Artykuł metodologiczny

Stosowanie barwienia czerwienią alizarynową w celu wykrycia chemicznie wywołanej utraty masy kostnej u larw danio pręgowanego

DOI:

10.3791/63251

⸱

28 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Toxicology, School of Public Health, Jiangsu Key Laboratory of Preventive and Translational Medicine for Geriatric Diseases, Medical College of Soochow University, 2Department of Occupational Disease Prevention, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, 3Jiangsu Preventive Medicine Association, Nanjing, China

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj użyliśmy czerwonego barwienia alizaryną, aby pokazać, że ekspozycja na octan ołowiu powoduje zmianę masy kostnej u larw danio pręgowanego. Ta metoda barwienia może być dostosowana do badania utraty kości u larw danio pręgowanego wywołanej przez inne niebezpieczne substancje toksyczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemicznie wywołana utrata masy kostnej spowodowana ekspozycją na ołów (Pb) może wywołać szereg niekorzystnych skutków zarówno dla ludzkich, jak i zwierzęcych układów kostnych. Jednak konkretne skutki i mechanizmy u danio pręgowanego pozostają niejasne. Czerwień alizarynowa ma wysokie powinowactwo do jonów wapnia i może pomóc w wizualizacji kości i zilustrowaniu masy mineralnej szkieletu. W tym badaniu naszym celem było wykrycie utraty masy kostnej wywołanej octanem ołowiu (PbAc) u larw danio pręgowanego za pomocą barwienia czerwienią alizarynową. Zarodki danio pręgowanego traktowano serią stężeń PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) między 2 a 120 godzinami po zapłodnieniu. Barwienie całego szkieletu przeprowadzono na larwach po 9 dniach od zapłodnienia, a całkowity obszar barwienia określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ. Wyniki wskazały, że zmineralizowane tkanki były zabarwione na czerwono, a zabarwiony obszar zmniejszył się znacznie w grupie ekspozycji na PbAc, z zależną od dawki zmianą mineralizacji kości. W pracy przedstawiono protokół barwienia do badania zmian szkieletowych w ubytkach kostnych wywołanych przez PbAc. Metoda może być również stosowana u larw danio pręgowanego do wykrywania utraty masy kostnej wywołanej przez inne substancje chemiczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie badania potwierdziły, że osteoporoza spowodowana glikokortykosteroidami, inhibitorami aromatazy i nadmiernym spożyciem alkoholu jest powszechna1,2. Ołów (Pb) jest toksycznym metalem występującym w roślinach, glebie i środowisku wodnym3. Chociaż niekorzystny wpływ Pb na organizm ludzki przyciągnął wiele uwagi, jego nieodwracalny wpływ na kości wymaga dalszych badań. Zatrucie ołowiem powoduje różnorodny szereg zmian patologicznych zarówno w rozwijającym się, jak i dorosłym szkielecie, wpływając na normalne czynności życiowe. Badania wykazały związek między przewlekłym narażeniem na Pb a uszkodzeniem kości4, w tym upośledzone struktury kostne5,6, zmniejszona gęstość mineralna kości, a nawet zwiększone ryzyko osteoporozy7.

Zmineralizowana tkanka ma ogromne znaczenie dla wytrzymałości kości8, a osadzanie się matrycy mineralizacji kości jest krytycznym wskaźnikiem tworzenia kości9. Czerwień alizarynowa ma wysokie powinowactwo do jonów wapnia, a barwienie czerwienią alizarynową jest standardową procedurą oceny tworzenia się kości10. Zgodnie z tą metodą zmineralizowana tkanka jest barwiona na czerwono, podczas gdy cała inna tkanka pozostaje przezroczysta. Zabarwiony obszar jest następnie określany ilościowo za pomocą cyfrowej analizy obrazu11.

