Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest najcięższą chorobą przewodu pokarmowego (GI), która często występuje u wcześniaków, szczególnie u niemowląt o bardzo niskiej masie urodzeniowej, z wysoką śmiertelnością i niejasną patogenezą. Przyczyna NEC może być związana z nieprawidłowościami w zakresie regulacji immunologicznej. Model zwierzęcy NEC jest niezbędnym narzędziem do badań immunologicznych nad chorobą NEC. Modele zwierzęce NEC zwykle wykorzystują nowonarodzone myszy C57BL/6J; Myszy nowonarodzone BALB/c są rzadko stosowane. Powiązane badania wykazały, że gdy myszy są zakażone, różnicowanie komórek Th2 dominuje u myszy BALB/c w porównaniu z myszami C57BL/6J. Badania sugerują, że występowanie i rozwój NEC są związane ze wzrostem liczby komórek T pomocniczych typu 2 (Th2) i na ogół towarzyszy im zakażenie. Dlatego w badaniu tym wykorzystano nowonarodzone myszy BALB/c do wywołania modelu NEC o podobnych cechach klinicznych i zmianach patologicznych jelitowych, jak te obserwowane u dzieci z NEC. Dalsze badania są uzasadnione w celu ustalenia, czy ten model zwierzęcy może być wykorzystany do badania odpowiedzi komórek Th2 w NEC.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mysi model martwiczego zapalenia jelit u noworodków BALB/c
* These authors contributed equally
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Podsumowanie
Streszczenie
Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest najcięższą chorobą przewodu pokarmowego (GI), która często występuje u wcześniaków, szczególnie u niemowląt o bardzo niskiej masie urodzeniowej, z wysoką śmiertelnością i niejasną patogenezą. Przyczyna NEC może być związana z nieprawidłowościami w zakresie regulacji immunologicznej. Model zwierzęcy NEC jest niezbędnym narzędziem do badań immunologicznych nad chorobą NEC. Modele zwierzęce NEC zwykle wykorzystują nowonarodzone myszy C57BL/6J; Myszy nowonarodzone BALB/c są rzadko stosowane. Powiązane badania wykazały, że gdy myszy są zakażone, różnicowanie komórek Th2 dominuje u myszy BALB/c w porównaniu z myszami C57BL/6J. Badania sugerują, że występowanie i rozwój NEC są związane ze wzrostem liczby komórek T pomocniczych typu 2 (Th2) i na ogół towarzyszy im zakażenie. Dlatego w badaniu tym wykorzystano nowonarodzone myszy BALB/c do wywołania modelu NEC o podobnych cechach klinicznych i zmianach patologicznych jelitowych, jak te obserwowane u dzieci z NEC. Dalsze badania są uzasadnione w celu ustalenia, czy ten model zwierzęcy może być wykorzystany do badania odpowiedzi komórek Th2 w NEC.
Wprowadzenie
Martwicze zapalenie jelit (NEC), najcięższa choroba przewodu pokarmowego (GI), występuje u większości wcześniaków (>90%), szczególnie tych z bardzo niską masą urodzeniową (VLBW)1. U niemowląt z VLBW częstość występowania choroby waha się od 10% do 12%, a śmiertelność dzieci, u których zdiagnozowano NEC, wynosi od 20% do 30%2,3. Przyczyna NEC może być związana z urazami błony śluzowej, inwazją bakterii chorobotwórczych i karmieniem jelit, co może prowadzić do reakcji zapalnych i indukcji urazów jelit u podatnych gospodarzy3. Patogeneza NEC jest niejasna. Odpowiednie badania pokazują, że odpowiedź immunologiczna chorego niemowlęcia jest nieprawidłowa, a podatność genetyczna, napięcie mikronaczyniowe i zmiany bakteryjne w jelitach mogą odgrywać ważną rolę w chorobie3.
Model zwierzęcy NEC jest niezbędnym narzędziem do badań nad patogenezą NEC. Gatunki zwierząt wykorzystywane w modelach NEC to świnie, szczury i myszy. Jednak ze względu na długi okres ciąży, cykle wzrostu i wysokie koszty, w ostatnich latach świnie nie były pierwszym wyborem dla modeli NEC i zostały zastąpione szczurami lub myszami4. Ponieważ istnieją różnice w pochodzeniu immunologicznym różnych szczepów myszy5, różne badania muszą wykorzystywać różne szczepy myszy w celu stworzenia modeli zwierzęcych NEC. Myszy BALB/c mają ważną cechę; gdy są zakażone lub radzą sobie z uszkodzeniami zewnętrznymi, polaryzacja komórek TH2 podczas infekcji u myszy jest znacznie silniejsza niż w innych szczepach myszy6,7,8. Limfocyty pomocnicze T odgrywają kluczową rolę w występowaniu i progresji NEC, zwłaszcza w rozwoju komórek TH23,9,10,11. Dlatego w badaniu tym wykorzystano myszy BALB/c do ustalenia modelu NEC, który może być pomocny w badaniach nad chorobą NEC na limfocytach T.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Medycznej Centrum Medycznego dla Kobiet i Dzieci w Kantonie (nr 174A01) oraz Komisję ds. Etyki Zwierząt w Guangzhou Forevergen Biosciences Laboratory Animal Center (IACUC-G160100). Wszystkie zwierzęta zostały wyhodowane w tym samym pomieszczeniu w specyficznym środowisku wolnym od patogenów (SPF), a eksperymenty przeprowadzono w środowisku konwencjonalnym. Myszy użyte do hodowli miały 7-8 tygodni; myszy w celu wywołania NEC (n = 72) oddzielono od matki w dniu 4, a matki (n = 14) trzymano w oryginalnej klatce i karmiono myszami z grupy kontrolnej (n = 24).
1. Przygotowanie odczynników i urządzeń
- Przygotuj substytut mleka dla myszy BALB/c w odpowiednim stosunku (mleko wcześniaka w proszku: mleko kozie w proszku = 2:1).
UWAGA: Końcowe składy odżywcze mleka modyfikowanego12 przedstawiono w tabeli 1. - Roztwór LPS (2,5 mg/ml)
- Rozpuścić łącznie 10 mg proszku LPS w 4 ml wysterylizowanej podwójnie destylowanej wody, dobrze wymieszać i przechowywać w lodówce w temperaturze -20 °C po podaniu
UWAGA: Roztwór LPS jest przechowywany w ciemności w temperaturze 2-8 °C do natychmiastowego użycia lub w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.
- Rozpuścić łącznie 10 mg proszku LPS w 4 ml wysterylizowanej podwójnie destylowanej wody, dobrze wymieszać i przechowywać w lodówce w temperaturze -20 °C po podaniu
2. Wywołanie martwiczego zapalenia jelit u noworodków myszy BALB/c
- Nakarm nowonarodzone myszy.
- Trzymaj nowonarodzone myszy w tej samej klatce z matką, karmione przez matkę w dniach 0-4.
- W nocy dnia 4 (gdy nowonarodzone myszy ważą 2,5-3 g), oddziel nowonarodzone myszy w grupie NEC od matki w celu wywołania NEC, trzymaj je w inkubatorze dla zwierząt i karm je mlekiem modyfikowanym. Jednak grupa Cont. może pozostać z matką i być przez nią karmiona.
UWAGA: Nowonarodzone myszy, które są oddzielone od matki, muszą być hodowane w inkubatorze ze względu na ich słabą regulację temperatury ciała.
- Przygotuj rurkę do zgłębnika, mocząc ją w pojemnikach z 75% alkoholem na 1-2 minuty i umyj je dwukrotnie w czystej, podwójnie destylowanej wodzie.
UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego wśród myszy, powyższy proces należy wykonać po karmieniu każdej myszy. - Wywołaj model NEC.
- Zabierz nowonarodzone myszy z tamy w dniu 4 i pościj je przez jedną noc.
- Zgłębnik myszy podaje LPS (20-30 μl na raz) i karmi je mlekiem modyfikowanym w 5 dniu (40-50 μl na raz).
- Od 5 dnia poddaj myszy cyklowi hipoksji, reoksygenacji i szoku zimnego dwa razy dziennie przez 5 dni. Umieść myszy w urządzeniu do hipoksji w temperaturze 5%O2 na 90 s i ponownie je natleniaj przez 3 minuty; Powtórz ten proces pięć razy. Następnie umieść myszy w środowisku o temperaturze 4 °C na 15 minut, a następnie przenieś je do inkubatora. Zobacz Rysunek 1A,B dla procesu indukcji.
UWAGA: Cykl hipoksji-reoksygenacji-stymulacji zimnem wykonywano raz rano i raz po południu. W pojemniku przygotowano mieszaninę 5%O2 z 95% N2, a stężenie zmierzono za pomocą detektora tlenu.
- Uważnie obserwuj wszystkie myszy, waż je codziennie, rejestruj przeżywalność myszy w okresie indukcji i zapisuj charakterystykę stolca (z lepkimi stolcami lub bez/krwawymi stolcami).
UWAGA: Uznany model NEC wystarcza na 5 dni. - W dniu 10 lub wcześniej, gdy myszy wykazują objawy NEC (niedrożność jelit, hematochezja, biegunka)13, poddaj myszy eutanazji w znieczuleniu wziewnym izofluranem, a następnie natychmiast pobierz tkankę jelitową. Nie pobieraj tkanek od myszy, które zmarły samoistnie.
UWAGA: W tym badaniu punkt końcowy eutenazji myszy został dostosowany, gdy mysz wykazywała hematochezję i sinicę całego ciała.
3. Zgłębnik myszy
- Zamocuj głowę myszy, trzymając sondę żołądkową w prawej ręce. Włóż sondę żołądkową z lewego kącika ust myszy.
UWAGA: Głowa została zamocowana palcem wskazującym na głowie myszy i delikatnie dociśnięta do tyłu i do dołu, aby zapobiec zginaniu się myszy do przodu podczas operacji i wpływaniu na wprowadzenie sondy żołądkowej. - Powoli przesuń rurkę do środka ust. Po włożeniu tubki na około 2-3 cm należy wepchnąć do przewodu pokarmowego 40-50 μL preparatu lub 20-30 μL LPS. Zobacz Rysunek 2A,B dla gavage.
UWAGA: W normalnych warunkach sonda żołądkowa jest wprowadzana do przewodu pokarmowego płynnie. Jeśli mysz ma silny odruch wymiotny, sonda żołądkowa została przez pomyłkę wprowadzona do tchawicy. Sondę żołądkową należy delikatnie wyciągnąć i pozostawić mysz na chwilę odpocząć przed ponowną próbą zgłębnika. Ponadto procedura zgłębnika jest stosowana do indukowania modelu NEC przed eutanazją myszy.
4. Zbierz świeże próbki tkanek jelitowych do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E)
- Zanurz świeżą tkankę jelita krętego myszy w 10% formalinie na 24 godziny.
- Zanurz tkanki w parafinie i pokrój je na odcinki o grubości 4 μm.
- Odparafinować skrawki w ksylenie i kolejno ponownie je uwodnić w absolutnym etanolu, 95% etanolu, 80% etanolu, 70% etanolu i wodzie destylowanej, mocząc przez 5 minut w każdym etapie. Skrawki barwić roztworem hematoksyliny przez 5 minut i różnicować je w 1% kwasie solnym w 75% alkoholu przez 5 s. Na koniec zabarwić je roztworem eozyny przez 1 min.
UWAGA: Po zabarwieniu roztworem hematoksyliny, należy go rozróżnić za pomocą 1% kwasu solnego w etanolu, aby usunąć nadmiernie związany roztwór hematoksyliny i cytoplazmatycznego barwnika hematoksylinowego. Stężenie 1% kwasu solnego jest odpowiednie dla tkanki jelitowej. - Zbadaj histopatologię tkanki jelitowej w 40-krotnym powiększeniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Model NEC u myszy BALB/c został wywołany poprzez żywienie preparatem, podawanie LPS, hipoksję oraz stymulację zimnem. W okresie indukcji obserwowano u myszy patologię jelit, charakter stolca, zmiany masy ciała oraz codzienną przeżywalność. Reprezentatywne obrazy jelita cienkiego podczas indukcji NEC; liczby na zdjęciach reprezentują ocenę patologii jelit od 0 (nabłonek prawidłowy) do 4 (najcięższa patologia) (Rycina 3A). Ocena patologii jelit była znacznie wyższa w grupie NEC niż w grupie Co...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
NEC jest najczęstszym nagłym przypadkiem ze strony układu pokarmowego u noworodków, charakteryzującym się wysoką częstością występowania i śmiertelnością, zwłaszcza u wcześniaków 1,2,3. Jednak jego patogeneza jest nadal niejasna. Obecnie uważa się, że uszkodzenie błony śluzowej, inwazja patogenów i żywienie dojelitowe są czynnikami wysokiego ryzyka NEC3. Do tej pory zwierzęta wykorzystywane w modelu NEC t...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Bankowi Klinicznych Zasobów Biologicznych Centrum Medycznego dla Kobiet i Dzieci w Kantonie za dostarczenie próbki klinicznej oraz Guangzhou Forevergen Biosciences Laboratory Animal Center za dostarczenie myszy. Badania te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin w ramach grantu 81770510 (R.Z.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Absolutny etanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. | ||
| Mleko kozie w proszku | Petag | ||
| Roztwór barwnika HE | Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. | G1003 | |
| Izofluran | RWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD. | Czynnik chłodniczy R510 | |
| LPS | Sigma-Adrich | L2880 | |
| Tlen medyczny | różne | różne | |
| mikroskopy | System obrazowania NIKON NIKON (DS-Ri2) | ||
| Neutralna żywica | Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. | ||
| Parafina | różne | różne Mleko | |
| dla wcześniaków w proszku | Abbott | 57430 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. | ||
| 1% Kwas solny | różne | różne | |
| 10% formalina | LEAGENE | DF0110 |
Bibliografia
- Horbar, J. D., et al. Mortality and neonatal morbidity among infants 501 to 1500 grams from 2000 to 2009. Pediatrics. 129 (6), 1019-1026 (2012).
- Stoll, B. J., et al. Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics. 126 (3), 443-456 (2010).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
- Sangild, P. T., et al. Invited Review: The preterm pig as a model in pediatric gastroenterology. Journal of Animal Science. 91 (10), 4713-4729 (2013).
- Cancro, M. P., Sigal, N. H., Klinman, N. R. Differential expression of an equivalent clonotype among BALB/c and C57BL/6 mice. Journal of Experimental Medicine. 147 (1), 1-12 (1978).
- Kuroda, E., Yamashita, U. Mechanisms of enhanced macrophage-mediated prostaglandin E2 production and its suppressive role in Th1 activation in Th2-dominant BALB/c mice. Journal of Immunology. 170 (2), 757-764 (2003).
- Fornefett, J., et al. Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6 mice infected with Streptobacillus moniliformis. Microbes and Infection. 20 (2), 101-110 (2018).
- Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
- Sproat, T., Payne, R. P., Embleton, N. D., Berrington, J., Hambleton, S. T cells in preterm infants and the influence of milk diet. Frontiers in Immunology. 11, 1035(2020).
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776(2011).
- Afrazi, A., et al. New insights into the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis: Toll-like receptors and beyond. Pediatric Research. 69 (3), 183-188 (2011).
- Auestad, N., Korsak, R. A., Bergstrom, J. D., Edmond, J. Milk-substitutes comparable to rat's milk; their preparation, composition and impact on development and metabolism in the artificially reared rat. British Journal of Nutrition. 61 (3), 495-518 (1989).
- Liu, Y., et al. Lactoferrin-induced myeloid-derived suppressor cell therapy attenuates pathologic inflammatory conditions in newborn mice. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4261-4275 (2019).
- MohanKumar, K., et al. A murine neonatal model of necrotizing enterocolitis caused by anemia and red blood cell transfusions. Nature Communications. 10 (1), 3494(2019).
- He, Y. M., et al. Transitory presence of myeloid-derived suppressor cells in neonates is critical for control of inflammation. Nature Medicine. 24 (2), 224-231 (2018).
- Cho, S. X., et al. Characterization of the pathoimmunology of necrotizing enterocolitis reveals novel therapeutic opportunities. Nature Communications. 11 (1), 5794(2020).
- Halpern, M. D., et al. Decreased development of necrotizing enterocolitis in IL-18-deficient mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (1), 20-26 (2007).
- Wu, N., et al. MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche. Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).
- Nino, D. F., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Necrotizing enterocolitis: new insights into pathogenesis and mechanisms. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 13 (10), 590-600 (2016).
- Chuang, S. L., et al. Cow's milk protein-specific T-helper type I/II cytokine responses in infants with necrotizing enterocolitis. Pediatric Allergy & Immunology. 20 (1), 45-52 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis
Posted by JoVE Editors on 3/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. The Representative Results section was updated.
Figure 1 was updated from:
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.
