Artykuł metodologiczny

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

DOI:

10.3791/63227

⸱

21 października 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems Neurobiology and Medicine, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology, 2Laboratory of Data-Driven Biology, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby stworzyć funkcjonalne sieci, neurony muszą migrować do odpowiednich miejsc docelowych, a następnie rozszerzać aksony w kierunku swoich komórek docelowych. Procesy te zależą od postępów stożków wzrostu, które znajdują się na końcach neurytów. Stożki wzrostu aksonów generują siły napędowe, wyczuwając swoje lokalne mikrośrodowisko i modulując dynamikę cytoszkieletu oraz sprzężenie adhezyjne aktyna (sprzężenie sprzęgła). Dziesięciolecia badań doprowadziły do zidentyfikowania cząsteczek naprowadzających, ich receptorów i kaskad sygnalizacyjnych w celu regulacji migracji neuronów i prowadzenia aksonów; Jednak mechanizmy molekularne niezbędne do generowania sił napędzających postęp stożka wzrostu i nawigację dopiero zaczynają być wyjaśniane. Na przedniej krawędzi neuronalnych stożków wzrostu włókna aktyny podlegają przepływowi wstecznemu, który jest napędzany przez polimeryzację aktyny i skurcz aktomiozyny. Sprzężenie sprzęgła między przepływem wstecznym F-aktyny a podłożem adhezyjnym generuje siły trakcyjne dla wyprzedzenia stożka wzrostu. W niniejszym badaniu opisano szczegółowy protokół monitorowania wstecznego przepływu F-aktyny za pomocą obrazowania pojedynczej plamki. Co ważne, w połączeniu z markerem F-aktyny Lifeact, technika ta może określić ilościowo 1) szybkość polimeryzacji F-aktyny i 2) skuteczność sprzężenia sprzęgła między przepływem wstecznym F-aktyny a podłożem adhezyjnym. Obie są zmiennymi krytycznymi do generowania sił dla wzrostu stożka wyprzedzenia i nawigacji. Ponadto w niniejszym badaniu opisano szczegółowy protokół mikroskopii sił trakcyjnych, który może określić ilościowo 3) siłę trakcyjną generowaną przez stożki wzrostu. W ten sposób, łącząc analizy obrazowania pojedynczej plamki i mikroskopii siły pociągowej, badacze mogą monitorować mechanikę molekularną leżącą u podstaw wyprzedzenia stożka wzrostu i nawigacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W rozwijającym się mózgu kręgowców neurony przechodzą misternie zorganizowane migracje i kierują aksony w kierunku odpowiednich partnerów synaptycznych w celu utworzenia funkcjonalnych sieci neuronowych1,2,3. Stożki wzrostu, które są czuciowymi i ruchliwymi strukturami znajdującymi się na czubku neurytów, określają prędkość i kierunek migracji neuronów oraz wzrostu aksonów3,4,5. Ponieważ neurony są otoczone ciasno upakowanymi środowiskami, stożki wzrostu muszą wywierać siły na swoje otoczenie, aby poruszać się naprzód6,7. Aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw migracji neuronów i przewodnictwa aksonów, niezbędne są analizy mechaniki molekularnej postępu stożka wzrostu.

Dziesięciolecia analiz wykazały, że siła pociągowa napędzająca postęp stożka wzrostu jest generowana przez mechanizm 'sprzęgła'; uważa się, że mechanizm ten działa nie tylko w stożku wzrostu aksonu, ale także w stożku wzrostu głównego procesu migrujących neuronów8,9,10,11,12. Mianowicie, filamenty aktynowe (F-aktyny) w stożkach wzrostu polimeryzują na krawędzi natarcia i depolimeryzują proksymalnie, wypychając membranę krawędzi natarcia13,14,15. Wynikowa siła, w połączeniu ze skurczem aktomiozyny, indukuje ruch F-aktyn do tyłu zwany przepływem wstecznym7,11,16,17,18,19,20,21. Cząsteczki adhezyjne sprzęgła i komórek pośredniczą w mechanicznym sprzężeniu między przepływem wstecznym F-aktyny a podłożem adhezyjnym i przenoszą siłę przepływu F-aktyny na podłoże, generując w ten sposób siłę pociągową dla wzrostu stożek natarcia 7,8,9,11,12,22. Jednocześnie sprzężenie aktyna-substrat zmniejsza prędkość przepływu F-aktyny i przekształca polimeryzację aktyny w siłę wystającą z membrany krawędzi natarcia9,10.

Stożki wzrostu aksonów wyczuwają lokalne sygnały chemiczne i przekształcają je w kierunkową siłę napędową dla nawigacji po stożku wzrostu3,23,24,25. Na przykład cząsteczka prowadząca aksony netrin-1 stymuluje swój receptor deleczowany w raku jelita grubego (DCC) i aktywuje białko kontrolujące podział komórek 42 (Cdc42) wiążące trifosforan guanozyny (GTP) i substrat 1 toksyny botulinowej C3 związany z Ras (Rac1) oraz ich kinazę aktywowaną przez p21 (Pak1)26. Cdc42 i Rac1 promują 1) polimeryzację aktyny, a Pak1 fosforyluje cząsteczkę sprzęgła shootin122,26. Shootin1 oddziałuje z przepływem wstecznym F-aktyny poprzez białko wiążące aktynę cortactin27. Shootin1 oddziałuje również z cząsteczką adhezyjną komórek L1 (L1-CAM)20,24. Fosforylacja Shootin1 zwiększa powinowactwo wiązania kortaktyny i L1-CAM oraz wzmacnia sprzężenie sprzęgła za pośrednictwem shootin1 2) sprzęgło sprzęgła24,27. W obrębie stożka wzrostu asymetryczne aktywacje polimeryzacji aktyny i sprzężenia sprzęgła zwiększają 3) siłę uciągu po stronie źródła netryny-1, generując w ten sposób kierunkową siłę napędową do obracania stożka wzrostu (Rysunek 1)24. Intensywne badania prowadzone w ciągu ostatnich kilku dekad w odniesieniu do migracji neuronów i kierowania aksonami poszerzyły wiedzę na temat cząsteczek naprowadzających, ich receptorów i związanych z nimi kaskad sygnałowych2,10,28,29,30. Jednak mechanizmy molekularne generujące siły powodujące postęp stożka wzrostu dopiero zaczynają być wyjaśniane; Można to przypisać ograniczonemu wykorzystaniu protokołów do analiz mechanobiologicznych.

Niniejsze badanie opisuje szczegółowy protokół monitorowania wstecznego przepływu F-aktyny za pomocą obrazowania pojedynczej plamki16,18. Monitorowanie przepływu wstecznego F-aktyny zostało szeroko przeprowadzone przy użyciu mikroskopii superrozdzielczej, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i mikroskopii fluorescencji refleksyjnej (TIRF) 25,31,32,33,34,35,36,37,38. Protokół w niniejszym badaniu wykorzystuje jednak standardowy mikroskop epifluorescencyjny, dzięki czemu można go łatwo zaadoptować11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. W połączeniu z znakowaniem F-aktyny przez Lifeact43, obrazowanie pojedynczej plamki pozwala na ilościowe określenie szybkości polimeryzacji aktyny i wydajności sprzężenia sprzęgła między przepływem wstecznym F-aktyny a podłożem adhezyjnym39,42. W niniejszym badaniu opisano szczegółowy protokół mikroskopii siły trakcyjnej przy użyciu żelu poliakrylamidowego (PAA) zatopionego we fluorescencyjnym kulkach11,22,23,24,27,39,41,42,44. Ta metoda wykrywa i określa ilościowo siłę uciągu pod stożkiem wzrostu, monitorując ruchy ściegu wywołane siłą44,45. Dostępny jest kod analizy siły pociągowej o otwartym kodzie źródłowym, a metoda ilościowego określania siły uciągu podczas migracji stożka wzrostu jest szczegółowo wyjaśniona. Dzięki obrazowaniu pojedynczych plamek i mikroskopii sił trakcyjnych łatwiej będzie zrozumieć mechanikę molekularną leżącą u podstaw migracji stożków wzrostu i nawigacji. Techniki te mają również zastosowanie do analizy mechaniki molekularnej leżącej u podstaw dendrytycznego powiększania kręgosłupa, o którym wiadomo, że jest ważne w uczeniu się i pamięci42.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty z użyciem zwierząt laboratoryjnych zostały przeprowadzone z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Instytutu Nauki i Technologii w Narze. Badacze powinni postępować zgodnie z ustalonymi wytycznymi swoich instytucjonalnych i krajowych komitetów regulacyjnych ds. zwierząt w zakresie opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania.

