Artykuł metodologiczny

Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

DOI:

10.3791/63242

⸱

2 listopada 2021

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otwarte wyszukiwanie umożliwia identyfikację glikopeptydów ozdobionych nieznanymi wcześniej kompozycjami glikanów. W tym artykule przedstawiono uproszczone podejście do podejmowania otwartych poszukiwań i późniejszych poszukiwań glikopeptydów skoncentrowanych na glikanie dla próbek bakteryjnych na przykładzie Acinetobacter baumannii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikozylacja białek jest coraz częściej uznawana za powszechną modyfikację w organizmach bakteryjnych, przyczyniając się do fizjologii prokariotycznej i optymalnej zakaźności gatunków chorobotwórczych. Z tego powodu rośnie zainteresowanie charakteryzacją glikozylacji bakteryjnej i zapotrzebowanie na wysokoprzepustowe narzędzia analityczne do identyfikacji tych zdarzeń. Chociaż proteomika oddolna z łatwością umożliwia generowanie bogatych danych dotyczących glikopeptydów, zakres i różnorodność glikanów obserwowanych w gatunkach prokariotycznych sprawia, że identyfikacja zdarzeń glikozylacji bakteryjnej jest niezwykle trudna.

Tradycyjnie, ręczne określanie składu glikanów w zbiorach danych proteomicznych bakteryjnych sprawiało, że była to w dużej mierze analiza na zamówienie, ograniczona do ekspertów w danej dziedzinie. Ostatnio otwarte podejścia oparte na wyszukiwaniu pojawiły się jako potężna alternatywa dla identyfikacji nieznanych modyfikacji. Analizując częstotliwość unikalnych modyfikacji obserwowanych w sekwencjach peptydowych, otwarte techniki wyszukiwania pozwalają na identyfikację powszechnych glikanów przyłączonych do peptydów w złożonych próbkach. W artykule przedstawiono usprawniony proces interpretacji i analizy danych glikoproteomicznych, pokazując, w jaki sposób można wykorzystać techniki otwartego wyszukiwania do identyfikacji bakteryjnych glikopeptydów bez wcześniejszej wiedzy na temat składu glikanów.

Korzystając z tego podejścia, można szybko zidentyfikować glikopeptydy w próbkach, aby zrozumieć różnice w glikozylacji. Wykorzystując Acinetobacter baumannii jako model, podejścia te umożliwiają porównanie składu glikanów między szczepami i identyfikację nowych glikoprotein. Podsumowując, praca ta demonstruje wszechstronność technik przeszukiwania otwartych baz danych w celu identyfikacji glikozylacji bakteryjnej, dzięki czemu charakterystyka tych wysoce zróżnicowanych glikoproteomów jest łatwiejsza niż kiedykolwiek wcześniej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikozylacja białek, proces przyłączania węglowodanów do cząsteczek białka, jest jedną z najczęstszych modyfikacji potranslacyjnych (PTM) w przyrodzie1,2. We wszystkich dziedzinach życia rozwinął się szereg złożonych mechanizmów dedykowanych generowaniu glikoprotein, które wpływają na niezliczone funkcje komórkowe1,3,4,5. Podczas gdy glikozylacja białek zachodzi na wielu aminokwasach6,7, zdarzenia glikozylacji sprzężonej z N i O, są dwiema dominującymi formami obserwowanymi w przyrodzie. Glikozylacja sprzężona z N polega na przyłączeniu glikanów do atomu azotu reszt asparaginy (Asn), podczas gdy w glikozylacji sprzężonej z O glikany są przyłączane do atomu tlenu reszt seryny (Ser), treoniny (Thr) lub tyrozyny (Tyr)7. Pomimo podobieństw w resztach docelowych przez systemy glikozylacji, różnice w glikanach przyłączonych do białek powodują, że glikozylacja jest najbardziej zróżnicowaną chemicznie klasą PTM występującą w przyrodzie.

Chociaż systemy glikozylacji eukariotycznej posiadają różnorodność glikanów, systemy te są zazwyczaj ograniczone pod względem liczby wykorzystywanych unikalnych węglowodanów. Wynikająca z tego różnorodność wynika z tego, jak te węglowodany są ułożone w glikany8,9,10,11,12. W przeciwieństwie do tego, gatunki bakteryjne i archeonowe posiadają praktycznie nieograniczoną różnorodność glikanów ze względu na sam wachlarz unikalnych cukrów generowanych w tych systemach2,10,13,14,15,16,17. Te różnice w różnorodności glikanów obserwowane w różnych dziedzinach życia stanowią poważne wyzwanie analityczne dla charakterystyki i identyfikacji zdarzeń glikozylacji. W przypadku glikozylacji eukariotycznej zdolność do przewidywania składu glikanów ułatwiła rosnące zainteresowanie glikobiologią; Jednak to samo nie dotyczy glikozylacji bakteryjnej, która nadal jest w dużej mierze ograniczona do badań przez wyspecjalizowane laboratoria. Wraz ze wzrostem dostępności oprzyrządowania do spektrometrii mas (MS) w naukach biologicznych, podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym są obecnie podstawową metodą analizy glikoproteomicznej.

