych (actin speckles) (Rysunek 2B). Aby dodatkowo zwiększyć stosunek S/N, zaleca się oświetlanie stożka wzrostu bez redukcji natężenia światła za pomocą filtrów neutralnych.
  10. Wykonaj zdjęcia time-lapse (Plik uzupełniający 2). Zapisz jako wielokanałowy stos obrazów time-lapse (format tiff).

6. Ilościowe oznaczenia prędkości przepływu F-aktyny i szybkości polimeryzacji przy użyciu oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów Fiji

UWAGA: Dane ćwiczeniowe służące do wyznaczania prędkości przepływu F-aktyny oraz szybkości polimeryzacji aktyny znajdują się w Pliku uzupełniającym 3.

  1. Otwórz w programie Fiji wielokanałowy obraz stosu time-lapse.
  2. Wybierz Analyze > Set Scale i ustaw rozmiar piksela obrazów.
  3. Znajdź plamkę (speckle) aktyny, która przemieszcza się retrogradnie przez minimum pięć klatek czasowych w obrębie pęczka F-aktyny w filopodiach lub lamellipodiach.
  4. Wybierz Image > Transform > Rotate i dostosuj kąt obrazów tak, aby pęczek F-aktyny był skierowany w górę (Rysunek 3A).
  5. Kliknij narzędzie Rectangle na pasku narzędzi i narysuj ramkę obejmującą plamki aktyny oraz końcówkę pęczka F-aktyny (Rysunek 3B, 1 i 2).
    UWAGA: Sygnały plamek HaloTag-aktyny są słabe. Ponadto sygnały Lifeact w dystalnych końcach stożka wzrostu są słabe i niewyraziste (Rysunek 2B), ponieważ dystalne końce stożka wzrostu są cieńsze w porównaniu z częścią proksymalną. Badacze powinni wzmocnić sygnały, aby zoptymalizować kwantyfikację prędkości przepływu F-aktyny i szybkości polimeryzacji (Rysunek 3B). Mimo że sygnał Lifeact w proksymalnym stożku wzrostu ulega nasyceniu, nie będzie to zakłócać wyznaczenia dystalnego końca F-aktyn (Rysunek 3E, żółta linia).
  6. Wybierz Image > Duplicate i wprowadź pięć klatek czasowych (Rysunek 3B, 3-5).
  7. Wybierz Image > Stacks > Make Montage i wprowadź następujące parametry: Columns, 5; Rows, 1; Scale factor, 1.
  8. Kliknij OK. Montaż obrazów pojawi się na ekranie.
  9. Wybierz Image > Color > Split Channels. Pozwoli to na rozdzielenie dwóch kanałów fluorescencyjnych.
  10. Kwantyfikacja prędkości przepływu F-aktyny.
    1. Wybierz Analyze > Set Measurements i zaznacz Area oraz Bounding Rectangle.
    2. Kliknij narzędzie Oval na pasku narzędzi i narysuj okrąg na plamce aktyny (Rysunek 3C, 1 i 2).
    3. Wybierz Image > Overlay > Add Selection. Okrąg zostanie nałożony na montaż obrazów (Rysunek 3C, 3 i 4).
      UWAGA: Kolor nałożonego elementu można zmienić w Edit > Options > Colors.
    4. Powtórz nakładanie okręgów dla pozostałych plamek (Rysunek 3C, 5).
      UWAGA: Aby dokładnie wyznaczyć środki plamek aktyny, badacze powinni nakładać okręgi na plamki.
    5. Kliknij narzędzie Straight na pasku narzędzi i narysuj linię łączącą środki okręgów (Rysunek 3D, 1 i 2).
    6. Wybierz Analyze > Measure. Wynik pojawi się na ekranie (Rysunek 3D, 3).
      UWAGA: Wartość Height wyświetlona w wyniku wskazuje dystans translokacji plamki aktyny podczas obserwacji (Rysunek 3D, 3).
    7. Oblicz prędkość przepływu F-aktyny, dzieląc dystans translokacji przez czas obserwacji.
  11. Kwantyfikacja szybkości polimeryzacji F-aktyny.
    1. Narysuj linię łączącą końcówki pęczka F-aktyny (Rysunek 3E, 1).
    2. Wybierz Analyze > Measure. Wynik pojawi się na ekranie (Rysunek 3E, 2).
      UWAGA: Wartość Height w wyniku wskazuje długość wydłużenia pęczka F-aktyny podczas obserwacji (Rysunek 3E, 2).
    3. Oblicz szybkość wydłużania F-aktyny, dzieląc długość wydłużenia przez czas obserwacji.
    4. Oblicz szybkość polimeryzacji F-aktyny jako sumę prędkości przepływu F-aktyny i szybkości wydłużania (Rysunek 3F).