1. Przygotowanie roztworów i mediów

  1. Przygotować roztwory i pożywki hodowlane zgodnie z podsumowaniem w pliku uzupełniającym 1

2. Przygotowanie podłoży pokrytych poli-D-lizyną (PDL)/lamininą

  1. Pokryć naczynia ze szklanym dnem o średnicy 14 mm roztworem PDL o stężeniu 100 μg/ml, rozpuszczonym w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS, pH 7,4) i inkubować przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Nie susz szklanych powierzchni po tym kroku
  2. Usunąć roztwór PDL i trzykrotnie odpipetować 1 ml PBS na szkło przez 10 s.
  3. Pokryć szalki 5 μg/ml lamininy, rozpuszczonej w PBS i inkubować przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  4. Usuń roztwór lamininy i trzykrotnie odpipetuj 1 ml PBS na szklance przez 10 sekund.
  5. Usunąć PBS i umieścić 0,5 ml podłoża neurobazalnego na szklanych powierzchniach. Przechowywać naczynia w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Naczynia pokryte PDL/lamininą można przechowywać przez 2-3 dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.

3. Rozwarstwienie i dysocjacja hipokampa

  1. Eutanazja ciężarnej myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
    UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano komercyjnie dostępne myszy (patrz tabela materiałów). Badacze powinni używać myszy, które są hodowane i humanitarnie traktowane w wysterylizowanym środowisku.
  2. Wypreparuj embrionalne zarodki myszy z dnia 16 (E16) i umieść je na lodzie.
  3. W okapie z przepływem laminarnym wypreparuj mózgi nożyczkami i umieść je na sterylnym 10-centymetrowym naczyniu zawierającym 10 ml lodowatego roztworu preparacyjnego.
  4. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego ostrożnie oderwij opony mózgowe półkul mózgowych, a następnie wypreparuj hipokampy za pomocą kleszczy.
  5. Przenieś hipokampy do 5 ml lodowatego roztworu do wytrawiania w probówce o pojemności 15 ml. Inkubować hipokampy w łaźni wodnej przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Usuń roztwór wytrawiający i dodaj 3 ml roztworu do rozwarstwiania.
  7. Delikatnie odpipetuj hipokampy cztery razy pipetą Pasteura.
  8. Inkubować hipokampy w łaźni wodnej przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
  9. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać 3 ml nowego roztworu rozwarstwiającego do niezdysocjowanej tkanki.
  10. Powtarzaj kroki 3.7-3.9, aż hipokampy całkowicie się rozłączą.
  11. Usunąć pływające agregaty DNA z zawiesiny komórkowej poprzez wirowanie i zasysanie pipetą Pasteura. Odwirować zawiesinę komórek o sile 180 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: DNA pochodzące z uszkodzonych komórek zakłóci proces wirowania. Jeśli neurony pozostaną w supernatancie, należy ponownie odwirować zawiesinę komórkową po ostrożnym usunięciu DNA.
  12. W wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C należy zrównoważyć podłoże neurobazalne zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), penicylinę (100 μg/ml) i streptomycynę (100 μg/ml) z 5% CO2 .

4. Transfekcja i hodowla neuronów

  1. Usunąć supernatant i dodać 5 ml lodowatego PBS do probówki o pojemności 50 ml. Zawiesić osad komórkowy przez delikatne pipetowanie.
  2. Przenieść 10 μl zawiesiny komórek do probówki mikrowirówkowej, dodać 10 μl 0,5% roztworu błękitu trypanowego, a następnie policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
  3. Odwirować zawiesinę komórek w probówce o pojemności 50 ml o sile 180 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  4. W międzyczasie podwielokrotność do transfekcji, 1 μg pFN21A-HaloTag-aktyny i 3 μg pmNeonGreen-N1-Lifeact na 1 x 106 komórek, do probówki mikrowirówkowej.
  5. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dodać 100 μl pożywki do elektroporacji (dostarczonej przez zestaw do transfekcji) do probówki o pojemności 50 ml. Zawiesić osad komórkowy przez pipetowanie.
  6. Wymieszać zawiesinę komórkową z roztworem DNA podzielonego na porcję i przenieść mieszaninę do kuwety (dostarczonej przez zestaw do transfekcji).
    UWAGA: Ponieważ pęcherzyki powietrza zakłócają elektroporację, należy je usunąć z zawiesiny ogniwa.
  7. Włóż kuwetę do aparatu do elektroporacji (Tabela materiałów) i wykonaj elektroporację za pomocą programu O-005.
  8. Natychmiast dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej i zrównoważonej pożywki neuropodstawowej zawierającej 10% FBS, penicylinę (100 U/ml) i streptomycynę (100 μg/ml) do kuwety.
  9. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą plastikowej pipety (dołączonej do zestawu do transfekcji).
  10. Przenieś 10 μl zawiesiny komórek do mikroprobówki, dodaj 10 μl 0,5% roztworu błękitu trypanowego, a następnie policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
  11. Wyjąć z inkubatora naczynia ze szklanym dnem pokryte PDL/lamininą i usunąć podłoże neuropodstawowe.
  12. Odpipetować 0,5 ml zawiesiny komórkowej zawierającej 2,0 x 105 komórek na szalkę i inkubować w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 godziny.
  13. Zastąp pożywkę 0,5 ml pożywki neuropodstawowej zawierającej 2% suplementu B-27, glutaminę (1 mM), penicylinę (100 U/ml) i streptomycynę (100 μg/ml). Hodować neurony w wilgotnym inkubatorze przez 3 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

5. Obrazowanie pojedynczej plamki na stożkach wzrostu neuronów

  1. W dniu in vitro (DIV) 3 należy potraktować neurony ligandem tetrametylo-rodaminy (TMR) w rozcieńczeniu 1:2000 w pożywce hodowlanej. Utrzymuj neurony przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Umyj ligand TMR trzykrotnie wstępnie podgrzanym PBS.
  3. Wyjmij PBS i odpipetuj 0,5 ml podgrzanej pożywki L-15 firmy Leibovitz zawierającej 2% suplementu B-27, glutaminę (1 mM), penicylinę (100 U/ml) i streptomycynę (100 μg/ml).
  4. Utrzymuj neurony przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  5. Włączyć mikroskop epifluorescencyjny i ustawić inkubator stopniowy na 37 °C.
    UWAGA: W niniejszym protokole wykorzystano mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w komplementarną kamerę półprzewodnikową z tlenkiem metalu, soczewkę obiektywu zanurzeniowego w oleju 100x/1,40 NA, lampę rtęciową i oprogramowanie do akwizycji obrazu (patrz tabela materiałów). Do tej analizy można również użyć innych mikroskopów epifluorescencyjnych o równoważnych specyfikacjach.
  6. Umieść neurony potraktowane ligandem TMR w naczyniu ze szklanym dnem na rozgrzanym inkubatorze stage-top.
  7. Ustaw parametry akwizycji obrazu w następujący sposób: czas naświetlania, 500 ms dla kanałów fluorescencyjnych Lifeact i HaloTag-actin; binning, 1 x 1 (0,065 μm × 0,065 μm na piksel); interwał czasowy, 3 s; czas trwania, 50 klatek.
  8. Wybierz stożek wzrostu, który silnie wyraża Lifeact i słabo wyraża HaloTag-actin.
    UWAGA: Ekspresja Lifeact powinna być wystarczająco silna, aby uwidocznić morfologię stożka wzrostu. Ekspresja aktyny HaloTag powinna być słaba, niewystarczająca, aby mogła zostać wykryta (Rysunek 2A). Poziomy ekspresji białek fluorescencyjnych można regulować, zmieniając ilość DNA do transfekcji.
  9. Zamknij pole przysłony, aby oświetlić minimalny obszar, który obejmuje stożek wzrostu (Rysunek 2B).
    UWAGA: Oświetlenie minimalnego obszaru zmniejsza sygnał tła i zwiększa stosunek sygnału fluorescencji do szumu (S/N), umożliwiając wykrycie plamek aktyny (Rysunek 2B). Aby jeszcze bardziej zwiększyć stosunek sygnału do szumu, zaleca się oświetlenie stożka wzrostu bez zmniejszania światła przez filtry o neutralnej gęstości.
  10. Pozyskiwanie zdjęć poklatkowych (plik uzupełniający 2). Zapisz jako wielokanałowy obraz poklatkowy (format tiff).

