Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji Wnt in vitro

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63247

⸱

10 grudnia 2021

 ,  , 
1Department of Surgery, Keck School of Medicine of USC, 2Department of Pediatrics, Keck School of Medicine of USC, 3Heart Institute, Children’s Hospital Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie przedstawia wysoce powtarzalną i wykonalną metodę badania parakrynnych niekanonicznych zdarzeń sygnalizacyjnych Wnt in vitro. Protokół ten zastosowano do oceny wpływu parakrynnej sygnalizacji Wnt5a w mysich komórkach grzebienia nerwowego i mioblastach.

Streszczenie

Niekanoniczna sygnalizacja Wnt reguluje wewnątrzkomórkową organizację włókien aktynowych i spolaryzowaną migrację komórek progenitorowych podczas embriogenezy. Proces ten wymaga złożonych i skoordynowanych oddziaływań parakrynnych między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnały. Biorąc pod uwagę, że te interakcje mogą zachodzić między różnymi typami komórek z różnych linii, ocena in vivo defektów specyficznych dla komórek może być wyzwaniem. W niniejszym badaniu opisano wysoce powtarzalną metodę oceny parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji Wnt in vitro. Protokół ten został zaprojektowany z myślą o (1) przeprowadzaniu funkcjonalnych i molekularnych ocen niekanonicznej sygnalizacji Wnt między dowolnymi dwoma typami komórek będących przedmiotem zainteresowania; (2) przeanalizować rolę cząsteczek wysyłających i odbierających sygnał w niekanonicznym szlaku sygnałowym Wnt; oraz (3) przeprowadzać fenotypowe eksperymenty ratunkowe przy użyciu standardowych podejść molekularnych lub farmakologicznych.

Ten protokół został użyty do oceny niekanonicznej sygnalizacji Wnt w mioblastach, w której pośredniczy komórka grzebienia nerwowego (NCC). Obecność NCC wiąże się ze zwiększoną liczbą cytoplazmatycznych filopodiów i lamellipodiów z dodatnim wynikiem falloidyny w mioblastach oraz poprawą migracji mioblastów w teście gojenia się ran. Oś Wnt5a-ROR2 została zidentyfikowana jako kluczowy niekanoniczny szlak sygnałowy Wnt między NCC a progenitorami kardiomioblastów drugiego pola serca (SHF). Podsumowując, jest to wysoce wykonalny protokół do badania parakrynnych niekanonicznych mechanizmów sygnalizacji Wnt in vitro.

Wprowadzenie

Niekanoniczne sygnalizacja Wnt to ewolucyjnie zachowany szlak, który reguluje organizację włókien komórkowych i migrację kierunkową. Szlak ten jest zaangażowany w wiele procesów biologicznych, w tym w morfogenezę tkanek embrionalnych1,2,3, angiogeneza limfatyczna i naczyniowa4,5,6,7, oraz wzrost i przerzuty raka8,9,10. Na poziomie komórkowym niekanoniczna sygnalizacja Wnt odbywa się poprzez skoordynowane interakcje parakrynne między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnał. Interakcje te często zachodzą między komórkami o różnych liniach lub typach i obejmują zróżnicowaną sieć molekularną, która obejmuje do 19 ligandów i wiele receptorów, koreceptorów i efektorów transdukcji sygnału11. Dalsze komplikowanie tego procesu sygnalizacji przez wcześniejsze badania wykazały, że kombinacje ligand-receptor mogą się różnić w sposób zależny od kontekstu i tkanki12,13, i że te same ligandy źródłowe, które napędzają niekanoniczną sygnalizację Wnt w komórkach odbierających sygnał, mogą być wytwarzane przez wiele typów komórek wysyłających sygnały14,15. Biorąc pod uwagę złożoność komórkową i molekularną związaną z niekanoniczną sygnalizacją Wnt, możliwość badania indywidualnych i klinicznie istotnych mechanizmów in vivo była ograniczona.

Podjęto próby zbadania niekanonicznej sygnalizacji Wnt za pomocą technik hodowli komórkowych in vitro. Na przykład testy gojenia się ran przeprowadzone w monowarstwach komórkowych zostały wykorzystane do funkcjonalnej oceny kierunkowej migracji komórkowej4,16,17,18,19. Techniki barwienia immunologicznego zostały wykorzystane do przeprowadzenia analiz przestrzennych ekspresji białek powierzchniowych w celu oceny niekanonicznych zmian w morfologii komórek wywołanych przez Wnt7,10, architektura i polaryzacja asymetryczna18,19,20. Chociaż podejścia te dostarczyły ważnych narzędzi do charakteryzowania fenotypów związanych z Wnt w komórkach odbierających sygnał, brak komponentów wysyłających sygnał w tych protokołach ogranicza ich zdolność do dokładnego modelowania parakrynnych mechanizmów sygnalizacyjnych obserwowanych in vivo. W związku z tym nadal istnieje pilna potrzeba opracowania systemów in vitro, które umożliwią solidną i odtwarzalną ocenę parakrynnych interakcji sygnalizacyjnych między komórkami wysyłającymi i odbierającymi sygnały niekanonicznego szlaku Wnt, w szczególności komórkami o różnych typach komórek.