7. Przygotowanie żelu PAA do mikroskopii sił trakcyjnych i hodowli neuronów

  1. Przygotowanie żeli PAA wymaganych do mikroskopii sił trakcyjnych (Rysunek 4)
    1. Odmierz pipetą 0,5 ml NaOH (10 mM) rozpuszczonego w destylowanej wodzie H2O2O, na szalkach z szklanym dnem o średnicy 27 mm, i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Dodaj 50 µL 3-aminopropyltrimetoksysilanu (APTMS) do roztworu NaOH na płytkach, a następnie wymieszać roztwory, delikatnie pipetując, i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj szalki z szklanym dnem wodą destylowaną H2O2O, a następnie osuszyć.
    4. Nanieś pipetą 0,5 ml 0,5% roztworu glutaraldehydu rozpuszczonego w PBS na szalkę z szklanym dnem poddaną działaniu APTMS i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    5. Umyj szalki z szklanym dnem wodą destylowaną H2O2i osuszyć.
    6. Przygotuj roztwór zawierający destylowaną H2O (412 µL), 30% (w/v) roztwór akrylamidu (63 µL), 2,5% (m/v) roztwór bis-akryloamidu (6 µL) oraz roztwór mikrosfer modyfikowanych grupami karboksylowymi (kuleczki fluorescencyjne) (20 µL).
      UWAGA: Przed dodaniem do roztworu akrylamidu należy wymieszać roztwór kulek fluorescencyjnych na wortexie w celu rozbicia agregatów kulek.
    7. Odgazuj roztwór w komorze próżniowej przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    8. Do tego roztworu dodać 1 µL 10% (w/v) nadsiarczanu amonu (APS), rozpuszczonego w destylowanej wodzie H2O2O i 1 µL N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i wymieszać, delikatnie pipetując.
    9. Umieść szklaną lamelkę (o średnicy 18 mm) na zakrętce probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    10. Bezzwłocznie dodać 25 µL roztworu na szkiełko nakrywkowe, a następnie ostrożnie umieść odwróconą szalkę z szklanym dnem na szkiełku. Pozostaw akrylamid do polimeryzacji na 1 h w temperaturze pokojowej.
    11. Nanieś destylowaną wodę H2O2Przenieś go na szkiełko nakrywkę i oddziel od żelu, używając igły strzykawki zagiętym końcem.
    12. Usuń H2Następnie do żelu należy dodać sulfo-SANPAH (1 mM) rozpuszczony w PBS.
    13. W warunkach sterylnych naświetlaj żele światłem ultrafioletowym przez 5 min. Przemyj żel trzykrotnie buforem PBS, poświęcając 15 min na każde płukanie.
  2. Wyznaczanie sztywności żelu metodą wciskania mikrosfery (Rycina 5A)44.
    1. Przenieś mikrosferę o określonej średnicy i gęstości do żelu, a następnie umieść ją na stole preparatowym konfokalnego mikroskopu skaningowego.
    2. Skup obraz na powierzchni żelu i zanotuj pozycję w osi z (Rysunek 5B).
    3. Podobnie należy skupić się na dolnej części mikrosfery i zapisać pozycję z (Rycina 5C).
    4. Oblicz głębokość wgłębienia, wyznaczając różnicę między pozycjami z powierzchni żelu a dołem mikrosfery.
    5. Oblicz moduł Younga E żelu poprzez:
      figure-protocol-1
      gdzie f jest to masa mikrosfery skorygowana o wyporność, d jest głębokość wcięcia w żelu, r jest promieniem mikrosfery, a v jest współczynnik Poissona (którego wartość wynosi 0,3, zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami46).
  3. Pokryć żele PDL i lamininą zgodnie z opisem w sekcji 2.
  4. Zgodnie z opisem w sekcjach 3 i 4, wypreparować zarodki myszy z etapu E16, zdysocjować hipokampy, a następnie przeprowadzić transfekcję za pomocą 5 µg pEGFP-C1 na 1,0 x 106 komórki. Wysiać 2,0 x 105 komórki na żelach powlekanych PDL/lamininą.
    ​UWAGA: W przypadku analizy siły trakcyjnej niezbędne jest obrazowanie mikroskopowe komórek znakowanych fluorescencyjnie w celu określenia powierzchni stożka wzrostu.