MS stał się kwintesencją narzędzia do charakterystyki glikozylacji, z obecnie powszechnie stosowanymi metodami odgórnymi i oddolnymi do charakteryzowania glikoprotein6. Podczas gdy proteomika odgórna jest wykorzystywana do oceny globalnych wzorców glikozylacji określonych białek18,19, podejścia oddolne są stosowane, aby umożliwić specyficzną dla glikanów charakterystykę glikopeptydów, nawet z mieszanin złożonych6,20,21,22,23. Do analizy glikopeptydów generowanie informacyjnych informacji o fragmentacji jest niezbędne do scharakteryzowania zdarzeń glikozylacji24,25. Szereg podejść do fragmentacji jest obecnie rutynowo dostępnych w instrumentach, w tym dysocjacja wywołana zderzeniem oparta na rezonansowej pułapce jonowej (IT-CID), dysocjacja wywołana zderzeniem typu wiązki (CID) i dysocjacja transferu elektronów (ETD). Każde podejście ma różne mocne i słabe strony analizy glikopeptydu25,26, ze znaczącym postępem w ciągu ostatniej dekady w stosowaniu tych podejść fragmentacji do analizy glikozylacji6,20. Jednak w przypadku analizy glikozylacji bakteryjnej krytycznym ograniczeniem nie była zdolność do fragmentacji glikopeptydów, ale raczej niemożność przewidzenia potencjalnego składu glikanów w próbkach. W tych systemach nieznany charakter różnorodnych glikanów bakteryjnych ogranicza identyfikację glikopeptydów, nawet przy użyciu narzędzi wyszukiwania skoncentrowanych na glikozylacji, które są obecnie powszechne do analizy glikopeptydów eukariotycznych, takich jak O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 i GlycReSoft29. Aby przezwyciężyć ten problem, potrzebna jest alternatywna metoda wyszukiwania, z wykorzystaniem otwartych narzędzi wyszukiwania, które stają się potężnym podejściem do badania glikozylacji bakteryjnej30.

Otwarte wyszukiwanie, znane również jako wyszukiwanie ślepe lub wieloznaczne, pozwala na identyfikację peptydów z nieznanymi lub nieoczekiwanymi PTM-ami21,30,31,32. Otwarte wyszukiwania wykorzystują różne techniki obliczeniowe, w tym wyselekcjonowane wyszukiwanie modyfikacji, wieloetapowe przeszukiwanie baz danych lub wyszukiwanie o szerokiej tolerancji masowej33,34,35,36,37. Chociaż wyszukiwanie otwarte ma ogromny potencjał, jego zastosowanie było zazwyczaj utrudnione przez znaczne wydłużenie czasu analizy i utratę czułości wykrywania niezmodyfikowanych peptydów w porównaniu z wyszukiwaniami ograniczonymi31,32. Spadek wykrywalności niezmodyfikowanych dopasowań peptydowo-spektralnych (PSM) jest wynikiem zwiększonego odsetka fałszywie dodatnich PSM związanych z tymi technikami, co wymaga zwiększonego rygorystycznego filtrowania w celu utrzymania pożądanych wskaźników fałszywych wykryć (FDR)33,34,35,36,37. Ostatnio dostępnych jest kilka narzędzi, które znacznie poprawiają dostępność otwartego wyszukiwania, w tym Byonic31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 i MSFragger21,41. Narzędzia te umożliwiają solidną identyfikację zdarzeń glikozylacji poprzez znaczne skrócenie czasu analizy i wdrożenie podejść do obsługi heterogenicznych kompozycji glikanów.

Ten artykuł przedstawia uproszczoną metodę identyfikacji bakteryjnych glikopeptydów za pomocą otwartego wyszukiwania, przy użyciu Gram-ujemnego patogenu szpitalnego, Acinetobacter baumannii, jako modelu. A. baumannii posiada konserwatywny system glikozylacji sprzężony z O, odpowiedzialny za modyfikację wielu substratów białkowych, znany jako system glikozylacji białek PglL42,43,44. Podczas gdy podobne białka są przeznaczone do glikozylacji między szczepami, system glikozylacji PglL jest bardzo zmienny ze względu na biosyntezę glikanu używanego do glikozylacji białek pochodzącego z locus kapsułki (znanego jako locus K)44,45,46. W ten sposób do substratów białkowych dodawane są różne glikany (znane również jako jednostka K), pochodzące z pojedynczych lub ograniczonych spolimeryzowanych jednostek K30,44,46. W ramach tej pracy wykorzystano otwarte narzędzie wyszukiwania, MSfragger, w oprogramowaniu FragPipe, do identyfikacji glikanów w szczepach A. baumannii. Łącząc otwarte wyszukiwanie i ręczne selekcjonowanie, można podjąć "poszukiwania skoncentrowane na glikanach" w celu dalszej poprawy identyfikacji bakteryjnych glikopeptydów. To wieloetapowe podejście do identyfikacji umożliwia identyfikację glikopeptydów bez dużego doświadczenia w charakteryzowaniu nowych zdarzeń glikozylacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przygotowanie i analizę próbek bakteryjnego glikopeptydu można podzielić na cztery sekcje (Rysunek 1). W tym badaniu oceniono glikozylację trzech sekwencjonowanych szczepów A. baumannii (Tabela 1). Bazy danych Proteome FASTA każdego z tych szczepów są dostępne za pośrednictwem Uniprot. Patrz Tabela 2 w celu zapoznania się ze składem stosowanych w niniejszym protokole.

1. Przygotowanie próbek białek do analizy proteomicznej

  1. Izolacja próbek proteomu będących przedmiotem zainteresowania
    1. W przypadku używania całych komórek należy upewnić się, że zostały one umyte roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) w celu usunięcia potencjalnych zanieczyszczeń białkowych obecnych w pożywce. Po umyciu należy zamrozić całe komórki i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą potrzebne.
    2. Jeśli używane są próbki frakcjonowane (takie jak preparaty membranowe), upewnij się, że użyte odczynniki nie będą zakłócać dalszej analizy chromatografii cieczowej MS (LC-MS) 50.
    3. Jeśli użyto detergentów, takich jak dodecylosiarczan sodu (SDS), Triton X-100, NP-40 lub lauroilosarkozyna, usuń te detergenty za pomocą wytrącania acetonu, metod przygotowania próbek SP351 lub komercyjnych proteomicznych kolumn czyszczących, takich jak S-traps52. Alternatywnie, niekompatybilne detergenty można zastąpić detergentem zgodnym ze stwardnieniem rozsianym lub usuwalnym, takim jak deoksycholan sodu (SDC) lub glukopiranozyd oktylu.
    4. Upewnij się, że wszystkie naczynia z tworzyw sztucznych i szkła, które mają być używane do przygotowania próbki, nie zostały sterylizowane w autoklawie. Autoklawowane wyroby szklane i tworzywa sztuczne są zazwyczaj silnie zanieczyszczone związkami o małej masie cząsteczkowej, takimi jak polimery, które są łatwo wykrywalne w stwardnieniu rozsianym.
  2. Solubilizacja próbek całokomórkowych
    1. Ponownie zawiesić ~10 mg przemytych, zamrożonych komórek w 200 μl świeżo przygotowanego buforu do lizy deoksycholanu sodu (bufor do lizy SDC: 4% SDC w 100 mM Tris, pH 8,5).
      UWAGA: Inhibitory proteazy można dodawać do buforu do lizy SDC w celu ograniczenia degradacji białek.
    2. Gotować próbki przez 10 minut w temperaturze 95 °C z wytrząsaniem (2000 obr./min na termomikserze), a następnie pozostawić na lodzie na 10 minut. Powtórzyć ten proces dwukrotnie, aby zapewnić efektywną lizę i rozpuszczalność próbek.
      UWAGA: W tym momencie próbki mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C. W przypadku przechowywania rozpuścić przez podgrzanie w temperaturze 95 °C przed dalszym przetwarzaniem.
  3. Określ ilościowo stężenie białka w próbce za pomocą testu białkowego kwasu bicinchoninowego (BCA)53. Przechowuj próbki na lodzie podczas wykonywania oceny ilościowej w celu ograniczenia degradacji białek.
    UWAGA: Do całkowitej analizy proteomu 20-100 μg białka jest więcej niż wystarczające dla nano LC-MS, który zwykle wymaga mniej niż 2 μg trawienia białka na analizę. Przygotowanie nadmiaru peptydu pozwala na analizę replikacji lub dalsze frakcjonowanie, jeśli wymagane jest głębokie pokrycie proteomiczne. Do analizy opartej na wzbogacaniu glikopeptydów przy użyciu chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC) wymagane jest 100-500 μg białka.
  4. Próbki redukować i alkilować.
    1. Dodać 1/10objętości 10-krotnego buforu redukcyjno-alkilacyjnego (100 mM chlorowodorku 2-karboksyetylofosfiny Tris; 400 mM 2-chloroacetamidu w 1 M Tris, pH 8,5) do próbek o końcowym stężeniu 1x i inkubować próbki w ciemności przez 30 minut w temperaturze 45 °C z wytrząsaniem przy 1 500 obr./min.
      UWAGA: Sprawdź pH 10-krotnego buforu redukcyjnego/alkilacyjnego, aby upewnić się, że pH wynosi około 7,0-8,0 przed dodaniem do próbek, ponieważ niższe pH spowoduje wytrącanie się SDC.
  5. Krótko odwiruj próbki i dodaj proteazy Trypsyna/Lys-C (~10 μL, ponownie zawieszone w 100 mM Tris, pH 8,5), aby uzyskać ostateczny stosunek proteazy do białka 1:100. Roztwory mineralne inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 1 500 obr./min (do 18 godzin). Aby zapewnić pełne trawienie białka, użyj stosunku proteazy trypsyny/Lys-C do białka 1:50 do 1:200.
  6. Trawienie hartowane przez dodanie do próbek 1,25 objętości 100% izopropanolu. Wirować próbki przez 1 minutę, aby je wymieszać i krótko je odwirować.
    UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w celu późniejszej obróbki.
  7. Zakwasić próbki, dodając 0,115 objętości 10% kwasu trifluorooctowego (TFA; końcowe stężenie ~1% TFA), zawirować próbki i krótko je odwirować.