W tym celu, głównym celem tego badania było ustalenie protokołu do modelowania parakrynnych niekanonicznych interakcji sygnalizacyjnych Wnt in vitro. Opracowaliśmy bezkontaktowy system kokultury, który podsumowuje komponenty wysyłania i odbierania sygnałów tych interakcji i umożliwia zastosowanie standardowych podejść molekularnych, genetycznych lub farmakologicznych do niezależnego badania specyficznych mechanizmów ligand-receptor w niekanonicznym szlaku Wnt. Mechanizmy sygnalizacji Wnt za pośrednictwem NCC zbadano w mioblastach przy użyciu ustalonych linii komórek mysich. Jako dowód zasadności, model ten został wykorzystany do potwierdzenia wyników wcześniejszych badań in vivo na myszach, które implikują oś Wnt5a-ROR2 jako istotny niekanoniczny szlak sygnałowy Wnt między NCCs21 i przodkami kardiomioblastów SHF3,22,23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przedeksperymentalna ekspansja i pasaż komórek

  1. Hodowla komórkowa C2C12:
    1. Przygotować 500 ml pożywki hodowlanej C2C12, łącząc zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.
    2. Rozmrozić fiolkę z komórkami C2C12 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Podczas rozmrażania komórek C2C12 dodaj 5 ml pożywki C2C12 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Natychmiast przenieś rozmrożone komórki do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety P1000.
      UWAGA: Komórki C2C12 to mysie komórki mioblastów, które były wcześniej używane i walidowane jako pierwotna linia komórkowa do modelowania progenitorów kardiomioblastów.
    3. Delikatnie wymieszaj komórki C2C12 w stożkowej probówce za pomocą pipety serologicznej. Następnie dodać całą objętość rozmrożonych komórek w pożywce C2C12 (6 ml) do kolby o długości75 cm2.
    4. Dodać 6 ml świeżej pożywki C2C12 do kolby, aby uzyskać całkowitą objętość 12 ml. Delikatnie obrócić kolbę tak, aby roztwór kuwety i pożywki pokrył całe dno kolby. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ), aby umożliwić przyleganie komórek.
    5. Pozwól komórkom rozrosnąć się w inkubatorze, aż osiągną ~60% konfluencji.
      UWAGA: Można to ustalić, okresowo wyjmując komórki z inkubatora i szybko sprawdzając ich zbieganie się pod mikroskopem. Należy pamiętać o zminimalizowaniu czasu usuwania komórek z inkubatora.
  2. Pasażowanie komórek C2C12:
    1. Podgrzej pożywkę C2C12, 500 ml 1x PBS i 0,25% trypsyny-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po ogrzaniu odczynników przenieś wszystkie odczynniki do kaptura do hodowli komórkowych.
    2. Przenieść kolbę zawierającą komórki C2C12 do kaptura do hodowli komórkowych. Delikatnie przepłukać kolbę zawierającą komórki C2C12 ciepłym 1x PBS dwukrotnie.
      1. Przechylić kolbę pod kątem 45° i zassać pożywkę C2C12 za pomocą szklanej pipety podłączonej do odsysania próżniowego. Utrzymując kąt 45°, ostrożnie dodać 10 ml ciepłego 1x PBS do rogu kolby za pomocą pipety serologicznej. Połóż kolbę płasko na powierzchni i delikatnie przesuwaj kolbę okrężnymi ruchami, aby upewnić się, że 1x PBS przemywa całą monowarstwę komórek.
        UWAGA: Należy uważać, aby nie zakłócić monowarstwy C2C12 podczas zasysania podłoża.
    3. Usuń 1x PBS po drugim praniu. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA do kolby, delikatnie przesunąć kolbę zgodnie z powyższym opisem, aby umożliwić rozpórce trypsyny-EDTA rozprzestrzenienie się na jak największej powierzchni monowarstwy i umieścić kolbę w inkubatorze na 2 minuty.
    4. Po 2 minutach inkubacji wyjąć kolbę z inkubatora i delikatnie postukać w nią, aby odłączyć pozostałe komórki.
    5. Dodać 9 ml pożywki C2C12 do kolby za pomocą pipety serologicznej w celu zgaszenia trypsyny. Za pomocą pipety serologicznej delikatnie przepłukać komórki pożywką i zebrać 10 ml zawiesiny komórek trypsynizowanych. Dodać 10 ml zawiesiny komórkowej do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować w stężeniu 100 × g przez 5 minut.
