Method Article

Zoptymalizowane protokoły pobierania próbek kości w celu odzyskania starożytnego DNA ze szczątków archeologicznych

DOI:

10.3791/63250

⸱

November 30th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Archaeogenetics, Max Planck Institute for the Science of Human History, 2School of Human Evolution and Social Change, Arizona State University, 3Department of Archaeogenetics, Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół przedstawia serię najlepszych praktyk w zakresie pobierania proszku kostnego z ośmiu zalecanych miejsc pobierania próbek anatomicznych (konkretne miejsca na danym elemencie szkieletu) na pięciu różnych elementach szkieletu od średniowiecznych osobników (radiowęgiel datowany na okres ok. 1040-1400 CE, kalibrowany zakres 2-sigma).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj metody mają na celu maksymalizację szans na odzyskanie ludzkiego DNA ze starożytnych pozostałości archeologicznych, przy jednoczesnym ograniczeniu materiału wejściowego próbki. Dokonano tego poprzez skupienie się na miejscach pobierania próbek anatomicznych, które wcześniej uznano za dostarczające największych ilości starożytnego DNA (aDNA) w analizie porównawczej odzyskiwania DNA w całym szkielecie. Wcześniejsze badania sugerowały, że protokoły te maksymalizują szanse na pomyślne odzyskanie starożytnego DNA człowieka i patogenów ze szczątków archeologicznych. Wydajność DNA została wcześniej oceniona przez Parkera i in. 2020 w szerokim badaniu zachowania aDNA w wielu elementach szkieletowych od 11 osób odzyskanych ze średniowiecznego (radiowęglowo datowanego na okres około (ok.) 1040-1400 n.e., kalibrowany zakres 2-sigma) cmentarzyska w Krakauer Berg, opuszczonej średniowiecznej osadzie w pobliżu Peißen w Niemczech. Te osiem miejsc pobierania próbek, które obejmują pięć elementów szkieletu (pars petrosa, stałe zęby trzonowe, kręg piersiowy, dystalny paliczek i kość skokowa) z powodzeniem dostarczyły wysokiej jakości starożytnego ludzkiego DNA, w którym wydajność była znacznie wyższa niż ogólna średnia dla wszystkich elementów i osobników. Plony były odpowiednie do wykorzystania w najczęstszych analizach genetycznych populacji niższego szczebla. Nasze wyniki przemawiają za preferencyjnym wykorzystaniem tych anatomicznych miejsc pobierania próbek w większości badań obejmujących analizy starożytnego ludzkiego DNA ze szczątków archeologicznych. Wdrożenie tych metod przyczyni się do zminimalizowania niszczenia cennych okazów archeologicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pobieranie próbek starożytnych szczątków ludzkich w celu odzyskania i analizy DNA jest z natury destrukcyjne1,2,3,4. Próbki same w sobie są cennymi okazami i w miarę możliwości należy zachować ich zachowanie morfologiczne. W związku z tym konieczne jest, aby praktyki pobierania próbek były zoptymalizowane, aby zarówno uniknąć niepotrzebnego niszczenia niezastąpionego materiału, jak i zmaksymalizować prawdopodobieństwo sukcesu. Obecne techniki najlepszych praktyk opierają się na niewielkiej kohorcie badań ograniczonych do badań kryminalistycznych5,6, badań starożytnych okazów, w których opracowanie optymalnego pobierania próbek nie jest bezpośrednim celem badania7, lub dedykowanych badań wykorzystujących szczątki inne niż ludzkie8 lub celując w bardzo mały wybór miejsc pobierania próbek anatomicznych (używanych tutaj do oznaczenia określonego obszaru elementu szkieletowego, z którego został wygenerowany proszek kostny, do wykorzystania w dalszych analizach DNA)9,10. Przedstawione tutaj protokoły pobierania próbek zostały zoptymalizowane w pierwszym systematycznym badaniu na dużą skalę dotyczącym zachowania DNA w wielu elementach szkieletu od wielu osób11. Wszystkie próbki pochodziły z elementów szkieletowych odzyskanych od 11 osób wykopanych z cmentarza kościelnego opuszczonej średniowiecznej osady Krakauer Berg w pobliżu Peißen, Saksonia-Anhalt, Niemcy (patrz Tabela 1 w celu uzyskania szczegółowych danych demograficznych próby) i jako takie mogą wymagać modyfikacji w celu wykorzystania próbek spoza tego zakresu geograficznego/czasowego.

powiedział: Rozdział powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: Rozdział powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: Rozdział
osobnikpłećSzacowany wiek w chwili śmierciDaty 14C (CE, Cal 2-sigma)
KRA001mężczyzna25-35Lata 1058-1219
KRA002kobieta20-22Lata 1227-1283
KRA003mężczyzna251059-1223
KRA004mężczyzna15Lata 1284-1392
KRA005mężczyzna10-12Lata 1170-1258
KRA006kobieta30-40Lata 1218-1266
KRA007kobieta25-30Rozdział 1167-1251
KRA008mężczyzna20Lata 1301-1402
KRA009mężczyznanieznanyLata 1158-1254
KRA010mężczyzna25Lata 1276-1383
KRA011kobieta30-451040-1159

Tabela 1: Genetycznie określona płeć, archeologicznie określony szacowany wiek w chwili śmierci i datowanie radiowęglowe (14C Cal 2-sigma) dla wszystkich 11 osób pobranych od próbek. Ta tabela została zaadaptowana z Parker, C. et al. 202011.

Te protokoły pozwalają na stosunkowo proste i efektywne generowanie proszku kostnego z ośmiu anatomicznych miejsc pobierania próbek z pięciu elementów szkieletu (w tym pars petrosa) z ograniczonym laboratoryjnym zanieczyszczeniem DNA. Spośród tych pięciu elementów szkieletu, siedem anatomicznych miejsc pobierania próbek znalezionych na czterech elementach szkieletu zostało określonych jako realna alternatywa dla destrukcyjnego pobierania próbek z piramidy skalistej11,12. Należą do nich cement, zębina i komora miazgi stałych zębów trzonowych; kość korowa pobrana z wcięcia górnego kręgu, a także z trzonu kręgów piersiowych; kość korowa wywodząca się z dolnej powierzchni kępki wierzchołkowej i trzonu paliczków dystalnych; i gęsta kość korowa wzdłuż zewnętrznej części tali. Chociaż istnieje kilka powszechnie stosowanych metod pobierania próbek pars petrosa4,12,13,14, zębina i komora miazgi zębowej1,2,15, opublikował metody opisujące udane wytwarzanie proszku kostnego z cementu16, trzon kręgu, dolne wcięcie kręgu i kość skokowa mogą być trudne do uzyskania. W związku z tym w tym miejscu demonstrujemy zoptymalizowane protokoły pobierania próbek dla piramidy skalistej (krok 3.1); cement (etap 3.2.1), zębina (etap 3.2.2) i miazga zębowa (etap 3.2.3) zębów trzonowych dorosłych; kość korowa trzonu kręgu (etap 3.3.1) i łuk kręgowy górny (etap 3.3.2); paliczek dystalny (krok 3.4); oraz kości skokowej (krok 3.5) w celu szerszego udostępnienia efektywnego wykorzystania tych elementów szkieletowych zarówno w badaniach aDNA, jak i w badaniach kryminalistycznych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania przedstawione tutaj zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytutu Nauki o Historii Człowieka im. Maxa Plancka, Jena, Niemcy do pracy ze starożytnymi szczątkami ludzkimi. Przed wykonaniem jakichkolwiek kroków tego protokołu upewnij się, że przestrzegasz wszystkich lokalnych/stanowych/federalnych wymogów etycznych dotyczących zarówno uzyskania pozwolenia na badania naukowe, jak i wykorzystania szczątków ludzkich do destrukcyjnego pobierania próbek w Twojej okolicy. Wszystkie procedury/przechowywanie chemikaliów powinny być wykonywane zgodnie z indywidualnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa w instytucji.

