Artykuł metodologiczny

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63253

⸱

10 listopada 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Critical Care, UCSF Benioff Children's Hospital, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Streszczenie

Komórki śródbłonka odgrywają kluczową rolę w regulacji napięcia naczyniowego, odporności, krzepnięcia i przepuszczalności. Dysfunkcja śródbłonka występuje w stanach chorobowych, w tym cukrzycy, miażdżycy, posocznicy i ostrym uszkodzeniu płuc. Potrzebna jest wiarygodna i powtarzalna metoda izolowania czystych komórek śródbłonka od myszy, aby zbadać rolę komórek śródbłonka w patogenezie tych i innych schorzeń. W tym protokole komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc przygotowano z 5-7 dniowych nowonarodzonych szczeniąt myszy. Płuca są zbierane, mielone i trawione enzymatycznie za pomocą kolagenazy I, a uwolnione komórki są hodowane przez noc. Komórki śródbłonka są następnie selekcjonowane za pomocą anty-PECAM1 (CD-31) IgG sprzężonej z kulkami magnetycznymi, a komórki są ponownie hodowane do konfluencji. Następnie następuje wtórna selekcja komórek z anty-ICAM2 (CD-102) IgG sprzężoną z kulkami magnetycznymi w celu zwiększenia czystości komórek śródbłonka, a komórki są ponownie hodowane do zbiegu. Cały proces trwa około 7-10 dni, zanim komórki będą mogły być wykorzystane do eksperymentów. Ten prosty protokół daje wysoce czyste (czystość >92%) komórki śródbłonka, które można natychmiast wykorzystać do badań in vitro, w tym badań koncentrujących się na produkcji cytokin śródbłonka i chemokin, interakcjach leukocytów-śródbłonek, szlakach krzepnięcia śródbłonka i przepuszczalności śródbłonka. Z wieloma dostępnymi nokautami i transgenicznymi liniami myszy, procedura ta nadaje się również do zrozumienia funkcji określonych genów wyrażanych przez komórki śródbłonka w zdrowych i patologicznych reakcjach na urazy, infekcje i stany zapalne.

Wprowadzenie

Zainteresowanie badaniem śródbłonka naczyniowego ostatnio wzrosło, ponieważ dysfunkcja komórek śródbłonka mikronaczyniowego występuje w wielu chorobach ludzkich, takich jak udar, choroby układu krążenia, cukrzyca, ostre uszkodzenie płuc, sepsa i urazy niezakaźne1,2,3,4,5. Aby zdefiniować patogenezę tych schorzeń i zrozumieć rolę określonych genów w ochronnych i rozregulowanych odpowiedziach komórek śródbłonka, potrzebne są niezawodne metody izolacji i hodowli komórek śródbłonka mikronaczyniowego o wysokiej czystości od myszy. Podczas gdy wiele badań wykorzystuje ludzkie komórki śródbłonka, takie jak ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) lub ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc (HMVEC), istnieje wiele powodów, dla których warto używać komórek śródbłonka myszy do badania funkcji i dysfunkcji śródbłonka. Po pierwsze, istnieje znaczna niejednorodność w odpowiedziach komórek śródbłonka pochodzących od różnych ludzkich dawców, co prowadzi do zmienności wyników między poszczególnymi eksperymentami6,7,8. Po drugie, wyciszanie celów genowych w pierwotnych liniach komórek ludzkich może również prowadzić do zmiennych poziomów ekspresji białek9,10. W przeciwieństwie do tego, istnieje minimalna heterogeniczność w odpowiedziach komórek śródbłonka myszy11, zakładając, że tło genetyczne jest takie samo między grupami badanymi. Co więcej, dużą liczbę komórek śródbłonka myszy można przygotować poprzez zebranie płuc kilku nowonarodzonych myszy. Czynniki te pozwalają na uzyskanie bardziej spójnych i powtarzalnych wyników między eksperymentami. Wreszcie, dostępność myszy z nokautem lub transgenicznych zapewnia również izolację typów komórek pozbawionych interesujących białek.