2. Przetwarzanie próbek proteomu

  1. Oczyszczanie peptydowe próbek proteomu
    1. Przygotuj jedną końcówkę sulfonianu odwróconej fazy styrenydenylobenzenu (SDB-RPS) do ekstrakcji typu stop-and-go (Stage) dla każdej próbki, jak opisano wcześniej54.
      1. Empirycznie, aby związać 50 μg peptydu, należy wyciąć trzy krążki SDB-RPS z membrany SDB-RPS o średnicy 47 mm2 za pomocą igły (14 G). W przypadku większych ilości peptydów należy odpowiednio zwiększyć liczbę krążków.
    2. Przed użyciem końcówek SDB-RPS należy przygotować końcówki, dodając kolejno co najmniej dziesięć objętości złoża następujących i albo obracając bufor przez kolumnę przez wirowanie (25 °C, 3 min, 500 × g), albo przepychając bufor przez kolumnę, delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki.
      1. Zwilż końcówki 150 μl 100% acetonitrylu.
      2. Umyj końcówki 150 μl 30% metanolu, 1% TFA w 18,2 MΩH2O.
      3. Zrównoważyć końcówki 150 μl 90% izopropanolu, 1% TFA zrównoważonym 18,2 MΩ H2O.
    3. Załadować próbki (zawierające 50% izopropanolu, 1% TFA) na końcówki stolika SDB-RPS przez odwirowanie (25 °C, 3 min, 500 × g) lub delikatnie naciskając za pomocą strzykawki.
    4. Umyj końcówki SDB-RPS Stage następującymi przez odwirowanie (25 °C, 3 min, 500 × g) lub delikatnie naciskając za pomocą strzykawki.
      UWAGA: Do usunięcia zanieczyszczeń niepeptydowych można użyć dodatkowych płukań lub alternatywnych, takich jak użycie octanu etylu zamiast izopropanolu55.
      1. Umyj końcówki 150 μl 90% izopropanolu, 1% TFA.
      2. Umyj końcówki 150 μl 1% TFA w 18,2 MΩH2O.
    5. Eluować peptydy z końcówek SDB-RPS za pomocą 150 μl 5% wodorotlenku amonu w 80% acetonitrylu przez odwirowanie lub delikatne naciśnięcie za pomocą strzykawki. Próbki należy pobrać do pojedynczych probówek.
      UWAGA: Przygotować 5% wodorotlenek amonu w 80% acetonitrylu w plastikowym pojemniku bezpośrednio przed użyciem w dygestorium.
    6. Wymyte peptydy wysuszyć przez odwirowanie próżniowe w temperaturze 25 °C.
      UWAGA: Jeśli podejmujesz wzbogacanie HILI, 1-10% eluatów peptydowych można w tym momencie usunąć, wysuszyć i wykorzystać jako całkowitą kontrolę wejściową proteomu.
  2. Wzbogacanie próbek glikopeptydu
    1. Przygotuj końcówki etapu chromatografii cieczowej z obojczojonową interakcją hydrofilową (ZIC-HILIC) zgodnie z wcześniejszym opisem54,56.
      1. Krótko mówiąc, wyciąć jeden krążek C8 z membrany 47 mm2 C8 za pomocą igły (14 G) i umieścić krążek w końcówce P200, aby uzyskać frytę. Dodać około 5 mm materiału ZIC-HILIC, zawieszonego w 50% acetonitrylu, 50% 18,2 MΩH2O, na frytę, delikatnie dociskając strzykawką.
    2. Przed użyciem końcówek ZIC-HILIC Stage należy kondycjonować żywicę, dodając kolejno następujące i delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki.
      UWAGA: Aby zapewnić integralność warstwy pseudo-wodnej na powierzchni żywicy ZIC-HILIC (wymaganej do wzbogacenia glikopeptydów), żywica musi zawsze pozostać mokra. Podczas mycia żywicy zawsze pozostawiaj ~10 μl rozpuszczalnika nad żywicą i upewnij się, że płyny/próbki są pipetowane bezpośrednio do tego pozostałego rozpuszczalnika.
      1. Zrównoważyć żywicę z 20 objętościami złoża (200 μL) buforu elucyjnego ZIC-HILIC (0,1% TFA w 18,2 MΩ H2O).
      2. Przemyć żywicę 20 objętościami złoża (200 μL) buforu do przygotowania ZIC-HILIC (95% acetonitrylu w 18,2 MΩH2O).
      3. Przepłukać żywicę 20 objętościami złoża (200 μl) buforu załadowczo-płuczącego ZIC-HILIC (80% acetonitrylu, 1% TFA zrównoważone 18,2 MΩH2O).
    3. Zawiesić wysuszone przefermentowane próbki (z etapu 2.1.6) w buforze naładowującym/przemłuczającym ZIC-HILIC do końcowego stężenia 4 μg/μL (np. dla 200 μg peptydu zawiesić w 50 μl buforu ładującego/płuczącego ZIC-HILI). Wirować krótko przez 1 minutę, aby upewnić się, że próbki zostały ponownie zawieszone, a następnie wirować przez 1 minutę w temperaturze 2 000 × g w temperaturze 25 °C.
    4. Załadować zawieszoną próbkę peptydu do kondycjonowanej kolumny ZIC-HILI.
      1. Przemyć trzykrotnie 20 objętości złoża (200 μl) buforu załadowczo-myjącego ZIC-HILIC (dla łącznie 60 prań objętościowych złoża), delikatnie uciskając za pomocą strzykawki.
      2. Eluować glikopeptydy z 20 objętościami złoża (200 μl) buforu elucyjnego ZIC-HILIC do probówki o pojemności 1,5 ml, delikatnie wywierając nacisk za pomocą strzykawki, a następnie wysuszyć eluat przez odwirowanie próżniowe w temperaturze 25 °C.