6. Kwantyfikacja prędkości przepływu F-aktyny i szybkości polimeryzacji przy użyciu oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów Fidżi

UWAGA: Zapoznaj się z plikiem uzupełniającym 3, aby uzyskać praktyczne dane do ilościowego określania prędkości przepływu F-aktyny i szybkości polimeryzacji aktyny.

  1. Otwórz wielokanałowy obraz stosu poklatkowego na Fidżi.
  2. Wybierz opcję Analizuj > Ustaw skalę, a następnie ustaw rozmiar obrazów w pikselach.
  3. Znajdź plamkę aktyny, która płynie wstecz przez co najmniej pięć ram czasowych w wiązce F-aktyny w filopodiach lub lamellipodiach.
  4. Wybierz Obraz > Przekształć > Obróć i dostosuj kąt obrazów tak, aby wiązka F-aktyny była skierowana w górę (Rysunek 3A).
  5. Kliknij Prostokąt na pasku narzędzi i narysuj pole zawierające plamki aktyny i końcówkę pakietu F-aktyny (Rysunek 3B, 1 i 2).
    UWAGA: Sygnały plamek HaloTag-aktyny są słabe. Ponadto sygnały Lifeact na dystalnych końcach stożka wzrostu są słabe i słabe (Rysunek 2B), ponieważ dystalne końcówki stożka wzrostu są cienkie w porównaniu z częścią proksymalną. Badacze powinni wzmocnić sygnały, aby zoptymalizować kwantyfikacje prędkości przepływu F-aktyny i szybkości polimeryzacji (Rysunek 3B). Chociaż sygnał Lifeact na proksymalnym stożku wzrostu ulega nasyceniu, nie zakłóci to wyznaczenia dystalnego końca F-aktyn (Rysunek 3E, żółta linia).
  6. Wybierz Obraz > Duplikuj i wprowadź pięć przedziałów czasowych ( Rysunek 3B, 3-5).
  7. Wybierz Obraz > Stosy > Utwórz montaż i wprowadź parametry: Kolumny, 5; Wiersze, 1; Współczynnik skali, 1.
  8. Kliknij OK. Na ekranie pojawi się montaż obrazu.
  9. Wybierz opcję Obraz > Kolor > Podziel kanały. To oddziela dwa kanały fluorescencyjne.
  10. Kwantyfikacja prędkości przepływu F-aktyny.
    1. Wybierz opcję Analizuj > Ustaw miary, a następnie wybierz opcję Obszar i prostokąt ograniczający.
    2. Kliknij na Owal na pasku narzędzi i narysuj okrąg na plamce aktyny (Rysunek 3C, 1 i 2).
    3. Wybierz opcję Obraz > nakładkę > Dodaj zaznaczenie. Okrąg jest nałożony na montaż obrazu (Rysunek 3C, 3 i 4).
      UWAGA: Kolor nakładki można zmienić w Edycja > Opcje > Kolory.
    4. Powtórz nakładanie okręgów dla pozostałych plamek (Rysunek 3C, 5).
      UWAGA: Aby dokładnie określić środki plamki aktyny, badacze powinni nałożyć okręgi na plamki.
    5. Kliknij na Prosto na pasku narzędzi i narysuj linię łączącą środki okręgów (Rysunek 3D, 1 i 2).
    6. Wybierz opcję Analizuj > mierz. Wynik pojawi się na ekranie (Rysunek 3D, 3).
      UWAGA: Wysokość wyświetlana w wyniku wskazuje odległość translokacji plamki aktyny podczas obserwacji (Rysunek 3D, 3).
    7. Oblicz prędkość przepływu F-aktyny, dzieląc odległość translokacji przez czas obserwacji.
  11. Kwantyfikacja szybkości polimeryzacji F-aktyny.
    1. Narysuj linię łączącą końcówki wiązki F-aktyny (Rysunek 3E, 1).
    2. Wybierz opcję Analizuj > mierz. Wynik pojawi się na ekranie (Rysunek 3E, 2).
      UWAGA: Wysokość w wyniku wskazuje długość rozciągnięcia wiązki F-aktyny podczas obserwacji (Rysunek 3E, 2).
    3. Oblicz szybkość wydłużania F-aktyny, dzieląc długość wydłużenia przez czas obserwacji.
    4. Oblicz szybkość polimeryzacji F-aktyny jako sumę prędkości przepływu F-aktyny i szybkości rozciągania (Rysunek 3F).

7. Przygotowanie żelu PAA do mikroskopii sił trakcyjnych i hodowli neuronów

  1. Przygotowanie żeli PAA wymaganych do mikroskopii siły pociągowej (Rysunek 4)
    1. Odpipetować 0,5 ml NaOH (100 mM), rozpuszczonego w destylowanymH2O, na szalkach ze szklanym dnem o średnicy 27 mm i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Dodać 50 μl 3-aminopropylotrimetyoksysilanu (APTMS) do roztworu NaOH na szalkach i wymieszać roztwory przez delikatne pipetowanie i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj naczynia ze szklanym dnem destylowanymH2Oi wysusz
      4. .
    4. Odpipetować 0,5 ml 0,5% roztworu aldehydu glutarowego, rozpuszczonego w PBS, na szklanym naczyniu poddanym działaniu APTMS i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Umyć naczynia ze szklanym dnem destylowanymH2Oi wysuszyć.
    6. Przygotować roztwór zawierający destylowanyH2O(412 μL), 30% (m/v) roztwór akryloamidu (63 μL), 2,5% (m/v) roztwór bis-akrylamidu (6 μL) i roztwór mikrosfery modyfikowanej karboksylanem (kulka fluorescencyjna) (20 μL).
      UWAGA: Odwiruj roztwór kulek fluorescencyjnych, aby zdysocjować zagregowane kulki przed dodaniem do roztworu akrylamidu.
    7. Odgazować roztwór w komorze próżniowej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Do tego roztworu dodać 1 μl 10% (w/v) nadsiarczanu amonu (APS), rozpuszczonego w destylowanymH2O, i 1 μl N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i wymieszać delikatnie pipetując.
    9. Umieścić szklane szkiełko nakrywkowe (o średnicy 18 mm) na nasadce probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    10. Natychmiast dodać 25 μl roztworu do szkiełka nakrywkowego, a następnie delikatnie umieścić na szkiełku nakrywkowym naczynie z odwróconym szklanym dnem. Pozostawić akryloamid do polimeryzacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    11. Nanieść destylowany H2Ona szkiełko nakrywkowe i oderwać go od żelu za pomocą igły strzykawkowej z zagiętą końcówką.
    12. UsunąćH2Oi dodać do żelu sulfo-SANPAH (1 mM), rozpuszczony w PBS.
    13. W sterylnych warunkach wystawiaj żele na działanie światła ultrafioletowego przez 5 minut. Umyj żel trzy razy PBS przez 15 minut na pranie.
  2. Oznaczanie sztywności żelu metodą wgłębień mikrosferycznych (Rysunek 5A)44.
    1. Przenieś mikrosferę, która jest określona dla średnicy i gęstości, do żelu, a następnie umieść ją na stoliku próbki laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.
    2. Skoncentruj się na powierzchni żelu i zapisz pozycję z ( Rysunek 5B).
    3. Podobnie, skup się na dolnej części mikrosfery i zapisz pozycję z (Rysunek 5C).
    4. Obliczyć głębokość wgłębienia określoną przez różnicę między pozycjami z powierzchni żelu a dnem mikrosfery.
    5. Obliczać moduł E Younga żelu według wzoru:
      figure-protocol-1
      gdzie f jest ciężarem mikrosfery skorygowanym o wyporność, d jest głębokością wgłębienia żelu, r jest promieniem mikrosfery, a v jest współczynnikiem Poissona (którego wartość wynosi 0,3, jak określono wcześniej46).
  3. Pokryć żele PDL i lamininą zgodnie z opisem w punkcie 2.
  4. Jak opisano w sekcjach 3 i 4, należy wyciąć zarodki myszy E16, rozdzielić hipokampy i przeprowadzić transfekcję za pomocą 5 μg pEGFP-C1 na 1,0 x 106 komórek. Wysiew 2,0 x 105 komórek na żelach pokrytych PDL/lamininą.
    UWAGA: Do analizy siły pociągowej konieczne jest obrazowanie mikroskopowe komórek znakowanych fluorescencyjnie w celu określenia obszaru stożka wzrostu.