Poważne wyzwania związane z izolacją zdrowych i czystych populacji komórek śródbłonka płuc myszy przy użyciu opublikowanych metod12,13,14,15,16 doprowadziły do opracowania bardziej niezawodnej i prostej metody izolowania wysokiej jakości komórek mikronaczyniowych płuc myszy. Zaletą obecnego protokołu jest wykorzystanie myszy noworodkowych, które są łatwo dostępne, co ogranicza koszty hodowli zwierząt i utrzymania. Dodatkowo, z naszego doświadczenia, żywotność komórek śródbłonka nowonarodzonych myszy jest znacznie wyższa niż komórek śródbłonka przygotowanych od dorosłych myszy. Ponieważ nowonarodzone myszy mają małą tkankę płucną, komórki śródbłonka można pobrać poprzez trawienie wyciętych płuc do kolagenazy, a nie za pomocą wkraplania kolagenazy tchawicy, co jest zalecane do pobierania od dorosłych myszy16. Skraca to również czas między eutanazją myszy a umieszczeniem ich komórek śródbłonka w pożywce do hodowli komórkowej i inkubatorze, bez wpływu na czystość, wydajność lub odtwarzalność odpowiedzi śródbłonka. Na koniec, czyste populacje komórek zostały wyizolowane bez cytometrii przepływowej, która może uszkodzić lub prowadzić do obniżenia wydajności komórek śródbłonka14,15,17.

Obecny zmodyfikowany protokół konsekwentnie prowadzi do wysokiej czystości i żywotności komórek śródbłonka w ciągu 7-10 dni, które mogą być natychmiast wykorzystane do eksperymentów in vitro. Izolowanie komórek bezpośrednio od nokautujących zwierząt również minimalizuje manipulację komórkami przed eksperymentami. Metody te mogą być wykorzystane do zbadania roli różnych białek w funkcjonowaniu śródbłonka w celu odkrycia celów terapeutycznych opartych na śródbłonku w przypadku wielu chorób.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco. Do badań wykorzystano młode nowonarodzone młode myszy C57BL/6 (w wieku 5-7 dni). Cały protokół trwa 7-10 dni (Rysunek 1).

1. Przygotowanie podłoża komórkowego śródbłonka

  1. Przygotuj podłoże podstawowe: Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco z 4,500 mg/l glukozy i 4 mM L-glutaminy (DMEM) uzupełnionej 20% (v/v) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 100 U/100 μg/ml penicyliny/streptomycyny i 25 mM HEPES (patrz tabela materiałów). Sterylny filtr z filtrem 22 μM. Przechowywać podłoże podstawowe w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu miesiąca od przygotowania.
  2. Przygotuj kompletną pożywkę: Pożywkę podstawową uzupełnioną 100 μg/ml heparyny, 100 μg/ml suplementu na wzrost komórek śródbłonka, 1x aminokwasy endogenne i 1 mM pirogronianu sodu (patrz tabela materiałów). Sterylny filtr z filtrem 22 μM. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu miesiąca od przygotowania.

2. Wstępne powlekanie koralików magnetycznych przeciw szczurom13

  1. Przygotować 50 ml buforu do płukania kulek: roztwór buforowany fosforanem (PBS) uzupełniony 0,1% (w/v) albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Sterylny filtr z filtrem 22 μM, przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu miesiąca od przygotowania.
  2. Wirować kulki magnetyczne przez kilka sekund, aby ponownie zawiesić kulki i odpipetować 50 μl kulek (2 x 107 kulek) do dwóch probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, jednej dla CD-31 i jednej dla CD-102 (patrz Tabela materiałów). Dodaj 1 ml buforu do płukania kulek i dobrze wymieszaj.
    UWAGA: Wszystkie wymienione objętości wykorzystano do wyizolowania komórek śródbłonka od 3-4 nowonarodzonych młodych myszy (w wieku 5-7 dni). CD-31 i CD-102 są markerami powierzchni komórek śródbłonka używanymi do selekcji magnetycznych kulek immunologicznych.
  3. Umieścić probówki na separatorze magnetycznym i usunąć supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura. Powtórz mycie 3 razy za pomocą 1 ml buforu do płukania kulek za każdym razem.
  4. Zawiesić kulki w oryginalnej objętości kulki, 50 μl, z buforem do płukania kulek. Następnie dodaj 5 μl (2,5 μg) przeciwciała (CD-31/CD-102) do każdych 50 μl kulek.
  5. Zawiesinę kulek inkubować przy delikatnym obrocie na rotatorze typu end-to-end przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Powtórz pranie 4 razy.
  6. Zawiesić granulki immunologiczne w pierwotnej objętości, 50 μl, z buforem do płukania kulek i przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1-2 tygodni.