1. Uwagi przed przetworzeniem próbki

  1. Z próbkami należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ starożytne szczątki są niepowtarzalnym i ograniczonym zasobem (np. pobieranie próbek powinno odbywać się w jak najmniejszym stopniu, a wszystkie szczątki powinny być zwracane odpowiednim i legalnym dostawcom, jeśli to możliwe).
  2. Wykonaj wszystkie kroki w środowisku pomieszczenia czystego, najlepiej w dedykowanym starożytnym obiekcie DNA17,18,19. Stosować środki ochrony osobistej (PPE) składające się ze sterylnych mikroporowatych kombinezonów z kapturem, sterylnych rękawic (dwie pary), maski chirurgicznej, okularów ochronnych oraz sterylnych butów lub butów antypoślizgowych ze sterylnymi osłonami (patrz tabela materiałów). Często zmieniaj rękawice, zwłaszcza między próbkami.
  3. Jeśli to możliwe, dokładnie wyczyść i zdezynfekuj cały sprzęt i powierzchnie wybielaczem/roztworem do odkażania DNA/etanolem i promieniowaniem UV (długość fali: 254 nm) (np. wiertła, wiertła, imadła/zaciski itp.). Wreszcie, zdecydowanie zaleca się robienie regularnych przerw ergonomicznych (co 2-3 godziny, jeśli to możliwe), aby uniknąć nadmiernego wyczerpania spowodowanego środowiskiem w pomieszczeniu czystym.
    UWAGA: Wszystkie szczątki szkieletowe powinny być odpowiednio udokumentowane (np. sfotografowane, zważone i, jeśli to możliwe, przeskanowane mikrotomografią komputerową, zobrazowane w 3D itp.) przed pobraniem próbek (protokoły odpowiedniej dokumentacji nie są zawarte w tym manuskrypcie). Wszystkie protokoły pobierania próbek mogą być wstrzymane między iteracjami pobierania próbek, a próbki mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w suchym, sterylnym środowisku o kontrolowanej temperaturze (25 °C).

2. Obróbka wstępna

  1. Odkaż wszystkie miejsca pobierania próbek anatomicznych przed wytworzeniem proszku kostnego, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia18.
    UWAGA: Skuteczność wybielacza i/lub usuwania powierzchni (patrz UWAGA w kroku 3.3.2, aby zapoznać się z etapami usuwania powierzchni) w przypadku dekontaminacji próbki jest nadal przedmiotem dyskusji wśród badaczy aDNA8,19,20,21,22,23,24,25 ponieważ oba mogą wpływać na ogólną wydajność DNA, szczególnie w próbkach o wysokiej degradacji. W związku z tym poniższe kroki są uważane za opcjonalne i są tutaj uwzględnione, ponieważ zostały użyte we wszystkich próbkach w celu wygenerowania reprezentatywnych wyników przedstawionych w tym artykule. Zaleca się, aby stosowanie tych protokołów wstępnego traktowania było ustalane indywidualnie dla każdego przypadku w oparciu o zastosowanie molekularne, wiek, rzadkość występowania i poziom degradacji morfologicznej każdego zestawu próbek.
    1. Wszystkie próbki należy pobrać w dedykowanym pomieszczeniu czystym pod kapturem wyposażonym w światło UV lub szafą bezpieczeństwa biologicznego z wyłączonym przepływem powietrza. Rozłóż sterylną folię aluminiową na blacie, aby wyłapać wszelkie zabłąkane proszek/fragmenty kości.
    2. Upewnij się, że wszystkie fragmenty kości zostały odzyskane (w celu repatriacji) przed wyrzuceniem folii. Zmieniaj folię między obróbką każdego elementu szkieletu. Zużytą folię należy wyrzucić do autoklawowalnej torby/pojemnika na zagrożenia biologiczne.
    3. Usuń jak najwięcej luźnego brudu/detrytusu z anatomicznych miejsc pobierania próbek, delikatnie przecierając obszar niestrzępiącą się, suchą, sterylną chusteczką (patrz Tabela materiałów). Chusteczki należy wyrzucić do autoklawowalnych worków lub pojemników na zagrożenia biologiczne.
    4. Odkazić oczyszczoną powierzchnię, przecierając sterylną chusteczką zwilżoną rozcieńczonym dostępnym w handlu wybielaczem (~0,01% v/v, rozcieńczony ultraczystą wodą wolną od DNazy/RNaz) i pozostawić do inkubacji na 5 minut. Chusteczki należy wyrzucić do autoklawowalnych worków lub pojemników na zagrożenia biologiczne.
      UWAGA: Wybielacz jest wysoce i reaktywną substancją chemiczną; W związku z tym przed jego użyciem należy zastosować odpowiednie środki ostrożności.
    5. Usuń jak najwięcej pozostałości wybielacza z anatomicznego miejsca pobierania próbek za pomocą sterylnej chusteczki zwilżonej ultraczystą wodą wolną od DNaz/RNaz. Chusteczki należy wyrzucić do autoklawowalnych worków lub pojemników na zagrożenia biologiczne.
    6. Wystawić wszystkie oczyszczone miejsca pobierania próbek anatomicznych na działanie promieniowania UV przez 30 minut (długość fali: 254 nm), a następnie pozostawić do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że anatomiczne miejsca pobierania próbek są całkowicie suche przed przystąpieniem do pobierania próbek lub powrotem do przechowywania, aby nie tylko ułatwić wytwarzanie proszku kostnego, ale także zapobiec dalszej degradacji próbki (np. pleśni).
      UWAGA: Narażenie na promieniowanie UV może być szkodliwe dla oczu.
    7. Natychmiast należy przystąpić do pobierania próbek lub przechowywać elementy szkieletowe w suchym, sterylnym środowisku o kontrolowanej temperaturze (25 °C).

3. Wytwarzanie proszku kostnego

UWAGA: Następujące protokoły są przeznaczone do stosowania w ekstrakcji DNA zgodnie z protokołem Dabney et al. 201926.