8. Mikroskopia sił trakcyjnych w stożkach wzrostu neuronów

  1. W dniu DIV3 zastąp pożywkę hodowlaną 0,5 mL podgrzanej pożywki Leibovitz's L-15 zawierającej 2% suplementu B-27, glutaminę (1 mM), penicylinę (10 U/mL) i streptomycynę (10 µg/mL). Utrzymuj neurony przez 1 h w temperaturze 37 °C.
  2. Włącz konfokalny mikroskop skaningowy i ustaw inkubator na stole obiektowym na 37 °C.
    UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano konfokalny mikroskop skaningowy wyposażony w obiektyw imersyjny wodny 63x/1,2 NA oraz oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów (patrz Tabela materiałów).
  3. Umieść neurony w naczyniu z dna szklanego w uprzednio ogrzanym inkubatorze na stole obiektowym.
  4. Ustaw parametry akwizycji obrazu w następujący sposób: rozmiar skanowania: 512 × 512 pikseli; obszar skanowania: powiększenie 1,5-3x; prędkość skanowania: ~1 s na klatkę; długość fali lasera: 561 nm (długość fali wzbudzenia dla kulek fluorescencyjnych) oraz 48 nm (długość fali wzbudzenia dla wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP)); odstęp czasowy: 3 s; czas trwania: 50 klatek.
  5. Aby zwizualizować morfologię stożka wzrostu, wybierz stożek wzrostu silnie wykazujący ekspresję EGFP.
  6. Ustaw ostrość na powierzchni żelu i wykonaj zdjęcia w trybie time-lapse (Rycina 6A oraz Plik uzupełniający 4).
    UWAGA: Do analizy trakcji użyj dwóch kanałów fluorescencyjnych (dla kulek fluorescencyjnych i EGFP) oraz kanału światła przechodzącego (zaleca się rejestrację obrazów w kontraście fazowym lub DIC).
  7. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazów (np. Fiji), aby utworzyć jednokanałowe stosy obrazów RGB w trybie time-lapse i zapisz te obrazy jako pliki tiff.
    UWAGA: Kluczowe jest, aby badacze zapisali również surowe dane.
  8. Nanieś 100 µL 10% (w/v) dodecylsiarczanu sodu (SDS) rozpuszczonego w destylowanej H2O do naczynia z dna szklanego, aby rozluźnić podłoże żelowe poprzez uwolnienie neuronów z podłoża. Inkubuj naczynie przez 5 min w temperaturze 37°C w celu stabilizacji temperatury.
    UWAGA: Obraz kulek w nierozciągniętym podłożu służy jako referencja dla pierwotnych pozycji kulek podczas analizy siły trakcji (Rycina 6C). Zastosowanie roztworu SDS zmienia pozycje xyz ze względu na zmianę termiczną w inkubatorze i rozluźnienie odkształcenia indukowanego przez komórkę. Badacze muszą zatem skorygować płaszczyznę ogniskowania i pozycję x-y.
  9. Ustaw ostrość na powierzchni żelu i wykonaj obraz kulek w nierozciągniętym podłożu (Rycina 6B).
  10. Utwórz jednokanałowy obraz RGB kulek w nierozciągniętym podłożu i zapisz ten obraz jako plik tiff.
  11. Korekcja pozycji x-y obrazu kulek w nierozciągniętym podłożu przy użyciu programu Fiji
    1. W programie Fiji otwórz obraz kulek w nierozciągniętym podłożu oraz stos obrazów time-lapse kulek fluorescencyjnych.
    2. Wybierz Image > Stacks > Tools > Concatenate. Na ekranie pojawi się okno dialogowe (Rycina 7A, 1).
    3. W polach Image1 oraz Image2 wybierz odpowiednio obraz kulek w nierozciągniętym podłożu i stos obrazów time-lapse kulek fluorescencyjnych (Rycina 7A, 2).
    4. Kliknij OK. Obraz kulek w nierozciągniętym podłożu zostanie dodany do stosu obrazów time-lapse (Rycina 7A, 3).
    5. Za pomocą paska przewijania (Rycina 7B, 1, czerwona ramka) wyświetl drugą klatkę stosu obrazów (czerwona strzałka).
    6. Wybierz Plugins > StackReg (Rycina 7B, 2). Na ekranie pojawi się okno dialogowe (Rycina 7B, 3).
    7. Wybierz Rigid Body z listy rozwijanej (Rycina 7B, 3, czerwona ramka) i kliknij OK. Rozpocznie się korekcja pozycji x-y.
    8. Użyj paska przewijania, aby wyświetlić pierwszą klatkę stosu obrazów z poprawioną pozycją x-y.
    9. Wybierz Image > Duplicate (Rycina 7C, 1). Na ekranie pojawi się okno dialogowe (Rycina 7B, 2).
    10. W polu Range wpisz 1, odznacz Duplicate Stack (Rycina 7C, 2) i kliknij OK. Na ekranie pojawi się obraz kulek w nierozciągniętym podłożu z poprawioną pozycją x-y (Rycina 7C, 3). Zapisz ten obraz jako plik tiff.
  12. Kwantyfikacja siły trakcji
    UWAGA: Opisana tutaj metoda analizy siły trakcji wykorzystuje program MATLAB oraz dwa zestawy narzędzi MATLAB: „Image Processing Toolbox” i „Parallel Computing Toolbox”. Badacze powinni je zainstalować przed przeprowadzeniem analizy. Kod analizy siły trakcji został opracowany w oparciu o wersję MATLAB 2018a. W związku z tym do analizy należy użyć wersji MATLAB 2018a (lub nowszej). Algorytmy użyte do analizy siły trakcji zostały opisane wcześniej2.
    1. Pobierz kod analizy siły trakcji TFM2021 z Pliku uzupełniającego 5. Otwórz TFM2021 w programie MATLAB.
    2. Otwórz plik main.m w TFM2021 i uruchom go. Na ekranie pojawi się graficzny interfejs użytkownika (GUI) (Rycina 8A).
    3. Kliknij Load unstrained substrate image i wybierz obraz kulek w nierozciągniętym podłożu z poprawioną pozycją x-y.
    4. Kliknij Load fluorescent bead images i wybierz stos obrazów kulek w trybie time-lapse.
    5. Kliknij Load bright-field images i wybierz stos obrazów światła przechodzącego w trybie time-lapse.
    6. Kliknij Load GFP Images i wybierz stos obrazów EGFP w trybie time-lapse.
    7. Wybierz GFP z listy rozwijanej w GUI (Rycina 8A, czerwona ramka).
    8. Kliknij ROI, aby określić prostokątny obszar zainteresowania (ROI), obejmujący stożek wzrostu, klikając w dwa punkty na obrazie komórki wyświetlonym w GUI (Rycina 8B).
    9. Kliknij przycisk Save w GUI (Rycina 8A, czerwona strzałka). Wybrane stosy obrazów wraz z ROI zostaną zapisane w pliku .mat (plik w formacie MATLAB).
    10. Kliknij Spot detect. Na ekranie pojawi się okno dialogowe.
    11. W oknie dialogowym wprowadź wartość (zazwyczaj 50-150), aby określić próg detekcji kulek. Kliknięcie OK rozpoczyna obliczenia.
    12. Po zakończeniu obliczeń kliknij Plot track, aby powiększyć obszar wybrany w kroku 8.12.8 i wyświetlić wykryte kulki jako białe kropki (Rycina 8C, 1).
      UWAGA: Sprawdź, czy detekcja kulek (białe kropki) pokrywa się z kulkami fluorescencyjnymi. Detekcja może również wykryć szum tła. Aby zredukować te zakłócenia zewnętrzne, zmień wartość progu w Spot detect. Dodatkowo w kroku 8.12.13 ręcznie wybierz poprawne kropki.
    13. Kliknij Select beads i wyznacz wielokątny obszar obejmujący poprawne kropki pod stożkiem wzrostu. Naciśnij klawisz Enter na klawiaturze. Białe kropki wewnątrz obszaru wielokąta zmienią kolor na czerwony (Rycina 8C, 2).
    14. Kliknij Estimate force w GUI. Następnie wprowadź wartości dla następujących parametrów: rozmiar piksela, µm/pixel; moduł Younga, wartość obliczona w Kroku 7.2.5; współczynnik Poissona, 0,3.
    15. Uruchom Estimate force , aby rozpocząć obliczenia. Oprogramowanie automatycznie zapisze wyniki obliczeń w pliku w formacie arkusza kalkulacyjnego.
      UWAGA: Arkusz przedstawia składową x, składową y oraz wartość siły dla każdej klatki czasowej (Rycina 8D). Dane do ćwiczeń w zakresie kwantyfikacji siły trakcji znajdują się w Pliku uzupełniającym 6.