    6. Umieścić stożkową probówkę z powrotem w okapie do hodowli komórkowych i usunąć supernatant za pomocą szklanej pipety podłączonej do odsysania próżniowego. Podczas zasysania supernatantu należy uważać, aby nie naruszyć osadu komórkowego znajdującego się na dnie stożkowej rurki. W tym celu należy pozostawić ~0,2 ml supernatantu w stożkowej probówce. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml świeżej pożywki C2C12.
    7. W celu dodatkowego pasażowania dodać 1 ml zawieszonych komórek do kolby o średnicy75 cm2. Dodać 11 ml pożywki C2C12 do kolby za pomocą pipety serologicznej i umieścić kolbę w inkubatorze.
  3. Hodowla komórkowa STO:
    1. Przygotuj pożywkę STO, robiąc 500 ml DMEM z 7% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 2 nM L-glutaminy.
    2. Przygotuj 0,1% żelatyny, dodając 0,5 g żelatyny w proszku do butelki zawierającej 500 ml wody tkankowej lub autoklawowanej. Dodać 7 ml 0,1% roztworu żelatyny do kolby o średnicy75 cm2. Obrócić kolbę w taki sposób, aby roztwór żelatyny pokrywał całe dno kolby. Pozostawić kolbę do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli komórkowych.
    3. Po 30 minutach inkubacji usunąć nadmiar żelatyny za pomocą pipety podłączonej do odsysania próżniowego. Pozostawić kolby w inkubatorze na kolejne 30 minut przed użyciem.
    4. Rozmrozić fiolkę z komórkami STO w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Za pomocą pipety P1000 natychmiast przenieś rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml świeżo przygotowanej pożywki hodowlanej STO.
      UWAGA: Komórki STO to mysie fibroblasty embrionalne rutynowo używane jako komórki żywicielskie w protokołach hodowli komórkowych.
    5. Delikatnie wymieszaj komórki w stożkowej probówce za pomocą pipety serologicznej. Dodać całą objętość (6 ml) komórek do pokrytej żelatyną kolby o długości 75cm2. Obrócić kolbę, aby upewnić się, że zawiesina komórek jest dobrze rozprowadzona wzdłuż dna kolby.
    6. Dodać 6 ml świeżej pożywki STO do kolby, aby uzyskać całkowitą objętość 12 ml. Obrócić kolbę w sposób opisany powyżej, aby upewnić się, że komórki i podłoże są dobrze rozmieszczone wzdłuż dna kolby. Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby umożliwić przyleganie komórek. Pozwól komórkom namnażać się w inkubatorze, aż osiągną ~60-70% konfluencji.
  4. Pasażowanie komórek STO:
    1. Ciepła pożywka komórkowa STO, 1xPBS i 0,25% trypsyna-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Delikatnie przepłukać kolbę zawierającą komórki STO ciepłym 1x PBS dwukrotnie, jak opisano w kroku 1.2.2.1.
    3. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA do kolby za pomocą pipety P1000. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut.
    4. Po 5 minutach inkubacji wyjąć kolbę z inkubatora. Delikatnie postukać w kolbę, aby odłączyć przylegające komórki.
    5. Dodać 9 ml pożywki STO do kolby w celu ugaszenia trypsyny i zebrać 10 ml zawiesiny komórek trypsynizowanych, jak opisano powyżej. Dodać 10 ml zawiesiny komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 100 × g przez 5 minut.
    6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki STO, jak opisano powyżej. W celu dodatkowego pasażowania dodać 1 ml zawieszonych komórek do kolby o średnicy75 cm2. Dodać 11 ml pożywki STO, obrócić kolbę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek i pożywki wzdłuż dna kolby, a następnie umieścić kolbę w inkubatorze.
  5. Nieaktywna hodowla komórek STO i preparat podłoża bazowego komórki O9-1:
    1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych O9-1, mieszając 500 ml DMEM z 15% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 2 nM L-glutaminy, minimum 0,1 mM aminokwasów endogennych, 1 nM pirogronianu sodu i 55 μM beta-merkaptoetanolu.
    2. Przygotować roztwór mitomycyny C w 1x PBS w stężeniu 0,5 mg/ml, dodając 4 ml 1x PBS bezpośrednio do fiolki z mitomycyną C. Kilkakrotnie odpipetować roztwór za pomocą pipety P1000. Aby dalej rozpuścić mitomycynę C w 1x PBS, umieść fiolkę na mieszaczu wirowym lub bujaku stołowym na 45 minut do 1 godziny.