3. Izolacja i posiewanie komórek płuc

  1. Przygotować roztwór kolagenazy typu 1 w dniu izolacji: Dodać 25 mg kolagenazy typu 1 do 25 ml HBSS (patrz tabela materiałów). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z delikatnym obracaniem i sterylnym filtrem przy użyciu filtra 22 μM. Utrzymywać roztwór w cieple w temperaturze 37 °C.
  2. Wstrzyknij domięśniowo 5-7 jednodniowym szczeniętom myszy heparynę (25 μL/mysz, 1,000 U/ml) 10 minut przed eutanazją, aby zminimalizować aktywację komórek śródbłonka i tworzenie się skrzepów14,15.
  3. Poddaj eutanazji szczeniaka myszy poprzez ścięcie głowy ostrymi nożyczkami zgodnie z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji z 2020 r. Następnie przypnij mysz do deski preparacyjnej brzuszną stroną do góry.
  4. Spryskaj tuszę 70% etanolem, a następnie odsłoń klatkę piersiową, najpierw przecinając membranę, a następnie tnąc górnie w górę wzdłuż całych bocznych ścian klatki piersiowej. Odbicie klatki piersiowej odsłania wtedy serce i płuca.
    UWAGA: Na tym etapie użyj mniejszych kleszczy i nożyczek, biorąc pod uwagę mały rozmiar nowonarodzonych myszy i upewnij się, że nie przebijasz serca ani płuc, ponieważ doprowadzi to do niewystarczającego usunięcia krwi z płuc.
  5. Podłącz igłę 25 G do strzykawki o pojemności 10 ml i wstrzyknij 5 ml zimnego DMEM do prawej komory serca, aby usunąć krew z płuc. Płuca zmienią kolor na biały.
  6. Usuń płuca z jamy klatki piersiowej, po jednym płacie na raz, przecinając płaty dystalnie do odpowiednich oskrzeli.
  7. Zebrać wszystkie płaty płuc w stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej 20 ml lodowatego podłoża podstawowego (od kroku 1.1).
  8. Powtórz kroki 3.2-3.7 z innymi młodymi myszy, łącząc wszystkie płaty płuc w tej samej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  9. Delikatnie poruszaj probówką ręcznie przez 10-15 sekund, aby zmyć nadmiar czerwonych krwinek, które są wizualnie widoczne na powierzchni płuc.
    UWAGA: Nie jest konieczne usuwanie całej krwi z wnętrza płuc lub wokół nich; Poprawia to jednak czystość. Wszelkie dalsze obchodzenie się z tkankami musi odbywać się w sterylnym kapturze.
  10. Użyj sitka do komórek, aby usunąć płuca z pożywki i przenieś tkankę do sterylnego, jednorazowego naczynia do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm i zmiel wysterylizowanymi nożyczkami.
  11. Przenieść zmieloną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 25 ml wstępnie podgrzanego roztworu kolagenazy (krok 3.1). Delikatnie mieszać na mieszadle obrotowym przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Nadmierne trawienie nawet przez 60 minut może prowadzić do niższych plonów.
  12. Podłączyć strzykawkę o pojemności 20 ml do kaniuli 15 G (patrz tabela materiałów) i rozcierać zawiesinę 10-15 razy, aby rozbić tkankę na zawiesinę komórkową. Bądź energiczny, ale unikaj nadmiernego spieniania.
    UWAGA: Nie będzie już widocznych kawałków płuca, a zamiast tego zawiesina będzie mętna po zakończeniu tego etapu.
  13. Przefiltrować zawiesinę przez sitko o pojemności 70 μm do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie przepłukać stożkową rurkę używaną do trawienia i sitko do komórek dodatkowymi 15 ml podłoża podstawowego.
  14. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 400 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
  15. Usunąć supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura i ponownie zawiesić osad w 2 ml kompletnego podłoża. Przenieść do kolby T-75 i dodać 8 ml kompletnej pożywki w temperaturze 37 °C do wilgotnego inkubatora o stężeniu 5% CO2 .
  16. Następnego dnia przemyć kolby dwukrotnie 10 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka bez wapnia i magnezu (HBSS/CMF) (patrz Tabela materiałów) i dodać 10 ml kompletnego podłoża.
    UWAGA: Po 2-3 dniach kultura będzie zlewać się w 90-95% i będzie gotowa do pierwotnej izolacji immunobeadów.