Wyniki

Obrazowanie pojedynczych plamek w celu ilościowego oznaczenia szybkości polimeryzacji aktyny i wydajności sprzężenia sprzęgła
Wysoka ekspresja Lifeact umożliwia wizualizację F-aktyny w obrębie stożka wzrostu; niska ekspresja HaloTag-aktyny pozwala na monitorowanie wstecznego przepływu F-aktyny (Rycina 3, Plik uzupełniający 2). Śledzenie plamek aktynowych pozwala na pomiar prędkości przepływu F-aktyny (Rycina 3C,D). Ponieważ mechaniczne sprzężenie wstecznego przepływu F-aktyny z podłożem adhezyjnym zmniejsza prędkość przepływu F-aktyny, wydajność sprzężenia sprzęgła można oszacować na podstawie tej prędkości. Ponadto znakowanie F-aktyny za pomocą Lifeact wspomaga wizualizację wydłużania się F-aktyny i jest przydatne do ilościowego oznaczenia szybkości polimeryzacji aktyny (Rycina 3E,F).

Ilościowa analiza siły trakcyjnej
Ścisłe przestrzeganie opisanej tutaj metodologii pozwoli na ujawnienie ruchów fluorescencyjnych kulek pod stożkiem wzrostu (Rycina 6C, Plik uzupełniający 4). Retrogradny przepływ F-aktyny w kierunku podłoża generuje siłę trakcyjną, która powoduje przemieszczanie się fluorescencyjnych kulek do tyłu pod stożkiem wzrostu. Kod do analizy siły trakcyjnej szacuje tę siłę na podstawie przemieszczenia fluorescencyjnych kulek i wyraża obliczoną siłę trakcyjną jako wektor siły. Kierunek i wartość siły trakcyjnej są wyznaczane z komponentów x i y wektora siły (Rycina 8C, D). Czerwona ramka na Rycynie 8D przedstawia komponenty x i y wektora siły; Rycina 8C przedstawia odpowiadający mu stożek wzrostu. W układzie współrzędnych x-y wektor wskazuje kąt -93,8° względem osi x; orientacja ta jest skierowana w stronę tylnej części stożka wzrostu (Rycina 8C). Wartość siły trakcyjnej F została obliczona w następujący sposób:

figure-results-1

figure-results-2
Rysunek 1Mechanizm stożka wzrostu odpowiedzialny za generowanie siły oraz nawigację stożka wzrostu. Gradient chemoatraktanta netryny-1 indukuje asymetryczną stymulację jej receptora DCC w stożku wzrostu aksonu. Aktywuje to białka Rac1 i Cdc42 oraz ich kinazę efektorową Pak1. Rac1 i Cdc42 promują (1) polimeryzację aktyny, podczas gdy Pak1 fosforyluje białko shootin1, wzmacniając zapośredniczone przez shootin1 (2) sprzężenie sprzęgła (clutch coupling). Asymetryczna aktywacja dynamiki aktyny oraz sprzężenia sprzęgła w obrębie stożka wzrostu zwiększa (3) siłę trakcyjną po stronie źródła netryny-1, generując tym samym kierunkową siłę napędową dla atrakcji stożka wzrostu. Przedstawione tutaj protokoły umożliwiają kwantyfikację kluczowych zmiennych (1)–(3) dla nawigacji stożka wzrostu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 2Obrazy fluorescencyjne stożka wzrostu neuronu przy w pełni otwartej i zwężonej przysłonie. Stożek wzrostu wykazuje ekspresję Lifeact oraz HaloTag-aktyny. (AWysoka ekspresja białka Lifeact umożliwia wizualizację morfologii stożka wzrostu. Z drugiej strony poziomy ekspresji HaloTag-aktyny są bardzo niskie, co skutkuje słabymi sygnałami przy całkowicie otwartej przysłonie.BPrzy odpowiednim przymknięciu przysłony sygnały tła słabną, a w stożku wzrostu pojawiają się pojedyncze plamki aktyny. Paski skali: 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 3Kroki kwantyfikacji prędkości przepływu F-aktyny i szybkości polimeryzacji aktyny przy użyciu oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów Fiji. (A) Dostosuj kąt obrazu do analizy. (1) Znajdź i zaznacz plamkę aktynową (grot strzałki) przemieszczającą się w pęczku aktyny F. (2) Zaznacz Obraz > Przekształć > Obracać(3) Ustaw kąt tak, aby wiązka F-aktyny była skierowana w górę. (4) Kąt obrazu zostanie zmieniony. (B) Wyznaczyć obszar, obejmujący plamkę aktynową (actin speckle) oraz pęczek F-aktyny. (1) Kliknąć w Prostokąt na pasku narzędzi. (2) Wyznacz obszar na obrazie. Jasność i kontrast obrazu zostają zwiększone, aby umożliwić wyraźną wizualizację plamki aktynowej oraz końcówki pęczka F-aktyny. (3) Wybierz Obraz > Duplikat(4) Wprowadź pięć przedziałów czasowych, które pokazują przepływ plamek aktynowych w pęczku F-aktyny. (5) Wybrany stos obrazów pojawi się na ekranie. (C) Nałóż okręgi na plamkę aktynową. (1) Kliknij w Owalu na pasku narzędzi. (2) Narysuj okrąg na plamce aktynowej. (3) Wybierz Obraz > Nałożenie > Dodaj do zaznaczenia(4) Naniesiono okrąg. 5) Powtórz nakładanie okręgów na pozostałe plamki aktyny.D) Zmierz dystans translokacji plamek aktyny w pięciu przedziałach czasowych. (1) Kliknij w Prosty na pasku narzędzi. (2) Narysować linię łączącą środki okręgów. (3) Wybrać Analiza > PomiarWynik, określony parametrem Wzrost (czerwone pole), przekazujące dystans translokacji plamek aktynowych. (E) Zmierz zmianę długości wypustki F-aktyny w pięciu ramach czasowych. (1) Narysuj linię łączącą końce wypustki F-aktyny. (2) Wybierz Analiza > PomiarWynik (czerwona ramka), Wzrost, wskazuje długość wydłużenia wiązki F-aktyny. (FSzybkość polimeryzacji aktyny oblicza się jako sumę prędkości przepływu aktyny filamentarnej (F-aktyny) i szybkości wydłużania. Zobacz także Plik uzupełniający 2. Plik uzupełniający 3 pomaga badaczom w ćwiczeniu opisanej powyżej metodologii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 4Kroki przygotowania żelu PAA. Szczegółowy opis znajduje się w kroku 7.1. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-6
Rysunek 5Wyznaczanie sztywności żelu PAA. (A) Metoda wgłębienia mikrosferą. Gdy mikrosferę umieści się na żelu PAA z zatopionymi fluorescencyjnymi kuleczkami, ciężar mikrosfery powoduje powstanie wgłębienia w żelu. Głębokość wgłębienia oblicza się poprzez odjęcie pozycji z powierzchni żelu PAA od pozycji dna mikrosfery (B,C) Obrazy fluorescencyjne żelu PAA z wgłębieniem wykonanym przez mikrosferę, zawierającego fluorescencyjne kuleczki. Do rejestracji obrazów powierzchni żelu wykorzystano konfokalny mikroskop skaningowy z laserowym wzbudzeniem (B) i dno mikrosfery (C). Sygnały z fluorescencyjnego perełki nie są widoczne na powierzchni żelu w obszarze z wgłębieniem (B, koło). Można je jednak zaobserwować u podstawy mikrosfery. Paski skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-7
Rycina 6Mapowanie sił stożka wzrostu neuronu. (A-Węgiel) Obrazy fluorescencyjne kulek zatopionych w żelu PAA oraz stożka wzrostu neuronu wizualizowanego za pomocą EGFP. Po wykonaniu obrazowania time-lapse (A), neuron został uwolniony z podłoża żelowego poprzez zastosowanie roztworu SDS, a następnie wykonano obraz kulek w nienapiętym podłożu (B). (CObraz kulek w podłożu nierozciągniętym przedstawia kulki w ich pierwotnych (zielonych) i przemieszczonych (czerwonych) pozycjach. Sygnał EGFP stożka wzrostu przedstawiono na niebiesko. Kimografy (po prawej) obrazują ruchy kulek w odstępach 3 s przez czas trwania 147 s, wskazane strzałkami w obramowanych obszarach 1 i 2. Kulka w obszarze 2 jest kulką referencyjną. Paski skali: 2 µm dla (A), (B) i (C, po lewej), i 1 µm dla (C, środek). Patrz również Plik uzupełniający 4. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