    3. Inaktywuj komórki STO, traktując płytki STO końcowym stężeniem 0,01 mg / ml mitomycyny C dodanej do standardowej pożywki STO. Umieścić płytki STO w inkubatorze na 2 godziny, zwracając uwagę na ochronę kolby zawierającej mitomycynę C przed światłem poprzez zminimalizowanie czasu spędzonego na zewnątrz inkubatora. Po poddaniu działaniu mitomycyny przemyć komórki w 1x PBS dwukrotnie, jak opisano w kroku 1.2.2.1.
      UWAGA: Mitomicyna C hamuje proliferację komórek STO, dzięki czemu mogą one być wykorzystywane do generowania kondycjonowanej pożywki przez kilka dni bez nadmiernego zlewania się w kolbie.
    4. Po usunięciu 1x PBS dodać 12 ml podstawowej pożywki hodowlanej O9-1 do inaktywowanych kultur komórkowych STO i inkubować je przez 24 godziny. Zebrać kondycjonowaną, inaktywowaną pożywkę do hodowli podstawowej STO + O9-1 i umieścić ją w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml owiniętych folią, aby chronić ją przed światłem.
    5. Dodać 12 ml świeżej pożywki bazowej O9-1 do inaktywowanych kultur komórkowych STO, jak opisano powyżej. Powtórz ten krok, dodając świeżą podstawową pożywkę hodowlaną O9-1 do tych samych boków zawierających inaktywowane komórki STO co 24 godziny
      UWAGA: Po leczeniu mitomycyną C inaktywowane komórki STO nie mogą się namnażać; w związku z tym kolby zawierające inaktywowane komórki STO mogą być ponownie wykorzystane do wytworzenia kondycjonowanego podłoża.
    6. Owinięte folią stożkowe probówki o pojemności 50 ml zawierające kondycjonowane, inaktywowane podłoże podstawowe STO + O9-1 należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu zebrania łącznie 500 ml pożywki.
  6. Hodowla komórkowa O9-1:
    1. Przygotować pożywkę do hodowli komórek O9-1 przy użyciu 500 ml kondycjonowanej pożywki podstawowej STO + O9-1 i dodać 103 jednostki czynnika hamującego białaczkę (LIF) i 25 ng / ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (zasada-FGF).
    2. Przygotować 0,1% kolby pokryte żelatyną, jak opisano w krokach 1.3.2-1.3.3.
    3. Rozmrozić fiolkę z komórkami O9-1 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Natychmiast przenieś rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml świeżo przygotowanej pożywki wzrostowej O9-1.
      UWAGA: Linia komórkowa O9-1 jest jedyną stabilną, multipotencjalną linią komórkową grzebienia nerwowego, która została wygenerowana z myszy. Ta linia komórkowa jest powszechnie stosowana w eksperymentach in vitro z grzebieniem nerwowym.
    4. Delikatnie wymieszaj komórki za pomocą pipety serologicznej. Dodać całe 6 ml komórek do pokrytej żelatyną kolby o długości 75cm2.
    5. Dodać 6 ml pożywki wzrostowej O9-1 do kolby, aby uzyskać całkowitą objętość 12 ml. Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby umożliwić przyleganie komórek. Pozwól komórkom namnażać się w inkubatorze, aż osiągną ~60-70% konfluencji.
  7. Pasażowanie komórek O9-1:
    1. Ciepła pożywka wzrostowa O9-1, 1x PBS i 0,25% trypsyny-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Delikatnie przepłukać płytkę zawierającą komórki O9-1 ciepłym 1x PBS dwukrotnie, jak opisano w kroku 1.2.2.1.
    3. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA do kolby i umieścić ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut.
    4. Po 5 minutach inkubacji wyjąć kolbę z inkubatora i delikatnie postukać w kolbę, aby odłączyć przylegające komórki.
    5. Dodaj 9 ml pożywki wzrostowej O9-1 do kolby, aby ugasić trypsynę. Zebrać 10 ml zawiesiny komórek trypsynizowanych i dodać 10 ml tej zawiesiny komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o masie 100 × g przez 5 minut.
    6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki wzrostowej O9-1. W celu dodatkowego pasażowania dodać 1 ml zawieszonych komórek do kolby o średnicy75 cm2. Dodać 11 ml pożywki wzrostowej O9-1 i umieścić kolbę zawierającą komórki w 12 ml pożywki w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