8. Mikroskopia sił trakcyjnych na stożkach wzrostu neuronów

  1. Na DIV3 zastąp pożywkę hodowlaną 0,5 ml podgrzanej pożywki L-15 Leibovitz zawierającej 2% suplementu B-27, glutaminę (1 mM), penicylinę (100 U/ml) i streptomycynę (100 μg/ml). Utrzymuj neurony przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  2. Włączyć laserowy skaningowy mikroskop konfokalny i ustawić inkubator stopniowy na 37 °C.
    UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano laserowy skaningowy mikroskop konfokalny wyposażony w soczewkę obiektywową 63x/1,2 NA zanurzoną w wodzie oraz oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazu (patrz tabela materiałów).
  3. Umieść neurony w naczyniu ze szklanym dnem na wstępnie podgrzanym inkubatorze stage-top.
  4. Ustaw parametry akwizycji obrazu w następujący sposób: rozmiar skanu, 512 × 512 pikseli; obszar skanowania, powiększenie 1,5-3x; prędkość skanowania, ~1 s na klatkę; długość fali lasera, 561 nm (długość fali wzbudzenia dla kulek fluorescencyjnych) i 488 nm (długość fali wzbudzenia dla wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP)); przedział czasowy, 3 s; czas trwania, 50 klatek.
  5. Aby zobrazować morfologię stożka wzrostu, wybierz stożek wzrostu, który silnie wyraża EGFP.
  6. Skoncentruj się na powierzchni żelu i uzyskaj obrazy poklatkowe (Rysunek 6A i plik uzupełniający 4).
    UWAGA: Do analizy trakcyjnej należy użyć dwóch kanałów fluorescencyjnych (dla koralików fluorescencyjnych i EGFP) oraz kanału jasnego pola (zalecane jest przechwytywanie obrazów kontrastu interferencji różnicowej (DIC) lub kontrastu fazowego).
  7. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazów (np. Fidżi), aby utworzyć jednokanałowe stosy obrazów poklatkowych RGB i zapisać te obrazy jako pliki tiff.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby badacze zapisywali również surowe dane.
  8. Nałożyć 100 μl 10% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS), rozpuszczonego w destylowanymH2O, do naczynia ze szklanym dnem, aby rozluźnić podłoże żelowe poprzez uwolnienie neuronów z podłoża. Inkubuj naczynie przez 5 minut w temperaturze 37°C, aby ustabilizować temperaturę.
    UWAGA: Obraz stopek na nienaprężonym podłożu służy do odniesienia do oryginalnych pozycji ściegów podczas analizy siły pociągowej (Rysunek 6C). Zastosowanie roztworu SDS zmienia pozycje xyz spowodowane zmianą termiczną w inkubatorze i rozluźnieniem deformacji wywołanej przez komórkę. Badacze muszą zatem skorygować płaszczyznę ogniskowej i pozycję x-y.
  9. Skoncentruj się na powierzchni żelu i uzyskaj obraz kulek w nienaprężonym podłożu (Rysunek 6B).
  10. Utwórz jednokanałowy obraz RGB ściegów na nienaprężonym podłożu i zapisz ten obraz jako plik TIFF.
  11. Korekcja pozycji x-y obrazu ściegu na nienaprężonym podłożu za pomocą Fiji
    1. Na Fidżi otwórz obraz koralików w nienaprężonym podłożu i poklatkowy obraz stosu koralików fluorescencyjnych.
    2. Wybierz opcję Stosy obrazów > > Narzędzia > Konkatenuj. Na ekranie pojawi się okno dialogowe (Rysunek 7A, 1).
    3. Wybierz obraz koralika na nienaprężonym podłożu i obraz poklatkowy stosu koralików fluorescencyjnych odpowiednio na Obrazie1 i Obrazie2 (Rysunek 7A, 2).
    4. Kliknij OK. Obraz koralika na nienaprężonym podłożu jest dodawany do obrazu stosu poklatkowego (Rysunek 7A, 3).
    5. Za pomocą paska przewijania (Rysunek 7B, 1, czerwona ramka), wyświetl drugą klatkę obrazu stosu (czerwona strzałka).
    6. Wybierz Wtyczki > StackReg (Rysunek 7B, 2). Na ekranie pojawi się okno dialogowe (Rysunek 7B, 3).
    7. Wybierz Rigid Body z listy rozwijanej (Rysunek 7B, 3, czerwona ramka) i kliknij OK. Następnie rozpoczyna się korekta pozycji x-y.
    8. Użyj paska przewijania, aby wyświetlić pierwszą klatkę obrazu stosu z korekcją położenia x-y.
    9. Wybierz obraz > duplikat ( Rysunek 7C, 1). Na ekranie pojawi się okno dialogowe (Rysunek 7B, 2).
    10. Wprowadź wartość 1 w polu Zakres, usuń zaznaczenie opcji Duplikuj stos (Rysunek 7C, 2) i kliknij przycisk OK. Na ekranie pojawi się obraz koralika z korekcją położenia x-y na nienaprężonym podłożu (Rysunek 7C, 3). Zapisz ten obraz jako plik tiff.
  12. Kwantyfikacja siły pociągowej
    UWAGA: Opisana tutaj metoda analizy siły pociągowej wykorzystuje MATLAB i dwa zestawy narzędzi MATLAB, "Image Processing Toolbox" i "Parallel Computing Toolbox". Badacze będą musieli je zainstalować przed analizą. Kod analizy siły pociągowej został opracowany w oparciu o MATLAB w wersji 2018a. W związku z tym do analizy należy użyć programu MATLAB w wersji 2018a (lub nowszej). Algorytmy używane do analizy siły pociągowej zostały opisane wcześniej22.
    1. Pobierz kod analizy siły pociągowej TFM2021 z pliku uzupełniającego 5. Otwórz TFM 2021 w MATLAB
    2. Otwórz main.m w TFM2021 i uruchom go. Na ekranie pojawi się graficzny interfejs użytkownika (GUI) (Rysunek 8A).
    3. Kliknij Załaduj obraz nienaprężonego podłoża i wybierz obraz ściegu z korekcją położenia x-y na nienaprężonym podłożu.
    4. Kliknij Załaduj obrazy koralików fluorescencyjnych i wybierz poklatkowy obraz stosu koralików.
    5. Kliknij Załaduj obrazy w jasnym polu i wybierz obraz poklatkowy stosu jasnego pola.
    6. Kliknij Załaduj obrazy GFP i wybierz poklatkowy obraz stosu EGFP.
    7. Wybierz GFP z listy rozwijanej w graficznym interfejsie użytkownika (Rysunek 8A, czerwone pole).
    8. Kliknij ROI, aby określić prostokątny obszar zainteresowania (ROI), w tym stożek wzrostu, klikając dwa punkty na obrazie komórki wyświetlanym w graficznym interfejsie użytkownika (Rysunek 8B).
    9. Kliknij przycisk Zapisz w graficznym interfejsie użytkownika (Rysunek 8A, czerwona strzałka). Wybrane obrazy stosu, wraz z ROI, zostaną zapisane w pliku .mat (plik w formacie MATLAB).
    10. Kliknij Wykrywanie punktowe. Na ekranie pojawi się okno dialogowe.
    11. Wprowadź wartość (zwykle 50-150) w oknie dialogowym, aby określić próg wykrywania ściegów. Kliknięcie przycisku OK uruchamia obliczenia.
    12. Po zakończeniu obliczeń kliknij Wykres ścieżki, aby powiększyć obszar wybrany w kroku 8.12.8 i wyświetlić wykryte koraliki jako białe kropki (Rysunek 8C, 1).
      UWAGA: Sprawdź, czy wykrywanie koralików (białe kropki) nakłada się na koraliki fluorescencyjne. Wykrywanie koralików może również wykrywać szum tła. Aby zmniejszyć te zakłócenia zewnętrzne, zmień wartość progową w opcji Wykrywanie punktowe. Ponadto ręcznie wybierz odpowiednie kropki w kroku 8.12.13.
    13. Kliknij Wybierz koraliki i wyznacz wielokątny obszar, który zawiera odpowiednie kropki pod stożkiem wzrostu. Naciśnij Enter na klawiaturze. Białe kropki w obszarze wielokąta zmienią kolor na czerwony (Rysunek 8C, 2).
    14. Kliknij Oszacuj siłę w graficznym interfejsie użytkownika. Następnie wprowadź wartości dla następujących parametrów: rozmiar piksela, μm/piksel; moduł Younga, wartość obliczona w kroku 7.2.5; Współczynnik Poissona, 0,3.
    15. Wykonaj polecenie Oszacuj siłę, aby rozpocząć obliczenia. Oprogramowanie automatycznie zapisze wyniki obliczeń w pliku w formacie arkusza kalkulacyjnego.
      UWAGA: Arkusz kalkulacyjny pokazuje składową x, składową y i wielkość siły w każdym przedziale czasowym (Rysunek 8D). Zapoznaj się z plikiem uzupełniającym 6, aby uzyskać praktyczne dane dotyczące ilościowego określania siły uciągu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie z pojedynczą plamką w celu ilościowego określenia szybkości polimeryzacji aktyny i wydajności sprzęgła sprzęgła
Wysoka ekspresja Lifeact pozwala na wizualizację F-aktyny w stożku wzrostu; niska ekspresja aktyny HaloTag umożliwia monitorowanie przepływu wstecznego F-aktyny (Rysunek 3, plik uzupełniający 2). Śledzenie plamek aktyny umożliwia pomiar prędkości przepływu F-aktyny (Rysunek 3C,D). Ponieważ mechaniczne sprzężenie przepływu wstecznego F-aktyny i podłoża adhezyjnego zmniejsza prędkość przepływu F-aktyny, sprawność sprzęgła sprzęgła można oszacować na podstawie prędkości. Co więcej, znakowanie F-aktyny za pomocą Lifeact pomaga w wizualizacji rozszerzania F-aktyny i jest przydatne do ilościowego określania szybkości polimeryzacji aktyny (Rysunek 3E,F).