4. Pierwotna izolacja immunobeadów i hodowla komórek śródbłonka

  1. Przemyć przylegające komórki śródbłonka dwukrotnie 10 ml HBSS/CMF. Dodać 2 ml roztworu do oddzielania komórek bez trypsyny (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez ~5 min. Upewnij się, że wszystkie komórki zostały wyjęte z kolby.
    UWAGA: Zamiast trypsyny należy użyć roztworu odrywającego bez trypsyny, ponieważ trypsyna może zakłócić marker adhezji powierzchni komórek CD-31.
  2. Dodać 8 ml podłoża podstawowego, aby zneutralizować roztwór do odrywania komórek i przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować w temperaturze 400 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura i ponownie zawiesić komórki w 2 ml podłoża podstawowego. Przenieść zawiesinę komórek o pojemności 2 ml do probówki z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml (patrz Tabela materiałów).
  4. Worować kulki pokryte anty-CD-31 przez kilka sekund, aby ponownie zawiesić kulki i dodać 30 μl kulek na każde 2 ml zawiesiny komórek. Zabezpiecz pokrywę.
  5. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze typu end-over-end. Następnie umieść probówki na separatorze magnetycznym i pozostaw na 2 minuty.
  6. Delikatnie za pomocą szklanej pipety Pasteura odessać supernatant. Wyjmij probówkę z magnesu, ponownie zawieś osad z komórek perełkowych, dodając do probówki 3 ml podłoża podstawowego, a następnie kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół.
  7. Wymienić rurkę na separatorze magnetycznym na 2 minuty, a następnie ostrożnie odessać supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura.
  8. Powtórzyć płukanie (etap 4.6-4.7) co najmniej 4 razy, aż supernatant okaże się klarowny.
  9. Po ostatnim przemyciu, ponownie zawiesić granulki perełkowokomórkowe w 3 ml kompletnej pożywki wzrostowej i przenieść ją do kolby T-75. Dodać 7 ml kompletnej pożywki wzrostowej i inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 .
  10. Następnego dnia przemyj komórki HBSS/CMF, a następnie dodaj 10 ml świeżej kompletnej pożywki. Zastąp pożywkę 10 ml świeżej kompletnej pożywki co 2-3 dni, aż do 90-95% konfluencji.
    UWAGA: Gdy komórki są zlewające się w ~90-95%, co trwa ~3-4 dni, hodowla jest gotowa do wtórnej izolacji immunobeadów.

5. Wtórna izolacja immunobeadów i hodowla komórek śródbłonka

  1. Przemyć przylegające komórki śródbłonka dwukrotnie 10 ml HBSS/CMF. Dodać 2 ml roztworu do oddzielania komórek bez trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez ~5 min. Upewnij się, że wszystkie komórki zostały wyjęte z kolby.
  2. Dodać 8 ml podłoża podstawowego, aby zneutralizować roztwór odrywający komórki i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować w temperaturze 400 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura i ponownie zawiesić komórki w 2 ml podłoża podstawowego. Przenieść zawiesinę komórek o objętości 2 ml do probówki z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml.
  4. Worek pokryty anty-CD-102 Vortex przez kilka sekund w celu ponownego zawieszenia kulek i dodać 30 μl kulek na każde 2 ml zawiesiny komórek. Zabezpiecz pokrywę.
  5. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze typu end-of-end. Umieść probówki na separatorze magnetycznym i pozostaw na 2 minuty. Następnie delikatnie odessać supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura.
  6. Wyjmij probówkę z magnesu, ponownie zawieś osad z komórek perełkowych, dodając do probówki 3 ml podłoża podstawowego, a następnie kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół.
  7. Wymienić rurkę na separatorze magnetycznym na 2 minuty przed ostrożnym zasysaniem supernatantu za pomocą szklanej pipety Pasteura.
  8. Powtórzyć pranie (etap 5.6-5.7) 4 razy lub więcej, aż supernatant stanie się przezroczysty.
  9. Po ostatnim przemyciu, ponownie zawiesić granulki perełkowokomórkowe w 3 ml kompletnej pożywki wzrostowej i przenieść ją do kolby T-75. Dodać 7 ml kompletnej pożywki wzrostowej i inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% stężeniemCO2.
  10. Następnego dnia przemyj komórki HBSS/CMF, a następnie dodaj 10 ml świeżej kompletnej pożywki. Zastąp pożywkę 10 ml świeżej, kompletnej pożywki co 2-3 dni, aż do 90-95% zlewania się. Gdy komórki śródbłonka są w pełni zlewne, są gotowe do eksperymentowania. Komórki nie powinny być używane po upływie szóstego pasażu, ponieważ może dojść do starzenia się, a inne typy komórek mogą przejąć kontrolę.