3. LC-MS próbek wzbogaconych w proteom/glikopeptyd

  1. Zawiesić próbki w buforze A* (2% acetonitrylu, 0,1% TFA) do końcowego stężenia 1 μg/μl (na przykład w przypadku 50 μg peptydu ponownie zawiesić w 50 μl buforu A*).
  2. Załadować próbki do HPLC/UPLC sprzężonego z MS, aby umożliwić oddzielenie i identyfikację glikopeptydów.
    UWAGA: Parametry kolumny, w tym średnica wewnętrzna, długość, natężenie przepływu, rodzaj żywicy chromatograficznej i wymagane ilości iniekcji peptydów, powinny być zoptymalizowane pod kątem konfiguracji analitycznej i długości gradientu, które mają być zastosowane; Aby zapoznać się z przykładem, jak przeprowadzić optymalizację ustawień analitycznych, zobacz57.
  3. Monitoruj gromadzenie wynikowych danych MS, upewniając się, że dane są zbierane z żądanymi parametrami.
    UWAGA: Do analizy składu wystarczające jest rozdrobnienie CID. Ze względu na dodanie glikanów do glikopeptydów, jony glikopeptydowe są zwykle obserwowane z wyższą m/z i niższą gęstością ładunku niż peptydy nieglikozylowane. Aby upewnić się, że jony te są obserwowalne, należy pozwolić na zakres masy MS1 od 400 do 2000 m/z.
  4. Fragmentacja wybranych jonów za pomocą CID, zapewniająca zbieranie jonów fragmentarycznych o niskiej zawartości m/z, które zawierają jony oksoniowe ważne dla charakterystyki glikanów.
    UWAGA: Na fragmentację glikopeptydów za pomocą CID mają wpływ zarówno sekwencje peptydów i glikanów, jak i energia zastosowana podczas fragmentacji25,58,59. Chociaż można zastosować szereg różnych energii zderzeń, optymalną strategią fragmentacji glikopeptydów jest użycie stopniowanych energii zderzeń łączących użycie wielu energii zderzeń25,59,60.
  5. Użyj alternatywnych metod fragmentacji, jeśli są dostępne, takich jak ETD do lokalizacji miejsca lub IT-CID, aby pomóc w określeniu składu glikanów.
    UWAGA: Żadne z tych podejść do fragmentacji nie jest niezbędne do analizy składowej, ale można je zebrać, aby umożliwić dalsze badanie interesujących nas glikopeptydów.