  1. Pobieranie próbek pars petrosa
    UWAGA: Ten protokół został zaadaptowany z procedur opisanych w Pinhasi et al. 20194 i jest przedstawiony tutaj dla ułatwienia użytkowania. Protokół ten nie stanowi obecnej, najmniej destrukcyjnej metody pobierania próbek pars petrosa. W związku z tym zaleca się stosowanie protokołu opisanego przez Sirak et al. 201713 lub Orfanou et al. 202014 dla próbek, w których zachowanie morfologiczne ma największe znaczenie.
    1. Wszystkie próbki należy pobrać w przeznaczonym do tego celu pomieszczeniu czystym pod okapem PCR wyposażonym w światło UV lub szafką bezpieczeństwa biologicznego (długość fali: 254 nm) z wyłączonym przepływem powietrza. Rozłóż sterylną folię aluminiową na blacie, aby wychwycić wszelkie zabłąkane proszek/fragmenty kości.
    2. Upewnij się, że wszystkie fragmenty kości i jak najwięcej proszku zostało odzyskane (w celu repatriacji) przed wyrzuceniem folii. Wymieniać folię między kolejnymi próbkami. Wyrzuć zużytą folię do autoklawowalnej torby/pojemnika na zagrożenie biologiczne.
    3. Zabezpiecz suchy, odkażony element za pomocą wysterylizowanego zacisku lub imadła.
    4. Przeciąć pars petrosa na pół wzdłuż górnej bruzdy petrosus (patrz Rysunek 1) za pomocą standardowej piły jubilerskiej wyposażonej w ostrze 0,6 mm (patrz Tabela Materiałów) ze średnią prędkością, aby uniknąć przegrzania (patrz UWAGA poniżej kroku 3.1.6).
      UWAGA: Pars petrosa jest bardzo gęsta i jako taka może być trudna do cięcia. Uważaj, aby element był bezpiecznie zaciśnięty, aby uniknąć obrażeń. Wyrzuć wszelkie złamane brzeszczoty do odpowiedniego pojemnika na ostre przedmioty.
    5. Usuń części petrous z zacisku. Odzyskaj i zachowaj wszelkie luźne/nadmiarowe materiały.
    6. Umieść papier wagowy w sterylnej łódce wagowej
    7. Przytrzymaj porcję petrous nad papierem wagowym, przeciętą stroną przechyloną w kierunku tacki wagowej. Wwiercić się w gęstą kość korową między kanałem twarzowym a antrum wyrostka sutkowatego (wydaje się bardziej błyszczący niż otaczający materiał, patrz Rysunek 1) za pomocą wiertła dentystycznego wyposażonego w wiertło o małym przekroju (patrz Tabela materiałów) i ustawionego na średnią prędkość, średni moment obrotowy, aby wytworzyć proszek kostny.
      UWAGA: Wiercenie/cięcie powinno być wykonywane w krótkich seriach z niskimi lub średnimi prędkościami, aby uniknąć przegrzania kości i potencjalnego zniszczenia/uszkodzenia DNA. Anegdotycznie, gdy gęsta część petrous zaczyna się przegrzewać, można zaobserwować zapach opisany jako gotowanie boczku. Natychmiast przerwij wiercenie/piłowanie i pozwól kości odpocząć, aż wystarczająco ostygnie przed wznowieniem.
    8. Powtarzaj wiercenie, aż około 50-100 mg proszku zostanie zebrane na biżulecie wagowym, mierzonym za pomocą dołączonej wagi o dokładności co najmniej 0,01 mg (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Tam, gdzie to możliwe, sugeruje się zebranie 100 mg proszku kostnego, aby umożliwić dwukrotną ekstrahowaną ekstrakcję DNA po 50 mg każda. Jednak nie zawsze jest to możliwe ze względu na ograniczenie samych anatomicznych miejsc pobierania próbek (np. paliczek dystalny, komora miazgi zębowej) lub potrzebę zachowania morfologicznego. W przypadku innych lokalizacji, takich jak cement, może być dostępnych znacznie mniej niż 50 mg materiału. Wykazano jednak, że cement, komora miazgi zębowej i dystalny paliczek dają znaczące endogenne DNA11,27,28, pomimo niższego początkowego wkładu proszku kostnego z procesu ekstrakcji.
    9. Przenieś proszek z papieru wagowego do oznaczonej 2 ml probówki z bezpiecznym wiązaniem o pojemności 2 ml w celu ekstrakcji lub przechowywania. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C, przez czas nieokreślony.
    10. Pozostałe kości/nadmiar proszku należy przechowywać w suchym, sterylnym środowisku o kontrolowanej temperaturze (25 °C) do czasu zakończenia powrotu/repatriacji.
    11. Wyrzuć wszystkie odpady do autoklawowalnych worków lub pojemników na zagrożenia biologiczne. Wysterylizować/odkazić cały sprzęt wielokrotnego użytku (np. zaciski, wiertła, wiertarki, piły itp.) za pomocą wybielacza/roztworu do odkażania DNA/etanolu i ekspozycji na promieniowanie UV (długość fali: 254 nm), w zależności od przypadku, między każdym pobraniem próbki.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Kość skroniowa, w tym pars petrosa. (A) Wstępne cięcie próbki pokazujące położenie piramidy skalistej i bruzdy petrosa. (B) Fragment Petrousa po cięciu z podkreśleniem gęstych obszarów do wiercenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Pobieranie próbek zębów trzonowych stałych
    UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, do pobierania próbek stałych zębów trzonowych należy wstępnie wybrać zęby trzonowe in situ ze zrośniętymi korzeniami i najlepiej pozbawione próchnicy, pęknięć szkliwa lub nadmiernego zużycia. Usunąć wszelkie próbki kamienia nazębnego i przechowywać w temperaturze -20 °C do ewentualnych przyszłych analiz mikrobiomu jamy ustnej (procedura nie została opisana tutaj).
    1. Pobieranie próbek cementu
      1. Wszystkie próbki należy pobrać w przeznaczonym do tego celu pomieszczeniu czystym pod okapem PCR wyposażonym w światło UV lub szafką bezpieczeństwa biologicznego (długość fali: 254 nm) z wyłączonym przepływem powietrza. Rozłóż sterylną folię aluminiową na blacie, aby wychwycić wszelkie zabłąkane proszek/fragmenty kości.
      2. Upewnij się, że wszystkie fragmenty kości i jak najwięcej proszku zostało odzyskane (w celu repatriacji) przed wyrzuceniem folii. Wymieniać folię między kolejnymi próbkami. Zużytą folię należy wyrzucić do autoklawowalnej torby/pojemnika na zagrożenia biologiczne.
      3. Umieść arkusz papieru wagowego na sterylnej tacy wagowej.
      4. Przytrzymaj/zabezpiecz odkażony ząb trzonowy za szkliwo, korzenie w dół, nad tacą wagową za pomocą ręcznego zacisku, takiego jak klucz nastawny (patrz Tabela materiałów).
      5. Wyposaż wiertło dentystyczne w okrągłą tarczę tnącą z diamentowymi krawędziami. Gdy wiertło jest ustawione na średnią prędkość/moment obrotowy, delikatnie przyłóż krawędź wiertła do korzenia pod kątem około -20°.
      6. Zeskrob w dół do tacy, aby usunąć/zebrać żółty, najbardziej zewnętrzny materiał z korzenia (cementu). Zatrzymaj zbieranie, gdy jaśniejszy (biały) materiał zębiny stanie się widoczny.
        UWAGA: Ważne jest, aby dopasować kierunek obrotu wiertła tnącego w stosunku do tacki zbierającej, aby uniknąć rozpylenia proszku i potencjalnego marnowania próbki przez całkowite pominięcie tacki. Cementum jest szczególnie bogate w DNA; Jednak typowa wydajność materiału jest znacznie mniejsza niż w innych miejscach pobierania próbek anatomicznych (~7-20 mg)11,27,28.
      7. Zapisać masę proszku zebranego na bibułce do ważenia za pomocą dołączonej wagi o dokładności co najmniej 0,01 mg (patrz tabela materiałów).
      8. Przenieść proszek z papieru do ważenia do bezpiecznej probówki z zamkiem o pojemności 2 ml w celu ekstrakcji. Przechowywać w temperaturze -20 °C, przez czas nieokreślony.
    2. Pobieranie próbek z komory pulpy
      1. Po zebraniu cementu (jeśli jest to pożądane), przeciąć ząb trzonowy wzdłuż połączenia cementowo-szkliwowego za pomocą piły jubilerskiej, aby usunąć koronę (patrz Rysunek 2).
      2. Umieść nowy arkusz papieru do ważenia w nowej tacy wagowej.
      3. Zamocuj sekcję korony w ręcznym zacisku lub imadle nad tacą wagową. Przytrzymaj stronę cięcia pochyloną w dół i wywierć/zeskrobać materiał jako pierwsze przejście wiertłem dentystycznym wyposażonym w wiertło o małym rozmiarze (patrz Tabela materiałów) wzdłuż krawędzi komory miazgi w części korony (patrz Rysunek 2).
        UWAGA: Tylko pierwsze przejście wnętrza komory miazgi należy pobrać i oznaczyć jako materiał miazgi (typowa wydajność 5-15 mg), wszystko, co znajduje się głębiej w zębie, jest uważane za zębinę.
      4. Obróć ząb dolną częścią skierowaną w dół, postukaj w zacisk młotkiem i zbierz uwolniony proszek na papier wagowy.
      5. Zapisać masę proszku zebranego na bibułce wagowej za pomocą dołączonej wagi o dokładności co najmniej 0,01 mg (patrz tabela materiałów).
      6. Przenieść proszek z bibułki do probówki o pojemności 2 ml z bezpiecznym wiązaniem i bezpiecznym zamknięciem o pojemności 2 ml w celu ekstrakcji. Przechowywać w temperaturze -20 °C, przez czas nieokreślony.
    3. Pobieranie próbek zębiny
      1. Umieść nowy arkusz papieru do ważenia w nowej tacy wagowej.
      2. Przytrzymaj sekcję korony nad tacą wagową (jak w kroku 3.2.2.3), wywierć i zbierz dalsze 50-100 mg zębiny, mierzonej za pomocą dołączonej wagi, o dokładności 0,01 mg (patrz Tabela Materiałów) z wnętrza komory miazgi w taki sam sposób do dalszego pobierania próbek zębiny (patrz Rysunek 2).
      3. Przenieś proszek kostny z bibułki do probówki o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamknięciem o niskim wiązaniu w celu ekstrakcji. Przechowywać w temperaturze -20 °C, przez czas nieokreślony.
      4. Pozostałe kawałki zębów/nadmiar proszku należy przechowywać w suchym, sterylnym środowisku o kontrolowanej temperaturze (25 °C) do czasu zakończenia powrotu/repatriacji.
      5. Wyrzuć wszystkie odpady do autoklawowalnych worków lub pojemników na zagrożenia biologiczne. Wysterylizować/odkazić cały sprzęt wielokrotnego użytku (np. zaciski, wiertła, wiertarki, piły itp.) za pomocą wybielacza/roztworu do odkażania DNA/etanolu i ekspozycji na promieniowanie UV (długość fali: 254 nm), w zależności od przypadku, między każdym pobraniem próbki.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Stałe wstępne pobieranie próbek zębów trzonowych. (A) Wstępnie obrobione zęby trzonowe przed pobraniem próbki, pokazujące koronę, cement (żółtawa warstwa korzenia) i miejsce cięcia na styku cemento-szkliwa. (B) Ten sam zbiór trzonowców po cemencie, pokazujący miejsce nacięcia na styku cementowo-szkliwym. (C) Pobranie zębów trzonowych po cięciu i pobranie próbek, ze wskazaniem anatomicznych miejsc pobierania próbek z komory miazgi zębowej i zębiny w koronie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Pobieranie próbek z kręgów piersiowych
    1. Pobieranie próbek z trzonu kręgu
      1. Wszystkie próbki należy pobrać w przeznaczonym do tego celu pomieszczeniu czystym pod okapem PCR wyposażonym w światło UV lub szafką bezpieczeństwa biologicznego (długość fali: 254 nm) z wyłączonym przepływem powietrza. Rozłóż sterylną folię aluminiową na blacie, aby wychwycić wszelkie zabłąkane proszek/fragmenty kości.
      2. Upewnij się, że wszystkie fragmenty kości i jak najwięcej proszku zostało odzyskane (w celu repatriacji) przed wyrzuceniem folii. Wymieniać folię między kolejnymi próbkami. Zużytą folię należy wyrzucić do autoklawowalnej torby/pojemnika na zagrożenia biologiczne.
      3. Umieść mały arkusz papieru do ważenia w standardowej tacy do ważenia.
      4. Zabezpiecz kręgi za pomocą zacisku lub imadła ręcznego, trzonem kręgu na zewnątrz.
      5. Trzymaj kręgi nad tacą wagową z trzonem kręgu pochylonym w dół. Używając wiertła dentystycznego wyposażonego w wiertło o małym przekroju (patrz Tabela materiałów) ustawione na niską prędkość i wysoki moment obrotowy, wywierć wzdłuż najbardziej zewnętrznej krawędzi (dolnej i górnej) kości korowej otaczającej gąbczastą tkankę wewnętrzną trzonu kręgu (patrz Rysunek 3).