6. Potwierdzenie markerów powierzchni komórek śródbłonka za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Po użyciu roztworu do odrywania komórek bez trypsyny w celu odłączenia komórek, ponownie zawieś osad komórkowy do 1 x 105 komórek/ml i podwielokrotność 100 μl zawiesiny komórkowej do trzech probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, oznaczonych 1, 2 i 3.
  2. Umyj komórki 1 ml 1x PBS. Wirować przy 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć bufor do płukania i powtórzyć dwukrotnie.
  3. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl 1x PBS. Do probówki 1 dodać 1 μl sprzężonego przeciwciała anty-mysiego CD-31 (PECAM-1) (np. fikoerytryny (PE) przeciwciała przeciwko mysiemu CD-31) i 1 μl sprzężonego przeciwciała anty-mysiego CD-102 (ICAM-2) (np. izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) przeciwko mysiemu przeciwciału CD102) (patrz tabela materiałów). Do rurki 2 dodaj odpowiednie kontrolki izotypu. Tuba nr 3 pozostanie niepoplamiona.
  4. Inkubuj probówki na lodzie i w ciemności przez 30-45 minut.
  5. Dodać 1 ml PBS do każdej probówki, delikatnie odwirować i wirować przy 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć mycie i powtórzyć trzy razy. Zawiesić ostatnią osadkę w 500 μl PBS.
  6. Przechowywać probówki przykryte folią aluminiową w temperaturze 4 °C do czasu analizy. Analiza musi zostać zakończona w ciągu 3-4 godzin.
  7. Uzyskaj dane o przepływie za pomocą cytometru. Użyj niebarwionej próbki jako kontroli ujemnej, aby prawidłowo ustawić napięcie lasera zgodnie z autofluorescencją komórki. Całkowita populacja komórek bramki z wykresem rozproszonym do przodu i bocznym wykresem punktowym.
    UWAGA: Po wykluczeniu dubletów, podwójnie dodatnie komórki CD31 + CD102 + definiuje się jako komórki śródbłonka.

Wyniki

Ten prosty protokół umożliwia izolację, hodowlę i charakterystykę mikro naczyniowych komórek śródbłonka myszy w ciągu 7–10 dni (Rysunek 1). W skrócie, płuca są wycinane i trawione enzymatycznie przed wysianiem. Bezpośrednio po wysianiu komórki śródbłonka oraz inne komórki będą unosić się w pożywce hodowlanej. Następnego dnia komórki śródbłonka oraz komórki zanieczyszczające przylgną do płytki, co wymaga zastosowania intensywnej techniki płukania w celu usunięcia zanieczyszczeń i komórek pływających. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji przeprowadza się pierwszą selekcję za pomocą kulek immunomagnetycznych. Komórki CD-31-dodatnie zaczynają wówczas rosnąć, tworząc strukturę przypominającą brukowanie (Rysunek 2). Komórki, które nie wykazują morfologii brukowej lub nadmiernie przerastają, są zanieczyszczeniami, a nie komórkami śródbłonka13,14,15,16.

Następnie przeprowadza się drugą selekcję za pomocą kulek immunomagnetycznych powlekanych przeciwciałami anty-CD-102, aby zwiększyć czystość komórek śródbłonka, analogicznie do innych protokołów13,16. Komórki, które osiągnęły konfluencję po drugiej selekcji kuleczkami immunomagnetycznymi, mogą być następnie wykorzystane do eksperymentów. Do potwierdzenia, że populacja komórek jest CD-31- oraz CD-102-dodatnia, stosuje się fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS) (Rycina 3).

Te komórki śródbłonka można następnie wykorzystać w wielu zastosowaniach, takich jak badanie ścieżek zapalnych śródbłonka oraz funkcji bariery śródbłonkowej. Na przykład zaobserwowano, że traktowanie mieszanką cytokin mysich (IFNg, TNFa i IL1b, każda w stężeniu 10 ng/mL) indukuje produkcję IL-6 przez komórki śródbłonka (Rycina 4A). Następnie zastosowano metodę elektrycznego pomiaru impedancji komórka-podłoże (ECIS)18, aby zmierzyć opór transepiteliowy (TER) dla przepływu prądu elektrycznego przez monowarstwy komórek śródbłonka płuc myszy. Zaobserwowano, że komórki traktowane mieszanką cytokin wykazywały spadek TER (Rycina 4B), co jest spójne ze zwiększoną przepuszczalnością śródbłonka. Przykłady te ilustrują, w jaki sposób komórki śródbłonka przygotowane zgodnie z tym protokołem mogą służyć do badania różnych procesów śródbłonkowych. Pozwala to badaczom na łatwiejsze studiowanie interesujących ich genów w komórkach śródbłonka, biorąc pod uwagę stale rosnącą liczbę dostępnych myszy z nokautem oraz myszy transgenicznych.