2. Posiewanie komórek w systemie kokultury

  1. Poszycie komór komórkowych C2C12:
    1. Po trypsynizacji (zgodnie z opisem w kroku 1.2) ponownie zawieś osad komórek C2C12 w 10 ml pożywki C2C12. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:20 w pożywce C2C12, usuwając 0,5 ml zawieszonych komórek C2C12 i dodając je do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9,5 ml świeżej pożywki C2C12. Delikatnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety serologicznej.
    2. Dodać 1 ml komórek C2C12 rozcieńczonych w stosunku 1:20 do każdej studzienki nowego 4-komorowego dołka za pomocą pipety P1000 i umieścić 4-komorową studzienkę w inkubatorze.
  2. Poszycie wkładek ogniw O9-1:
    1. Po trypsynizacji ponownie zawieś osad komórek O9-1 w 10 ml pożywki wzrostowej O9-1. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:20 w pożywce wzrostowej O9-1, usuwając 0,5 ml zawieszonych komórek C2C12 i dodając je do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9,5 ml świeżej pożywki wzrostowej O9-1. Delikatnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety serologicznej.
    2. Umieść pojedynczą przepuszczalną wkładkę (patrz Tabela materiałów) w każdej studzience nowej 4-komorowej studzienki wypełnionej 1 ml pożywki wzrostowej O9-1.
      UWAGA: Ta 4-komorowa studzienka powinna różnić się od tej zawierającej komórki C2C12 z kroku 2.1.3.
    3. Dodać 300 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek O9-1 do każdej wkładki za pomocą pipety P1000. Upewnij się, że spód każdej wkładki jest zanurzony w studzience wypełnionej 1.3 ml pożywki wzrostowej O9-1. Umieścić studzienkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  3. (Opcjonalnie). Wykonaj knockdown siRNA w komórkach O9-1 lub komórkach C2C12.
    1. Wykonaj knockdown genu przez siRNA 18-24 h po posianiu wstawień komórek O9-1 lub studzienek komory komórkowej C2C12.
      1. Rozcieńczyć siRNA i odczynnik do transfekcji w pożywce o zredukowanej surowicy (patrz Tabela materiałów) zgodnie z zaleceniami producentów i pożądanymi stężeniami dla doświadczenia. Delikatnie wymieszać rozcieńczony siRNA i odczynnik do transfekcji (1:1) i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 7 min.
        UWAGA: W tym protokole zastosowano stężenia 50 nM, ponieważ to stężenie siRNA zostało określone tak, aby spowodować wystarczające obniżenie ekspresji docelowego genu.
      2. Dodaj kompleksy siRNA-lipid do wstawień komórek O9-1 lub studzienek komory komórkowej C2C12, jak określono w projekcie eksperymentalnym i inkubuj komórki z kompleksami siRNA-lipid przez ~ 36-48 godzin.

