Artykuł metodologiczny

Testy ACT1-CUP1 określają specyficzną dla substratu wrażliwość mutantów spliceosomalnych w pączkujących drożdżach

DOI:

10.3791/63232

⸱

30 czerwca 2022

1College of Arts and Sciences, Northwest University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test ACT1-CUP1, test wzrostu miedzi, zapewnia szybki odczyt splicingu prekursorowego informacyjnego RNA (pre-mRNA) i wpływu zmutowanych czynników splicingu na funkcję spliceosomalną. To badanie zawiera protokół i podkreśla możliwe dostosowanie, aby odpowiedzieć na interesujące nas pytanie dotyczące splingu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutacje wprowadzone w spliceosomie lub jego substracie znacząco przyczyniły się do naszego zrozumienia zawiłości funkcji spliceosomalnej. Niezależnie od tego, czy są one związane z chorobą, czy też są wyselekcjonowane funkcjonalnie, wiele z tych mutacji zostało przebadanych za pomocą testów wzrostu w organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae (drożdże). Test wzrostu miedzi specyficzny dla splicingu lub test ACT1-CUP1 zapewnia kompleksową analizę mutacji na poziomie fenotypowym. Test ACT1-CUP1 wykorzystuje reportery, które nadają tolerancję miedzi po prawidłowym łączeniu. Tak więc, w obecności miedzi, zmiany żywotności drożdży korelują ze zmianami w produkcji mRNA poprzez splicing. W typowym eksperymencie spliceosom drożdży jest poddawany próbie różnych niezgodnych reporterów splicingu i mutacji czynnika splicingu, która jest przedmiotem zainteresowania, w celu wykrycia jakiegokolwiek synergicznego lub przeciwstawnego wpływu na splicing. Tutaj podano pełny opis przygotowania płytki miedzianej, posiewu komórek drożdży i oceny danych. Opisano wybór uzupełniających się eksperymentów, podkreślając wszechstronność reporterów ACT1-CUP1. Test ACT1-CUP1 jest poręcznym narzędziem w zestawie narzędzi do splicingu dzięki bezpośredniemu odczytowi efektów mutacyjnych i możliwościom porównawczym wynikającym z dalszego stosowania w terenie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spliceosom to duża, biologiczna maszyna, która katalizuje usuwanie intronów, regionów niekodujących w prekursorowym informacyjnym RNA (pre-mRNA)1,2. Charakterystyka wpływu pojedynczego punktowego mutanta w 1 z prawie 100 białek i 5 niekodujących RNA jest często niejednoznaczna podczas badania białka lub RNA w izolacji. Zmiana funkcji zmutowanego komponentu może być najlepiej oceniona in vivo w kontekście pełnego, funkcjonującego spliceosomu.

Opisany tutaj test wzrostu miedzi jest szybkim miernikiem efektywności splicingu u drożdży Saccharomyces cerevisiae lub pączkujących. Opracowany przez C.F. Lesser i C. Guthrie i opublikowany w 1993 roku, test ten łączy w sobie łatwość pracy z prostym organizmem modelowym i prostym odczytem żywotności komórek3. Żywotność koreluje z tym, jak dobrze spliceosomy w tych komórkach mogą rozpoznawać i łączyć transkrypt reporterowy.

Ten test wzrostu miedzi jest częściej nazywany testem ACT1-CUP1. Nazwa ACT1-CUP1 pochodzi od dwóch genów połączonych w celu stworzenia reportera wydajności splicingu. ACT1 to gen aktyny drożdży, który ulega silnej ekspresji i ma efektywnie splicingowany intron4,5. Cup1p to chelator miedzi, który sekwestruje miedź w komórce, aby zapobiec zakłóceniom w prawidłowych funkcjach komórkowych6,7,8. Reporter ACT1-CUP1 zawiera te geny w takiej sekwencji, że CUP1 znajduje się we właściwej ramce odczytu tylko wtedy, gdy następuje splicing intronu ACT1 przed mRNA (Figura 1). Powstałe białko fuzyjne zawiera pierwsze 21 aminokwasów aktyny i białko Cup1p o pełnej długości, które zwiększa żywotność drożdży w środowisku bogatym w miedź3. Zatem wzrost ilości splotów reportera skutkuje wyższym stężeniem Cup1p i wyższą odpornością na miedź (Rysunek 1). W porównaniu z innymi genami reporterowymi, CUP1 wpływa na żywotność komórek nawet na niskich poziomach, ma szeroki zakres czułości i może być używany do bezpośredniej selekcji mutacji splicingu3,6,7. Ponadto CUP1 nie jest niezbędny do standardowego wzrostu drożdży, a zatem homeostaza komórkowa nie jest zakłócona podczas przygotowania do tego testu. Uzupełnienie testów delecji lub wzrostu temperatury, ACT1-CUP1 dostarcza informacji o wpływie na splicing w optymalnych warunkach wzrostu drożdży.