Danio pręgowany jest ważnym organizmem modelowym, szeroko wykorzystywanym w odkrywaniu leków i modelach chorób. Badania genetyczne na danio pręgowanym i ludziach wykazały podobieństwa w mechanizmach leżących u podstaw morfogenezy szkieletu na poziomie molekularnym12. Co więcej, wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków lub biomolekuł są bardziej wykonalne w dużych lęgach danio pręgowanego niż w modelach mysich, ułatwiając mechanistyczne badanie cząsteczek proosteogennych lub osteotoksycznych13. Barwienie różnicowe szkieletu w tototo10 jest często używane w badaniu dysplazji szkieletowej u małych kręgowców i płodów ssaków. Barwienie czerwienią alizaryny przeprowadzono w celu zbadania toksyczności rozwojowej kości substancji chemicznych u larw danio pręgowanego. W tym artykule użyliśmy ołowiu jako przykładu do opisania protokołu wykrywania wad kostnych wywołanych octanem ołowiu u larw danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj procedury dla zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytut Opieki nad Zwierzętami Komisji Etyki Uniwersytetu Soochow.

1. Hodowla ryb i zbieranie zarodków 14

  1. Karm ryby trzy razy dziennie; upewnić się, że danio pręgowany jest utrzymywany w temperaturze 28,5 ± 0,5 °C w cyklu 14:10 godzin światła/ciemności.
  2. Dorosłe samce i samice należy oddzielić deskami izolacyjnymi w zbiornikach tarłowych w stosunku 2:1 samce do samic wieczorem.
  3. Następnego ranka usuń tablice izolacyjne o 9:00 i zbierz zarodki 2 godziny później.
  4. Przed rozpoczęciem doświadczenia umieścić zarodki w inkubatorze biochemicznym utrzymywanym w temperaturze 28,5 °C.

2. Narażenie na działanie substancji chemicznych

  1. Przygotować wywar macierzysty: zważyć trójwodny octan ołowiu (5 g) i rozpuścić go w ultraczystej wodzie (50 ml), mieszając.
    UWAGA: PbAc jest toksyczny. Nosić odpowiednie maski przeciwpyłowe, odzież ochronną i rękawice. Wykonaj eksperyment pod wyciągiem.
  2. Wybierz i losowo rozmieść zarodki danio pręgowanego na czystych płytkach 6-dołkowych (30 zarodków na studzienkę w 3 ml wody hodowlanej danio pręgowanego; patrz tabela 1, aby zapoznać się z ich składem). Traktować zarodki PbAc (0, 5, 10, 20 mg/l) od 2 do 120 godzin po zapłodnieniu (hpf).
    UWAGA: Stężenia PbAc zostały wybrane zgodnie z eksperymentami ustalającymi zakres dawek. Wyniki wykazały, że LC50 octanu ołowiu na zarodkach danio pręgowanego wynosił 41,044 mg/l przy 120 hpf. Stąd najwyższe stężenie ustalono na połowę LC50 i szereg roztworów przygotowanych przez 2-krotne rozcieńczenie.
  3. Karm larwy dwa razy dziennie od 5 dni po zapłodnieniu (dpf). Utrzymuj zarodki danio pręgowanego w temperaturze 28,5 ± 0,5 °C w cyklu 14:10 godzin światła/ciemności.
  4. Pożywkę wolną od Pb (wodę hodowlaną danio pręgowanego) należy odświeżać co 24 godziny do godziny 9 dpf.
    UWAGA: Po zakończeniu eksperymentów wszystkie roztwory zawierające ołów zostały przelane do wyznaczonego zbiornika na ciecz i poddane obróbce przez centrum zarządzania eksperymentem.

3. Czerwone zabarwienie alizaryny

UWAGA: Noś odpowiednie maski przeciwpyłowe, odzież ochronną i rękawice podczas całego procesu barwienia. Składy wszystkich roztworów przedstawiono w tabeli 1.

  1. Specjalne etapy barwienia
    UWAGA: Proces barwienia przeprowadzono na 24-dołkowej płytce w temperaturze pokojowej. Po dodaniu każdego roztworu umieścić 24-dołkową płytkę na stole do wytrząsania ustawionym na niską prędkość.
    1. Usuń losowo 10 larw danio pręgowanego z każdej grupy przy 9 dpf i utrwal ryby w 1 ml 2% paraformaldehydu/1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem na 2 godziny.
    2. Zdekantować roztwór i przemyć larwy danio pręgowanego 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2 przez 10 minut.
    3. Zdekantować roztwór i inkubować larwy w następujących roztworach przez 5 minut każde w celu odbarwienia: bezwodny roztwór etanolu (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH = 7,5) i 25% EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH = 7,5).
    4. Zdekantować roztwór, usunąć pigment przez wybielanie roztworem składającym się z 3%H2O2i 0,5% KOH i obserwować raz na 10 minut, aż pigment zostanie całkowicie usunięty.
    5. Opłucz larwy danio pręgowanego kilka razy 25% gliceryną/0,1% KOH przez 10 minut, aż nie będzie pęcherzyków.
      UWAGA: Ważne jest, aby unikać pęcherzyków; W przeciwnym razie pęcherzyki w ciele danio pręgowanego pojawią się pod mikroskopem jako czarne pole widzenia, co wpłynie na obserwacje i analizę ilościową.
    6. Zabarwić larwy, mocząc je w 1 ml 0,01% alizaryny przez 50 minut.
    7. Zdekantuj roztwór i dodaj 1 ml 50% gliceryny/0,1% KOH przez 10 minut, aby oczyścić tło. Przechowuj ryby w świeżej 50% glicerynie/0,1% KOH do późniejszej obserwacji.

4. Akwizycja obrazu

  1. Za każdym razem przenoś jedną larwę na szkiełko podstawowe, trzymając larwę w środku kropli płynu.
  2. Obserwuj larwy pod mikroskopem stereoskopowym.
  3. Włącz aparat, otwórz oprogramowanie (patrz Spis materiałów) i zachowaj ustawienia domyślne.
  4. Kliknij AE i wybierz odpowiedni czas naświetlania (60 ms w tym eksperymencie), aby uzyskać najlepszy obraz.
  5. Przechwyć wszystkie obrazy przy tych samych ustawieniach. Zapisz obrazy w .tif formacie do późniejszej analizy.

5. Analiza obrazu

UWAGA: Zobacz plik uzupełniający dla przykładu z zestawem przykładowych wykresów do analizy obrazu.

  1. Kliknij dwukrotnie ikonę ImageJ i przeanalizuj obrazy zapisane w kroku 4.5.
    1. Kliknij Plik | Otwórz, aby otworzyć obrazy zapisane w kroku 4.5.
    2. Kliknij na Obrazek | Wpisz i wybierz opcję 8-bitowy.
    3. Kliknij Edytuj | Odwrócić.
    4. Kliknij Analizuj | Kalibruj, wybierz Nieskalibrowany OD w wyskakującym interfejsie, zaznacz Kalibracja globalna w lewym dolnym rogu dolnego interfejsu i kliknij OK.
    5. Kliknij Analizuj | Ustawianie skali | Kliknij, aby usunąć skalę w wyskakującym interfejsie, zaznacz Globalne poniżej i kliknij OK.
    6. Kliknij Analizuj | Ustaw Pomiary, wybierz obszar elementu w wyskakującym interfejsie, zaznacz Ogranicz do progu poniżej (aby mierzyć tylko wybrany zakres) i kliknij OK.
    7. Kliknij na Obrazek | Dostosuj| Próg, przesuń suwak na środku interfejsu wyskakującego, aby wybrać odpowiedni próg (zmień próg dla każdego obrazu), tak aby wszystkie obiekty docelowe do przetestowania na jednym obrazie zostały wybrane, a następnie kliknij przycisk Ustaw.
    8. Kliknij Analizuj | Miara. Zapisz daty każdej grupy.
  2. Użyj jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya, aby przeanalizować różnice i ustaw poziom istotności na p < 0,001 (***).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barwienie czerwienią alizarynową jest czułą i specyficzną metodą pomiaru zmian w mineralizacji kości u larw danio pręgowanego. W tym badaniu zaobserwowaliśmy, że PbAc miał niekorzystny wpływ na larwy danio pręgowanego, w tym śmierć, wady rozwojowe, zmniejszenie częstości akcji serca i skrócenie długości ciała. Ponadto oceniono obszary szkieletu mineralnego larw danio pręgowanego w celu zbadania utraty masy kostnej wywołanej przez PbAc. Przy 9 dpf (Ryc. 1A), wiele kości szkieletu głowy jest zmineralizo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany jest odpowiednim modelem do badania chorób metabolicznych kości. W porównaniu z modelami gryzoni, modele danio pręgowanego są stosunkowo szybkie do ustalenia, a pomiar ciężkości choroby jest łatwiejszy. U larw danio pręgowanego typu dzikiego mineralizacja szkieletu głowy zachodzi przy 5 dpf, a szkieletu osiowego przy 7 dpf15. Tak więc kości czaszki, takie jak PS, OP, CB i NC, są dobrze rozwinięte przy 9 dpf. Po całkowitym odbarwieniu i wybieleniu larw tkanki miękkie zostały oczyszc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81872646; 81811540034; 81573173) oraz Priorytetowy Program Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu (PAPD).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 M Tris-HCl (pH = 7,5)Solarbio, Pekin, Chiny21do zatrzymywania
4% roztworu utrwalającego paraformaldehydBBI, Szanghaj, Chiny14tkanek utrwalających
10x bufor PBSBBI, Szanghaj, Chiny15do mocowania
35% H2< / sub>O2Yonghua, Jiangsu, Chiny8usuwanie pigmentu
Probówka wirówkowa 50 mlAKX, Jiangsu, Chiny4
95% bezwodny etanolEnox, Jiangsu, Chiny2odbarwiające
czerwień alizarynową (czystość 99,5%)Solarbio, Pekin, Chiny1barwienie
Inkubator biochemicznyYiheng, Szanghaj, Chiny3hodowla zarodków danio pręgowanego
Waga elektronicznaSartorius, Niemcy5ważenie surowców stałych
Gliceryna (czystość 99,5%)BBI, Szanghaj, Chiny7przechowywanie barwionych ryb
ImageJ (oprogramowanie)USA9analiza cyfrowa
KOH (czystość 99,9%)Sigma, Ameryka10roztwór wybielający
Trójwodny octan ołowiu (czystość 99,5%)Aladyn, Szanghaj, Chiny11
MgCl2 (Czystość 99,9%)Aladyn,Szanghaj,Chiny12roztwór czyszczący
NIS-Elements F (oprogramowanie)Nikon, Japonia13obserwacji i robienia zdjęć
RuraAKX, Jiangsu, Chiny18usuwanie zarodków i
płytek roztworu (24-dołkowe)Corning, Ameryka17pojemnik do barwienia płytek zarodkowych
(6-dołkowy)Corning, Ameryka16pojemnik do hodowli zarodków
Stół do wytrząsaniaBeyotime, Chiny19mieszanie roztworu
Mikroskop stereoskopowyNikon, Japonia20obserwacji i robienia zdjęć
Danio pręgowanyCentrum Doświadczalne Danio Pręgowanego Uniwersytetu Soochow, Suzhou, Chiny22zwierzę doświadczalne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
  2. Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
  3. Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).
  4. Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147(2020).
  5. Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
  6. Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
  7. Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
  8. Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
  9. Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
  10. Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
  11. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
  14. Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).
  15. Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).
  16. Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
  17. Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).
  18. Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie utraty masy kostnejekspozycja na octan o owiubarwienie szkieletumineralizacja ko cichemiczna toksyczno kostnastereomikroskopiaanaliza w programie ImageJmodel osteoporozy

Powiązane artykuły