Ilościowa analiza siły pociągowej
Ścisłe trzymanie się przedstawionej tutaj metodologii ujawni ruchy koralików fluorescencyjnych pod stożkiem wzrostu (Rysunek 6C, plik uzupełniający 4). Przepływ wsteczny F-aktyny na podłoże generuje siłę pociągową, powodując ruch kulek fluorescencyjnych do tyłu pod stożkiem wzrostu. Kod analizy siły pociągowej szacuje siłę uciągu na podstawie przemieszczenia koralików fluorescencyjnych i wyraża obliczoną siłę pociągową jako wektor siły. Kierunek i wielkość siły pociągowej są wyznaczane na podstawie składowych x i y wektora siły (Rysunek 8C,D). Czerwona ramka w Rysunek 8D przedstawia składowe x i y wektora siły; Rysunek 8C przedstawia odpowiadający mu stożek wzrostu. Jeśli chodzi o współrzędne x-y, wektor wskazuje na -93,8° w stosunku do osi x; orientacja ta jest skierowana do tyłu stożka wzrostu (Rysunek 8C). Wielkość siły pociągowej F obliczono w następujący sposób:

figure-results-1

figure-results-2
Rysunek 1: Maszyneria stożka wzrostu do generowania siły i nawigacji stożkiem wzrostu. Gradient chemoatraktantu nettryny-1 indukuje asymetryczną stymulację jego receptora DCC na aksonalnym stożku wzrostu. To aktywuje Rac1 i Cdc42 oraz ich kinazę Pak1. Rac1 i Cdc42 promują (1) polimeryzację aktyny, podczas gdy Pak1 fosforyluje shootin1, wzmacniając sprzężenie sprzęgła za pośrednictwem shootin1 (2). Asymetryczna aktywacja dynamiki aktyny i sprzężenie sprzęgła w stożku wzrostu zwiększa (3) siłę uciągu po stronie źródła netryny-1, generując w ten sposób kierunkową siłę napędową przyciągania stożka wzrostu. Przedstawione tutaj protokoły pozwalają na ilościowe określenie kluczowych zmiennych (1)-(3) dla nawigacji stożkiem wzrostu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 2: Obrazy fluorescencyjne stożka wzrostu neuronów pod całkowicie otwartą i zwężoną membraną. Stożek wzrostu wyraża Lifeact i HaloTag-aktynę. (A) Wysoka ekspresja Lifeact pozwala na wizualizację morfologii stożka wzrostu. Z drugiej strony, poziomy ekspresji aktyny HaloTag są bardzo niskie, z przyćmionymi sygnałami, gdy membrana jest całkowicie otwarta. (B) Gdy membrana jest odpowiednio zwężona, sygnały tła zmniejszają się, a w stożku wzrostu pojawiają się pojedyncze plamki aktyny. Podziałka skali: 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 3: Etapy ilościowego określania prędkości przepływu F-aktyny i szybkości polimeryzacji aktyny za pomocą oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów Fidżi. (A) Dostosuj kąt obrazu do analizy. (1) Znajdź i wybierz plamkę aktyny (grot strzałki), która przepływa w pakiecie F-aktyny. (2) Wybierz Obraz > Przekształć > Obróć. (3) Ustaw kąt tak, aby wiązka F-aktyny była skierowana do góry. (4) Kąt obrazu zostanie zmieniony. (B) Odgraniczyć obszar, łącznie z plamką aktyny i wiązką F-aktyny. (1) Kliknij Prostokąt na pasku narzędzi. (2) Nakreśl region na obrazie. Jasność i kontrast obrazu są zwiększone, aby umożliwić wyraźną wizualizację plamki aktyny i końcówki wiązki F-aktyny. (3) Wybierz opcję Obraz > Duplikuj. (4) Wprowadź pięć ram czasowych, które pokazują przepływ plamek aktyny w wiązce F-aktyny. (5) Wybrany obraz stosu pojawi się na ekranie. (C) Nałóż kółka na plamkę aktyny. (1) Kliknij Owal na pasku narzędzi. (2) Narysuj okrąg na plamce aktyny. (3) Wybierz Obraz > nakładkę > Dodaj zaznaczenie. (4) Okrąg jest nałożony. 5) Powtórz nakładanie kółek na pozostałe plamki aktyny. (D) Zmierz odległość translokacji plamek aktyny w pięciu przedziałach czasowych. (1) Kliknij Prosto na pasku narzędzi. (2) Narysuj linię, która łączy środki okręgów. (3) Wybierz opcję Analizuj > Mierz. Wynik, wskazywany przez parametr Wysokość (czerwona ramka), nakładający odległość translokacji plamki aktyny. (E) Zmierz zmianę długości występu F-aktyny w ciągu pięciu przedziałów czasowych. (1) Narysuj linię łączącą końcówki występu F-aktyny. (2) Wybierz opcję Analizuj > Mierz. Wynik (czerwona ramka), Wysokość, wskazuje długość przedłużenia wiązki F-aktyny. (F) Szybkość polimeryzacji aktyny oblicza się na podstawie sumy prędkości przepływu F-aktyny i szybkości rozciągania. Patrz również plik uzupełniający 2. Plik uzupełniający 3 pomaga badaczom w ćwiczeniu metodologii opisanej powyżej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 4: Etapy przygotowania żelu PAA. Zapoznaj się z krokiem 7.1, aby uzyskać szczegółowy opis. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 5: Określanie sztywności żelu PAA. (A) Metoda wgłębiania mikrosfery. Kiedy mikrosfera jest umieszczana na fluorescencyjnym żelu PAA zatopionym w kulkach, ciężar mikrosfery powoduje wgłębienie w żelu. Głębokość wgłębienia oblicza się, odejmując pozycje z powierzchni żelu PAA od dna mikrosfery (B,C) Obrazy fluorescencyjne żelu PAA wciętego przez mikrosferę i zawierającego kulki fluorescencyjne. Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny został wykorzystany do wykonania obrazów powierzchni żelu (B) i dna mikrosfery (C). Sygnały z kulek fluorescencyjnych nie są widoczne na powierzchni żelu w obszarze wgłębienia (B, okrąg). Można je jednak zaobserwować na dnie mikrosfery. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 6: Mapowanie siły stożka wzrostu neuronów. (A-C) Obrazy fluorescencyjne koralików osadzonych w żelu PAA i stożku wzrostu neuronów wizualizowane za pomocą EGFP. Po uzyskaniu obrazów poklatkowych (A), neuron został uwolniony z podłoża żelowego poprzez zastosowanie roztworu SDS i uchwycono obraz kulek w nienapiętym podłożu (B). (C) Obraz koralików w nienaprężonym podłożu pokazuje koraliki w ich pierwotnej (zielonej) i przemieszczonej (czerwonej) pozycji. Sygnał EGFP stożka wzrostu jest pokazany na niebiesko. Kimografy (po prawej) pokazują ruchy koralików w odstępach 3 s przez czas trwania 147 s, oznaczone strzałkami w polach 1 i 2. Koralik w obszarze 2 jest koralikiem referencyjnym. Podziałka: 2 μm dla (A), (B) i (C, po lewej) i 1 μm dla (C, środek). Patrz również plik uzupełniający 4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 7: Kroki do korygowania pozycji x-y obrazu koralika na nienaprężonym podłożu przy użyciu Fidżi. (A) Połącz obraz koralika na nienapiętym podłożu z obrazem stosu poklatkowego koralików fluorescencyjnych. (1) Wybierz Obraz > Stosy > Narzędzia > Konkatenuj. (2) Wybierz obraz koralików na nienaprężonym podłożu i obraz poklatkowy stosu koralików fluorescencyjnych odpowiednio na Obrazie 1 i Obrazie 2. Kliknij OK. (3) Obraz ściegu na nienaprężonym podłożu jest dodawany do obrazu poklatkowego stosu. (B) Skoryguj pozycję x-y obrazu koralików fluorescencyjnych. (1) Użyj paska przewijania (czerwona ramka), aby wybrać drugą klatkę (czerwona strzałka) w stosie obrazów. (2) Wybierz Wtyczki > StackReg. (3) Z listy rozwijanej wybierz Rigid Body (czerwona ramka) i kliknij OK. Rozpocznie się korekta pozycji x-y. (C) Zapisz obraz koralika z korekcją pozycji x-y. Po wybraniu pierwszej klatki obrazu stosu z korekcją położenia x-y (1) wybierz opcję Image (Obraz > Duplikuj). (2) wprowadź 1 w polu Zakres i usuń zaznaczenie opcji Duplikuj stos. Następnie kliknij OK. (3) Na ekranie pojawi się obraz koralika z korekcją położenia X-Y na nieobciążonym podłożu. Zapisz ten obraz jako plik tiff. Plik uzupełniający 6 pomaga badaczom w ćwiczeniu metodologii opisanej powyżej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 8: Analiza siły trakcyjnej pod stożkiem wzrostu neuronów przy użyciu kodu analizy siły pociągowej o otwartym kodzie źródłowym. (A) GUI do analizy siły uciągu. Zdjęcia poklatkowe wybrane w GUI można potwierdzić z listy rozwijanej i za pomocą wskazanego suwaka (czerwone pole). (B) Wybierz region, w którym znajduje się stożek wzrostu. (1) Kliknij ROI w graficznym interfejsie użytkownika. Za pomocą kursora myszy określ dwa punkty (groty strzałek) na obrazie komórki. (2) Na obrazie komórki pojawi się czerwone pole. Dwa kliknięcia określają położenie dwóch narożników. (C) Wybierz wykryte koraliki (białe kropki) pod stożkiem wzrostu. (1) W graficznym interfejsie użytkownika kliknij Wybierz koraliki i kliknij wielokątny obszar, który zawiera stożek wzrostu. Naciśnij Enter. (2) Białe kropki w obszarze wielokąta zmienią kolor na czerwony. (D) Obliczone wyniki kierunku i wielkości siły pociągowej. Czerwone pole w arkuszu kalkulacyjnym reprezentuje składowe x i y wektora siły, oszacowane na podstawie analizy siły pociągowej. Na współrzędnej x-y w prawym panelu wektor siły generowany przez stożek wzrostu wskazuje -93,8° w stosunku do osi x; ta orientacja jest skierowana w stronę tylnej części stożka wzrostu w (C). Plik uzupełniający 6 pomaga badaczom w ćwiczeniu metodologii opisanej powyżej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Receptury roztworów i mediów użytych w tym badaniu. Zobacz tekst, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat użytkowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Obrazowanie fluorescencyjne Lifeact i fluorescencyjne obrazowanie plamkowe HaloTag-aktyny w stożku wzrostu nerwu. Lifeact (zielony) i HaloTag-aktyna (magenta). Obrazy były rejestrowane co 3 s przez łączny czas trwania 147 s. Podziałka: 2 μm. Zobacz także Rysunek 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Dane praktyczne do ilościowego określania prędkości przepływu F-aktyny i szybkości polimeryzacji aktyny. Wielokanałowy obraz poklatkowy przedstawiający Lifeact (zielony) i HaloTag-actin (magenta). Zobacz też Rysunek 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Wideo mapujące siłę, wykrywające siłę trakcyjną na stożku wzrostu neuronów. Pierwotne (zielone) i przemieszczone (czerwone) położenie koralików. Sygnał EGFP w stożku wzrostu jest pokazany na niebiesko. Obrazy były rejestrowane co 3 s przez 147 s. Podziałka: 2 μm. Zobacz także Rysunek 6. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Kod analizy siły pociągowej. Zobacz krok 8.12, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat użytkowania. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Dane praktyczne do ilościowego określania siły pociągowej. Jednokanałowy obraz RGB koralików na nienaprężonym podłożu i jednokanałowe obrazy RGB poklatkowe koralików fluorescencyjnych pod stożkiem wzrostu, EGFP i jasnym polem. Zobacz także Rysunki 7 i 8. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły opisane w tym badaniu wykorzystują komercyjnie dostępne materiały i sprzęt mikroskopowy, który rutynowo znajduje się we wszystkich laboratoriach, instytutach i uniwersytetach. W związku z tym badacze mogą z łatwością zastosować w swoich badaniach obrazowanie pojedynczej plamki i mikroskopię sił trakcyjnych.