      6. Zeskrob wiertło o warstwę korową na standardowej tacce ważącej, aż do zebrania 50-100 mg materiału, mierzonego za pomocą dołączonej wagi o dokładności 0,01 mg (patrz Tabela materiałów).
      7. Przenieś proszek kostny z bibułki do bezpiecznej probówki o pojemności 2 ml w celu ekstrakcji. Przechowywać w temperaturze -20 °C, przez czas nieokreślony.
    2. Pobieranie próbek z łuku kręgowego górnego
      UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Usuń i wyrzuć najbardziej zewnętrzną warstwę kości korowej górnego łuku kręgowego za pomocą wiertarki dentystycznej wyposażonej w wiertło o małej średnicy (patrz Tabela materiałów), skrobając ją po powierzchni19. Nie jest to zalecane w przypadku pobierania próbek z trzonu kręgu, ponieważ warstwa kości korowej jest na ogół bardzo cienka i prawdopodobnie zostanie całkowicie zubożona w wyniku tego procesu (patrz UWAGA w punkcie 2).
      1. Umieść mały arkusz papieru do ważenia w standardowej tacy do ważenia.
      2. Zabezpiecz kręgi w zacisku ręcznym/imadle tak, aby wyrostek kręgowy był skierowany na zewnątrz, górnym aspektem w dół.
      3. Trzymając kręgi, górną stroną w dół, nad tacą wagową, wywierć w górę do środka wcięcia w kształcie litery V powstałego w wyniku połączenia wyrostka kolczystego z blaszkami (patrz Rysunek 3) za pomocą wiertła dentystycznego z małym wiertłem (patrz Tabela materiałów) ustawionym na niską prędkość i wysoki moment obrotowy.
      4. Przerwij wiercenie, gdy zauważalny będzie spadek oporu. Zmień nieznacznie pozycję wiercenia i powtarzaj, aż zbierze się 50-100 mg proszku kostnego, mierzonego za pomocą dołączonej wagi o dokładności 0,01 mg (patrz Tabela materiałów).
      5. Przenieś proszek kostny z bibułki do probówki o niskim wiązaniu o pojemności 2 ml w celu ekstrakcji. Przechowywać w temperaturze -20 °C, przez czas nieokreślony.
      6. Pozostałe kości/nadmiar proszku należy przechowywać w suchym, sterylnym środowisku o kontrolowanej temperaturze (25 °C) do czasu powrotu/repatriacji.
      7. Wyrzuć wszystkie odpady do autoklawowalnych worków lub pojemników na zagrożenia biologiczne. Wysterylizować/odkazić wszystkie urządzenia wielokrotnego użytku (np. zaciski, wiertła, wiertarki, piły itp.) za pomocą wybielacza/roztworu do odkażania DNA/etanolu i ekspozycji na promieniowanie UV (długość fali: 254 nm), w zależności od przypadku, między każdym pobraniem próbki.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Anatomiczne pobieranie próbek kręgosłupa kręgowego kręgu piersiowego przez trzon kręgu kręgowego i górny łuk kręgu korowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Pobieranie próbek z paliczka dystalnego
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Usuń i wyrzuć najbardziej zewnętrzną warstwę kości korowej trzonu i/lub kępki wierzchołkowej za pomocą wiertła dentystycznego wyposażonego w wiertło o małym rozmiarze, skrobając je po powierzchni19. Może to nie być możliwe w przypadku próbek z nadmiernie cienką kością korową lub szczątkami młodocianych (patrz UWAGA w punkcie 2).
    1. Wszystkie próbki należy pobrać w przeznaczonym do tego pomieszczeniu czystym, pod osłoną PCR wyposażoną w światło UV lub szafką bezpieczeństwa biologicznego (długość fali UV: 254 nm) z wyłączonym przepływem powietrza. Rozłóż sterylną folię aluminiową na blacie, aby wychwycić wszelkie zabłąkane proszek/fragmenty kości.
    2. Upewnij się, że wszystkie fragmenty kości i jak najwięcej proszku zostało odzyskane (w celu repatriacji) przed wyrzuceniem folii. Wymieniać folię między kolejnymi próbkami. Zużytą folię należy wyrzucić do autoklawowalnej torby/pojemnika na zagrożenia biologiczne.
    3. Umieść mały arkusz papieru do ważenia w standardowej tacy do ważenia.
    4. Zabezpiecz próbkę w ręcznym zacisku/imadle, górną stroną do góry.
    5. Przytrzymaj próbkę nad tacą wagową, zbierz proszek kostny z kości korowej z dolnej strony kępki wierzchołkowej i trzonu, wiercąc przez najbardziej zewnętrzne gęste warstwy (patrz Rysunek 4) za pomocą wiertła dentystycznego wyposażonego w wiertło o małej średnicy (patrz Tabela materiałów).
    6. Przerwij wiercenie, gdy nastąpi wyraźny spadek oporu, ponieważ oznacza to lżejszy, gąbczasty materiał. Powtórz ten proces, promieniując na zewnątrz od początkowego wiercenia, aż do zebrania co najmniej 50-100 mg proszku kostnego, mierzonego za pomocą dołączonej wagi o dokładności 0,01 mg (patrz Tabela Materiałów).
    7. Przenieś proszek kostny z bibułki do probówki o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamknięciem o niskim wiązaniu w celu ekstrakcji. Przechowywać w temperaturze -20 °C, przez czas nieokreślony.
    8. Pozostałą kość/nadmiar proszku należy przechowywać w suchym, sterylnym środowisku o kontrolowanej temperaturze (25 °C) do czasu powrotu/repatriacji.
    9. Wyrzuć wszystkie odpady do autoklawowalnych worków lub pojemników na zagrożenia biologiczne. Wysterylizuj/odkaż cały sprzęt wielokrotnego użytku (np. zaciski, wiertła, wiertarki, piły itp.) za pomocą wybielacza/roztworu do odkażania DNA/etanolu i ekspozycji na promieniowanie UV, w zależności od przypadku, między każdym pobraniem próbki.
      UWAGA: W przypadku mniejszych próbek (np. próbek młodocianych) może być znacznie mniej niż sugerowane 50-100 mg kości korowej dostępnej do pobrania. Jednak nawet w przypadku niewielkich ilości wykazano, że to anatomiczne miejsce pobierania próbek jest szczególnie bogate w DNA11.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Dystalny paliczek pokazujący położenie gęstej kości korowej wzdłuż trzonu i dolnej strony kępki wierzchołkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Pobieranie próbek kości skokowej
    1. Wszystkie próbki należy pobrać w przeznaczonym do tego celu pomieszczeniu czystym pod okapem PCR wyposażonym w światło UV lub szafką bezpieczeństwa biologicznego (długość fali: 254 nm) z wyłączonym przepływem powietrza. Rozłóż sterylną folię aluminiową na blacie, aby wychwycić wszelkie zabłąkane proszek/fragmenty kości.
    2. Upewnij się, że wszystkie fragmenty kości i jak najwięcej proszku zostało odzyskane (w celu repatriacji) przed wyrzuceniem folii. Wymieniać folię między kolejnymi próbkami. Zużytą folię należy wyrzucić do autoklawowalnej torby/pojemnika na zagrożenia biologiczne.
    3. Umieść mały arkusz papieru do ważenia w standardowej tacy do ważenia.
    4. Zabezpiecz próbkę w ręcznym zacisku/imadle, kopułą do góry.
    5. Trzymaj kość skokową, kopułę skierowaną do góry, a powierzchnię przyśrodkową w kierunku kolektora, nad tacą wagową. Zeskrob kość korową z szyjki kości skokowej na głębokość ~1 mm (patrz Rysunek 5) za pomocą wiertła dentystycznego z wiertłem o małej średnicy (patrz Tabela materiałów) ustawionym na niską prędkość i wysoki moment obrotowy.
    6. Zmień nieznacznie pozycję wiercenia i powtarzaj, aż zbierze się około 50-100 mg proszku kostnego, mierzonego za pomocą dołączonej wagi o dokładności 0,01 mg (patrz Tabela materiałów).
    7. Przenieś proszek kostny z bibułki do probówki o niskim wiązaniu o pojemności 2 ml w celu ekstrakcji. Przechowywać w temperaturze -20 °C, przez czas nieokreślony.
    8. Pozostałą kość/nadmiar proszku należy przechowywać w suchym, sterylnym środowisku o kontrolowanej temperaturze (25 °C) do czasu zakończenia powrotu/repatriacji.
    9. Wyrzuć wszystkie odpady do autoklawowalnych worków lub pojemników na zagrożenia biologiczne. Wysterylizować/odkazić cały sprzęt wielokrotnego użytku (np. zaciski, wiertła, wiertarki, piły itp.) za pomocą wybielacza/roztworu do odkażania DNA/etanolu i ekspozycji na promieniowanie UV (długość fali: 254 nm), w zależności od przypadku, między każdym pobraniem próbki.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Obszar pobierania próbek kości skokowej w celu regeneracji kości korowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Kość skokowa ma bardzo mało kości korowej (cienka warstwa zewnętrzna). Materiał powinien być pobierany nie tylko z powierzchni, ale także z leżącej pod nią gęstej warstwy kości gąbczastej.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W osobnym badaniu11, DNA zostało wyekstrahowane z proszku kostnego wygenerowanego z każdego miejsca pobierania próbek anatomicznych u 11 osób, przy użyciu standardowego protokołu ekstrakcji DNA zoptymalizowanego pod kątem krótkich fragmentów ze zwapniałej tkanki2. Następnie wyprodukowano biblioteki jednoniciowe28 i zsekwencjonowano na HiSeq 4000 (75 bp paired-end) do głębokości ~20 000 000 odczytów na próbkę. Uzyskane dane sekwencyjne zostały następnie ocenione pod kątem zawartości endogennego ludzkiego DNA przy użyciu EAGER pipeline29 (ustawienia BWA: długość ziarna 32, kara za niedopasowanie 0,1, filtr jakości mapowania 37). Wszystkie reprezentatywne wyniki są raportowane przy użyciu tych samych wskaźników, co Parker i in. 202011 w celu zapewnienia spójności. Biblioteki ze sproszkowanych części pars petrosa dostarczyły średnio wyższego endogennego DNA niż którekolwiek z pozostałych 23 badanych miejsc pobierania próbek anatomicznych (Ryc. 6A-B). Siedem dodatkowych anatomicznych miejsc pobierania próbek przedstawionych w tym protokole (cement, pierwsze przejście komory miazgi zębowej i zębina stałych zębów trzonowych; kość korowa z trzonu kręgu i górny łuk kręgowy kręgu piersiowego; kość korowa z kępki wierzchołkowej paliczka dystalnego oraz kość korowa z szyjki kości skokowej) dało kolejne najwyższe plony (bez istotności statystycznej między tymi anatomicznymi lokalizacjami pobierania próbek; Rysunek 6A-B; Plik uzupełniający 1: EndogenousDNAPreCap). Wszystkie te alternatywne lokalizacje konsekwentnie dawały plony DNA odpowiednie dla standardowych analiz genetyki populacyjnej, takich jak analizy mitochondrialne i analizy polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP). Wskaźniki duplikacji w bibliotekach pochodzących ze wszystkich lokalizacji próbkowania anatomicznego były niskie (współczynniki klastrów < średnio 1,2, obliczone jako stosunek wszystkich odczytów mapowania do unikalnych odczytów mapowania, tabela 2; Supplemental File 1: ClusterFactor), co wskazuje, że wszystkie przebadane biblioteki miały bardzo wysoki stopień skomplikowania. Podobnie, średnie szacunki egzogennego zanieczyszczenia ludzkiego DNA były niskie, średnio < 2% (zanieczyszczenie chromosomem X u mężczyzn, n = 7, zgodnie z raportem ANGSD30 pipeline) we wszystkich anatomicznych miejscach pobierania próbek, z wyjątkiem górnego łuku kręgowego (średnie szacowane zanieczyszczenie: 2,11%, z jedną próbką usuniętą jako wartość odstającą; KRA005: 19,52%, zob. tabela 2; Plik uzupełniający 1: Xcontamination). Średnia długość fragmentu (po przefiltrowaniu w celu usunięcia wszystkich odczytów < 30 pz) była najniższa w materiale pobranym z komory miazgi zębowej i zębiny, bez istotnych różnic wśród innych anatomicznych miejsc pobierania próbek (odpowiednio 55,14 pz i 60,22 pz w porównaniu ze średnią medianą 62,87, wartości p parami < 0,019, tab. 2; Plik uzupełniający 1: AvgFragLength). Dodatkowo, zęby i kręgi piersiowe zawierają wiele anatomicznych miejsc pobierania próbek, w których zaobserwowano wysoki poziom endogennego odzyskiwania DNA, co czyni je szczególnie odpowiednimi jako alternatywa dla pars petrosa.

