Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

Jessica M. Lewis; Pauline M. L. Coulon; Taylor A. McDaniels; Nichollas E. Scott

doi:10.3791/63242

Artykuł metodologiczny

Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

DOI:

10.3791/63242

⸱

2 listopada 2021

Jessica M. Lewis^*¹ , Pauline M. L. Coulon^*¹ , Taylor A. McDaniels^*¹ , Nichollas E. Scott¹

¹Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otwarte wyszukiwanie umożliwia identyfikację glikopeptydów ozdobionych nieznanymi wcześniej kompozycjami glikanów. W tym artykule przedstawiono uproszczone podejście do podejmowania otwartych poszukiwań i późniejszych poszukiwań glikopeptydów skoncentrowanych na glikanie dla próbek bakteryjnych na przykładzie Acinetobacter baumannii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikozylacja białek jest coraz częściej uznawana za powszechną modyfikację w organizmach bakteryjnych, przyczyniając się do fizjologii prokariotycznej i optymalnej zakaźności gatunków chorobotwórczych. Z tego powodu rośnie zainteresowanie charakteryzacją glikozylacji bakteryjnej i zapotrzebowanie na wysokoprzepustowe narzędzia analityczne do identyfikacji tych zdarzeń. Chociaż proteomika oddolna z łatwością umożliwia generowanie bogatych danych dotyczących glikopeptydów, zakres i różnorodność glikanów obserwowanych w gatunkach prokariotycznych sprawia, że identyfikacja zdarzeń glikozylacji bakteryjnej jest niezwykle trudna.

Tradycyjnie, ręczne określanie składu glikanów w zbiorach danych proteomicznych bakteryjnych sprawiało, że była to w dużej mierze analiza na zamówienie, ograniczona do ekspertów w danej dziedzinie. Ostatnio otwarte podejścia oparte na wyszukiwaniu pojawiły się jako potężna alternatywa dla identyfikacji nieznanych modyfikacji. Analizując częstotliwość unikalnych modyfikacji obserwowanych w sekwencjach peptydowych, otwarte techniki wyszukiwania pozwalają na identyfikację powszechnych glikanów przyłączonych do peptydów w złożonych próbkach. W artykule przedstawiono usprawniony proces interpretacji i analizy danych glikoproteomicznych, pokazując, w jaki sposób można wykorzystać techniki otwartego wyszukiwania do identyfikacji bakteryjnych glikopeptydów bez wcześniejszej wiedzy na temat składu glikanów.

Korzystając z tego podejścia, można szybko zidentyfikować glikopeptydy w próbkach, aby zrozumieć różnice w glikozylacji. Wykorzystując Acinetobacter baumannii jako model, podejścia te umożliwiają porównanie składu glikanów między szczepami i identyfikację nowych glikoprotein. Podsumowując, praca ta demonstruje wszechstronność technik przeszukiwania otwartych baz danych w celu identyfikacji glikozylacji bakteryjnej, dzięki czemu charakterystyka tych wysoce zróżnicowanych glikoproteomów jest łatwiejsza niż kiedykolwiek wcześniej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikozylacja białek, proces przyłączania węglowodanów do cząsteczek białka, jest jedną z najczęstszych modyfikacji potranslacyjnych (PTM) w przyrodzie¹^,². We wszystkich dziedzinach życia rozwinął się szereg złożonych mechanizmów dedykowanych generowaniu glikoprotein, które wpływają na niezliczone funkcje komórkowe¹^,³^,⁴^,⁵. Podczas gdy glikozylacja białek zachodzi na wielu aminokwasach⁶^,⁷, zdarzenia glikozylacji sprzężonej z

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przygotowanie i analizę próbek bakteryjnego glikopeptydu można podzielić na cztery sekcje (Rysunek 1). W tym badaniu oceniono glikozylację trzech sekwencjonowanych szczepów A. baumannii (Tabela 1). Bazy danych Proteome FASTA każdego z tych szczepów są dostępne za pośrednictwem Uniprot. Patrz Tabela 2 w celu zapoznania się ze składem stosowanych w niniejszym protokole.