figure-results-8
Rycina 7Kroki korygowania pozycji x-y obrazu kulek w podłożu nieodkształconym przy użyciu programu Fiji. (A) Połącz obraz kulek w nieprzefiltrowanym podłożu ze stosem obrazów time-lapse fluorescencyjnych kulek. (1) Wybierz Obraz > Stosy > Narzędzia > Łączyć (konkatenować)(2) Wybrać obraz kulek w nieprzefiltrowanym podłożu oraz obraz z serii czasowej (time-lapse stack) fluorescencyjnych kulek w Obraz 1 i Obraz 2odpowiednio. Kliknij w Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.(3) Obraz kulek w podłożu nierozciągniętym zostaje dodany do stosu obrazów time-lapse.B) Skoryguj pozycję x-y obrazu fluorescencyjnego koralika. (1) Użyj paska przewijania (czerwona ramka), aby wybrać drugą klatkę (czerwona strzałka) w stosie obrazów. (2) Wybierz Wtyczki > StackReg(3) Wybierz Bryła sztywna z listy rozwijanej (czerwona ramka) i kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Rozpocznie się korekcja pozycji x-y.C) Zapisz obraz kulek po korekcie pozycji x-y. Po wybraniu pierwszej klatki stosu obrazów po korekcie pozycji x-y (1) wybierz Obraz > Duplikat(2) wejście 1 do Zakres i odznacz Duplikuj stosNastępnie kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.(3) na ekranie pojawi się obraz kulek w podłożu nierozciągniętym z korekcją pozycji x-y. Zapisz ten obraz jako plik tiff. Plik uzupełniający 6 pomaga badaczom w przećwiczeniu opisanej powyżej metodologii. Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.