figure-results-1
Rysunek 6: Zawartość ludzkiego DNA we wszystkich próbkach przesiewowych. Czarne linie reprezentują ogólną średnią, podczas gdy czerwone linie reprezentują medianę (solidna: proporcja ludzkiego DNA, przerywana: zmapowane odczyty ludzkie na milion wygenerowanych odczytów). Poszczególne miejsca pobierania próbek anatomicznych, w których średni udział ludzkiego DNA jest wyższy niż średnia ogólna (8,16%) są kolorowane we wszystkich analizach. (A) Proporcja odczytów odwzorowanych na genomie referencyjnym hg19. Niebieska linia przerywana reprezentuje teoretyczne maksimum biorąc pod uwagę parametry mapowania rurociągu (wygenerowane przy użyciu Gargammel31 w celu symulacji losowego rozkładu 5 000 000 odczytów z genomu referencyjnego hg19 z symulowanym uszkodzeniem). Indywidualne średnie (X) i mediany (czerwone kółko) są podawane dla tych próbek, w których średni udział ludzkiego DNA jest wyższy niż średnia ogółem. Przedziały ufności wskazują górną i dolną granicę z wyłączeniem statystycznych wartości odstających. (B) Liczba unikalnych odczytów odwzorowujących genom referencyjny hg19 na milion odczytów wysiłku sekwencjonowania (75 pz sparowanego końca). Przedziały ufności wskazują górną i dolną granicę z wyłączeniem statystycznych wartości odstających. Ten rysunek został zaadaptowany z Parker, C. et al. 202011. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 2: Średnie poziomy duplikacji (odczyty mapowania/unikalne odczyty), średnia i mediana długości fragmentów oraz szacunki zanieczyszczenia chromosomu X dla wszystkich miejsc pobierania próbek anatomicznych. Błąd zgłaszany jako błąd standardowy średniej. Ta tabela została zaadaptowana z Parker, C. et al. 202011.

Miejsce pobierania próbekŚredni współczynnik duplikacji (# zmapowane odczyty / # unikatowe zmapowane odczyty)Średnia długość fragmentu w bpŚredni szacowany odsetek zanieczyszczenia chromosomem X
Piramida Petrousa1,188 ± 0,00665,40 ± 1,360,000 ± 0,003
Cement1,197 ± 0,02867,28 ± 1,760,011 ± 0,003
zębina1,188 ± 0,06160,22 ± 2,370,002 ± 0,007
miąższ1,179 ± 0,02455,14 ± 2,900,013 ± 0,006
Paliczek dystalny1,191 ± 0,04965,95 ± 1,080,013 ± 0,005
Trzon kręgu1,194 ± 0,03766,14 ± 1,030,008 ± 0,003
Łuk kręgowy górny1,19 ± 0,01763,02 ± 1,230,021 ± 0,009*
usypisko1,198 ± 0,01068,20 ± 1,240,011 ± 0,003
*Próbka KRA005 usunięta jako wartość odstająca przy 0,1952

Dostępność kodu
Wszystkie programy analityczne i moduły R wykorzystane w analizach tego manuskryptu są swobodnie dostępne u ich autorów. Wszystkie niestandardowe kody języka R są dostępne na żądanie.

Dostępność danych
Wszystkie surowe dane użyte do obliczenia reprezentatywnych wyników są swobodnie dostępne w repozytorium danych ENA Europejskiego Archiwum Nukleotydów (numer dostępu PRJ-EB36983) lub w materiałach uzupełniających Parker, C. et al.11.

Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecna praktyka w genetyce populacji starożytnej człowieka polega na preferencyjnym pobieraniu próbek z pars petrosa (krok 2.1), gdy tylko jest to możliwe. Jednak pars petrosa może być próbą trudną do uzyskania, ponieważ jest wysoko ceniona w niezliczonych ocenach szkieletu (np. historia populacji32, oszacowanie wieku płodu w chwili śmierci33 i determinacja płci34), a historycznie rzecz biorąc, pobieranie próbek pars petrosa do analizy DNA może być wysoce destrukcyjne 3,4 (w tym protokół przedstawiony tutaj, Chociaż nowe, minimalnie inwazyjne protokoły13,14 zostały obecnie powszechnie przyjęte w celu złagodzenia tego problemu). Sytuację pogarsza fakt, że do niedawnanie podjęto próby przeprowadzenia na dużą skalę, systematycznego badania nad odzyskiwaniem ludzkiego DNA w szkielecie11, co sprawia, że znalezienie odpowiedniej strategii pobierania próbek, gdy piramida skalista jest niedostępna, jest trudne.

Przedstawione tutaj protokoły pomagają złagodzić to wyzwanie, zapewniając zestaw zoptymalizowanych procedur pobierania próbek DNA ze szczątków szkieletowych archeologicznych/sądowych, w tym pars petrosa, a także siedem alternatywnych lokalizacji pobierania próbek anatomicznych z czterech dodatkowych elementów szkieletu. Wszystkie zawarte w nim krytyczne kroki mają na celu zminimalizowanie możliwości utraty/uszkodzenia DNA z powodu nieefektywnego pobierania próbek (kroki 2.1.6 i 3.2.1.3) lub przegrzania próbek podczas wiercenia/cięcia (krok 3.1.6). Ponadto w całym protokole zauważono, że może być konieczna modyfikacja/pominięcie etapów obróbki wstępnej w celu zapewnienia najlepszej wydajności w próbkach o wysokiej degradacji. Należy również zauważyć, że nawet wśród wybranych elementów przedstawionych tutaj pozostaje kilka możliwych alternatywnych technik pobierania próbek (szczególnie w przypadku pars petrosa13,14), a także duże pole do dalszej optymalizacji przedstawionych tu niedostatecznie wykorzystanych anatomicznych miejsc pobierania próbek (tj. kości skokowej: krok 2.5 i kręgów: krok 2.3).

Należy również pamiętać, że protokoły te zostały zaprojektowane i przetestowane przy użyciu starożytnych szczątków młodocianych i dorosłych o wysokiej jakości (dobre zachowanie morfologiczne) do celów analiz endogennego DNA człowieka. Przedstawione wyniki mogą nie obejmować bardziej zdegradowanych materiałów, innych kontekstów konserwacji, szczątków niemowląt, szczątków innych niż ludzkie lub badań patogenów lub mikrobiomu, ponieważ nadal potrzebne jest dokładniejsze badanie wykorzystania tych protokołów w dodatkowych kontekstach. Ponadto przedstawione tutaj alternatywne elementy szkieletu (zęby, kręgi, dystalny paliczek i tali) mogą być trudne do przypisania do jednego osobnika wśród zmieszanych szczątków, co wymaga pobierania próbek z wielu elementów, aby zapewnić jedno pochodzenie. Pomimo tych ograniczeń, szerokie udostępnienie tych protokołów może pomóc złagodzić pewną niejednorodność związaną z wyborem i przetwarzaniem próbek, zapewniając uogólnione i ilościowo zoptymalizowane ramy do wykorzystania w szerokim zakresie przyszłych badań aDNA/kryminalistycznych na szczątkach ludzkich.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zgłaszania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować personelowi laboratorium Instytutu Nauki o Historii Człowieka im. Maxa Plancka za pomoc w opracowaniu i wdrożeniu tych protokołów. Ta praca nie byłaby możliwa bez wkładu i ciężkiej pracy dr Guido Brandta, dr Elizabeth Nelson, Antje Wissegot i Franziski Aron. Badanie zostało sfinansowane przez Towarzystwo Maxa Plancka, Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 na podstawie umów o grant nr 771234 - PALEoRIDER (WH, ABR) oraz Starting Grant nr 805268 CoDisEASe (do KIB).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#16 Wiertło dentystyczneNTIH1-016-HPprzykład wiertło
0,6 mm brzeszczot do przewijaniaFisher Scientific50-949-097ostrze do jubilerów Piła
diamentowa 22 mmKahlaSKU 806 104 358 514 220Nasadka do cięcia Dremel
Komercyjny wybielaczFisher ScientificNC1818018
Control Company Ultra-Clean Folia aluminiowa SupremeFisher Scientific15-078-29X
Probówki DNA LoBind (2 ml)Eppendorf22431048
Dremel 225-01 Nasadka z elastycznym wałkiemDremel225-01Przedłużka elastyczna Dremel
4300 Narzędzie obrotoweDremel4300Przykładowe wiertło
Zestaw tulei zaciskowych i nakrętek DremelDremel4485Adaptery do różnych Nasadki/bity do narzędzi Dremel
Eagle 33 galony czerwony worek na odpady BiohazardFisher Scientific17-988-501
Probówka do mikrowirówek Eppendorf DNA LoBind 2 mlFisher Scientific13-698-792
Etanol (klasa biologii molekularnej)Millipore Sigma1.08543
Zatwierdzona przez FDA maska chirurgiczna poziomu 2Fisher Scientific50-206-0397PPE
Rękawice nitrylowe Fisherbrand ComfortFisher Scientific19-041-171XPPE
Okulary ochronne FisherbrandFisher Scientific19-130-208XPPE
Imadło stacjonarne Granger Imadło stołoweFisher ScientificNC1336173
Invitrogen UltraPure Woda destylowana bez DNaz/RnazFisher Scientific10-977-023
Jubilerzy PiłaFisher Scientific50-949-231
KimwipesSigma-AldritchZ188956
Labconco Purifier Logic Szafka bezpieczeństwa biologicznegoFisher Scientific30-368-1101
LookOut DNA EraseMillipore SigmaL9042-1L
Łódź o średniej wadzeHeathrow ScientificHS120223
MSC 10-częściowy zestaw szczypiec/zaciskówFisher Scientific50-129-5352Różne  uchwyty zacisków/imadła do bezpiecznego trzymania próbek podczas wiercenia/cięcia
Sartorius Quintix Semi-Micro BalanceFisher Scientific14-560-019waga zamknięta
Kombinezon Tyvek z kapturemFisher Scientific01-361-7X
PPE Ważenie papieruHeathrow ScientificHS120116

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones. Journal of Archaeological Science. 38 (5), 956-964 (2011).">Adler, C. J., Haak, W., Donlon, D., Cooper, A. Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones. Journal of Archaeological Science. 38 (5), 956-964 (2011).
  2. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Ancient DNA: Methods and Protocols. , 25-29 (2019).">Dabney, J., Meyer, M. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Ancient DNA: Methods and Protocols. , 25-29 (2019).
  3. Not a limitless resource: ethics and guidelines for destructive sampling of archaeofaunal remains. Royal Society Open Science. 6 (10), 191059(2019).">Palsdottir, A. H., Bläuer, A., Rannamäe, E., Boessenkool, S., Hallsson, J. Not a limitless resource: ethics and guidelines for destructive sampling of archaeofaunal remains. Royal Society Open Science. 6 (10), 191059(2019).
  4. Isolating the human cochlea to generate bone powder for ancient DNA analysis. Nature Protocols. 14 (4), 1194-1205 (2019).">Pinhasi, R., Fernandes, D. M., Sirak, K., Cheronet, O. Isolating the human cochlea to generate bone powder for ancient DNA analysis. Nature Protocols. 14 (4), 1194-1205 (2019).
  5. DNA recovery and analysis from skeletal material in modern forensic contexts. Forensic Sciences Research. 4 (1), 51-59 (2019).">Latham, K. E., Miller, J. J. DNA recovery and analysis from skeletal material in modern forensic contexts. Forensic Sciences Research. 4 (1), 51-59 (2019).
  6. DNA preservation in skeletal elements from the World Trade Center disaster: Recommendations for mass fatality management. Journal of Forensic Sciences. 54 (4), 739-745 (2009).">Mundorff, A. Z., Bartelink, E. J., Mar-Cash, E. DNA preservation in skeletal elements from the World Trade Center disaster: Recommendations for mass fatality management. Journal of Forensic Sciences. 54 (4), 739-745 (2009).
  7. Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).">Gamba, C., et al. Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
  8. Optimized DNA sampling of ancient bones using Computed Tomography scans. Molecular Ecology Resources. 18 (6), 1196-1208 (2018).">Alberti, F., et al. Optimized DNA sampling of ancient bones using Computed Tomography scans. Molecular Ecology Resources. 18 (6), 1196-1208 (2018).
  9. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).">Hansen, H. B., et al. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).
  10. Human auditory ossicles as an alternative optimal source of ancient DNA. Genome Research. 30 (3), 427-436 (2020).">Sirak, K., et al. Human auditory ossicles as an alternative optimal source of ancient DNA. Genome Research. 30 (3), 427-436 (2020).
  11. A systematic investigation of human DNA preservation in medieval skeletons. Scientific Reports. 10 (1), 18225(2020).">Parker, C., et al. A systematic investigation of human DNA preservation in medieval skeletons. Scientific Reports. 10 (1), 18225(2020).
  12. Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone. PLoS ONE. 10 (6), 0129102(2015).">Pinhasi, R., et al. Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone. PLoS ONE. 10 (6), 0129102(2015).
  13. A minimally-invasive method for sampling human petrous bones from the cranial base for ancient DNA analysis. BioTechniques. 62 (6), 283-289 (2017).">Sirak, K. A., et al. A minimally-invasive method for sampling human petrous bones from the cranial base for ancient DNA analysis. BioTechniques. 62 (6), 283-289 (2017).
  14. https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w (2020).">Orfanou, E., Himmel, M., Aron, F., Haak, W. Minimally-invasive sampling of pars petrosa (os temporale) for ancient DNA extraction. protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w (2020).
  15. Improving access to endogenous DNA in ancient bones and teeth. Scientific Reports. 5 (1), 1-12 (2015).">Damgaard, P. B., et al. Improving access to endogenous DNA in ancient bones and teeth. Scientific Reports. 5 (1), 1-12 (2015).
  16. A minimally destructive protocol for DNA extraction from ancient teeth. Genome Research. 31 (3), 472-483 (2021).">Harney, É, et al. A minimally destructive protocol for DNA extraction from ancient teeth. Genome Research. 31 (3), 472-483 (2021).
  17. Ancient DNA: Do it right or not at all. Science. 289 (5482), 1139(2000).">Cooper, A., Poinar, H. N. Ancient DNA: Do it right or not at all. Science. 289 (5482), 1139(2000).
  18. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).">Llamas, B., et al. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).
  19. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).">Llamas, B., et al. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).
  20. Combining bleach and mild predigestion improves ancient DNA recovery from bones. Molecular Ecology Resources. 17 (4), 742-751 (2017).">Boessenkool, S., et al. Combining bleach and mild predigestion improves ancient DNA recovery from bones. Molecular Ecology Resources. 17 (4), 742-751 (2017).
  21. Fragmentation of contaminant and endogenous DNA in ancient samples determined by shotgun sequencing; Prospects for human palaeogenomics. PLoS ONE. 6 (8), 24161(2011).">García-Garcerà, M., et al. Fragmentation of contaminant and endogenous DNA in ancient samples determined by shotgun sequencing; Prospects for human palaeogenomics. PLoS ONE. 6 (8), 24161(2011).
  22. More on contamination: The use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA. Molecular Biology and Evolution. 24 (4), 998-1004 (2007).">Malmström, H., et al. More on contamination: The use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA. Molecular Biology and Evolution. 24 (4), 998-1004 (2007).
  23. Reduction of the contaminant fraction of DNA obtained from an ancient giant panda bone. BMC Research Notes. 10, 754(2017).">Basler, N., et al. Reduction of the contaminant fraction of DNA obtained from an ancient giant panda bone. BMC Research Notes. 10, 754(2017).
  24. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth. Forensic Science International. 154 (1), 53-61 (2005).">Kemp, B. M., Smith, D. G. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth. Forensic Science International. 154 (1), 53-61 (2005).
  25. Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth. BioTechniques. 59 (2), 87-93 (2015).">Korlević, P., et al. Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth. BioTechniques. 59 (2), 87-93 (2015).
  26. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Methods in Molecular Biology. 1963, 25-29 (2019).">Dabney, J., Meyer, M. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Methods in Molecular Biology. 1963, 25-29 (2019).
  27. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).">Hansen, H. B., et al. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).
  28. Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase. Nucleic Acids Research. 45 (10), 79(2017).">Gansauge, M. -T., et al. Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase. Nucleic Acids Research. 45 (10), 79(2017).
  29. EAGER: efficient ancient genome reconstruction. Genome Biology. 17 (1), 60(2016).">Peltzer, A., et al. EAGER: efficient ancient genome reconstruction. Genome Biology. 17 (1), 60(2016).
  30. ANGSD: analysis of next generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 15, 356(2014).">Korneliussen, T. S., Albrechtsen, A., Nielsen, R. ANGSD: analysis of next generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 15, 356(2014).
  31. Gargammel: A sequence simulator for ancient DNA. Bioinformatics. 33 (4), 577-579 (2017).">Renaud, G., Hanghøj, K., Willerslev, E., Orlando, L. Gargammel: A sequence simulator for ancient DNA. Bioinformatics. 33 (4), 577-579 (2017).
  32. Human bony labyrinth is an indicator of population history and dispersal from Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), 4128-4133 (2018).">Ponce de León, M. S., et al. Human bony labyrinth is an indicator of population history and dispersal from Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), 4128-4133 (2018).
  33. Using the petrous part of the temporal bone to estimate fetal age at death. Forensic Science International. 248, 188(2015).">Nagaoka, T., Kawakubo, Y. Using the petrous part of the temporal bone to estimate fetal age at death. Forensic Science International. 248, 188(2015).
  34. Lateral angle: A method for sexing using the petrous bone. American Journal of Physical Anthropology. 128 (2), 318-323 (2005).">Norén, A., Lynnerup, N., Czarnetzki, A., Graw, M. Lateral angle: A method for sexing using the petrous bone. American Journal of Physical Anthropology. 128 (2), 318-323 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ancient DNABone SamplingArchaeological RemainsDNA ExtractionSkeletal ElementsBone PowderPopulation GeneticsDental DrillAnatomical SamplingDegraded Forensic Remains

Related Articles