Spliceosom rozpoznaje swój substrat poprzez trzy sekwencje introniczne, a mianowicie miejsce splicingu 5' (5' SS), miejsce rozgałęzienia (BS) i miejsce splicingu 3' (3' SS). Wygenerowano liczne reportery ACT1-CUP1 zawierające niezgodne sekwencje w tych miejscach. Wybór najpopularniejszych reporterów ACT1-CUP1 jest pokazany w Rysunek 1 i Tabela 1. Ponieważ spliceosom oddziałuje z każdym miejscem splicingu w unikalny sposób w różnych punktach cyklu splicingu, wytrzymałość spliceosomu można testować na różnych etapach, w oparciu o które używany jest reporter bez konsensusu. Reporterzy, którzy nie są zgodni, są nazywani na cześć zmutowanej pozycji w intronie i podstawy, do której został zmutowany. Na przykład A3c jest reporterem z mutacją w 5' SS, a konkretnie w pozycji 3 od konsensusu adenozyny do cytozyny. Ten reporter będzie silnie oddziaływał z mutacjami spliceosomów, które wpływają na selekcję i wykorzystanie 5' SS. W swoich wstępnych badaniach Lesser i Guthrie określili, które mutacje SS 5' hamowały splicing3. Później w tym samym roku, Burgess i Guthrie opublikowali niezgodne reporterzy we wszystkich trzech miejscach splicingu w badaniu przesiewowym supresorów mutacji w ATPase Prp16p9. Porównując konsensus z reporterami niejednomyślnymi, test ACT1-CUP1 był ważnym kluczem do zrozumienia wytrzymałości i selektywności spliceosomu drożdży oraz do wnioskowania o funkcji spliceosomów innych eukariontów.

Ponieważ reporterzy ACT1-CUP1 bez zgody uwrażliwiają spliceosom na dalsze perturbacje, wpływ pojedynczej mutacji czynnika splicingu można scharakteryzować poprzez reportery, na które wpływa pozytywnie lub negatywnie. Zostało to zastosowane do łączenia pytań badawczych na różne sposoby. Po pierwsze, test ACT1-CUP1 może być i był stosowany jako genetyczne badanie przesiewowe pod kątem mutacji w czynnikach splicingowych. Na przykład Prp8p, największe białko splicingowe, służy jako platforma, na której rdzeń RNA spliceosomu katalizuje reakcję splicingu. Zostało to częściowo wywnioskowane dzięki temu, w jaki sposób mutanty Prp8p poprawiły lub zmniejszyły splicing różnych reporterów ACT1-CUP110,11,12,13,14,15,16,17. Inne składniki białkowe spliceosomu zostały również zbadane przy użyciu ACT1-CUP1, w tym Hsh155p, Cwc2p, Cef1p i Ecm2p18,19,20,21,22,23,24,25. Progi energetyczne dla Prp16p i czterech innych ATPaz biorących udział w przejściu spliceosomalnym były również badane za pomocą tego testu9,26,27,28,29,30. Małe jądrowe RNA (snRNA) zostały również szeroko przebadane przy użyciu ACT1-CUP1 w celu identyfikacji sekwencji pre-mRNA, które koordynują, oraz zmian w strukturze drugorzędowej, którym ulegają snRNA podczas splicingu3,31,32,33,34,35,36,37.

Test ACT1-CUP1 wymaga szczepu drożdży, w którym wszystkie kopie genu CUP1 zostały znokautowane. Ponieważ CUP1 może mieć dużą liczbę kopii6,38, przygotowanie pełnego szczepu nokautującego może wymagać wielu rund lub obszernego badania. W rezultacie, cup1Δ szczepy drożdży były często współdzielone między laboratoriami, podobnie jak reporterzy.