Obrazowanie plamkowe może analizować polimeryzację aktyny i sprzęgło sprzęgła. Ponadto obrazowanie plamkowe może monitorować wsteczny przepływ cząsteczek sprzęgła, takich jak shootin1 i kortaktyna, które oddziałują z przepływem wstecznym F-aktyny. Za pomocą mikroskopu TIRF można również monitorować wsteczny przepływ cząsteczki adhezyjnej L1-CAM23,41; L1-CAM ulega przyczepności i poślizgowi, które odzwierciedlają sprawność sprzęgła23,41. Chociaż w niniejszym badaniu wykorzystano system TMR-HaloTag do obrazowania plamkowego, w analizie dostępne są również inne białka fluorescencyjne, takie jak EGFP i monomeryczne czerwone białko fluorescencyjne 16,18,20,23,24,27,39. Podstawą do wizualizacji plamek aktyny jest niski poziom ekspresji fluorescencyjnej aktyny i oświetlenie minimalnego obszaru (ryc. 2). W tym protokole sygnały Lifeact i HaloTag-actin są pozyskiwane sekwencyjnie. Ponieważ przepływ wsteczny aktyny jest stosunkowo powolny (4,5 ± 0,1 μm/min)24, analiza przepływu wstecznego F-aktyny i polimeryzacji aktyny nie ma wpływu sekwencyjna akwizycja obrazów różnych kanałów fluorescencyjnych (interwał ~1 s). Lifeact jest szeroko stosowanym markerem F-aktyny, ale może konkurować z białkami wiążącymi aktynę47. Co ważne, Lifeact może zmieniać dynamikę aktyny, wpływając w ten sposób na struktury F-aktyny i morfologię komórek 47,48,49.

Mikroskopia sił trakcyjnych może wykryć siły napędzające postęp stożka wzrostu. Montując neurony w macierzy zewnątrzkomórkowej, badacze mogą również analizować siły generowanew środowisku pół-3D11. Obrazowanie w dużym powiększeniu jest ważne dla dokładnej oceny siły uciągu, ponieważ stożki wzrostu generują słabe siły pociągowe7. Chociaż do pomiaru siły pociągowej stosuje się również inne metody z nanofilarami lub bioczujnikami wrażliwymi na stres50,51, metoda na bazie żelu PAA jest wysoce elastyczna i pozwala na regulację sztywności podłoża poprzez zmianę stężeń akrylamidu i bis-akrylamidu 41,44,52. W tym protokole żel PAA przygotowuje się w końcowym stężeniu 3,75% akrylamidu i 0,03% bis-akrylamidu; Moduł Younga wynosi ~270 Pa22, a sztywność ta mieści się w zakresie tkanki mózgowej (100-10 000 Pa)53,54,55. Ze względu na grubość żelu PAA (~100 μm) metoda ta ogranicza stosowanie soczewek o dużym powiększeniu podczas mikroskopii. Aby uzyskać obrazy o dużym powiększeniu, badacze powinni korzystać z funkcji zoomu w laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym.