4. Analiza próbek wzbogaconych w proteom/glikopeptyd

  1. Wstępne filtrowanie plików danych w celu umożliwienia wyszukiwania w FragPipe
    1. Jeśli skany ETD lub IT-CID zostały uzyskane w zestawach danych, przefiltruj te zdarzenia skanowania z plików danych przy użyciu MSConvert61 przed wyszukiwaniem za pomocą FragPipe.
      UWAGA: W przypadku opisanych poniżej parametrów wyszukiwania otwartego wymagane są tylko dane CID typu belki.
  2. Przeprowadzanie otwartych wyszukiwań w FragPipe
    1. Otwórz FragPipe i kliknij zakładkę Workflow. Z menu rozwijanego przepływu pracy wybierz opcję Otwórz wyszukiwanie i kliknij Dodaj pliki, aby zaimportować pliki danych, które mają być przeszukiwane do FragPipe (Rysunek 2A).
    2. Kliknij kartę Baza danych i uruchom menedżera pobierania, klikając Pobierz. Pozwala to na pobieranie baz danych proteomu z Uniprot przy użyciu identyfikatora Uniprot Proteome ID. Kliknij opcję Dodaj wabiki i zanieczyszczenia w menedżerze pobierania, aby włączyć białka wabiące i zanieczyszczające do baz danych.
    3. Aby uzyskać bardziej rygorystyczne progi FDR, kliknij kartę Validation (Walidacja) i zmodyfikuj wartość Filter and report (Filtruj i raportuj) z 0,01 na wymaganą wartość FDR.
      UWAGA: Domyślne ustawienia FragPipe zapewnią 1% FDR na poziomie białka.
    4. Kliknij kartę MSfragger. W polu Dopasowanie piku zwiększ tolerancję masy prekursora z domyślnej 500 Da do 2,000 Da, aby umożliwić identyfikację dużych modyfikacji (Rysunek 2A).
    5. Kliknij zakładkę Uruchom i zdefiniuj lokalizację wyjść FragPipe. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć wyszukiwanie.
  3. Korzystając z PSM zidentyfikowanych w zestawach danych (zawartych w danych wyjściowych psm.tsv z FragPipe), zidentyfikuj potencjalne glikany, wykreślając częstotliwość obserwowanych mas delta w zestawach danych (Rysunek 3). Tworzenie wykresów masy różnicowej na podstawie danych wyjściowych MSfragger przy użyciu skryptów języka R dostępnych za pośrednictwem PXD027820 przystąpienia do programu PRIDE
    UWAGA: W tych skryptach odbywa się minimalne przetwarzanie końcowe otwartych wyników wyszukiwania, ponieważ głównym celem tych skryptów jest pomoc w wizualizacji profili masy delta. Co ważne, sama obserwacja obfitych mas delta nie jest dowodem na to, że modyfikacja jest potencjalnym glikanem, ponieważ przypisanie mas delta jako glikanów wymaga dalszej analizy odpowiadających im zdarzeń MS2.
  4. Aby umożliwić charakterystykę glikopeptydów w próbkach, należy skupić się na identyfikacji masy delta o wysokim poziomie ufności, odpowiadającej przypisaniom z wysokimi hiperwynikami.
    1. Aby pomóc w ocenie widm glikopeptydów, użyj narzędzi do adnotacji peptydów, takich jak Interactive Peptide Spectral Annotator63, który umożliwia przypisanie jonów związanych z peptydami w widmach, umożliwiając ręczną identyfikację jonów związanych z glikanem (Rysunek 4).
      UWAGA: W przedstawionych tutaj zestawach danych hiperwyniki >30 są uważane za wysokie wyniki, ponieważ odpowiadają one wynikom w obrębie górnych 50% wszystkich zidentyfikowanych glikopeptydów (Rysunek 5).
  5. Mając przypisane glikopeptydy o wysokim poziomie ufności, zidentyfikuj powszechnie obserwowane jony związane z glikanami (Rysunek 4), aby poprawić identyfikację glikopeptydów.
    UWAGA: Poprzez włączenie jonów związanych z glikanem do wyszukiwań, znanych jako wyszukiwania skoncentrowane na glikanie, można poprawić jakość przypisań glikopeptydów.
    1. Kliknij zakładkę MSfragger w FragPipe, włącz wyznaczone masy delta obserwowanych glikanów do sekcji Modyfikacje zmiennych i Przesunięcia masy. Dodaj te masy, wpisując wartości w sekcjach Modyfikacje zmiennych i Przesunięcia masy, oddzielając poszczególne bryły znakiem /. Dodaj masy fragmentów tych glikanów związanych z glikanami do sekcji Mody gliko/labilne w MSFragger.
      UWAGA: Rysunek 2B przedstawia kluczowe informacje wymagane do skoncentrowanego na glikanie wyszukiwania szczepu A. baumannii AB307-0294.
  6. Prześlij wszystkie dane dotyczące stwardnienia rozsianego związane z badaniami proteomicznymi do scentralizowanych repozytoriów proteomicznych, takich jak repozytoria PRIDE lub MASSUARY.
    UWAGA: Wszystkie dane związane z tym badaniem zostały zdeponowane w repozytorium proteomicznym PRIDE i można uzyskać do nich dostęp za pośrednictwem akcesji PRIDE: PXD027820.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować użyteczność otwartego poszukiwania analizy bakteryjnej glikopeptydu, oceniono różnorodność chemiczną glikanów związanych z O w trzech szczepach A. baumannii-AB307-0294, ACICU i D1279779-. Glikoproteomy sprzężone z O są bardzo zmienne między szczepami A. baumannii, ponieważ glikany używane do glikozylacji pochodzą z wysoce zmiennych loci44,45,46. Ta różnorodność chemiczna sprawi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otwarte wyszukiwanie to skuteczna i systematyczna metoda identyfikacji nieznanych modyfikacji. Podczas gdy identyfikacja nieznanych glikanów w próbkach proteomu bakteryjnego była tradycyjnie czasochłonnym i technicznie wyspecjalizowanym przedsięwzięciem, ostatnie osiągnięcia narzędzi takich jak MSfragger21,41 i Byonic31,38 umożliwiają teraz szybką i skuteczną identyfikację mas delta w celu dalszej charakt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N.E.S jest wspierany przez Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) oraz ARC Discovery Project Grant (DP210100362). Dziękujemy Zakładowi Spektrometrii Mas i Proteomiki w Melbourne Instytutu Nauk Molekularnych i Biotechnologii Bio21 za dostęp do oprzyrządowania do stwardnienia rozsianego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
14 G Kel-F Hub Point Style 3Hamilton companyhanc90514
2-ChloroacetamidSigma Aldrich Pty LtdC0267-100G
AcetonitrylSigma Aldrich Pty Ltd34851-4L
Wodorotlenek amonu (28%)Sigma Aldrich Pty Ltd338818-100ML
Odczynnik do oznaczania białek BCA APierce23228
Odczynnik do oznaczania białek BCAB Pierce23224
C8 Empore SPESigma Aldrich Pty Ltd66882-UAlternatywnym dostawcą materiału C8 jest Kwas powinowacy (https://www.affinisep.com/about-us/)
mrówkowySigma Aldrich Pty Ltd5.33002
IsopropanolSigma Aldrich Pty Ltd650447-2.5L
MetanolFisher ChemicalM/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (sulfonian odwróconej fazy)Sigma Aldrich Pty Ltd66886-UAlternatywnym dostawcą dla SDB-RPS jest Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium DeoxycholateSigma Aldrich Pty LtdD6750-100G
ThermoMixer CEppendorf2232000083
kwas trifluorooctowySigma Aldrich Pty Ltd302031-10X1ML