Jeśli mutacje w czynniku splicingu są oceniane na podstawie kopii plazmidu, gen typu dzikiego dla tego czynnika powinien zostać wyeliminowany. Ponadto, tło drożdży powinno pozwolić na wybór co najmniej dwóch plazmidów, jednego zawierającego reporter ACT1-CUP1, historycznie na plazmidzie selekcyjnym leucyny, a drugiego zawierającego mutację lub zaburzenie w maszynerii splicingowej, która będzie badana (Rysunek 2). Zwykle w jednym teście wiele szczepów drożdży, z których każdy zawiera perturbację splicingu zapytania (QSP) i inny reporter, przetestuje wpływ zapytania na splicing

.

Zmienne niezależne w teście ACT1-CUP1 pozwalają badaczowi ocenić dotkliwość QSP. Te zmienne niezależne to stężenie miedzi i wybór wielu reporterów splicingu bez konsensusu. Po pierwsze, ponieważ szczepy drożdży są hodowane na płytkach zawierających różne stężenia miedzi (Rysunek 2), ustawienie testu obejmuje wybór gradientu stosowanych stężeń. W badaniach można wykorzystać przebiegowy gradient stężenia miedzi, aby uzyskać wstępny odczyt żywotności, a następnie powtórzyć test z drobniejszym gradientem w celu zidentyfikowania subtelnych różnic w żywotności. Drugą zmienną jest szeroki zakres możliwych do przetestowania reporterów ACT1-CUP1 (Rysunek 1 i Tabela 1). Jeśli QSP wpływa na żywotność drożdży w różny sposób w obecności reportera bez konsensusu w porównaniu z typem dzikim, można wyciągnąć wniosek, że QSP wpływa na etap splicingu lub region spliceosomu ważny podczas rozpoznawania lub przetwarzania tego regionu intronu.

Zestaw narzędzi do produkcji drożdży jest obszerny, a test ACT1-CUP1 jest integralną częścią badań nad splotem. Test ACT1-CUP1 jest często wykonywany wraz z bardziej dogłębną analizą genetyczną, strukturalną i/lub biochemiczną wpływu QSP. Ponieważ te bardziej szczegółowe badania mają zazwyczaj dłuższą procedurę i/lub wyższą cenę, częstym podejściem jest najpierw badanie przesiewowe w kierunku interesujących mutantów z ACT1-CUP1.

Dostarczony tutaj jest protokół testu ACT1-CUP1, w tym przygotowanie płytki miedzianej. Test ten dostarcza naukowcom wstępnej odpowiedzi na pytanie o wpływ QSP na splicing i które regiony introniczne są najbardziej dotknięte zaburzeniami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa szczepu drożdży

  1. Wytworzyć lub otrzymać szczep S. cerevisiae, którego tło obejmuje leu2 i cup1Δ. Aby wygenerować to tło, użyj dobrze znanej metody drożdżowej, która wykorzystuje octan litu i jednoniciowy DNA39.
    UWAGA: Haploidalne szczepy drożdży mogą zawierać jedną, dwie lub więcej kopii CUP16,38. Zapoznaj się z informacjami genomicznymi dla wybranego szczepu drożdży podczas projektowania starterów knock-out w celu flankowania lokalizacji genu CUP1.
  2. Przeprowadzić transformację drożdży w celu włączenia QSP poprzez inkorporację genomową lub na plazmidzie. Użyj sprawdzonego protokołu, takiego jak te opisane w poprzednich badaniach40,41,42.
  3. Wykonaj transformację drożdży z otrzymanym szczepem (szczepami) z kroku 1.2., aby dodać żądany plazmid reporterowy ACT1-CUP1.
    UWAGA: Komórki muszą być utrzymywane na płytkach i pożywkach z kroplą leucyny (-Leu), aby zapewnić zatrzymanie plazmidów reporterowych ACT1-CUP1 po tej transformacji.
  4. Wykonaj kroki 1.2 i 1.3 dla każdego QSP i każdego plazmidu reporterowego ACT1-CUP1, który ma być badany, w tym szczepów kontrolnych.

2. Przygotowanie płyty miedzianej

  1. Należy wybrać zakres stężeń miedzi, który odpowiada badanym osobom zgłaszającym (patrz Tabela 1, aby zapoznać się z często stosowanymi wskaźnikami śmiertelności).
    UWAGA: Przykładem kompleksowego zakresu stężeń miedzi jest 30 różnych stężeń miedzi: 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM i 2,5 mM Cu2+.
  2. Przygotować roztwór podstawowy 1 MCuSO4 i sterylnego filtra przez sterylny filtr PES (polieterosulfon) o wielkości 0,22 μm.
  3. Na żądaną płytkę miedzianą przygotuj 2 ml roztworu CuSO4 w sterylnej wodzie.
    UWAGA: Ponieważ płytka z 0 mM Cu2+ będzie zawsze analizowana i obrazowana jako odniesienie, zaleca się wykonanie dwóch płytek 0 mM Cu2+, jednej na początku i jednej na końcu etapu powlekania (krok 3.4.).
    1. Obliczyć ilość surowca dla końcowego pożądanego stężenia miedzi w 40 ml objętości płytki (tabela uzupełniająca 1).
    2. Dodaj obliczoną ilość sterylnej wody i 1 M bulionu CuSO4 do sterylnej probówki o pojemności 2 ml.
  4. Wlać płytki do testu ACT1-CUP1.
    UWAGA: Alternatywą dla poniższego protokołu jest wstępne połączenie pożywki i agaru w dużym pojemniku i podwielokrotności po autoklawowaniu do mniejszych pojemników w celu uzyskania różnych stężeń miedzi dla każdej płytki. Niezależnie od przyjętej metody ważne jest, aby upewnić się, że stężenie mediów jest spójne między wszystkimi płytkami, mimo że każda z nich ma inne stężenie miedzi.
    1. Oznacz każdą pustą płytkę do nalania końcowym stężeniem miedzi, które będzie zawierać. Przygotuj co najmniej jedną kwadratową płytkę na każde stężenie miedzi, które ma być badane.
    2. Oznacz butelkę o pojemności 100 ml na stężenie miedzi, która ma być testowana.
    3. Do każdej butelki dodaj 790 mg agaru (2% w/v agaru) i mieszadło.
    4. W dużej zlewce połącz pożywkę wzrostową -Leu dla wszystkich miedzianych płytek, które mają zostać wylane. Na każdą płytkę, która ma być wykonana, rozpuść 265 mg drożdżowej zasady azotowej (YNB) i 64 mg mieszanki drop-out minus leucyna (i wszelkie inne składniki odżywcze, które mogą być wymagane do utrzymania plazmidu QSP w komórkach) w 34 ml wody dejonizowanej.
    5. Dodać 34 ml roztworu pożywki wzrostowej -Leu do każdej przygotowanej butelki o pojemności 100 ml i zakręcić folią aluminiową. Oznacz folię zamierzonym stężeniem miedzi.
    6. Autoklaw do sterylizacji i rozpuszczenia agaru przy użyciu zalecanego dla autoklawu cyklu cieczy.
    7. Tak szybko, jak to możliwe, dodaj 4 ml 20% w/v glukozy (sterylnie przefiltrowanej) do każdej butelki.
    8. Dopasuj etykiety i dodaj 2 ml rozcieńczeniaCuSO4 do przeznaczonej do tego butelki.
      UWAGA: Ponieważ w tym samym czasie można wykonać dziesiątki miedzianych płytek, z których każda ma inne stężenie, wyraźne oznakowanie wszystkich butelek, probówek i talerzy zamierzonym stężeniem miedzi zapobiegnie pomyłkom podczas nalewania płytek.
    9. Użyj płytki mieszającej do mieszania przez ~30 s i wlej lub odpipetuj 35 ml do oznaczonej płytki, unikając pęcherzyków. Pozostawić do ostygnięcia przed przechowywaniem lub użyciem.
      UWAGA: Często płytki są przygotowywane 1 dzień lub 2 dni przed testem i przechowywane w temperaturze 4 °C do kilku godzin przed użyciem. Płytki powinny mieć temperaturę pokojową (RT) przed rozpoczęciem powlekania (krok 3.4.).