Izolacja komórek płuc myszy, schemat trawienia kolagenazą; selekcja CD31, CD102; przebieg eksperymentu.
Rycina 1: Schemat izolacji komórek śródbłonka płuc myszy. Płuca noworodków myszy w wieku 5-7 dni są pobierane i rozdrabniane. Rozdrobniona tkanka została poddana trawieniu enzymatycznemu kolagenazą I. Zawiesinę komórkową wysiano i hodowano przez 2-3 dni. Następnie komórki poddano pierwotnej izolacji za pomocą immunokulek powlekanych CD-31 i hodowano przez kolejne 3-4 dni. Druga izolacja immunokulkami powlekanymi CD-102 przed kolejną hodowlą przez 2-3 dni. Komórki są teraz gotowe do eksperymentów funkcjonalnych. Obraz został stworzony za pomocą internetowego narzędzia do ilustracji, Biorender. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Hodowla komórkowa pod mikroskopem; obraz w kontraście fazowym; proliferacja komórek; pasek skali 100 μm.
Rycina 2: Morfologia komórek śródbłonka płuc myszy. Hodowlane komórki śródbłonka płuc myszy wykazują morfologię brukową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cytometrii przepływowej; wykresy ekspresji CD102 i CD31; rozkład populacji komórek.
Rycina 3: Analiza komórek śródbłonka za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Wszystkie zdarzenia zostały przedstawione na wykresie kropkowym rozpraszania przedniego (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC). (B) Wykres rozproszenia potwierdzający, że mysie komórki śródbłonka płuc są pozytywne zarówno w odniesieniu do swoistych dla śródbłonka antygenów powierzchni komórki CD-31, jak i CD-102. (C) Histogram próbki izotypowej oraz próbki barwionej swoistym przeciwciałem CD-31/CD-102. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie poziomu IL-6 w pożywce i cytomiksie; dwuczęściowy wykres zawierający wyniki w postaci wykresu słupkowego i liniowego.
Rycina 4: Cytomiks indukuje produkcję IL-6 oraz przepuszczalność komórek śródbłonka płuc myszy. Komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc myszy szczepu C57BL/6 poddano działaniu cytomiksu (IFNg, TNFa i IL1b, każde w stężeniu 10 ng/mL). (A) Następnie zmierzono poziom IL-6 w supernatantach hodowli po 15 h (**p<0.01, n = 4 studniek/warunek). (B) Do wielokrotnego pomiaru oporu transendotelialnego (TER) w ciągu 15 h wykorzystano metodę elektrycznego pomiaru impedancji między komórkami a podłożem (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing). Dane znormalizowano do wartości oporu zmierzonego bezpośrednio przed dodaniem cytomiksu, zgodnie z oznaczeniem, a następnie przeanalizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Tukeya19 (**p<0.01, n = 4 studniek/warunek). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Ten prosty protokół nadaje się do komórek śródbłonka o wysokiej czystości z mysich płuc. Chociaż całkowity czas od początku do końca to 7-10 dni, czas ćwiczeń to około 3-4 godziny. W porównaniu z innymi metodami 13,14,15,16, obecny protokół jest uproszczony, zachowując podstawowe kroki bez uszczerbku dla wydajności i czystości.

Warto zwrócić uwagę na kilka krytycznych aspektów tego protokołu. Po pierwsze, ważne jest, aby używać nowonarodzonych szczeniąt, a nie dorosłych myszy. Z naszego doświadczenia wynika, że komórki śródbłonka dorosłych myszy nie namnażają się tak łatwo, jak komórki nowonarodzonych młodych i są łatwo opanowane przez komórki o wrzecionowatej morfologii zgodnej z fibroblastami lub mezenchymalnymi komórkami macierzystymi 15,16. Jednym z możliwych wyjaśnień tej różnicy jest to, że rozwój płuc odbywa się w stadium pęcherzykowym u nowonarodzonych myszy, charakteryzujących się szybszą proliferacją komórek śródbłonka20. Wraz ze starzeniem się może również wystąpić pewien stopień starzeniasię 21 lat. Czas trawienia enzymatycznego również musi być precyzyjny, ponieważ niedożywienie może prowadzić do niskiej wydajności zawiesiny jednokomórkowej. Natomiast nadmierne trawienie może prowadzić do znacznej śmierci komórek. Ustaliliśmy, że optymalny czas trawienia kolagenazy określa się na 45 minut. Następnie następuje mechaniczna dysocjacja za pomocą kaniuli. Zgłaszano również wkraplanie kolagenazy dotchawiczej podczas trawienia enzymatycznego14,15; Może to być jednak czasochłonne i prowadzi do niepełnego trawienia podczas bieżącej pracy. Wreszcie, niektóre protokoły przechodzą bezpośrednio do izolacji immunobeadów bezpośrednio po trawieniu enzymatycznym13,16. Odkryliśmy, że hodowla komórek z dysocjowanego płuca w pożywce przez dzień lub dwa przed dokonaniem selekcji immunobeadów znacznie zwiększa wydajność żywotnych i wysoce czystych komórek śródbłonka. Może to być związane z szybkością wprowadzania izolowanych komórek do pożywki do hodowli tkankowej, co prowadzi do mniejszej śmierci komórek we wczesnych stadiach po usunięciu od myszy, wyższej początkowej gęstości wysiewu i czasu na przyleganie i proliferację komórek śródbłonka przed pierwszą izolacją immunokulek.

Ograniczenia w przygotowaniu i analizie komórek śródbłonka myszy są następujące. Każda mysz zapewnia tylko ograniczoną liczbę komórek, które muszą być używane w ciągu kilku fragmentów. Ten problem można rozwiązać, łącząc trawienie płuc od kilku myszy. Niestety, nie udaje nam się osiągnąć sukcesu w celu krioprezerwacji i rozmrożenia komórek do wykorzystania w przyszłości. Pomimo tych ograniczeń komórki śródbłonka myszy mają pewne zalety. Mogą być pomocne, szczególnie w sytuacjach, gdy ludzkie komórki śródbłonka albo nie mogą być wykorzystane (np. nokaut genów), gdy wymagane są badania uzupełniające w celu potwierdzenia wyników z komórkami ludzkimi lub gdy niejednorodność odpowiedzi komórek śródbłonka od różnych ludzkich dawców sprawia, że odtwarzalność między eksperymentami jest problematyczna6. Jednorodna populacja komórek śródbłonka od genetycznie identycznych myszy pozwala na odtwarzalność między eksperymentami i badaniem określonych genów i szlaków w stabilnych warunkach tła.

Komórki śródbłonka myszy mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, aby zapewnić wgląd w aktywację i dysfunkcję śródbłonka w różnych procesach chorobowych. Na przykład komórki śródbłonka odgrywają integralną rolę w sepsi, przyczyniając się zarówno do korzystnych, jak i patologicznych odpowiedzi poprzez swoją rolę w aktywacji miejscowego i ogólnoustrojowego stanu zapalnego, promowaniu transportu leukocytów i aktywacji w tkankach, regulacji krzepnięcia i modulacji przepuszczalności śródbłonka 2,22,23. Ten prosty protokół zapewnia żywotne, funkcjonalne komórki śródbłonka, które można wykorzystać w testach dla każdego z tych procesów śródbłonka.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH T32GM008440 (JH/EW) i NIH R01AI058106 (JH). Uznajemy UCSF Parnassus Flow Cytometry Core (RRID:SCR_018206) wspierany częściowo przez Grant NIH P30 DK063720 oraz przez NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
50 ml stożkoweCorning Life Sciences430829
Accutase Cell Detachment SolutionInnovative Cell Technologies, IncAT-104
BD Igła PrecisionGlide 25 G x 5/8"Becton Disckinson305122
BioRender.comBioRender
Blunt Cannula 15 G x 1-1/2"Covidien8881202314
CD-102 Szczurzy anty-mysi (3C4 (MIC2/4))BDBiosciences553326
CD-31 Szczurzy anty-mysz (MEC 13.3)BD Biosciences557355
Kolagenaza, typ 1Worthington Biochemical CorpLS004194
DMEM, wysoki poziom glukozyGibco11965092
Dynabeads Owca Anti-Rat IgGInvitrogen11035
Wspomaganie wzrostu komórek śródbłonkaEMD Millipore Corp02-102
Sitka do komórek Falcon (70 &mikro; m)Corning Life Sciences352350
Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznieGibco10082-147
Drobne nożyczkiFine Science Tools14060-09
Cienkie nożyczkiFine Science Tools14060-10
Fisherbrand Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowegoFisher Scientific13-678-20B
FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4)BD Biosciences557444
FITC Rat IgG2a,  κ Kontrola izotypu (R35-95)BD Biosciences553929
Graefe KleszczeFine Science Tools11050-10
HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowejGibco14175095
Heparyna Sodowa do wstrzykiwań (1,000 jednostek/ml)Medline0409-2720-02
Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świńSigmaH3393
HEPES (1 M)Gibco15630106
Aminokwasy endogenne (100x)Gibco11140050
PE Rat Anty-mysie CD31 (MEC 13.3)BD Biosciences553373
PE Szczur IgG2a,  κ   Kontrola izotypu R35-95)BD Biosciences553930
Penicylina Streptomycyna (10 000 U/mL, 10 000 &mikro; g / mL)Gibco15140122
Rekombinowany mysi IFN-γPeprotech315-05
Rekombinowana mysia IL-1βPeprotech211-11B
Rekombinowany mysi TNF-&alfa;Peprotech315-01A
Probówki z polistyrenu okrągłodennegoCorning Life Sciences352058
Kleszcze SemkenNarzędzia do nauki precyzyjnej11008-13
Pirogronian sodu (100 mM)
Stericup Quick Release-GP, 250 mlmiliporówS2GPU02RE
Steriflip-GP Sterylna górna jednostka filtrująca w probówce wirówkowejMiliporeSCGP00525
Sterylna strzykawka (10 ml)Fisher Scientific14-955-459
Sterylna strzykawka (20 ml)Fisher Scientific14-955-460
Kolba do hodowli komórkowych T-75 z nasadką odpowietrzającą, z powłoką CellBINDCorning Life Sciences3290
Sterylny system filtracji próżniowej Gibco 11360070