Chlorowodorek 2-karboksyetylofosfiny TrisSigma Aldrich Pty LtdC4706-2G
Tris(hydroksymetylo)aminometanSigma Aldrich Pty Ltd252859-500G
Mieszanina proteazy trypsyna/Lys-CPromegaV5073
Koncentrator próżniowyLabconco7810040
materiałZIC-HILICŻywicę Merck1504580001do stosowania w jednorazowych kolumnach SPE można uzyskać poprzez opróżnienie większej kolumny formularzowej i użycie wolnej żywicy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
  2. Schaffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Reviews. 41 (1), 49-91 (2017).
  3. Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N. Not just for Eukarya anymore: Protein glycosylation in bacteria and archaea. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 544-550 (2008).
  4. Szymanski, C. M., Yao, R., Ewing, C. P., Trust, T. J., Guerry, P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Molecular Microbiology. 32 (5), 1022-1030 (1999).
  5. Koomey, M. O-linked protein glycosylation in bacteria: snapshots and current perspectives. Current Opinion in Structural Biology. 56, 198-203 (2019).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100029(2020).
  7. Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
  8. Hu, H., Khatri, K., Klein, J., Leymarie, N., Zaia, J. A review of methods for interpretation of glycopeptide tandem mass spectral data. Glycoconjugate Journal. 33 (3), 285-296 (2016).
  9. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: Diversity, synthesis and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 448-462 (2012).
  10. Bohm, M., et al. Glycosciences.DB: An annotated data collection linking glycomics and proteomics data (2018 update). Nucleic Acids Research. 47, 1195-1201 (2019).
  11. Kawano, S., Hashimoto, K., Miyama, T., Goto, S., Kanehisa, M. Prediction of glycan structures from gene expression data based on glycosyltransferase reactions. Bioinformatics. 21 (21), 3976-3982 (2005).
  12. McDonald, A. G., Tipton, K. F., Davey, G. P. A knowledge-based system for display and prediction of O-glycosylation network behaviour in response to enzyme knockouts. PLOS Computational Biology. 12 (4), 1004844(2016).
  13. Eichler, J., Koomey, M. Sweet new roles for protein glycosylation in prokaryotes. Trends in Microbiology. 25 (8), 662-672 (2017).
  14. Scott, N. E., et al. Simultaneous glycan-peptide characterization using hydrophilic interaction chromatography and parallel fragmentation by CID, higher energy collisional dissociation, and electron transfer dissociation MS applied to the N-linked glycoproteome of Campylobacter jejuni. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 10 (2), (2011).
  15. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii strain 307-0294 is a major virulence factor. Infection and Immunity. 78 (9), 3993-4000 (2010).
  16. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Reviews Microbiology. 3 (3), 225-237 (2005).
  17. Imperiali, B. Bacterial carbohydrate diversity - a brave new world. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 1-8 (2019).
  18. Caval, T., Buettner, A., Haberger, M., Reusch, D., Heck, A. J. R. Discrepancies between high-resolution native and glycopeptide-centric mass spectrometric approaches: A case study into the glycosylation of erythropoietin variants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2099-2104 (2021).
  19. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100010(2020).
  20. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: growing up fast. Current Opinion in Structural Biology. 68, 18-25 (2020).
  21. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  22. Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. , (2021).
  23. Yu, A., et al. Advances in mass spectrometry-based glycoproteomics. Electrophoresis. 39 (24), 3104-3122 (2018).
  24. Reiding, K. R., Bondt, A., Franc, V., Heck, A. J. R. The benefits of hybrid fragmentation methods for glycoproteomics. Trends in Analytical Chemistry. 108, 260-268 (2018).
  25. Riley, N. M., Malaker, S. A., Driessen, M., Bertozzi, C. R. Optimal dissociation methods differ for N- and O-glycopeptides. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3286-3301 (2020).
  26. Mao, Y., et al. Systematic evaluation of fragmentation methods for unlabeled and isobaric mass tag-labeled O-glycopeptides. Analytical Chemistry. 93 (32), 11167-11175 (2021).
  27. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  28. Choo, M. S., Wan, C., Rudd, P. M., Nguyen-Khuong, T. GlycopeptideGraphMS: Improved glycopeptide detection and identification by exploiting graph theoretical patterns in mass and retention time. Analytical Chemistry. 91 (11), 7236-7244 (2019).
  29. Maxwell, E., et al. GlycReSoft: a software package for automated recognition of glycans from LC/MS data. PLoS One. 7 (9), 45474(2012).
  30. Ahmad Izaham, A. R., Scott, N. E. Open database searching enables the identification and comparison of bacterial glycoproteomes without defining glycan compositions prior to searching. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 19 (9), 1561-1574 (2020).
  31. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: Advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit 13.20 (2012).
  32. Na, S., Bandeira, N., Paek, E. Fast multi-blind modification search through tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 11 (4), 010199(2012).
  33. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Error tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data. Proteomics. 2 (10), 1426-1434 (2002).
  34. Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: Matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
  35. Ahrné, E., Nikitin, F., Lisacek, F., Müller, M. QuickMod: A tool for open modification spectrum library searches. Journal of Proteome Research. 10 (7), 2913-2921 (2011).
  36. Shortreed, M. R., et al. Global identification of protein post-translational modifications in a single-pass database search. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4714-4720 (2015).
  37. Chick, J. M., et al. A mass-tolerant database search identifies a large proportion of unassigned spectra in shotgun proteomics as modified peptides. Nature Biotechnology. 33 (7), 743-749 (2015).
  38. Roushan, A., et al. Peak filtering, peak annotation, and wildcard search for glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100011(2020).
  39. Chi, H., et al. Comprehensive identification of peptides in tandem mass spectra using an efficient open search engine. Nature Biotechnology. , (2018).