3. Test ACT1-CUP1

  1. Umieść pożądane szczepy na płytkach -Leu.
    UWAGA: W przypadku pracy z wywarami kriogenicznymi należy zadbać o to, aby komórki zostały wystarczająco ożywione z przechowywania przed posiewem. Zalecaną procedurą jest usuwanie smug z materiału kriogenicznego i pozostawienie go do wzrostu przez 3-5 dni w temperaturze 30 °C. Następnie ponownie narysuj małą próbkę i pozwól jej rosnąć przez kolejne 2-3 dni w temperaturze 30 °C.
  2. Hoduj kultury przez noc w 10 ml pożywki.
    1. Przygotować pożywkę wzrostową -Leu, stosując te same proporcje, jak opisano w kroku 2.4.2. Na 10 ml pożywki dodać 66 mg drożdżowej zasady azotowej (YNB) i 16 mg mieszanki drop-out minus leucyna do 9 ml wody dejonizowanej. Przepuścić przez sterylny filtr PES 0,22 μm.
    2. Na szczep drożdży dodać 9 ml pożywki wzrostowej -Leu i 1 ml 20% w/v glukozy (sterylnie przefiltrowanej) do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    3. Za pomocą sterylnego patyczka lub końcówki pipety zbierz małą (~1 mm okrągłą) próbkę drożdży i zaszczep pożywkę.
    4. Wstrząśnij wszystkimi nocnymi kulturami przy 180 obr./min i temperaturze 30 °C.
      UWAGA: Jeśli są dostępne, zamiast wytrząsarki można użyć rotatorów.
  3. Rozcieńczyć szczepy do OD600 0,5 ± 0,05 w 10% glicerolu.
    1. Na szczep dodaj 100 μl kultury do kuwety zawierającej 900 μl wody.
    2. Zmierz OD600 za pomocą spektrofotometru.
    3. Obliczyć rozcieńczenie wymagane do osiągnięcia OD600 wynoszącego 0,5 w końcowej objętości 2 ml.
    4. Rozcieńczyć każdy szczep do OD600 0,5 w 10% glicerolu (sterylny).
    5. Ponownie zmierz OD600, aby potwierdzić, że gęstość komórek mieści się w pożądanym zakresie od 0,5 ± 0,05.
  4. Pokryj naprężenia na miedzianych płytkach.
    UWAGA: Do powlekania szczepów można stosować różne metody, w tym pipetowanie ręczne objętości 5-10 μl, pipetator wielokrotny lub wielokanałowy lub tłoczenie za pomocą replikatora pinowego. Ta ostatnia metoda jest opisana poniżej, chociaż większość kroków będzie podobna niezależnie od metody.
    1. Ustaw sterylne miejsce pracy i zapalony palnik Bunsena.
    2. W przypadku replikatora 48-pinowego odpipetuj 200 μl każdego rozcieńczonego szczepu do oddzielnego dołka na 96-dołkowej płytce. Wypełnij puste przestrzenie w siatce 6 x 8 200 μl 10% glicerolu (sterylnego).
      UWAGA: Przykład schematu posiewu dla dziewięciu szczepów drożdży znajduje się w tabeli uzupełniającej 2.
    3. Zanurz replikator w płytkim naczyniu z 95% (v/v) etanolem i płomieniem w celu sterylizacji. Pozwól mu ostygnąć przez co najmniej 2 minuty po wygaśnięciu płomienia, aby uniknąć szoku cieplnego komórek.
    4. Umieść cztery talerze w pobliżu palnika i zdejmij pokrywki.
    5. Zanurz replikator w 96-dołkowej płytce i podnieś go jednym szybkim ruchem.
    6. Delikatnie połóż na talerzu i lekko kołysz się w przód iw tył, aby ułatwić dobre przenoszenie.
    7. Podnieś jednym szybkim ruchem i umieść w dokładnie tej samej orientacji na 96-dołkowej płytce.
    8. Powtórz tę czynność dla maksymalnie trzech innych talerzy. Powtórz proces zanurzania replikatora w etanolu, palenia w celu sterylizacji i czekania na ostygnięcie co cztery płytki.
    9. Po platerowaniu płytki przesuń płynnym ruchem w bok, ale nadal w parasolu sterylizacyjnym płomienia.
      UWAGA: Zaleca się rozcieńczanie drożdży i powlekanie w pobliżu płomienia. Płytki mogą łatwo ulec zanieczyszczeniu podczas suszenia.
    10. Pozostaw talerze do całkowitego wyschnięcia przed nałożeniem pokrywek, zwykle 3-5 minut.
    11. Inkubować płytki przez 3 dni w temperaturze 30 °C.

4. Zbieranie i analiza danych

  1. Wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź je wzrokowo.
  2. Rejestruj obrazy płyt za pomocą dostępnej kamery lub innego cyfrowego systemu obrazowania.
  3. Zapisz (lub uzyskaj wynik) dla każdego szczepu ostatnie stężenie miedzi, widoczny wzrost.
    UWAGA: Komórki są w stanie łączyć się i pozostają żywotne aż do tego stężenia. Aby uzyskać spójność, zawsze używaj tej samej metody, na oko lub na podstawie obrazów z płyty, aby ocenić ostatnie żywe stężenie miedzi. Bardzo małe kolonie są czasami widoczne gołym okiem, ale nie na obrazie. Różnica między bezpośrednią inspekcją wizualną a zapisem z obrazów jest niewielka, zwykle jest to stopień w gradiencie. Ponieważ zdjęcia kolonii są często wykorzystywane w publikacjach, zaleca się ocenianie na podstawie obrazów.
  4. Połącz dane z wielu testów ACT1-CUP1 dla tego samego szczepu, aby wyciągnąć wnioski na temat tego, jak QSP wpływa na splicing.
    UWAGA: Publikacje zwyczajowo pokazują obrazy kolonii drożdży przy stężeniu 0 mM Cu2+, ostatnim stężeniu żywej miedzi i kolejnym stężeniu, w którym kolonia padła. Dane mogą być również wyświetlane w postaci wykresu słupkowego ze słupkami błędów dla odchylenia standardowego między powtórzeniami. Dane nie muszą być znormalizowane, ale można je znormalizować, ustawiając żywotność kontroli czynnika splicingu WT na 1 i porównując wpływ wprowadzonej mutacji (mutacji).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy wzrostu, takie jak ACT1-CUP1, wymagają wizualnej, porównawczej oceny wielu kolonii. Tutaj każdy szczep został wyhodowany do nasycenia przez noc, rozcieńczony do OD600 0,5 i posiany na 20 płytkach zawierających zakres stężeń miedzi od 0 mM do 1,1 mM CuSO4 (Rysunek 3). Zakres ten jest mniejszy niż podany w protokole, ponieważ pozwolił na pełną ocenę wpływu zastosowanych i opisanych poniżej reporterów QSP oraz ACT1-CUP1. Tabliczki zostały zobrazowane i ocenione (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ACT1-CUP1 jest testem wzrostu i należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że obserwowane różnice wzrostu można przypisać wyłącznie wadom splicingu. Wszystkie szczepy powinny być traktowane w podobny sposób przed posiewem, w tym powinny mieć podobną długość i rodzaj wzrostu oraz warunki przechowywania. W przypadku stosowania szczepów wrażliwych na temperaturę, testy ACT1-CUP1 powinny być wykonywane tylko w warunkach, w których szczepy te rosną porównywalnie do typu dzikiego. W związku z tym, w przypadku komponentu QSP,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękuję Aaronowi Hoskinsowi i członkom laboratorium Hoskinsa z University of Wisconsin-Madison za użycie szczepów drożdży i sprzętu do generowania rysunków 3-5. Dziękuję Harpreet Kaur i Xingyang Fu za ich wnikliwe komentarze na temat rękopisu. Dziękuję wspierającym studentom, pracownikom i wykładowcom Uniwersytetu Północno-Zachodniego podczas pisania, redagowania i filmowania tego artykułu. Dziękuję Isabelle Marasigan za pomoc w sfilmowaniu tej metody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml sterylne probówki do mikrowirówekFisher Scientific05-408-129Lub porównywalny przedmiot od innego producenta.
2 ml sterylne probówki do mikrowirówekFisher Scientific05-408-138Lub porównywalny produkt od innego producenta.
Sterylne probówki wirówkowe 50 mlFisher Scientific07-201-332Lub porównywalny przedmiot od innego producenta.
96-dołkowa mikropłytka z okrągłym dnemFisher Scientific07-200-760Lub porównywalny produkt innego producenta.
190-procentowy etanolFisher Scientific22-032-600Lub porównywalny przedmiot od innego producenta.
System filtracyjny 500 ml (0,22 &mikro; m)CellTreat Scientific Products229707Lub porównywalny produkt innego producenta.
AgarFisher ScientificBP1423-500Każdy agar klasy molekularnej będzie działał.
AutoklawTuttnauer3870EALub porównywalny produkt innego producenta.
PalnikBunsena HumboldtPN6200.1Lub porównywalny produkt innego producenta.
Miernik gęstości komórekVWR490005-906Lub inne urządzenie spektralne, które może mierzyć absorbancję przy 595 nm.
Siarczan miedzi PentahydrateFisher ScientificLC134051Lub porównywalny przedmiot innego producenta.
Cyfrowy system obrazowaniaCytiva29399481ImageQuant 4000 (wykorzystany na rysunku 3),  Amersham ImageQuant 800 lub porównywalny produkt innego producenta.
Mieszanka rezygnacji (-Leu)USBiological Life SciencesD9525Użyj odpowiedniej mieszanki do rezygnacji do swojego eksperymentu. Możliwe, że będziesz używać markera składników odżywczych drożdży również do zaburzeń zapytania. W takim przypadku mieszanka odpadająca powinna być dla tego markera i Leu
D-GlucoseFisher ScientificAAA1682836Lub porównywalnego produktu od innego producenta.
Oprogramowanie do kwantyfikacji opaskiżelowej Cytiva29-0006-05ImageQuant TL v8.1 (używane dla rysunku 5A) lub porównywalny produkt innego producenta.