Bibliografia

  1. Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion Critical Care. 14 (1), 22-30 (2008).
  2. Khakpour, S., Wilhelmsen, K., Hellman, J. Vascular endothelial cell Toll-like receptor pathways in sepsis. Innate Immunity. 21 (8), 827-846 (2015).
  3. Tuttolomondo, A., Daidone, M., Pinto, A. Endothelial dysfunction and inflammation in ischemic stroke pathogenesis. Current Pharmaceutical Design. 26 (34), 4209-4219 (2020).
  4. Roberts, A. C., Porter, K. E. Cellular and molecular mechanisms of endothelial dysfunction in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 10 (6), 472-482 (2013).
  5. Widmer, R. J., Lerman, A. Endothelial dysfunction and cardiovascular disease. Global Cardiology Science and Practice. 2014 (3), 291-308 (2014).
  6. Joffre, J., et al. Catecholaminergic vasopressors reduce toll-like receptor agonist-induced microvascular endothelial cell permeability but not cytokine production. Critical Care Medicine. 49 (3), 315-326 (2021).
  7. Yan, J., Nunn, A. D., Thomas, R. Selective induction of cell adhesion molecules by proinflammatory mediators in human cardiac microvascular endothelial cells in culture. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 3 (4), 315-331 (2010).
  8. Bouïs, D., Hospers, G. A., Meijer, C., Molema, G., Mulder, N. H. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
  9. Nolte, A., et al. Optimized basic conditions are essential for successful siRNA transfection into primary endothelial cells. Oligonucleotides. 19 (2), 141-150 (2009).
  10. Auguste, D. T., et al. Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes. Journal of Controlled Release. 130 (3), 266-274 (2008).
  11. Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Blood Vessels. 24 (1-2), 11-23 (1987).
  12. Alphonse, R. S., et al. The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs. Nature Protocols. 10 (11), 1697-1708 (2015).
  13. Lim, Y. -C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods in Molecular Biology. 341, 141-154 (2006).
  14. Cao, G., Abraham, V., DeLisser, H. M. Isolation of endothelial cells from mouse lung. Current Protocols in Toxicoly. 61, 1-9 (2014).
  15. Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (6), 1096-1103 (2009).
  16. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458(2019).
  17. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Scientific Reports. 9 (1), 227(2019).
  18. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  19. Wong, E., et al. ERK1/2 has divergent roles in lps-induced microvascular endothelial cell cytokine production and permeability. Shock. 55 (3), 349-356 (2020).
  20. Domm, W., Misra, R. S., O'Reilly, M. A. Affect of early life oxygen exposure on proper lung development and response to respiratory viral infections. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 55(2015).
  21. Jia, G., Aroor, A. R., Jia, C., Sowers, J. R. Endothelial cell senescence in aging-related vascular dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (7), 1802-1809 (2019).
  22. Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (3), 361-370 (2020).
  23. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja kom rek r db onkakom rki r db onka myszyselekcja za pomoc kulek magnetycznychtrawienie kolagenazkom rki CD31 dodatniekom rki CD102 dodatniehodowla kom rek r db onkaprzepuszczalno r db onkatest funkcji barierowej
Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.