  40. Bittremieux, W., Laukens, K., Noble, W. S. Extremely fast and accurate open modification spectral library searching of high-resolution mass spectra using feature hashing and graphics processing units. Journal of Proteome Research. 18 (10), 3792-3799 (2019).
  41. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nature Methods. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  42. Harding, C. M., et al. Acinetobacter strains carry two functional oligosaccharyltransferases, one devoted exclusively to type IV pilin, and the other one dedicated to O-glycosylation of multiple proteins. Molecular Microbiology. 96 (5), 1023-1041 (2015).
  43. Iwashkiw, J. A., et al. Identification of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter baumannii and its role in virulence and biofilm formation. PLoS Pathogens. 8 (6), 1002758(2012).
  44. Scott, N. E., et al. Diversity within the O-linked protein glycosylation systems of Acinetobacter species. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2354-2370 (2014).
  45. Kenyon, J. J., Hall, R. M. Variation in the complex carbohydrate biosynthesis loci of Acinetobacter baumannii genomes. PLoS One. 8 (4), 62160(2013).
  46. Lees-Miller, R. G., et al. A common pathway for O-linked protein-glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter baumannii. Molecular Microbiology. 89 (5), 816-830 (2013).
  47. Iacono, M., et al. Whole-genome pyrosequencing of an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain belonging to the European clone II group. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (7), 2616-2625 (2008).
  48. Hamidian, M., et al. Insights from the revised complete genome sequences of Acinetobacter baumannii strains AB307-0294 and ACICU belonging to global clones 1 and 2. Microbial Genomics. 5 (10), 000298(2019).
  49. Farrugia, D. N., et al. The complete genome and phenome of a community-acquired Acinetobacter baumannii. PLoS One. 8 (3), 58628(2013).
  50. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  51. Batth, T. S., et al. Protein aggregation capture on microparticles enables multipurpose proteomics sample preparation. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (5), 1027-1035 (2019).
  52. HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
  53. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  54. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  55. Harney, D. J., et al. Proteomic analysis of human plasma during intermittent fasting. Journal of Proteome Research. 18 (5), 2228-2240 (2019).
  56. Scott, N. E. Characterizing glycoproteins by mass spectrometry in Campylobacter jejuni. Methods in Molecular Biology. 1512, 211-232 (2017).
  57. Bian, Y., et al. Robust microflow LC-MS/MS for proteome analysis: 38000 runs and counting. Analytical Chemistry. 93 (8), 3686-3690 (2021).
  58. Diedrich, J. K., Pinto, A. F., Yates, J. R. Energy dependence of HCD on peptide fragmentation: stepped collisional energy finds the sweet spot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1690-1699 (2013).
  59. Liu, M. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438(2017).
  60. Hinneburg, H., et al. The art of destruction: Optimizing collision energies in quadrupole-time of flight (Q-TOF) instruments for glycopeptide-based glycoproteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 507-519 (2016).
  61. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  62. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , http://www.r-project.org/index.html (2020).
  63. Brademan, D. R., Riley, N. M., Kwiecien, N. W., Coon, J. J. Interactive peptide spectral annotator: A versatile web-based tool for proteomic applications. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18, 193-201 (2019).
  64. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide from Acinetobacter baumannii is a potential therapeutic target via passive immunization. Infection and Immunity. 81 (3), 915-922 (2013).
  65. Senchenkova, S. N., et al. Structure of the capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii ACICU containing di-N-acetylpseudaminic acid. Carbohydrate Research. 391, 89-92 (2014).
  66. Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 5 (4), 397-409 (1988).
  67. Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. Determining the structure of glycan moieties by mass spectrometry. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 12, Unit 12.7 (2006).
  68. Medzihradszky, K. F., Kaasik, K., Chalkley, R. J. Characterizing sialic acid variants at the glycopeptide level. Analytical Chemistry. 87 (5), 3064-3071 (2015).
  69. Kelstrup, C. D., Frese, C., Heck, A. J., Olsen, J. V., Nielsen, M. L. Analytical utility of mass spectral binning in proteomic experiments by SPectral Immonium Ion Detection (SPIID). Molecular & Cellular Proteomics:MCP. 13 (8), 1914-1924 (2014).
  70. Ahmad Izaham, A. R., et al. What are we missing by using hydrophilic enrichment? Improving bacterial glycoproteome coverage using total proteome and FAIMS analyses. Journal of Proteome Research. 20 (1), 599-612 (2021).
  71. Neue, K., Mormann, M., Peter-Katalinic, J., Pohlentz, G. Elucidation of glycoprotein structures by unspecific proteolysis and direct nanoESI mass spectrometric analysis of ZIC-HILIC-enriched glycopeptides. Journal of Proteome Research. 10 (5), 2248-2260 (2011).
  72. Mysling, S., Palmisano, G., Hojrup, P., Thaysen-Andersen, M. Utilizing ion-pairing hydrophilic interaction chromatography solid phase extraction for efficient glycopeptide enrichment in glycoproteomics. Analytical Chemistry. 82 (13), 5598-5609 (2010).
  73. Escobar, E. E., et al. Precision mapping of O-Linked N-acetylglucosamine sites in proteins using ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 142 (26), 11569-11577 (2020).
  74. Madsen, J. A., et al. Concurrent automated sequencing of the glycan and peptide portions of O-linked glycopeptide anions by ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (19), 9253-9261 (2013).
  75. Lysiak, A., Fertin, G., Jean, G., Tessier, D. Evaluation of open search methods based on theoretical mass spectra comparison. BMC Bioinformatics. 22, 65(2021).
  76. Pabst, M., et al. A general approach to explore prokaryotic protein glycosylation reveals the unique surface layer modulation of an anammox bacterium. ISME Journal. , (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Glycopeptide IdentificationBacterial GlycosylationZIC HILIC EnrichmentBottom Up ProteomicsGlycan DiversityLC MS AnalysisGlycoproteomic Workflow

Powiązane artykuły