figure-results-9
Rycina 8Analiza siły trakcyjnej pod stożkiem wzrostu neuronu z wykorzystaniem otwartoźródłowego kodu do analizy sił trakcyjnych. (A) Interfejs graficzny użytkownika (GUI) do analizy siły trakcyjnej. Obrazy z serii czasowej wybrane w interfejsie można potwierdzić na liście rozwijanej oraz za pomocą wskazanego suwaka (czerwona ramka). (B) Wybierz obszar obejmujący stożek wzrostu. (1) Kliknij w ROI (region zainteresowania) na interfejsie graficznym (GUI). Za pomocą kursora myszy należy wyznaczyć dwa punkty (groty strzałek) na obrazie komórki. (2) Na obrazie komórki pojawi się czerwone pole. Dwa kliknięcia określają położenie dwóch narożników. (C) Wybierz wykryte kuleczki (białe kropki) pod stożkiem wzrostu. (1) W interfejsie użytkownika (GUI) kliknij Wybierz kuleczkii wyznaczyć kliknięciem obszar wielokąta obejmujący stożek wzrostu. Nacisnąć Wprowadź klucz. (2) Białe kropki wewnątrz obszaru wielokąta zmienią kolor na czerwony. (D) Obliczone wyniki kierunku i wartości siły trakcyjnej. Czerwona ramka w arkuszu kalkulacyjnym przedstawia składowe x i y wektora siły, oszacowane za pomocą analizy sił trakcyjnych. W układzie współrzędnych x-y na prawym panelu wektor siły generowany przez stożek wzrostu skierowany jest w stronę -93.8° przeciwlegle do osi x; orientacja ta jest skierowana w stronę tylnej części stożka wzrostu w (C). Plik uzupełniający 6 pomaga badaczom w ćwiczeniu opisanej powyżej metodologii. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający 1: Składy roztworów i pożywek użytych w niniejszym badaniu. Zapoznaj się z tekstem w celu uzyskania szczegółowych informacji o zastosowaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Obrazowanie fluorescencyjne Lifeact oraz obrazowanie fluorescencyjne plamek HaloTag-aktyny w stożku wzrostu nerwu. Lifeact (zielony) i HaloTag-aktyna (magenta). Obrazy pozyskano co 3 s przez całkowity czas 147 s. Pasek skali: 2 µmZobacz także Rycina 3. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Dane ćwiczeniowe do ilościowego oznaczenia prędkości przepływu F-aktyny i szybkości polimeryzacji aktyny. Wielokanałowy stos obrazów time-lapse przedstawiający Lifeact (zielony) i HaloTag-aktynę (magenta). Zobacz także Rycina 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Film z mapowania sił wykrywający siłę trakcyjną w stożku wzrostu neuronu. Pozycje pierwotne (zielone) i przesunięte (czerwone) kulek. Sygnał EGFP w stożku wzrostu przedstawiono kolorem niebieskim. Obrazyzowano co 3 s przez 147 s. Pasek skali: 2 µmPatrz również Rycina 6. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Kod do analizy siły trakcyjnej. Szczegółowe informacje dotyczące zastosowania znajdują się w kroku 8.12. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Dane treningowe do kwantyfikacji siły trakcyjnej. Jednokanałowy obraz RGB kulek w nierozciągniętym podłożu oraz jednokanałowe serie obrazów RGB time-lapse fluorescencyjnych kulek pod stożkiem wzrostu, EGFP i w polu jasnym. Patrz również Ryciny 7 i 8. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokoły opisane w tym badaniu wykorzystują komercyjnie dostępne materiały i sprzęt mikroskopowy, który rutynowo znajduje się we wszystkich laboratoriach, instytutach i uniwersytetach. W związku z tym badacze mogą z łatwością zastosować w swoich badaniach obrazowanie pojedynczej plamki i mikroskopię sił trakcyjnych.

Obrazowanie plamkowe może analizować polimeryzację aktyny i sprzęgło sprzęgła. Ponadto obrazowanie plamkowe może monitorować wsteczny przepływ cząsteczek sprzęgła, takich jak shootin1 i kortaktyna, które oddziałują z przepływem wstecznym F-aktyny. Za pomocą mikroskopu TIRF można również monitorować wsteczny przepływ cząsteczki adhezyjnej L1-CAM23,41; L1-CAM ulega przyczepności i poślizgowi, które odzwierciedlają sprawność sprzęgła23,41. Chociaż w niniejszym badaniu wykorzystano system TMR-HaloTag do obrazowania plamkowego, w analizie dostępne są również inne białka fluorescencyjne, takie jak EGFP i monomeryczne czerwone białko fluorescencyjne 16,18,20,23,24,27,39. Podstawą do wizualizacji plamek aktyny jest niski poziom ekspresji fluorescencyjnej aktyny i oświetlenie minimalnego obszaru (ryc. 2). W tym protokole sygnały Lifeact i HaloTag-actin są pozyskiwane sekwencyjnie. Ponieważ przepływ wsteczny aktyny jest stosunkowo powolny (4,5 ± 0,1 μm/min)24, analiza przepływu wstecznego F-aktyny i polimeryzacji aktyny nie ma wpływu sekwencyjna akwizycja obrazów różnych kanałów fluorescencyjnych (interwał ~1 s). Lifeact jest szeroko stosowanym markerem F-aktyny, ale może konkurować z białkami wiążącymi aktynę47. Co ważne, Lifeact może zmieniać dynamikę aktyny, wpływając w ten sposób na struktury F-aktyny i morfologię komórek 47,48,49.

Mikroskopia sił trakcyjnych może wykryć siły napędzające postęp stożka wzrostu. Montując neurony w macierzy zewnątrzkomórkowej, badacze mogą również analizować siły generowanew środowisku pół-3D11. Obrazowanie w dużym powiększeniu jest ważne dla dokładnej oceny siły uciągu, ponieważ stożki wzrostu generują słabe siły pociągowe7. Chociaż do pomiaru siły pociągowej stosuje się również inne metody z nanofilarami lub bioczujnikami wrażliwymi na stres50,51, metoda na bazie żelu PAA jest wysoce elastyczna i pozwala na regulację sztywności podłoża poprzez zmianę stężeń akrylamidu i bis-akrylamidu 41,44,52. W tym protokole żel PAA przygotowuje się w końcowym stężeniu 3,75% akrylamidu i 0,03% bis-akrylamidu; Moduł Younga wynosi ~270 Pa22, a sztywność ta mieści się w zakresie tkanki mózgowej (100-10 000 Pa)53,54,55. Ze względu na grubość żelu PAA (~100 μm) metoda ta ogranicza stosowanie soczewek o dużym powiększeniu podczas mikroskopii. Aby uzyskać obrazy o dużym powiększeniu, badacze powinni korzystać z funkcji zoomu w laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym.