1. Przygotowanie próbek białek do analizy proteomicznej

Izolacja próbek proteomu będących przedmiotem zainteresowania
1. W przypadku używania całych komórek nal....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować użyteczność otwartego poszukiwania analizy bakteryjnej glikopeptydu, oceniono różnorodność chemiczną glikanów związanych z O w trzech szczepach A. baumannii-AB307-0294, ACICU i D1279779-. Glikoproteomy sprzężone z O są bardzo zmienne między szczepami A. baumannii, ponieważ glikany używane do glikozylacji pochodzą z wysoce zmiennych loci⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶. Ta różnorodność chemiczna sprawi.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otwarte wyszukiwanie to skuteczna i systematyczna metoda identyfikacji nieznanych modyfikacji. Podczas gdy identyfikacja nieznanych glikanów w próbkach proteomu bakteryjnego była tradycyjnie czasochłonnym i technicznie wyspecjalizowanym przedsięwzięciem, ostatnie osiągnięcia narzędzi takich jak MSfragger^21,41 i Byonic^31,38 umożliwiają teraz szybką i skuteczną identyfikację mas delta w celu dalszej charakt.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N.E.S jest wspierany przez Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) oraz ARC Discovery Project Grant (DP210100362). Dziękujemy Zakładowi Spektrometrii Mas i Proteomiki w Melbourne Instytutu Nauk Molekularnych i Biotechnologii Bio21 za dostęp do oprzyrządowania do stwardnienia rozsianego.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
14 G Kel-F Hub Point Style 3	Hamilton company	hanc90514
2-Chloroacetamid	Sigma Aldrich Pty Ltd	C0267-100G
Acetonitryl	Sigma Aldrich Pty Ltd	34851-4L
Wodorotlenek amonu (28%)	Sigma Aldrich Pty Ltd	338818-100ML
Odczynnik do oznaczania białek BCA A	Pierce	23228
Odczynnik do oznaczania białek BCA	B Pierce	23224
C8 Empore SPE	Sigma Aldrich Pty Ltd	66882-U	Alternatywnym dostawcą materiału C8 jest Kwas powinowacy (https://www.affinisep.com/about-us/)
mrówkowy	Sigma Aldrich Pty Ltd	5.33002
Isopropanol	Sigma Aldrich Pty Ltd	650447-2.5L
Metanol	Fisher Chemical	M/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (sulfonian odwróconej fazy)	Sigma Aldrich Pty Ltd	66886-U	Alternatywnym dostawcą dla SDB-RPS jest Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium Deoxycholate	Sigma Aldrich Pty Ltd	D6750-100G
ThermoMixer C	Eppendorf	2232000083
kwas trifluorooctowy	Sigma Aldrich Pty Ltd	302031-10X1ML
Chlorowodorek 2-karboksyetylofosfiny Tris	Sigma Aldrich Pty Ltd	C4706-2G
Tris(hydroksymetylo)aminometan	Sigma Aldrich Pty Ltd	252859-500G
Mieszanina proteazy trypsyna/Lys-C	Promega	V5073
Koncentrator próżniowy	Labconco	7810040
materiał	ZIC-HILICŻywicę Merck	1504580001	do stosowania w jednorazowych kolumnach SPE można uzyskać poprzez opróżnienie większej kolumny formularzowej i użycie wolnej żywicy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
Schaffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Reviews. 41 (1), 49-91 (2017).
Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Open Searching Glycopeptide Identification Bacterial Glycosylation Acinetobacter Baumannii O Linked Glycopeptides ZIC HILIC Enrichment Bottom Up Proteomics Glycan Diversity LC MS Analysis Glycoproteomic Workflow

Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły