Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowane protokoły pobierania próbek kości w celu odzyskania starożytnego DNA ze szczątków archeologicznych

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63250

⸱

30 listopada 2021

 ,  ,  , 
1Department of Archaeogenetics, Max Planck Institute for the Science of Human History, 2School of Human Evolution and Social Change, Arizona State University, 3Department of Archaeogenetics, Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół przedstawia serię najlepszych praktyk w zakresie pobierania proszku kostnego z ośmiu zalecanych miejsc pobierania próbek anatomicznych (konkretne miejsca na danym elemencie szkieletu) na pięciu różnych elementach szkieletu od średniowiecznych osobników (radiowęgiel datowany na okres ok. 1040-1400 CE, kalibrowany zakres 2-sigma).

Streszczenie

Przedstawione tutaj metody mają na celu maksymalizację szans na odzyskanie ludzkiego DNA ze starożytnych pozostałości archeologicznych, przy jednoczesnym ograniczeniu materiału wejściowego próbki. Dokonano tego poprzez skupienie się na miejscach pobierania próbek anatomicznych, które wcześniej uznano za dostarczające największych ilości starożytnego DNA (aDNA) w analizie porównawczej odzyskiwania DNA w całym szkielecie. Wcześniejsze badania sugerowały, że protokoły te maksymalizują szanse na pomyślne odzyskanie starożytnego DNA człowieka i patogenów ze szczątków archeologicznych. Wydajność DNA została wcześniej oceniona przez Parkera i in. 2020 w szerokim badaniu zachowania aDNA w wielu elementach szkieletowych od 11 osób odzyskanych ze średniowiecznego (radiowęglowo datowanego na okres około (ok.) 1040-1400 n.e., kalibrowany zakres 2-sigma) cmentarzyska w Krakauer Berg, opuszczonej średniowiecznej osadzie w pobliżu Peißen w Niemczech. Te osiem miejsc pobierania próbek, które obejmują pięć elementów szkieletu (pars petrosa, stałe zęby trzonowe, kręg piersiowy, dystalny paliczek i kość skokowa) z powodzeniem dostarczyły wysokiej jakości starożytnego ludzkiego DNA, w którym wydajność była znacznie wyższa niż ogólna średnia dla wszystkich elementów i osobników. Plony były odpowiednie do wykorzystania w najczęstszych analizach genetycznych populacji niższego szczebla. Nasze wyniki przemawiają za preferencyjnym wykorzystaniem tych anatomicznych miejsc pobierania próbek w większości badań obejmujących analizy starożytnego ludzkiego DNA ze szczątków archeologicznych. Wdrożenie tych metod przyczyni się do zminimalizowania niszczenia cennych okazów archeologicznych.

Wprowadzenie

Pobieranie próbek starożytnych szczątków ludzkich w celu odzyskania i analizy DNA jest z natury destrukcyjne1,2,3,4. Próbki same w sobie są cennymi okazami i w miarę możliwości należy zachować ich zachowanie morfologiczne. W związku z tym konieczne jest, aby praktyki pobierania próbek były zoptymalizowane, aby zarówno uniknąć niepotrzebnego niszczenia niezastąpionego materiału, jak i zmaksymalizować prawdopodobieństwo sukcesu. Obecne techniki najlepszych praktyk opierają się na niewielkiej kohorcie badań ograniczonych do badań kryminalistycznych5,6, badań starożytnych okazów, w których opracowanie optymalnego pobierania próbek nie jest bezpośrednim celem badania7, lub dedykowanych badań wykorzystujących szczątki inne niż ludzkie8 lub celując w bardzo mały wybór miejsc pobierania próbek anatomicznych (używanych tutaj do oznaczenia określonego obszaru elementu szkieletowego, z którego został wygenerowany proszek kostny, do wykorzystania w dalszych analizach DNA)9,10. Przedstawione tutaj protokoły pobierania próbek zostały zoptymalizowane w pierwszym systematycznym badaniu na dużą skalę dotyczącym zachowania DNA w wielu elementach szkieletu od wielu osób11. Wszystkie próbki pochodziły z elementów szkieletowych odzyskanych od 11 osób wykopanych z cmentarza kościelnego opuszczonej średniowiecznej osady Krakauer Berg w pobliżu Peißen, Saksonia-Anhalt, Niemcy (patrz Tabela 1 w celu uzyskania szczegółowych danych demograficznych próby) i jako takie mogą wymagać modyfikacji w celu wykorzystania próbek spoza tego zakresu geograficznego/czasowego.

powiedział: Rozdział powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: Rozdział powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: Rozdział
osobnikpłećSzacowany wiek w chwili śmierciDaty 14C (CE, Cal 2-sigma)
KRA001mężczyzna25-35Lata 1058-1219
KRA002kobieta20-22Lata 1227-1283
KRA003mężczyzna251059-1223
KRA004mężczyzna15Lata 1284-1392
KRA005mężczyzna10-12Lata 1170-1258
KRA006kobieta30-40Lata 1218-1266
KRA007kobieta25-30Rozdział 1167-1251
KRA008mężczyzna20Lata 1301-1402
KRA009mężczyznanieznanyLata 1158-1254
KRA010mężczyzna25Lata 1276-1383
KRA011kobieta30-451040-1159

Tabela 1: Genetycznie określona płeć, archeologicznie określony szacowany wiek w chwili śmierci i datowanie radiowęglowe (14C Cal 2-sigma) dla wszystkich 11 osób pobranych od próbek. Ta tabela została zaadaptowana z Parker, C. et al. 202011.

Te protokoły pozwalają na stosunkowo proste i efektywne generowanie proszku kostnego z ośmiu anatomicznych miejsc pobierania próbek z pięciu elementów szkieletu (w tym pars petrosa) z ograniczonym laboratoryjnym zanieczyszczeniem DNA. Spośród tych pięciu elementów szkieletu, siedem anatomicznych miejsc pobierania próbek znalezionych na czterech elementach szkieletu zostało określonych jako realna alternatywa dla destrukcyjnego pobierania próbek z piramidy skalistej11,12. Należą do nich cement, zębina i komora miazgi stałych zębów trzonowych; kość korowa pobrana z wcięcia górnego kręgu, a także z trzonu kręgów piersiowych; kość korowa wywodząca się z dolnej powierzchni kępki wierzchołkowej i trzonu paliczków dystalnych; i gęsta kość korowa wzdłuż zewnętrznej części tali. Chociaż istnieje kilka powszechnie stosowanych metod pobierania próbek pars petrosa4,12,13,14, zębina i komora miazgi zębowej1,2,15, opublikował metody opisujące udane wytwarzanie proszku kostnego z cementu16, trzon kręgu, dolne wcięcie kręgu i kość skokowa mogą być trudne do uzyskania. W związku z tym w tym miejscu demonstrujemy zoptymalizowane protokoły pobierania próbek dla piramidy skalistej (krok 3.1); cement (etap 3.2.1), zębina (etap 3.2.2) i miazga zębowa (etap 3.2.3) zębów trzonowych dorosłych; kość korowa trzonu kręgu (etap 3.3.1) i łuk kręgowy górny (etap 3.3.2); paliczek dystalny (krok 3.4); oraz kości skokowej (krok 3.5) w celu szerszego udostępnienia efektywnego wykorzystania tych elementów szkieletowych zarówno w badaniach aDNA, jak i w badaniach kryminalistycznych.

Protokół

Wszystkie badania przedstawione w niniejszym dokumencie zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez Instytut Maks Plancka ds. Nauki o Historii Ludzkości w Jenie w Niemczech w zakresie pracy z dawnymi szczątkami ludzkimi. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek etapów niniejszego protokołu należy upewnić się, że przestrzegane są wszystkie lokalne, stanowe i federalne wymogi etyczne dotyczące zarówno uzyskania zgody na badania naukowe, jak i wykorzystania szczątków ludzkich do pobierania próbek niszczących w danym regionie. Wszystkie procedury oraz przechowywanie odczynników chemicznych powinny być realizowane zgodnie z indywidualnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa w danej instytucji.

1. Uwagi przed przetwarzaniem próbek

  1. Z próbkami należy obchodzić się z najwyższą ostrożnością, ponieważ starożytne szczątki stanowią nieodnawialny i ograniczony zasób (np. pobieranie próbek powinno być jak najmniej marnotrawne, a wszystkie szczątki powinny zostać zwrócone odpowiednim i prawnym dostawcom, jeśli jest to możliwe).
  2. Wszystkie etapy należy przeprowadzić w środowisku typu clean-room, najlepiej w dedykowanym laboratorium starożytnego DNA17,18,19. Należy stosować środki ochrony indywidualnej (PPE), w skład których wchodzą sterylne mikroporowate kombinezony z kapturem, sterylne rękawiczki (dwie pary), maseczka chirurgiczna, okulary ochronne oraz sterylne buty lub obuwie antypoślizgowe z okryciami sterylnymi (patrz Tabela materiałów). Rękawiczki należy zmieniać często, zwłaszcza pomiędzy próbkami.
  3. Wszystkie urządzenia i powierzchnie należy dokładnie wyczyścić i zdezynfekować roztworem wybielacza/roztworem do dekontaminacji DNA/etanolem oraz, gdzie to możliwe, poddać naświetlaniu UV (długość fali: 254 nm) (np. wiertła, wiertarki, imadła/zaciski itp.). Na koniec wysoce zaleca się robienie regularnych przerw ergonomicznych (jeśli to możliwe co 2-3 h), aby uniknąć nadmiernego zmęczenia wynikającego z pracy w środowisku clean-room.
    UWAGA: Wszystkie szczątki szkieletowe powinny zostać odpowiednio udokumentowane (np. sfotografowane, zważone i, jeśli to możliwe, poddane mikro-CT, obrazowaniu 3D itp.) przed pobraniem próbek (protokoły odpowiedniej dokumentacji nie są opisane w niniejszym manuskrypcie). Wszystkie protokoły pobierania próbek mogą zostać przerwane pomiędzy iteracjami, a próbki mogą być przechowywane bezterminowo w suchym, sterylnym środowisku o kontrolowanej temperaturze (25 °C).

2. Obróbka wstępna

  1. Przed pozyskaniem proszku kostnego należy odkazić wszystkie miejsca pobierania próbek anatomicznych, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji18.
    UWAGA: Skuteczność stosowania wybielacza i/lub usuwania powierzchni (patrz UWAGA w kroku 3.3.2 w celu zapoznania się z etapami usuwania powierzchni) w celu dekontaminacji próbek jest nadal przedmiotem dyskusji wśród badaczy aDNA8,19,20,21,22,23,24,25, ponieważ obie te metody mogą wpływać na całkowitą wydajność DNA, szczególnie w przypadku próbek silnie zdegradowanych. W związku z tym poniższe kroki są uznawane za opcjonalne i zostały tutaj uwzględnione, ponieważ były stosowane we wszystkich próbkach w celu uzyskania reprezentatywnych wyników przedstawionych w niniejszej pracy. Zaleca się, aby decyzję o zastosowaniu tych protokołów wstępnego przygotowania podejmować indywidualnie, w zależności od zastosowania molekularnego, wieku, rzadkości oraz stopnia degradacji morfologicznej każdego zestawu próbek.
    1. Wszystkie czynności pobierania próbek należy wykonywać w dedykowanym pomieszczeniu czystym, pod dygestorium do polimerazy łańcuchowej (PCR) wyposażonym w lampę UV lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego z wyłączonym przepływem powietrza. Na blacie należy rozłożyć sterylną folię aluminiową, aby zebrać wszelki przypadkowy proszek kostny lub fragmenty kości.
    2. Przed wyrzuceniem folii należy upewnić się, że wszystkie fragmenty kości zostały odzyskane (w celu repatriacji). Folię należy wymieniać po obróbce każdego elementu szkieletu. Zużytą folię należy wyrzucić do autoklawowalnego worka lub pojemnika na odpady biologiczne.
    3. Należy usunąć jak najwięcej luźnej ziemi/detrytusu z miejsc pobierania próbek anatomicznych, delikatnie przecierając ten obszar suchą, sterylną ściereczką beztkaninową (patrz Tabela materiałów). Ściereczki należy wyrzucić do autoklawowalnych worków lub pojemników na odpady biologiczne.
    4. Oczyszczoną powierzchnię należy odkazić, przecierając ją sterylną ściereczką zwilżoną rozcieńczonym komercyjnym wybielaczem (~0,01% v/v, rozcieńczonym w ultraczystej wodzie wolnej od DNaz/RNaz) i pozostawić do inkubacji na 5 min. Ściereczki należy wyrzucić do autoklawowalnych worków lub pojemników na odpady biologiczne.
      OSTROŻNIE: Wybielacz jest substancją silnie korozyjną i reaktywną; dlatego przed jego użyciem należy zachować odpowiednie środki ostrożności.
    5. Należy usunąć jak najwięcej pozostałości wybielacza z miejsca pobierania próbki anatomicznej za pomocą sterylnej ściereczki zwilżonej ultraczystą wodą wolną od DNaz/RNaz. Ściereczki należy wyrzucić do autoklawowalnych worków lub pojemników na odpady biologiczne.
    6. Wszystkie oczyszczone miejsca pobierania próbek anatomicznych należy naświetlać promieniowaniem UV przez 30 min (długość fali: 254 nm), a następnie pozostawić do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Przed przystąpieniem do pobierania próbek lub ich ponownym zmagazynowaniem należy upewnić się, że miejsca pobierania są całkowicie suche, co nie tylko ułatwi pozyskanie proszku kostnego, ale także zapobiegnie dalszej degradacji próbki (np. pleśnieniu).
      OSTROŻNIE: Ekspozycja na promieniowanie UV może być szkodliwa dla oczu.
    7. Należy niezwłocznie przystąpić do pobierania próbek lub przechowywać elementy szkieletu w suchym, sterylnym środowisku o kontrolowanej temperaturze (25 °C).

3. Pozyskiwanie proszku kostnego

UWAGA: Poniższe protokoły są przeznaczone do stosowania podczas ekstrakcji DNA zgodnie z protokołem Dabney et al. 201926.

  1. Pobieranie próbek z pars petrosa
    UWAGA: Niniejszy protokół został zaadaptowany z procedur opisanych przez Pinhasi i in. 20194 i przedstawiono go tutaj dla ułatwienia użytkowania. Protokół ten nie reprezentuje obecnie najmniej destrukcyjnej metody pobierania próbek z pars petrosa. W związku z tym, w przypadku próbek, w których zachowanie morfologiczne ma najwyższe znaczenie, zaleca się stosowanie protokołu opisanego przez Sirak i in. 201713 lub Orfanou i in. 202014.
    1. Wszystkie czynności pobierania próbek należy wykonywać w dedykowanym pomieszczeniu czystym pod dygestorium PCR wyposażonym w lampę UV lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego (długość fali: 254 nm) przy wyłączonym przepływie powietrza. Na blacie należy rozłożyć sterylną folię aluminiową, aby zebrać ewentualny rozproszony proszek lub fragmenty kości.
    2. Przed wyrzuceniem folii należy upewnić się, że odzyskano wszystkie fragmenty kości oraz jak największą ilość proszku (w celu repatriacji). Folię należy wymieniać po każdym pobieraniu próbki. Zużytą folię należy wyrzucić do autoklawowalnego worka lub pojemnika na odpady biologiczne.
    3. Suchy, zdekontaminowany element należy unieruchomić za pomocą wysterylizowanego zacisku lub imadła.
    4. Przeciąć pars petrosa na pół wzdłuż górnego sulcus petrosus (patrz Rycina 1), używając standardowej piłki jubilerskiej wyposażonej w brzeszczot 0,6 mm (patrz Tabela materiałów) z umiarkowaną prędkością, aby uniknąć przegrzania (patrz UWAGA pod punktem 3.1.6).
      OSTROŻNIE: pars petrosa jest bardzo gęsta, przez co może być trudna do przecięcia. Należy zadbać o stabilne zamocowanie elementu, aby uniknąć urazów. Złamane brzeszczoty pił należy utylizować w odpowiednim pojemniku na odpady ostre.
    5. Wyjąć części skaliste z zacisku. Odzyskać i zachować wszelki luźny lub nadmiarowy materiał.
    6. Umieścić papier do ważenia w sterylnym naczyniu wagowym.
    7. Trzymać część skalistą nad papierem do ważenia, przechylając stronę cięcia w stronę naczynia wagowego. Wywiercić otwór w gęstej kości korowej między kanałem twarzowym a wgłębieniem sutkowym (wygląda ona bardziej błyszcząco niż materiał otaczający, patrz Rycina 1), używając wiertła stomatologicznego wyposażonego w wiertło o małej średnicy (patrz Tabela materiałów) ustawionego na umiarkowaną prędkość i umiarkowany moment obrotowy, aby uzyskać proszek kostny.
      UWAGA: Wiercenie i cięcie należy wykonywać krótkimi seriami przy niskich lub umiarkowanych prędkościach, aby uniknąć przegrzania kości i potencjalnego zniszczenia lub uszkodzenia DNA. Empirycznie zauważono, że gdy gęsta część części skalistej zaczyna się przegrzewać, może pojawić się zapach przypominający smażony boczek. W takim przypadku należy natychmiast przerwać wiercenie lub piłowanie i odczekać, aż kość wystarczająco ostygnie przed wznowieniem prac.
    8. Powtarzać wiercenie, aż na papierze do ważenia zostanie zebrane około 50-100 mg proszku, co należy zmierzyć za pomocą zamkniętej wagi o dokładności co najmniej 0,01 mg (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Jeśli to możliwe, sugeruje się zebranie 100 mg proszku kostnego, aby umożliwić dwie powtórne ekstrakcje DNA po 50 mg każda. Może to być jednak nie zawsze możliwe ze względu na ograniczenia anatomiczne miejsc poboru (np. paliczek dalszy, komora miazgi zębowej) lub konieczność zachowania morfologii. W przypadku innych lokalizacji, takich jak cementum, dostępna może być ilość materiału znacznie mniejsza niż 50 mg. Niemniej jednak wykazano, że cementum, komora miazgi zębowej i paliczek dalszy dostarczają znaczącej ilości endogennego DNA11,27,28, mimo mniejszej początkowej ilości proszku kostnego w procesie ekstrakcji.
    9. Przenieść proszek z papieru do ważenia do opisanej probówki 2 mL typu low-bind z bezpiecznym zamknięciem (safe-lock) w celu ekstrakcji lub przechowywania. Próbki przechowywać w temperaturze -20 °C bez określonego terminu ważności.
    10. Pozostałą kość/nadmiarowy proszek przechowywać w suchym, sterylnym środowisku o kontrolowanej temperaturze (25 °C) do czasu zakończenia zwrotu lub repatriacji.
    11. Wszystkie odpady utylizować w autoklawowalnych workach lub pojemnikach na odpady biologiczne. Cały sprzęt wielorazowego użytku (np. zaciski, wiertła, wiertarki, piły itp.) należy sterylizować/dekontaminować za pomocą wybielacza, roztworu do dekontaminacji DNA lub etanolu oraz ekspozycji na UV (długość fali: 254 nm), w zależności od potrzeb, pomiędzy każdym pobieraniem próbki.

Pobieranie próbek kości do analizy; opisany obraz przedstawiający miejsce cięcia bocznego i obszar pobierania próbek z podziałką linijki.
Rycina 1: Kość skroniowa, w tym pars petrosa. (A) Próbka przed cięciem, pokazująca położenie piramidy skalistej i sulcus petrosa. (B) Część skalista po cięciu, z zaznaczonymi gęstymi obszarami przeznaczonymi do wiercenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Pobieranie próbek z trwałych zębów trzonowych
    UWAGA: W przypadku pobierania próbek z zębów trzonowych stałych, należy wcześniej wyselekcjonować in situ zęby trzonowe z zrośniętymi korzeniami, a dla uzyskania najlepszych wyników najlepiej pozbawione próchnicy, pęknięć szkliwa lub nadmiernego starcia. Usunąć kamień nazębny, pobrać próbki i przechowywać w temperaturze -20 °C do ewentualnych przyszłych analiz mikrobiomu jamy ustnej (procedura nie jest tutaj opisana).
    1. Pobieranie próbek cementu
      1. Wszystkie etapy pobierania próbek należy przeprowadzić w dedykowanej sterylnej pomieszczeniu, pod dygestorium do PCR wyposażonym w lampę UV lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego (długość fali: 254 nm) przy wyłączonym przepływie powietrza. Na blacie roboczym należy rozłożyć sterylną folię aluminiową, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się pyłu lub fragmentów kości.
      2. Należy upewnić się, że wszystkie fragmenty kości oraz jak największa ilość proszku zostały odzyskane (w celu repatriacji) przed utylizacją folii. Folię należy wymieniać po każdym pobraniu próbki. Zużytą folię należy wyrzucić do autoklawowalnego worka lub pojemnika na odpady biologiczne.
      3. Umieść arkusz papieru ważącego w sterylnej tacce ważącej.
      4. Przytrzymać/unieruchomić zdekontaminowany ząb trzonowy za szkliwo, skierowując korzeń w dół, nad tacką wagową za pomocą zacisku ręcznego, np. klucza nastawnego (patrz Tabela materiałów).
      5. Wyposażyć wiertarkę stomatologiczną w diamentową tarczę tnącą. Przy ustawionej średniej prędkości/momencie obrotowym wiertarki, lekko dotknąć krawędzi wiertła do korzenia pod kątem około -20°.
      6. Zeskrobuj materiał w dół do tacki, aby usunąć/zebrać żółtą, zewnętrzną warstwę korzenia (cement). Przerwij zbieranie, gdy stanie się widoczny jaśniejszy (biały) materiał zębiny.
        UWAGA: Ważne jest, aby kierunek obrotu wiertła był zgodny z położeniem tacy kolektorskiej, aby zapobiec aerozolizacji proszku i potencjalnej utracie próbki w wyniku jej wypadnięcia poza tacę. Cement korzenia jest szczególnie bogaty w DNA, jednak typowa ilość uzyskanego materiału jest znacznie mniejsza niż w przypadku innych anatomicznych miejsc pobierania próbek (~7-20 mg).11,27,28.
      7. Zanotuj masę proszku zebranego na papierze ważącym, korzystając z wagi w obudowie o dokładności co najmniej 0,01 mg (patrz Lista materiałów).
      8. Przenieść proszek z papierka do ważenia do probówki 2 ml typu low-bind z bezpiecznym zamknięciem (safe lock) w celu ekstrakcji. Przechowywać w temperaturze -20 °Cw nieskończoność.
    2. Pobieranie próbek z komory miazgi
      1. Po pobraniu cementu (jeśli jest to wskazane), należy przeciąć ząb trzonowy wzdłuż połączenia cementowo-szkliwnego za pomocą piłki jubilerskiej, aby usunąć koronę (patrz Rycina 2).
      2. Umieść nowy arkusz papieru wagowego w nowej szalce wagowej.
      3. Zabezpiecz sekcję korony w uchwycie ręcznym lub imadle, nad tacką wagową. Trzymając stronę przeciętą nachyloną w dół, wykonaj pierwsze przejście, wiercąc lub zdrapując materiał za pomocą wiertarki stomatologicznej wyposażonej w wiertło o małej średnicy (patrz Tabela materiałów) wzdłuż krawędzi komory miazgi w obrębie korony (patrz Rycina 2).
        UWAGA: Jako materiał miazgi (typowa wydajność 5–15 mg) należy zebrać i oznakować wyłącznie materiał z pierwszego przejścia wnętrza komory miazgi; wszystko, co znajduje się głębiej w zębie, uznaje się za dentynę.
      4. Obrócić ząb tak, aby jego część dolna była skierowana w dół, uderzyć młotkiem w zacisk i zebrać uwolniony proszek na papierze wagowym.
      5. Zważ zebrany na papierze wagowym proszek, korzystając z wagi analitycznej w komorze o dokładności co najmniej 0,01 mg (patrz Tabela materiałów).
      6. Przenieść proszek z papierka do ważenia do probówki 2 ml typu low-bind z bezpiecznym zamknięciem (safe-lock) w celu ekstrakcji. Przechowywać w temperaturze -20 °C, w nieskończoność.
    3. Pobieranie próbek dentyny
      1. Umieść nową kartkę papieru wagowego w nowej szalce wagowej.
      2. Trzymając sekcję korony nad tacką wagową (zgodnie z krokiem 3.2.2.3), należy wywiercić i zebrać kolejne 50–100 mg dentyny, odważając je na wadze analitycznej o dokładności do 0,01 mg (patrz Tabela materiałów) z wnętrza komory miazgi w ten sam sposób w celu pobrania kolejnych próbek miazgi (patrz Rycina 2).
      3. Przenieść proszek kostny z papieru wagowego do probówki 2 ml typu low-bind z zabezpieczeniem safe-lock w celu przeprowadzenia ekstrakcji. Przechowywać w temperaturze -20 °C, w nieskończoność.
      4. Przechowywać pozostałe fragmenty zęba/nadmiar proszku w suchym miejscu, w kontrolowanej temperaturze (25 °C) środowisko sterylne do momentu zakończenia procesu zwrotu/repatriacji.
      5. Wszystkie odpady należy utylizować w autoklawowalnych workach lub pojemnikach na odpady biologiczne. Cały sprzęt wielorazowy (np. zaciski, wiertła, wiertarki, piły itp.) należy sterylizować/dekontaminować, stosując wybielacz/roztwór do dekontaminacji DNA/etanol oraz naświetlanie promieniami UV (długość fali: 254 nm) w zależności od potrzeb, pomiędzy poszczególnymi pobraniami próbek.

Schemat budowy zęba przedstawiający cement, korzenie, komorę miazgi oraz zębinę wraz z pomiarami.
Rysunek 2: Trwały ząb trzonowy przed pobraniem próbek. (A) Wstępnie potraktowany ząb trzonowy przed pobraniem próbek, przedstawiający koronę, cement (żółtawa warstwa korzenia) oraz miejsce cięcia na połączeniu cementowo-szkliwnym. (B) Ten sam ząb trzonowy po pobraniu cementu, przedstawiający miejsce cięcia na połączeniu cementowo-szkliwnym. (C) Ząb trzonowy po przecięciu i pobraniu próbek, przedstawiający anatomiczne miejsca pobrania próbek z komory miazgi zębowej i zębiny w obrębie korony. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Pobieranie próbek z kręgów piersiowych
    1. Pobieranie próbek z trzonu kręgu
      1. Wszystkie czynności związane z pobieraniem próbek należy przeprowadzić w dedykowanym pomieszczeniu czystym, pod dygestorium do PCR wyposażonym w lampę UV lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego (długość fali: 254 nm) przy wyłączonym przepływie powietrza. Na blacie roboczym należy rozłożyć sterylną folię aluminiową, aby zapobiec rozproszeniu proszku lub fragmentów kości.
      2. Należy upewnić się, że wszystkie fragmenty kości oraz jak największa ilość proszku zostały odzyskane (w celu repatriacji) przed utylizacją folii. Folię należy wymieniać po każdym pobraniu próbki. Zużytą folię należy wyrzucić do autoklawowalnego worka lub pojemnika na odpady biologiczne.
      3. Umieść mały kawałek papieru wagowego w standardowej szalce wagowej.
      4. Unieruchom kręgi za pomocą zacisku lub imadła ręcznego, tak aby trzon kręgu był skierowany na zewnątrz.
      5. Przytrzymaj kręgi nad tacką wagową tak, aby trzon kręgu był nachylony w dół. Używając wiertarki stomatologicznej wyposażonej w wiertło o małej średnicy (patrz Tabela materiałów) ustawionym na niską prędkość i wysoki moment obrotowy, wiercić wzdłuż zewnętrznej krawędzi (dolnej i górnej) kości korowej otaczającej tkankę gąbczastą trzonu kręgu (patrz Rysunek 3).
      6. Zeskrob materiał z warstwy korowej na standardową szalkę wagową, aż do zebrania od 50 do 100 mg materiału, odważonego za pomocą wagi analitycznej z dokładnością do 0,01 mg (patrz Lista materiałów).
      7. Przenieść proszek kostny z papieru do ważenia do probówki 2 ml typu low-bind z bezpiecznym zamknięciem (safe lock) w celu przeprowadzenia ekstrakcji. Przechowywać w temperaturze -20 °C, w nieskończoność.
    2. Pobieranie próbek z górnego łuku kręgowego
      UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Usuń i wyrzuć zewnętrzną warstwę kości korowej górnego łuku kręgu, używając wiertarki stomatologicznej wyposażonej w wiertło o małej średnicy (patrz Tabela materiałów) poprzez przesuwanie go wzdłuż powierzchni19Metoda ta nie jest zalecana do pobierania próbek z trzonu kręgu, ponieważ warstwa kości korowej jest tam zazwyczaj bardzo cienka i prawdopodobnie zostanie całkowicie usunięta w tym procesie (patrz UWAGA w sekcji 2).
      1. Umieść niewielki arkusz papieru do ważenia w standardowej szalce wagowej.
      2. Zabezpiecz kręgi w imadle ręcznym, ustawiając wyrostki kręgów na zewnątrz, a stronę górną skierowaną w dół.
      3. Trzymając kręgi stroną górną skierowaną w dół nad tacką wagową, wierć ku górze w centrum wcięcia w kształcie litery V, utworzonego przez zrost wyrostka kolczystego z blaszkami (patrz Rycina 3) przy użyciu wiertarki stomatologicznej z wiertłem o małej średnicy (patrz Tabela materiałów) ustawić na niską prędkość i wysoki moment obrotowy.
      4. Przerwij wiercenie, gdy nastąpi zauważalny spadek oporu. Nieznacznie zmień pozycję wiercenia i powtarzaj czynność, aż do zebrania 50–100 mg proszku kostnego, odmierzonego za pomocą dołączonej wagi o dokładności 0,01 mg (patrz Tabela materiałów).
      5. Przenieś proszek kostny z papieru do ważenia do probówki low-bind o pojemności 2 ml w celu przeprowadzenia ekstrakcji. Przechowuj w temperaturze -20 °C, w nieskończoność.
      6. Przechowywać pozostałą kość/nadmiar proszku w suchym miejscu, w kontrolowanej temperaturze (25 °C) środowisko sterylne do czasu powrotu/repatriacji.
      7. Wszystkie odpady należy utylizować w autoklawowalnych workach lub pojemnikach na odpady biologiczne. Wszystkie urządzenia wielorazowego użytku (np. zaciski, wiertła, wiertarki, piły itp.) należy wysterylizować/zdekontaminować..) stosując wybielacz/roztwór do dekontaminacji DNA/etanol oraz naświetlanie promieniowaniem UV (długość fali: 254 nm), w zależności od potrzeb, pomiędzy każdym pobraniem próbek.

Schemat anatomii kręgu z oznaczonym trzonem kręgu i górnym łukiem kręgu, do użytku edukacyjnego.
Rycina 3: Miejsca pobierania próbek anatomicznych kości korowej trzonu kręgu i górnego łuku kręgu w kręgu piersiowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Pobieranie próbek z paliczka dystalnego
    UWAGA: Krok ten jest opcjonalny. Usuń i zutylizuj zewnętrzną warstwę kości korowej trzonu i/lub guzka szczytowego, używając wiertarki stomatologicznej z wiertłem o małej średnicy i zeskrobując materiał wzdłuż powierzchni19. Może to być niemożliwe w przypadku próbek z nadmiernie cienką kością korową lub szczątków młodocianych (patrz UWAGA w sekcji 2).
    1. Wszystkie czynności pobierania próbek należy przeprowadzać w dedykowanym pomieszczeniu czystym, pod dygestorium PCR wyposażonym w lampę UV lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego (długość fali UV: 254 nm) przy wyłączonym przepływie powietrza. Rozłóż sterylną folię aluminiową na blacie, aby zebrać wszelkie przypadkowe pyły i fragmenty kości.
    2. Przed utylizacją folii upewnij się, że odzyskano wszystkie fragmenty kości i jak największą ilość pyłu (w celu repatriacji). Wymieniaj folię pomiędzy każdym pobraniem próbki. Zużytą folię utylizuj w autoklawowalnym worku lub pojemniku na odpady biologiczne.
    3. Umieść mały arkusz papieru ważącego w standardowej tacy ważącej.
    4. Zabezpiecz próbkę w ręcznym zacisku/imadle, stroną górną do góry.
    5. Trzymając próbkę nad tacą ważącą, zbierz pył kostny z kości korowej z dolnej strony guzka szczytowego i trzonu, wiercąc przez zewnętrzne gęste warstwy (patrz Rysunek 4) za pomocą wiertarki stomatologicznej wyposażonej w wiertło o małej średnicy (patrz Tabela materiałów).
    6. Przerwij wiercenie, gdy nastąpi wyraźny spadek oporu, co sygnalizuje obecność lżejszego materiału gąbczastego. Powtarzaj ten proces, rozszerzając obszar wiercenia od miejsca początkowego, aż do zebrania co najmniej 50-100 mg pyłu kostnego, zmierzonego za pomocą wagi w obudowie z dokładnością do 0,01 mg (patrz Tabela materiałów).
    7. Przenieś pył kostny z papieru ważącego do probówki 2 mL typu low-bind z bezpiecznym zamknięciem w celu ekstrakcji. Przechowuj w temperaturze -20 °C bezterminowo.
    8. Pozostałą kość/nadmiar pyłu przechowuj w suchym, sterylnym środowisku o kontrolowanej temperaturze (25 °C) do czasu zwrotu/repatriacji.
    9. Wszystkie odpady utylizuj w autoklawowalnych workach lub pojemnikach na odpady biologiczne. Sterylizuj/dekontaminuj cały sprzęt wielorazowego użytku (np. zaciski, wiertła, wiertarki, piły itp.) przy użyciu wybielacza/roztworu do dekontaminacji DNA/etanolu oraz naświetlania UV, w zależności od potrzeb, pomiędzy każdym pobraniem próbki.
      UWAGA: W przypadku mniejszych próbek (np. próbek młodocianych) dostępna ilość kości korowej do pobrania może być znacznie mniejsza niż sugerowane 50-100 mg. Jednakże, nawet w niskich ilościach, wykazano, że to anatomiczne miejsce pobierania jest szczególnie bogate w DNA11.

Schemat pobierania próbek z fragmentu kości z zaznaczonym trzonem i kępką apikalną, pasek skali wskazuje 5 cm.
Rycina 4: Paliczek dystalny z zaznaczonymi lokalizacjami gęstej kości korowej wzdłuż trzonu i na dolnej stronie kępki apikalnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Pobieranie próbek kości skokowej
    1. Wszystkie czynności związane z pobieraniem próbek należy przeprowadzać w dedykowanym pomieszczeniu czystym, pod dygestorium do PCR wyposażonym w lampę UV lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego (długość fali: 254 nm) przy wyłączonym przepływie powietrza. Na blacie należy rozłożyć sterylną folię aluminiową, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się pyłu lub fragmentów kości.
    2. Należy upewnić się, że przed wyrzuceniem folii odzyskano wszystkie fragmenty kości oraz jak największą ilość proszku (w celu repatriacji). Folię należy wymieniać po każdym pobraniu próbki. Zużytą folię należy zutylizować w autoklawowalnym worku lub pojemniku na odpady biologiczne.
    3. Umieść mały arkusz papieru do ważenia w standardowej szalce wagowej.
    4. Zabezpiecz próbkę w uchwycie ręcznym/imadle, kopułą skierowaną do góry.
    5. Przytrzymaj kość skokową kopułą do góry i powierzchnią przyśrodkową skierowaną w stronę kolektora, nad tacką wagową. Zeskrob kość korową z szyjki kości skokowej do głębokości ok. 1 mm (patrz Rysunek 5) przy użyciu wiertarki stomatologicznej z wiertłem o małym rozmiarze (patrz Tabela materiałów) ustawić na niską prędkość i wysoki moment obrotowy.
    6. Należy nieznacznie zmienić pozycję wiercenia i powtarzać czynność do momentu zebrania około 50–100 mg proszku kostnego, odmierzonego za pomocą zamkniętej wagi o dokładności 0,01 mg (patrz Tabela materiałów).
    7. Przenieś proszek kostny z papieru wagowego do probówki o niskim stopniu wiązania o pojemności 2 ml w celu przeprowadzenia ekstrakcji. Przechowuj w temperaturze -20 °Cw nieskończoność.
    8. Przechowywać pozostałą kość/nadmiar proszku w suchym miejscu, w kontrolowanej temperaturze (25 °C) środowisko sterylne do czasu zakończenia procesu zwrotu/repatriacji.
    9. Wszystkie odpady należy utylizować w autoklawowalnych workach lub pojemnikach na odpady biologiczne. Wszystkie urządzenia wielorazowego użytku (np. zaciski, wiertła, wiertarki, piły itp.) należy sterylizować/dekontaminować za pomocą wybielacza/roztworu do dekontaminacji DNA/etanolu oraz naświetlania promieniowaniem UV (długość fali: 254 nm), w zależności od potrzeb, pomiędzy każdym pobraniem próbek.

Badanie anatomii kości, oznakowana przyśrodkowa powierzchnia szyjki, pasek skali, analiza archeologiczna.
Rysunek 5: Obszar pobierania próbek z kości skokowej w celu odzyskania kości korowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

UWAGA: Kość skokowa posiada bardzo mało kości korowej (cienką warstwę zewnętrzną). Materiał należy pobierać nie tylko z powierzchni, ale także z leżącej pod nią gęstej warstwy kości gąbczastej.

Wyniki

W oddzielnym badaniu11 DNA wyekstrahowano z proszku kostnego uzyskanego z każdego anatomicznego miejsca pobrania u 11 osobników, stosując standardowy protokół ekstrakcji DNA zoptymalizowany dla krótkich fragmentów z tkanki zwapniałej2. Następnie przygotowano biblioteki jednoniciowe28 i zsekwencjonowano je na platformie HiSeq 4000 (75 bp paired-end) do głębokości ok. 20 000 000 odczytów na próbkę. Uzyskane dane sekwencyjne oceniono pod kątem zawartości endogennego ludzkiego DNA przy użyciu potoku EAGER29 (ustawienia BWA: długość ziarna 32, kara za niedopasowanie 0,1, filtr jakości mapowania 37). Dla zachowania spójności wszystkie reprezentatywne wyniki przedstawiono przy użyciu tych samych wskaźników, co w pracy Parker et al. 202011. Biblioteki przygotowane z rozdrobnionych części pars petrosa przyniosły średnio wyższą zawartość endogennego DNA niż każde z pozostałych 23 badanych anatomicznych miejsc pobrania (Rycina 6A-B). Siedem dodatkowych anatomicznych miejsc pobrania przedstawionych w niniejszym protokole (cementum, pierwsze przejście przez jamę miazgi zębowej oraz zębinę zębów trzonowych stałych; kość korowa z trzonu kręgu i górnego łuku kręgu kręgów piersiowych; kość korowa z kępki apikalnej paliczka dalszego oraz kość korowa z szyjki kości skokowej) dało następne najwyższe wydajności (bez istotności statystycznej między tymi anatomicznymi miejscami pobrania; Rycina 6A-B; Plik uzupełniający 1: EndogenousDNAPreCap). Wszystkie te alternatywne miejsca konsekwentnie dostarczały wydajności DNA wystarczającej do standardowych analiz genetyki populacyjnej, takich jak analizy mitochondrialne i analizy polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP). Wskaźniki duplikacji w bibliotekach pochodzących ze wszystkich anatomicznych miejsc pobrania były niskie (średni współczynnik klastrowania < 1,2, obliczony jako stosunek wszystkich zmapowanych odczytów do unikalnych odczytów zmapowanych, Tabela 2; Plik uzupełniający 1: ClusterFactor), co wskazuje, że wszystkie przesiewowe biblioteki charakteryzowały się bardzo wysoką złożonością. Podobnie, średnie szacunki kontaminacji egzogennym ludzkim DNA były niskie, wynosząc średnio < 2% (kontaminacja chromosomem X u mężczyzn, n = 7, zgodnie z raportem potoku ANGSD30) we wszystkich anatomicznych miejscach pobrania, z wyjątkiem górnego łuku kręgu (średnia szacowana kontaminacja: 2,11%, z usunięciem jednej próbki jako wartości odstającej; KRA005: 19,52%, patrz Tabela 2; Plik uzupełniający 1: Xcontamination). Średnia długość fragmentów (po odfiltrowaniu wszystkich odczytów < 30 bp) była najniższa w materiale pobranym z jamy miazgi zębowej i zębiny, przy braku istotnych różnic między pozostałymi anatomicznymi miejscami pobrania (odpowiednio 55,14 bp i 60,22 bp w porównaniu do średniej mediany 62,87, wartości p dla porównań parami < 0,019, Tabela 2; Plik uzupełniający 1: AvgFragLength). Dodatkowo, zęby i kręgi piersiowe zawierają po kilka anatomicznych miejsc pobrania, w których zaobserwowano wysoką odzyskiwalność endogennego DNA, co czyni je szczególnie odpowiednimi alternatywami dla pars petrosa.

Analiza odzyskiwania i mapowania DNA wykazująca proporcje ludzkiego DNA i unikalne mapowania odczytów, wykresy pudełkowe.
Rycina 6: Zawartość ludzkiego DNA dla wszystkich badanych próbek. Czarne linie reprezentują średnią ogólną, natomiast czerwone linie reprezentują medianę (linia ciągła: proporcja ludzkiego DNA, linia przerywana: zmapowane ludzkie odczyty na milion wygenerowanych odczytów). Poszczególne anatomiczne miejsca pobrania próbek ze średnią proporcją ludzkiego DNA wyższą niż średnia ogólna (8,16%) są wyróżnione kolorami we wszystkich analizach. (A) Proporcja odczytów mapujących do genomu referencyjnego hg19. Niebieska przerywana linia reprezentuje teoretyczne maksimum przy danych parametrach mapowania potoku przetwarzania (wygenerowane przy użyciu Gargammel31 w celu symulacji losowego rozkładu 5 000 000 odczytów z genomu referencyjnego hg19 z symulowanym uszkodzeniem). Średnie poszczególnych próbek (czarny znak X) i mediany (czerwone koło) są podane dla próbek o średniej proporcji ludzkiego DNA wyższej niż średnia ogólna. Przedziały ufności wskazują górne i dolne granice z wyłączeniem wartości odstających statystycznie. (B) Liczba unikalnych odczytów mapujących do genomu referencyjnego hg19 na milion odczytów z sekwencjonowania (75 bp paired end). Przedziały ufności wskazują górne i dolne granice z wyłączeniem wartości odstających statystycznie. Rycina ta została zaadaptowana z Parker, C. et al. 202011. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 2: Średnie poziomy duplikacji (odczyty zmapowane/odczyty unikalne), średnie i medianowe długości fragmentów oraz szacunki zanieczyszczenia chromosomem X dla wszystkich anatomicznych miejsc pobrania próbek. Błąd podano jako błąd standardowy średniej. Tabela została opracowana na podstawie pracy Parker, C. et al. 202011.

Miejsce poboru próbekŚredni współczynnik duplikacji (liczba zmapowanych odczytów / liczba unikalnych zmapowanych odczytów)Średnia długość fragmentu w bpŚredni szacowany stopień zanieczyszczenia chromosomem X
Piramida skroniowa1.188 ± 0.00665.40 ± 1.360.000 ± 0.003
Cement**1.197 ± 0.02867.28 ± 1.760.011 ± 0.003
Dentyna1.188 ± 0.06160.22 ± 2.370.002 ± 0.007
Miazga zęba1.179 ± 0.02455.14 ± 2.900.013 ± 0.006
Paliczek dalszy1.191 ± 0.04965.95 ± 1.080.013 ± 0.005
Trzon kręgu1.194 ± 0.03766.14 ± 1.030.008 ± 0.003
Górny łuk kręgowy1.19 ± 0.01763.02 ± 1.230.021 ± 0.009*
Kość skokowa1.198 ± 0.01068.20 ± 1.240.011 ± 0.003
*Próbkę KRA005 usunięto jako wartość odstającą przy 0,1952

Dostępność kodu
Wszystkie programy analityczne oraz moduły R wykorzystane w analizach w niniejszym manuskrypcie są bezpłatnie dostępne u ich odpowiednich autorów. Wszystkie niestandardowe kody R są dostępne na żądanie.

Dostępność danych
Wszystkie surowe dane wykorzystane do obliczenia reprezentatywnych wyników są swobodnie dostępne w repozytorium danych European Nucleotide Archive ENA (numer dostępu PRJ-EB36983) lub w materiałach uzupełniających pracy Parker, C. et al.11.

Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Obecna praktyka w genetyce populacji starożytnej człowieka polega na preferencyjnym pobieraniu próbek z pars petrosa (krok 2.1), gdy tylko jest to możliwe. Jednak pars petrosa może być próbą trudną do uzyskania, ponieważ jest wysoko ceniona w niezliczonych ocenach szkieletu (np. historia populacji32, oszacowanie wieku płodu w chwili śmierci33 i determinacja płci34), a historycznie rzecz biorąc, pobieranie próbek pars petrosa do analizy DNA może być wysoce destrukcyjne 3,4 (w tym protokół przedstawiony tutaj, Chociaż nowe, minimalnie inwazyjne protokoły13,14 zostały obecnie powszechnie przyjęte w celu złagodzenia tego problemu). Sytuację pogarsza fakt, że do niedawnanie podjęto próby przeprowadzenia na dużą skalę, systematycznego badania nad odzyskiwaniem ludzkiego DNA w szkielecie11, co sprawia, że znalezienie odpowiedniej strategii pobierania próbek, gdy piramida skalista jest niedostępna, jest trudne.

Przedstawione tutaj protokoły pomagają złagodzić to wyzwanie, zapewniając zestaw zoptymalizowanych procedur pobierania próbek DNA ze szczątków szkieletowych archeologicznych/sądowych, w tym pars petrosa, a także siedem alternatywnych lokalizacji pobierania próbek anatomicznych z czterech dodatkowych elementów szkieletu. Wszystkie zawarte w nim krytyczne kroki mają na celu zminimalizowanie możliwości utraty/uszkodzenia DNA z powodu nieefektywnego pobierania próbek (kroki 2.1.6 i 3.2.1.3) lub przegrzania próbek podczas wiercenia/cięcia (krok 3.1.6). Ponadto w całym protokole zauważono, że może być konieczna modyfikacja/pominięcie etapów obróbki wstępnej w celu zapewnienia najlepszej wydajności w próbkach o wysokiej degradacji. Należy również zauważyć, że nawet wśród wybranych elementów przedstawionych tutaj pozostaje kilka możliwych alternatywnych technik pobierania próbek (szczególnie w przypadku pars petrosa13,14), a także duże pole do dalszej optymalizacji przedstawionych tu niedostatecznie wykorzystanych anatomicznych miejsc pobierania próbek (tj. kości skokowej: krok 2.5 i kręgów: krok 2.3).

Należy również pamiętać, że protokoły te zostały zaprojektowane i przetestowane przy użyciu starożytnych szczątków młodocianych i dorosłych o wysokiej jakości (dobre zachowanie morfologiczne) do celów analiz endogennego DNA człowieka. Przedstawione wyniki mogą nie obejmować bardziej zdegradowanych materiałów, innych kontekstów konserwacji, szczątków niemowląt, szczątków innych niż ludzkie lub badań patogenów lub mikrobiomu, ponieważ nadal potrzebne jest dokładniejsze badanie wykorzystania tych protokołów w dodatkowych kontekstach. Ponadto przedstawione tutaj alternatywne elementy szkieletu (zęby, kręgi, dystalny paliczek i tali) mogą być trudne do przypisania do jednego osobnika wśród zmieszanych szczątków, co wymaga pobierania próbek z wielu elementów, aby zapewnić jedno pochodzenie. Pomimo tych ograniczeń, szerokie udostępnienie tych protokołów może pomóc złagodzić pewną niejednorodność związaną z wyborem i przetwarzaniem próbek, zapewniając uogólnione i ilościowo zoptymalizowane ramy do wykorzystania w szerokim zakresie przyszłych badań aDNA/kryminalistycznych na szczątkach ludzkich.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zgłaszania konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować personelowi laboratorium Instytutu Nauki o Historii Człowieka im. Maxa Plancka za pomoc w opracowaniu i wdrożeniu tych protokołów. Ta praca nie byłaby możliwa bez wkładu i ciężkiej pracy dr Guido Brandta, dr Elizabeth Nelson, Antje Wissegot i Franziski Aron. Badanie zostało sfinansowane przez Towarzystwo Maxa Plancka, Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 na podstawie umów o grant nr 771234 - PALEoRIDER (WH, ABR) oraz Starting Grant nr 805268 CoDisEASe (do KIB).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#16 Wiertło dentystyczneNTIH1-016-HPprzykład wiertło
0,6 mm brzeszczot do przewijaniaFisher Scientific50-949-097ostrze do jubilerów Piła
diamentowa 22 mmKahlaSKU 806 104 358 514 220Nasadka do cięcia Dremel
Komercyjny wybielaczFisher ScientificNC1818018
Control Company Ultra-Clean Folia aluminiowa SupremeFisher Scientific15-078-29X
Probówki DNA LoBind (2 ml)Eppendorf22431048
Dremel 225-01 Nasadka z elastycznym wałkiemDremel225-01Przedłużka elastyczna Dremel
4300 Narzędzie obrotoweDremel4300Przykładowe wiertło
Zestaw tulei zaciskowych i nakrętek DremelDremel4485Adaptery do różnych Nasadki/bity do narzędzi Dremel
Eagle 33 galony czerwony worek na odpady BiohazardFisher Scientific17-988-501
Probówka do mikrowirówek Eppendorf DNA LoBind 2 mlFisher Scientific13-698-792
Etanol (klasa biologii molekularnej)Millipore Sigma1.08543
Zatwierdzona przez FDA maska chirurgiczna poziomu 2Fisher Scientific50-206-0397PPE
Rękawice nitrylowe Fisherbrand ComfortFisher Scientific19-041-171XPPE
Okulary ochronne FisherbrandFisher Scientific19-130-208XPPE
Imadło stacjonarne Granger Imadło stołoweFisher ScientificNC1336173
Invitrogen UltraPure Woda destylowana bez DNaz/RnazFisher Scientific10-977-023
Jubilerzy PiłaFisher Scientific50-949-231
KimwipesSigma-AldritchZ188956
Labconco Purifier Logic Szafka bezpieczeństwa biologicznegoFisher Scientific30-368-1101
LookOut DNA EraseMillipore SigmaL9042-1L
Łódź o średniej wadzeHeathrow ScientificHS120223
MSC 10-częściowy zestaw szczypiec/zaciskówFisher Scientific50-129-5352Różne  uchwyty zacisków/imadła do bezpiecznego trzymania próbek podczas wiercenia/cięcia
Sartorius Quintix Semi-Micro BalanceFisher Scientific14-560-019waga zamknięta
Kombinezon Tyvek z kapturemFisher Scientific01-361-7X
PPE Ważenie papieruHeathrow ScientificHS120116

Bibliografia

  1. Adler, C. J., Haak, W., Donlon, D., Cooper, A. Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones. Journal of Archaeological Science. 38 (5), 956-964 (2011).
  2. Dabney, J., Meyer, M. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Ancient DNA: Methods and Protocols. , 25-29 (2019).
  3. Palsdottir, A. H., Bläuer, A., Rannamäe, E., Boessenkool, S., Hallsson, J. Not a limitless resource: ethics and guidelines for destructive sampling of archaeofaunal remains. Royal Society Open Science. 6 (10), 191059(2019).
  4. Pinhasi, R., Fernandes, D. M., Sirak, K., Cheronet, O. Isolating the human cochlea to generate bone powder for ancient DNA analysis. Nature Protocols. 14 (4), 1194-1205 (2019).
  5. Latham, K. E., Miller, J. J. DNA recovery and analysis from skeletal material in modern forensic contexts. Forensic Sciences Research. 4 (1), 51-59 (2019).
  6. Mundorff, A. Z., Bartelink, E. J., Mar-Cash, E. DNA preservation in skeletal elements from the World Trade Center disaster: Recommendations for mass fatality management. Journal of Forensic Sciences. 54 (4), 739-745 (2009).
  7. Gamba, C., et al. Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
  8. Alberti, F., et al. Optimized DNA sampling of ancient bones using Computed Tomography scans. Molecular Ecology Resources. 18 (6), 1196-1208 (2018).
  9. Hansen, H. B., et al. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).
  10. Sirak, K., et al. Human auditory ossicles as an alternative optimal source of ancient DNA. Genome Research. 30 (3), 427-436 (2020).
  11. Parker, C., et al. A systematic investigation of human DNA preservation in medieval skeletons. Scientific Reports. 10 (1), 18225(2020).
  12. Pinhasi, R., et al. Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone. PLoS ONE. 10 (6), 0129102(2015).
  13. Sirak, K. A., et al. A minimally-invasive method for sampling human petrous bones from the cranial base for ancient DNA analysis. BioTechniques. 62 (6), 283-289 (2017).
  14. Orfanou, E., Himmel, M., Aron, F., Haak, W. Minimally-invasive sampling of pars petrosa (os temporale) for ancient DNA extraction. protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w (2020).
  15. Damgaard, P. B., et al. Improving access to endogenous DNA in ancient bones and teeth. Scientific Reports. 5 (1), 1-12 (2015).
  16. Harney, É, et al. A minimally destructive protocol for DNA extraction from ancient teeth. Genome Research. 31 (3), 472-483 (2021).
  17. Cooper, A., Poinar, H. N. Ancient DNA: Do it right or not at all. Science. 289 (5482), 1139(2000).
  18. Llamas, B., et al. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).
  19. Llamas, B., et al. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).
  20. Boessenkool, S., et al. Combining bleach and mild predigestion improves ancient DNA recovery from bones. Molecular Ecology Resources. 17 (4), 742-751 (2017).
  21. García-Garcerà, M., et al. Fragmentation of contaminant and endogenous DNA in ancient samples determined by shotgun sequencing; Prospects for human palaeogenomics. PLoS ONE. 6 (8), 24161(2011).
  22. Malmström, H., et al. More on contamination: The use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA. Molecular Biology and Evolution. 24 (4), 998-1004 (2007).
  23. Basler, N., et al. Reduction of the contaminant fraction of DNA obtained from an ancient giant panda bone. BMC Research Notes. 10, 754(2017).
  24. Kemp, B. M., Smith, D. G. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth. Forensic Science International. 154 (1), 53-61 (2005).
  25. Korlević, P., et al. Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth. BioTechniques. 59 (2), 87-93 (2015).
  26. Dabney, J., Meyer, M. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Methods in Molecular Biology. 1963, 25-29 (2019).
  27. Hansen, H. B., et al. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).
  28. Gansauge, M. -T., et al. Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase. Nucleic Acids Research. 45 (10), 79(2017).
  29. Peltzer, A., et al. EAGER: efficient ancient genome reconstruction. Genome Biology. 17 (1), 60(2016).
  30. Korneliussen, T. S., Albrechtsen, A., Nielsen, R. ANGSD: analysis of next generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 15, 356(2014).
  31. Renaud, G., Hanghøj, K., Willerslev, E., Orlando, L. Gargammel: A sequence simulator for ancient DNA. Bioinformatics. 33 (4), 577-579 (2017).
  32. Ponce de León, M. S., et al. Human bony labyrinth is an indicator of population history and dispersal from Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), 4128-4133 (2018).
  33. Nagaoka, T., Kawakubo, Y. Using the petrous part of the temporal bone to estimate fetal age at death. Forensic Science International. 248, 188(2015).
  34. Norén, A., Lynnerup, N., Czarnetzki, A., Graw, M. Lateral angle: A method for sexing using the petrous bone. American Journal of Physical Anthropology. 128 (2), 318-323 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja DNAelementy szkieletoweproszek kostnygenetyka populacyjnawiertarka dentystycznapobieranie pr bek anatomicznychzdegradowane szcz tki kryminalistyczne
Zoptymalizowane protokoły pobierania próbek kości w celu odzyskania starożytnego DNA ze szczątków archeologicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.