Podsumowując, obecne obrazowanie plamkowe i mikroskopia sił trakcyjnych umożliwiają analizę ilościową kluczowych zdarzeń w generacjach sił. Informacje te będą nieocenione dla lepszego zrozumienia mechanizmów, które leżą u podstaw rozwoju stożka wzrostu i nawigacji.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez AMED w ramach grantu numer 21gm0810011h0005 (N.I. i Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) i JSPS Grants-in-Aid dla początkujących naukowców (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Incurable Diseases (T.M.) oraz NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5% roztwór niebieskiego trypanuNacalai29853-34
3-aminopropylotrimetyoksysilanSigma281778-100ML
Monomer akryloamiduNacalai00809-85
Nadsiarczan amonuCytiva17-1311-1
Axio Observer Z1Zeiss431007-9902-000Mikroskop epifluorescencyjny ( obrazowanie z pojedynczą plamką)
Suplement B-27 (50x)Thermo Fisher Scientific17504-044
Surowica bydlęca albmineSigmaA7906-10G
C-Apochromat 63x/1,2 W CorrZeiss421787-9970-799Soczewka obiektywowa (mikroskopia siły trakcji)
Szkiełko nakrywkowe (średnica 18 mm)MatsunamiC018001
D-glukozaNacalai16806-25
DNaseISigmaDN25-100MG
Surowica bydlęcapłodu Thermo Fisher Scientific10270-106
FijiPakiet oprogramowania Open sourcehttps://imagej.net/software/fiji/
FluoSpheres modyfikowany karboksylanem 0,2 mm, czerwony (580/605), 2% stałeThermo Fisher ScientificF8810modyfikowany karboksylanem mikrokulki
Naczynie ze szklanym dnem (średnica 14 mm)MatsunamiD1130H
Naczynie ze szklanym dnem (średnica 27 mm)MatsunamiD1140H
Roztwór aldehydu glutarowegoSigmaG5882-10X10ML
HaloTag TMRligand PromegaG8251
HBO103 W/2Osram4050300382128Lampa rtęciowa (pojedyncza plamka obrazowanie)
Zestaw narzędzi do przetwarzania obrazuMathWorkhttps://www.mathworks.com/products/image.html
Roztwór Lamininy z mysiego guza EHSWako120-05751
Leibovitz' s L-15 mediumThermo Fisher Scientific11415064
L-glutaminaNacalai16919-42
LSM710ZeissN/AKonforcyjny mikroskop laserowy (mikroskopia sił pociągowych)
MATLAB2018aMyszhttps://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html
C57BL/6Japonia SLCNie dotyczy
Zestaw nukleofektora neuronów myszyLonzaVPG-1001
N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Nacalai33401-72
N,N'-metylenobisakryloamidNacalai22402-02
Pożywka neuropodstawowaThermo Fisher Scientific21103-049
Nucleofector IAmaxaAAD-1001Aparat do elektroporacji
ORCA Flash 4.0 V2HamamatsuC11440-22CUKamera CMOS (obrazowanie z pojedynczą plamką)
PapainaNacalai26036-34
Zestaw narzędzi do obliczeń równoległychMathWorkhttps://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html
pEGFP-C1Clontech1528177
Penicylina-streptomycyna (100x)Nacalai Tesque26253-84
pFN21A-HaloTag-aktyna(Minegishi i wsp., 2018)N/A
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) pH 7,4 (10x)Thermo Fisher Scientific70011-044
Plan-Apochromat 100x/1.4 OlejZeiss420790-9901-000Soczewka obiektywowa (obrazowanie z pojedynczą plamką)
pmNeonGreen-N1-Lifeact(Kastian i in., 2021)N/A
Bromowodorek poli-D-lizynySigmaP6407-5MG
Slulfo-SAMPHAThermo Fisher Scientific22589
Dodecylosiarczan soduNacalai08933-05
Hydrat sodu (NaOH)Nacalai31511-05
Stalowa kulaSako tekkouN/AMicroshpere do określania sztywności żelu PAA. Średnica 0,6 mm, 7,87 g/cm3.
ZEN2009Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction(mikroskopia sił trakcyjnych)
ZEN2012Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introductionOprogramowanie do akwizycji obrazu (obrazowanie z pojedynczą plamką)
MathWork Oprogramowanie do akwizycji obrazu