3. Przeprowadzanie testów ran i ilościowa ocena migracji mioblastów

  1. Oznaczanie rany:
    1. Pozwól, aby wkładki komórek O9-1 i studzienki komory komórkowej C2C12 przylegały i namnażały się w inkubatorze, aż obie komórki osiągną ~70-80% zbiegu przed przystąpieniem do tej części protokołu. Jeśli komórki rosną w >90% zlewają się, nie przystępuj do testu zarysowania, ponieważ komórki po prostu oderwą się od studni.
    2. Podgrzej 1x PBS i C2C12, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    3. Dobrze usunąć pożywkę sklarowaną nad osadem z komory C2C12 i przemyć komórki raz 1x PBS. Wyjmij 1x PBS i natychmiast zarysuj komórki sterylną końcówką pipety P10.
      1. Przesunąć sterylną końcówkę pipety P10 mocno w jednym kierunku, aby objąć całą długość lub szerokość monowarstwy ogniwa (np. od prawej do lewej, od góry do dołu). Pamiętaj, aby zadrapać każdą studzienkę zawierającą komórki tylko raz.
        UWAGA: Aby zoptymalizować wyniki zarysowywania, zdrapuj studzienki w różnych warunkach eksperymentalnych na podobnym poziomie konfluencji. Aby to zrobić, upewnij się, że każda studzienka 4-komorowa ma komórki dla każdego wymaganego warunku eksperymentalnego (np. studnia #1 kontrola ujemna, studnia #2 kontrola pozytywna). Ponadto do każdego zadrapania należy używać nowej sterylnej pipety P10 i za każdym razem przykładać do niej podobną siłę. Nie próbuj tworzyć więcej niż jednej rysy w każdym dołku.
      2. Po zdrapaniu szybko dodaj 1 ml 1x PBS z powrotem do studzienki za pomocą końcówki do pipety P1000. Powtórz ten proces dla każdej studzienki, która zostanie porysowana.
        UWAGA: Biorąc pod uwagę zmienność związaną z każdym zadrapaniem, zaleca się, aby do tworzenia ran w każdym warunku doświadczalnym używać wielu studzienek (n = 3). Pracuj szybko, ponieważ bardzo ważne jest, aby zminimalizować czas, przez jaki komórki są pozbawione 1x PBS podczas tych kroków. Po usunięciu 1x PBS z każdej studzienki, nie należy potrzebować więcej niż 5 sekund, aby wytworzyć ranę w każdym dołku.
    4. Po wygenerowaniu rany i dodaniu 1x PBS z powrotem do każdej studzienki, zobrazuj rysę za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola i użyj tego obrazu jako wyjściowego rozmiaru rany (czas 0). Aby zrobić zdjęcia, wykonaj następujące czynności:
      1. Włącz komputer i mikroskop (patrz Spis materiałów), naciskając przycisk zasilania. Umieść szkiełko komory na stoliku i obróć tarczę obiektywu do 5-krotnego powiększenia.
      2. Otwórz oprogramowanie do obrazowania (patrz Spis materiałów), klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania na pulpicie komputera. Kliknij kartę Kamera na ekranie głównym oprogramowania. Kliknij przycisk Na żywo, aby wyświetlić komórki na karcie AxioCam IC.
      3. Upewnij się, że filtr światła jest całkowicie wysunięty, aby światło mogło przechodzić do aparatu i ekranu komputera. Ręcznie przesuń i/lub obróć suwak komory, aby ustawić obszar rany w środku obrazu na żywo na karcie AxioCam IC.
      4. Aby zrobić zdjęcia, kliknij przycisk snap, aby otworzyć nową kartę obok karty AxioCam IC, która zawiera obraz.
      5. Aby zapisać ten nieruchomy obraz, kliknij plik w lewym górnym rogu strony głównej oprogramowania | Zapisz jako | Wprowadź nazwę pliku w polu Nazwa pliku. Zapisz rysunek w formacie obrazu Carl Zeiss (*.czi) (ustawienie domyślne) i wybierz pulpit na pasku po lewej stronie, aby zapisać plik na pulpicie jako plik .czi, który można otworzyć tylko w oprogramowaniu Zen lite 2012.
      6. Aby zapisać obraz jako .tiff, kliknij polecenie plik | zapisz jako | wprowadź nazwę pliku w polu nazwy pliku. Zapisz rysunek jako oznaczony plik obrazu (*.tiff), klikając przycisk Zapisz jako typ i wybierając *.tiff z menu rozwijanego.
        UWAGA: Format .tiff można otworzyć w dowolnym oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.
      7. Ręcznie zmień położenie szkiełka komory, aby wykonać 2-3 dodatkowe obrazy w innych punktach rany w tym samym dołku.
        UWAGA: W sumie spowoduje to powstanie 3-4 nienakładających się na siebie, powiększonych obrazów rany w każdym dołku.
    5. Wyjmij 1x PBS z każdej studzienki i dodaj 1 ml pożywki C2C12.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie pipetować zbyt agresywnie podczas wyjmowania lub dodawania roztworów do studzienki po powstaniu rany, ponieważ może to spowodować oderwanie się komórek od studzienki komory. Ponadto należy dobrze przechylić komorę, aby można było przeprowadzić aspirację i ponowne wprowadzenie roztworów w rogach każdej studzienki, aby zminimalizować rozerwanie monowarstwy komórek.
    6. Zmontuj system kokultury wkładów studzienkowych, ręcznie umieszczając wkładki zawierające komórki O9-1 w każdym dołku studzienki komory. Delikatnie wepchnij wkładki do studzienki tak, aby spód wkładki znajdował się tuż nad leżącymi poniżej komórkami C2C12. Umieść konstrukty wkładów studzienkowych z powrotem w inkubatorze.
      UWAGA: Nie pozwól, aby spód wkładki fizycznie dotykał i mechanicznie zakłócał leżące pod spodem ogniwa C2C12.
    7. Pozwól komórkom migrować przez łącznie 9-12 godzin. Aby określić optymalny czas migracji, należy sprawdzić komórki po 6 godzinach od powstania rany, a następnie co 2-3 godziny. Zakończ eksperyment, gdy komórki w warunkach kontroli lub kontroli pozytywnej zaczną całkowicie pokrywać ranę.
      UWAGA: Biorąc pod uwagę bezkontaktowy charakter konstrukcji, wkładka leżąca nad nią nie musi być usuwana ze studzienek podczas sprawdzania postępu migracji w odstępach czasu. Zmienność migracyjna będzie obserwowana w zależności od takich czynników, jak typy komórek użyte w tym teście, gęstość komórkowa w momencie powstawania rany, szerokość utworzonej rany oraz warunki eksperymentalne manipulowanych komórek (np. knockdown genu, addycja rekombinowanego białka). Stężenia tych odczynników należy określić doświadczalnie zgodnie z zaleceniami producenta.

4. Barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie migrujących mioblastów

  1. Zakończenie testu migracji i dekonstrukcja systemu wkładów studzienek:
    1. Usuń wstawki komórek O9-1 po 9-12 godzinnym okresie migracji (lub alternatywnym czasie wyznaczonym przez warunki eksperymentalne). Ostrożnie zassać pożywkę C2C12 za pomocą pipety P1000. Dodaj 0,5 ml 1x PBS do studzienek komory i wykonaj końcowe obrazy komórek po migracji.
    2. Ostrożnie odessać wszystkie 0,5 ml 1x PBS zmieszanego z pożywką i wyjąć plastikowe komory z dołków komory, korzystając z instrukcji zestawu, pozostawiając pod spodem szkiełko zawierające komórki C2C12.
      UWAGA: Uważaj, aby nie zakłócić przylegających do szkiełka komórek C2C12 podczas wyjmowania studzienek komory.
  2. Wykonywanie barwienia immunologicznego:
    1. Natychmiast umieścić szkiełko w uchwycie na szkiełko zawierające 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wylej 4% PFA i dodaj 0,1% Triton X-100 zawierający 1x PBS (1x PBST) do uchwytu szkiełka, aby myć szkiełko przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Wylej 1x PBST i dodaj 1x PBS do uchwytu szkiełka, aby myć szkiełko przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok jeszcze raz, aby uzyskać w sumie dwa prania 1x PBS.
    2. Wyjmij suwak z uchwytu suwaka. Obrysuj zewnętrzne krawędzie szkiełka za pomocą hydrofobowego pisaka, aby utworzyć hydrofobową granicę wokół szkiełka, aby zapobiec rozlewaniu się roztworów ze szkiełka. Uważaj, aby nie zakłócić przylegających komórek.
    3. Dodać 1% roztwór blokujący albuminę surowicy bydlęcej (BSA) (rozcieńczony w 1x PBS) do szkiełka (~0,5 ml na szkiełko). Upewnij się, że roztwór znajduje się w granicy hydrofobowej utworzonej w kroku 4.2.4. Inkubować szkiełko przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze szkiełkowej.
      UWAGA: Chociaż blokowanie BSA nie jest wymagane do barwienia immunologicznego falloidyny, ten krok w protokole pozwala na sprzężenie z barwieniem przeciwciałami fluorescencyjnymi.
    4. Po zablokowaniu przez 1 godzinę wylać roztwór blokujący ze szkiełka, dodać przeciwciało falloidyny (rozcieńczone w stosunku 1:200 w 1% roztworze blokującym BSA przez dodanie 5 μl przeciwciała do 995 μl roztworu BSA) do szkiełka i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Ponownie upewnij się, że roztwór znajduje się w granicy hydrofobowej utworzonej w kroku 4.2.4. Biorąc pod uwagę, że przeciwciało falloidyny jest sprzężone z barwnikiem Alexa Fluor-488, zminimalizuj ekspozycję na światło odczynnika przeciwciała przed i po dodaniu do szkiełka.
    5. Następnego dnia umieść szkiełko w uchwycie na szkiełka zabezpieczonym przed ekspozycją na światło (np. zawiń uchwyt szkiełka w folię lub użyj nieprzezroczystego uchwytu na szkiełko). Umyj komórki w uchwycie na szkiełka za pomocą 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz pranie, w sumie trzy 10-minutowe prania.
    6. Dodać podłoże mocujące zawierające 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) i zamontować szkiełka ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Wyobraź sobie komórki, które migrowały, za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wpływ NCC na zdolność migracyjną mioblastów mysich
Metodę tę zastosowano po raz pierwszy w celu oceny wpływu NCC na zdolność migracyjną mioblastów. Rysunek 1 przedstawia schematyczny model testu. Aby zbadać ten wpływ, przeprowadzono testy gojenia ran (scratch assays) z użyciem mioblastów hodowanych w izolacji (bez wstawek z NCC) w porównaniu do mioblastów hodowanych w obecności wstawek. Jako kontrolę pozytywną do dołków komory z wstawkami z NCC dodano 500 ng/mL rekombino...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niekanoniczny szlak sygnałowy Wnt / płaskiej polaryzacji komórek (PCP) jest krytycznie ważnym szlakiem sygnalizacji komórkowej, który jest zaangażowany w wiele procesów rozwojowych24,25 i chorobowych24,26. Podczas rozwoju embrionalnego niekanoniczna sygnalizacja Wnt obejmuje ekspansywną sieć sygnałów molekularnych z komórek wysyłających sygnały, które ostatecznie indukują zmiany w morfologii, asy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez nagrody NIH F30HL154324 dla O.T. i K08HL121191 oraz R03HL154301 dla S.R.K. Autorzy pragną potwierdzić, że schemat na rysunku 1 w tym manuskrypcie został stworzony przy użyciu biorender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolSigma AldrichM-7522
Medium montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPIVector LaboratoriesH-1200-10Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Albumina surowicy bydlęcejSanta Cruz Biotechnologysc-2323Przechowywana w temperaturze 4 stopni; C
C2C12 mysia linia komórkowa mioblastówATCCCRL-1772
Kolby do hodowli komórkowych, 75 cm2ThermoFisher Scientific156499