Aparat ręcznyNikonD3500Lub porównywalny przedmiot innego producenta.
Żelowe urządzenie do obrazowania w bliskiej podczerwieniCytiva29238583Amersham Typhoon NIR (użyte na rysunku 5a) lub porównywalny produkt innego producenta.
Zacisk laboratoryjnyFisher Scientific05-769-7QLub porównywalny przedmiot innego producenta.
Stojak i zacisk klasy laboratoryjnejFisher Scientific12-000-101Lub porównywalny przedmiot od innego producenta.
Mieszadła magnetyczneFisher Scientific14-513-51Lub porównywalny przedmiot od innego producenta.
Replikator sworzniVP ScientificVP 407AH
Półmikrokuwety jednorazoweVWR97000-590Lub porównywalny produkt innego producenta.
ShakerJEIO TechIST-3075Lub porównywalny produkt innego producenta.
SpektrofotometrBiowave80-3000-45Lub dowolny spektrofotometr, który może zmierzyć absorbancję przy 600 nm.
Płyty kwadratoweVWR102091-156Można również stosować płyty okrągłe, chociaż są one trudniejsze w przypadku korzystania z replikatora pinów.
Mieszaj płytkęFisher Scientific11-520-16SLub porównywalny produkt od innego producenta.
Drożdżowa baza azotowaUSBiological Life SciencesY2025Lub porównywalny produkt innego producenta.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  3. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
  4. Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
  5. Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
  6. Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
  7. Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
  8. Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
  9. Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
  10. Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
  11. Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
  12. Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3' splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
  13. Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
  14. Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
  15. Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
  16. Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
  17. MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5' splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
  18. Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
  19. Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
  20. Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
  21. Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315(2020).
  22. vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
  23. Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
  24. Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O'Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
  25. Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
  26. Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
  27. Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5' splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
  28. Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
  29. Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
  30. Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
  31. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
  32. McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
  33. Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
  34. Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
  35. Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
  36. Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
  37. Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
  38. Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
  39. Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
  40. JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  41. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
  42. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. Biotechniques. 30 (4), 816(2001).
  43. Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
  46. vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
  47. Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
  48. Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
  49. Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
  50. Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
  51. Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
  52. Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
  53. Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
  54. Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
  55. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  56. Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
  57. Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test ACT1 CUP1splicing dro d owytest wzrostu na miedzimutacja czynnika splicingowegoSaccharomyces cerevisiaesplicing pre mRNAfenotyp wzrostutest reporterowywra liwo splicingu

Powiązane artykuły