Bibliografia

  1. TessierLavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274, 1123-1133 (1996).
  2. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 001834(2010).
  3. Vitriol, E. A., Zheng, J. Q. Growth cone travel in space and time: the cellular ensemble of cytoskeleton, adhesion, and membrane. Neuron. 73 (6), 1068-1081 (2012).
  4. Cooper, J. A. Cell biology in neuroscience: mechanisms of cell migration in the nervous system. Journal of Cell Biology. 202, 725-734 (2013).
  5. Dupraz, S., et al. RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain. Current Biology. 29, 3874-3886 (2019).
  6. Suter, D. M., Miller, K. E. The emerging role of forces in axonal elongation. Progress in Neurobiology. 94, 91-101 (2011).
  7. Franze, K. Integrating chemistry and mechanics: the forces driving axon growth. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 61-83 (2020).
  8. Mitchison, T., Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1, 761-772 (1988).
  9. Suter, D. M., Forscher, P. Substrate-cytoskeletal coupling as a mechanism for the regulation of growth cone motility and guidance. Journal of Neurobiology. 44, 97-113 (2000).
  10. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 332-343 (2009).
  11. Minegishi, T., et al. Shootin1b mediates a mechanical clutch to produce force for neuronal migration. Cell Reports. 25, 624-639 (2018).
  12. Minegishi, T., Inagaki, N. Forces to drive neuronal migration steps. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 863(2020).
  13. Forscher, P., Smith, S. J. Actions of cytochalasins on the organization of actin filaments and microtubules in a neuronal growth cone. Journal of Cell Biology. 107, 1505-1516 (1988).
  14. Suter, D. M., Forscher, P. An emerging link between cytoskeletal dynamics and cell adhesion molecules in growth cone guidance. Current Opinion in Neurobiology. 8, 106-116 (1998).
  15. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  16. Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. Current Biology. 8, 1227-1230 (1998).
  17. Katoh, K., Hammar, K., Smith, P. J., Oldenbourg, R. Birefringence imaging directly reveals architectural dynamics of filamentous actin in living growth cones. Molecular Biology of the Cell. 10, 197-210 (1999).
  18. Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 295, 1083-1086 (2002).
  19. Medeiros, N. A., Burnette, D. T., Forscher, P. Myosin II functions in actin-bundle turnover in neuronal growth cones. Nature Cell Biology. 8, 215-226 (2006).
  20. Shimada, T., et al. Shootin1 interacts with actin retrograde flow and L1-CAM to promote axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 181, 817-829 (2008).
  21. He, M., Zhang, Z. H., Guan, C. B., Xia, D., Yuan, X. B. Leading tip drives soma translocation via forward F-actin flow during neuronal migration. Jounal of Neuroscience. 30, 10885-10898 (2010).
  22. Toriyama, M., Kozawa, S., Sakumura, Y., Inagaki, N. Conversion of a signal into forces for axon outgrowth through Pak1-mediated shootin1 phosphorylation. Current Biology. 23, 529-534 (2013).
  23. Abe, K., et al. Grip and slip of L1-CAM on adhesive substrates direct growth cone haptotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 2764-2769 (2018).
  24. Baba, K., et al. Gradient-reading and mechano-effector machinery for netrin-1-induced axon guidance. Elife. 7, 34593(2018).
  25. Nichol, R. I., Hagen, K. M., Lumbard, D. C., Dent, E. W., Gomez, T. M. Guidance of axons by local coupling of retrograde flow to point contact adhesions. Journal of Neuroscience. 36, 2267-2282 (2016).
  26. Shekarabi, M., et al. Deleted in colorectal cancer binding netrin-1 mediates cell substrate adhesion and recruits Cdc42, Rac1, Pak1, and N-WASP into an intracellular signaling complex that promotes growth cone expansion. Journal of Neuroscience. 25, 3132-3141 (2005).
  27. Kubo, Y., et al. Shootin1-cortactin interaction mediates signal-force transduction for axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 210, 663-676 (2015).
  28. Huber, A. B., Kolodkin, A. L., Ginty, D. D., Cloutier, J. F. Signaling at the growth cone: ligand-receptor complexes and the control of axon growth and guidance. Annual Review of Neuroscience. 26, 509-563 (2003).
  29. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, 001727(2011).
  30. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128, 29-43 (2007).
  31. Tatavarty, V., Kim, E. J., Rodionov, V., Yu, J. Investigating sub-spine actin dynamics in rat hippocampal neurons with super-resolution optical imaging. PLoS One. 4, 7724(2009).
  32. Frost, N. A., Shroff, H., Kong, H., Betzig, E., Blanpied, T. A. Single-molecule discrimination of discrete perisynaptic and distributed sites of actin filament assembly within dendritic spines. Neuron. 67, 86-99 (2010).
  33. Chazeau, A., et al. Nanoscale segregation of actin nucleation and elongation factors determines dendritic spine protrusion. EMBO Journal. 33, 2745-2764 (2014).
  34. Garcia, M., et al. Two-tiered coupling between flowing actin and immobilized N-cadherin/catenin complexes in neuronal growth cones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 6997-7002 (2015).
  35. Swaminathan, V., et al. Actin retrograde flow actively aligns and orients ligand-engaged integrins in focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 10648-10653 (2017).
  36. Tsai, T. Y., et al. Efficient front-rear coupling in neutrophil chemotaxis by dynamic myosin II localization. Developmental Cell. 49, 189-205 (2019).
  37. Zhang, X. F., et al. Regulation of axon growth by myosin II-dependent mechanocatalysis of cofilin activity. Journal of Cell Biology. 218 (7), 2329-2349 (2019).
  38. Reversat, A., et al. Cellular locomotion using environmental topography. Nature. 582, 582-585 (2020).
  39. Katsuno, H., et al. Actin migration driven by directional assembly and disassembly of membrane-anchored actin filaments. Cell Reports. 12, 648-660 (2015).
  40. Urasaki, A., et al. Shootins mediate collective cell migration and organogenesis of the zebrafish posterior lateral line system. Scientific Reports. 9, 12156(2019).
  41. Abe, K., et al. Mechanosensitive axon outgrowth mediated by L1-laminin clutch interface. Biophysical Journal. 120, 3566-3576 (2021).
  42. Kastian, R. F., et al. Shootin1a-mediated actin-adhesion coupling generates force to trigger structural plasticity of dendritic spines. Cell Reports. 35, 109130(2021).
  43. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
  44. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322, 1687-1691 (2008).
  45. Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  46. Li, Y., Hu, Z., Li, C. New method for measuring poisson's ratio in polymer gels. Journal of Applied Polymer Science. 50, 1107-1111 (1993).
  47. Belyy, A., Merino, F., Sitsel, O., Raunser, S. Structure of the Lifeact-F-actin complex. PLoS Biology. 18, 3000925(2020).
  48. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9, 3241(2019).
  49. Kumari, A., Kesarwani, S., Javoor, M. G., Vinothkumar, K. R., Sirajuddin, M. Structural insights into actin filament recognition by commonly used cellular actin markers. EMBO Journal. 39, 104006(2020).
  50. du Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2390-2395 (2005).
  51. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466, 263-266 (2010).
  52. Koch, D., Rosoff, W. J., Jiang, J., Geller, H. M., Urbach, J. S. Strength in the periphery: growth cone biomechanics and substrate rigidity response in peripheral and central nervous system neurons. Biophysical Journal. 102 (3), 452-460 (2012).
  53. Barnes, J. M., Przybyla, L., Weaver, V. M. Tissue mechanics regulate brain development, homeostasis and disease. Journal of Cell Science. 130, 71-82 (2017).
  54. Moore, S. W., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Stretchy proteins on stretchy substrates: the important elements of integrin-mediated rigidity sensing. Developmental Cell. 19, 194-206 (2010).
  55. Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews Neuroscience. 13, 867-878 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

przepływ wsteczny F-aktynyobrazowanie pojedynczych plamekmikroskopia sił trakcyjnychmigracja neuronalnapolimeryzacja aktynymikroskopia konfokalna
Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.