Chamber Slide System, 4-dołkowyThermoFisher Scientific154526
Dulbecco" s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozy (4,5 g/L), L-glutamina (2 mM)Corning10-017-CVPrzechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon, 15 mlFisher Scientific14-959-53A Przepuszczalne
podłoże Falcon do płytki 24-dołkowej z 0,4 i mikro; Przezroczysta membrana PET MCorning353095
Płodowa surowica bydlęcaFisher ScientificW3381EPrzechowywana w 50 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 & deg; C
Roztwór żelatyny, 0,1%ATCCPCS-999-027Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Miarowe i sterylne końcówki do pipet, 10 i mikro; LUSA Scientific1111-3810
Czynnik hamujący białaczkę (LIF), 106 jednostek/mlMillipore SigmaESG1106
L-glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-081
Lipofectamina RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
MEM aminokwasy endogenne (MEM NEAA) 100xGibco11140-050
Minimalna niezbędna pożywka (MEM)Corning10-022-CV
Mitomycyna CRoche10107409001
Nieprzywierające szkiełka nakrywkowe z automatycznym szkłem, 24 x 55 mmgrzebienia nerwowego Springside Scientific
O9-1Millipore SigmaSCC049
Opti-MEM I, 1xGibco31985-070
Paraformaldehyd roztwór w PBS, 4%Santa Cruz Biotechnologysc-281692Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Penicylina-streptomycyna (10 000 j./ml penicyliny i 10 000 μ; g/ml streptomycyny)Fisher ScientificW3470HPrzechowywany w 10 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 ° C
Phalloidin-iFluor 488Abcamab176753Przechowywany w temperaturze -20 &; C, Przechowywać z dala od światła
Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS), 1x, bez wapnia i magnezu, pH 7,4Corning21-040-CVPrzechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu fibroblastów-zasadowy (rhFGF-zasadowy)R& D Systems233-FB-025
Rekombinowane białko ludzkie / mysie Wnt5aR& D Systems645-WN-010
Pirogronian sodu, 100 mMGibco11360-070
Kwadratowa szalka Petriego z siatkąThomas Scientific1219C98
STO mysie komórki zasilające fibroblastyATCCCRL-1503
Triton X-100 roztwórSigma AldrichX100-100ML
Trypsin-EDTA, 0,25%Fisher ScientificW3513CPrzechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Mikroskop fluorescencyjny Zeiss Apotome.2 Mikroskop fluorescencyjnyCarl Zeiss AG
Odwrócony mikroskop świetlny Zeiss Axio Vert.A1Carl Zeiss AG
Zen lite 2012Oprogramowanie do obrazowaniaCarl Zeiss AG
Linia komórkowa HRTCG2455 Oprogramowanie mikroskopowe

Bibliografia

  1. Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
  2. Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093(2019).
  3. Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719(2019).
  4. Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).
  5. Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).
  6. Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
  7. Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
  8. Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
  9. Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
  10. Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
  11. Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
  12. Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
  13. Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).
  14. Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
  15. Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305(2016).
  16. Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
  17. Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456(2010).
  18. Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
  19. Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).
  20. Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
  21. Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).
  22. Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
  23. Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
  24. Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
  25. Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).
  26. Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
  27. Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
  28. Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).
  29. Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
  30. Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
  31. Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).
  32. Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).
  33. Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sygnalizacja parakrynnaoś Wnt5a-ROR2komórki grzebienia neuronalnegomigracja mioblastówtest gojenia ransystem kokulturywyciszanie siRNAcytoszkielet aktynowymikroskopia fluorescencyjna
Modelowanie parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji Wnt in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.