Podsumowując, obecne obrazowanie plamkowe i mikroskopia sił trakcyjnych umożliwiają analizę ilościową kluczowych zdarzeń w generacjach sił. Informacje te będą nieocenione dla lepszego zrozumienia mechanizmów, które leżą u podstaw rozwoju stożka wzrostu i nawigacji.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez AMED w ramach grantu numer 21gm0810011h0005 (N.I. i Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) i JSPS Grants-in-Aid dla początkujących naukowców (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Incurable Diseases (T.M.) oraz NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5% roztwór niebieskiego trypanuNacalai29853-34
3-aminopropylotrimetyoksysilanSigma281778-100ML
Monomer akryloamiduNacalai00809-85
Nadsiarczan amonuCytiva17-1311-1
Axio Observer Z1Zeiss431007-9902-000Mikroskop epifluorescencyjny ( obrazowanie z pojedynczą plamką)
Suplement B-27 (50x)Thermo Fisher Scientific17504-044
Surowica bydlęca albmineSigmaA7906-10G
C-Apochromat 63x/1,2 W CorrZeiss421787-9970-799Soczewka obiektywowa (mikroskopia siły trakcji)
Szkiełko nakrywkowe (średnica 18 mm)MatsunamiC018001
D-glukozaNacalai16806-25
DNaseISigmaDN25-100MG
Surowica bydlęcapłodu Thermo Fisher Scientific10270-106
FijiPakiet oprogramowania Open sourcehttps://imagej.net/software/fiji/
FluoSpheres modyfikowany karboksylanem 0,2 mm, czerwony (580/605), 2% stałeThermo Fisher ScientificF8810modyfikowany karboksylanem mikrokulki
Naczynie ze szklanym dnem (średnica 14 mm)MatsunamiD1130H
Naczynie ze szklanym dnem (średnica 27 mm)MatsunamiD1140H
Roztwór aldehydu glutarowegoSigmaG5882-10X10ML
HaloTag TMRligand PromegaG8251
HBO103 W/2Osram4050300382128Lampa rtęciowa (pojedyncza plamka obrazowanie)
Zestaw narzędzi do przetwarzania obrazuMathWorkhttps://www.mathworks.com/products/image.html
Roztwór Lamininy z mysiego guza EHSWako120-05751
Leibovitz' s L-15 mediumThermo Fisher Scientific11415064
L-glutaminaNacalai16919-42
LSM710ZeissN/AKonforcyjny mikroskop laserowy (mikroskopia sił pociągowych)
MATLAB2018aMyszhttps://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html
C57BL/6Japonia SLCNie dotyczy
Zestaw nukleofektora neuronów myszyLonzaVPG-1001
N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Nacalai33401-72
N,N'-metylenobisakryloamidNacalai22402-02
Pożywka neuropodstawowaThermo Fisher Scientific21103-049
Nucleofector IAmaxaAAD-1001Aparat do elektroporacji
ORCA Flash 4.0 V2HamamatsuC11440-22CUKamera CMOS (obrazowanie z pojedynczą plamką)
PapainaNacalai26036-34
Zestaw narzędzi do obliczeń równoległychMathWorkhttps://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html
pEGFP-C1Clontech1528177
Penicylina-streptomycyna (100x)Nacalai Tesque26253-84
pFN21A-HaloTag-aktyna(Minegishi i wsp., 2018)N/A
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) pH 7,4 (10x)Thermo Fisher Scientific70011-044
Plan-Apochromat 100x/1.4 OlejZeiss420790-9901-000Soczewka obiektywowa (obrazowanie z pojedynczą plamką)
pmNeonGreen-N1-Lifeact(Kastian i in., 2021)N/A
Bromowodorek poli-D-lizynySigmaP6407-5MG
Slulfo-SAMPHAThermo Fisher Scientific22589
Dodecylosiarczan soduNacalai08933-05
Hydrat sodu (NaOH)Nacalai31511-05
Stalowa kulaSako tekkouN/AMicroshpere do określania sztywności żelu PAA. Średnica 0,6 mm, 7,87 g/cm3.
ZEN2009Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction(mikroskopia sił trakcyjnych)
ZEN2012Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introductionOprogramowanie do akwizycji obrazu (obrazowanie z pojedynczą plamką)
MathWork Oprogramowanie do akwizycji obrazu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. TessierLavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274, 1123-1133 (1996).
  2. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 001834(2010).
  3. Vitriol, E. A., Zheng, J. Q. Growth cone travel in space and time: the cellular ensemble of cytoskeleton, adhesion, and membrane. Neuron. 73 (6), 1068-1081 (2012).
  4. Cooper, J. A. Cell biology in neuroscience: mechanisms of cell migration in the nervous system. Journal of Cell Biology. 202, 725-734 (2013).
  5. Dupraz, S., et al. RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain. Current Biology. 29, 3874-3886 (2019).
  6. Suter, D. M., Miller, K. E. The emerging role of forces in axonal elongation. Progress in Neurobiology. 94, 91-101 (2011).
  7. Franze, K. Integrating chemistry and mechanics: the forces driving axon growth. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 61-83 (2020).
  8. Mitchison, T., Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1, 761-772 (1988).
  9. Suter, D. M., Forscher, P. Substrate-cytoskeletal coupling as a mechanism for the regulation of growth cone motility and guidance. Journal of Neurobiology. 44, 97-113 (2000).
  10. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 332-343 (2009).
  11. Minegishi, T., et al. Shootin1b mediates a mechanical clutch to produce force for neuronal migration. Cell Reports. 25, 624-639 (2018).
  12. Minegishi, T., Inagaki, N. Forces to drive neuronal migration steps. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 863(2020).
  13. Forscher, P., Smith, S. J. Actions of cytochalasins on the organization of actin filaments and microtubules in a neuronal growth cone. Journal of Cell Biology. 107, 1505-1516 (1988).
  14. Suter, D. M., Forscher, P. An emerging link between cytoskeletal dynamics and cell adhesion molecules in growth cone guidance. Current Opinion in Neurobiology. 8, 106-116 (1998).
  15. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  16. Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. Current Biology. 8, 1227-1230 (1998).
  17. Katoh, K., Hammar, K., Smith, P. J., Oldenbourg, R. Birefringence imaging directly reveals architectural dynamics of filamentous actin in living growth cones. Molecular Biology of the Cell. 10, 197-210 (1999).
  18. Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 295, 1083-1086 (2002).
  19. Medeiros, N. A., Burnette, D. T., Forscher, P. Myosin II functions in actin-bundle turnover in neuronal growth cones. Nature Cell Biology. 8, 215-226 (2006).
  20. Shimada, T., et al. Shootin1 interacts with actin retrograde flow and L1-CAM to promote axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 181, 817-829 (2008).
  21. He, M., Zhang, Z. H., Guan, C. B., Xia, D., Yuan, X. B. Leading tip drives soma translocation via forward F-actin flow during neuronal migration. Jounal of Neuroscience. 30, 10885-10898 (2010).
  22. Toriyama, M., Kozawa, S., Sakumura, Y., Inagaki, N. Conversion of a signal into forces for axon outgrowth through Pak1-mediated shootin1 phosphorylation. Current Biology. 23, 529-534 (2013).
  23. Abe, K., et al. Grip and slip of L1-CAM on adhesive substrates direct growth cone haptotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 2764-2769 (2018).
  24. Baba, K., et al. Gradient-reading and mechano-effector machinery for netrin-1-induced axon guidance. Elife. 7, 34593(2018).
  25. Nichol, R. I., Hagen, K. M., Lumbard, D. C., Dent, E. W., Gomez, T. M. Guidance of axons by local coupling of retrograde flow to point contact adhesions. Journal of Neuroscience. 36, 2267-2282 (2016).
  26. Shekarabi, M., et al. Deleted in colorectal cancer binding netrin-1 mediates cell substrate adhesion and recruits Cdc42, Rac1, Pak1, and N-WASP into an intracellular signaling complex that promotes growth cone expansion. Journal of Neuroscience. 25, 3132-3141 (2005).
  27. Kubo, Y., et al. Shootin1-cortactin interaction mediates signal-force transduction for axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 210, 663-676 (2015).
  28. Huber, A. B., Kolodkin, A. L., Ginty, D. D., Cloutier, J. F. Signaling at the growth cone: ligand-receptor complexes and the control of axon growth and guidance. Annual Review of Neuroscience. 26, 509-563 (2003).
  29. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, 001727(2011).
  30. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128, 29-43 (2007).
  31. Tatavarty, V., Kim, E. J., Rodionov, V., Yu, J. Investigating sub-spine actin dynamics in rat hippocampal neurons with super-resolution optical imaging. PLoS One. 4, 7724(2009).
  32. Frost, N. A., Shroff, H., Kong, H., Betzig, E., Blanpied, T. A. Single-molecule discrimination of discrete perisynaptic and distributed sites of actin filament assembly within dendritic spines. Neuron. 67, 86-99 (2010).
  33. Chazeau, A., et al. Nanoscale segregation of actin nucleation and elongation factors determines dendritic spine protrusion. EMBO Journal. 33, 2745-2764 (2014).
  34. Garcia, M., et al. Two-tiered coupling between flowing actin and immobilized N-cadherin/catenin complexes in neuronal growth cones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 6997-7002 (2015).
  35. Swaminathan, V., et al. Actin retrograde flow actively aligns and orients ligand-engaged integrins in focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 10648-10653 (2017).
  36. Tsai, T. Y., et al. Efficient front-rear coupling in neutrophil chemotaxis by dynamic myosin II localization. Developmental Cell. 49, 189-205 (2019).
  37. Zhang, X. F., et al. Regulation of axon growth by myosin II-dependent mechanocatalysis of cofilin activity. Journal of Cell Biology. 218 (7), 2329-2349 (2019).
  38. Reversat, A., et al. Cellular locomotion using environmental topography. Nature. 582, 582-585 (2020).
  39. Katsuno, H., et al. Actin migration driven by directional assembly and disassembly of membrane-anchored actin filaments. Cell Reports. 12, 648-660 (2015).
  40. Urasaki, A., et al. Shootins mediate collective cell migration and organogenesis of the zebrafish posterior lateral line system. Scientific Reports. 9, 12156(2019).
  41. Abe, K., et al. Mechanosensitive axon outgrowth mediated by L1-laminin clutch interface. Biophysical Journal. 120, 3566-3576 (2021).
  42. Kastian, R. F., et al. Shootin1a-mediated actin-adhesion coupling generates force to trigger structural plasticity of dendritic spines. Cell Reports. 35, 109130(2021).
  43. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
  44. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322, 1687-1691 (2008).
  45. Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  46. Li, Y., Hu, Z., Li, C. New method for measuring poisson's ratio in polymer gels. Journal of Applied Polymer Science. 50, 1107-1111 (1993).
  47. Belyy, A., Merino, F., Sitsel, O., Raunser, S. Structure of the Lifeact-F-actin complex. PLoS Biology. 18, 3000925(2020).
  48. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9, 3241(2019).
  49. Kumari, A., Kesarwani, S., Javoor, M. G., Vinothkumar, K. R., Sirajuddin, M. Structural insights into actin filament recognition by commonly used cellular actin markers. EMBO Journal. 39, 104006(2020).
  50. du Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2390-2395 (2005).
  51. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466, 263-266 (2010).
  52. Koch, D., Rosoff, W. J., Jiang, J., Geller, H. M., Urbach, J. S. Strength in the periphery: growth cone biomechanics and substrate rigidity response in peripheral and central nervous system neurons. Biophysical Journal. 102 (3), 452-460 (2012).
  53. Barnes, J. M., Przybyla, L., Weaver, V. M. Tissue mechanics regulate brain development, homeostasis and disease. Journal of Cell Science. 130, 71-82 (2017).
  54. Moore, S. W., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Stretchy proteins on stretchy substrates: the important elements of integrin-mediated rigidity sensing. Developmental Cell. 19, 194-206 (2010).
  55. Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews Neuroscience. 13, 867-878 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

przep yw wsteczny F aktynyobrazowanie pojedynczych plamekmikroskopia si trakcyjnychmigracja neuronalnapolimeryzacja aktynymikroskopia konfokalna

Powiązane artykuły